具体实施方式

虽然在本文中已经显示和描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员来说，显然这些实施方案仅仅是作为示例提供的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替代。应当理解，可采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。

如本文中所用，术语“聚合物”通常是指通过聚合形成，并且主要由重复结构单元组成的化合物或化合物的混合物。

如本文中所用，术语“水凝胶”通常是指包含一种或多种悬浮在水溶液(例如，水)中的聚合物的凝胶或凝胶样结构。

如本文中所用，术语“粘度”通常是指流体或半流体中的流动阻力特性。

如本文中所用，术语“特性粘度”通常是指物质(例如，聚合物)对系统(例如，溶液)粘度的贡献的量度。在本公开中，特性粘度[η]可通过Ubbelohde粘度计或差示粘度计来测量。或者，特性粘度[η]可根据特性粘度和分子量之间建立的关系由Mark–Houwink方程计算。

如本文中所用，术语“水凝胶形成聚合物”通常指参与水凝胶形成的聚合物。其可以是能够形成水凝胶的天然存在的聚合物或合成聚合物。水凝胶形成聚合物可包括对水凝胶形成有贡献的一种或多种聚合物。在一些实施方案中，水凝胶形成聚合物不包括不能参与水凝胶形成的聚合物，和/或即使存在于本公开的滴眼剂组合物中也不能形成水凝胶的聚合物。在一些情况下，水凝胶形成聚合物也可称为“骨架聚合物”。

如本文中所用，术语“C_T”通常是指组合物中一种或多种聚合物的总浓度。例如，水凝胶形成聚合物的C_T可以指形成和/或已形成本公开的水凝胶的聚合物的总浓度。例如，其可以指本公开的滴眼剂组合物中存在的水凝胶形成聚合物的总浓度。在一些情况下，本公开的滴眼剂组合物可包含已经形成水凝胶的水凝胶形成聚合物，和/或还未结合到水凝胶中的水凝胶形成聚合物，并且水凝胶形成聚合物的C_T可以指滴眼剂组合物中存在的水凝胶形成聚合物的总浓度(例如，包括已经结合到水凝胶中的聚合物和还未结合的聚合物)。在另一个实例中，特性粘度[η]至少为3dL/g的水凝胶形成聚合物的C_T可以指特性粘度[η]至少为3dL/g的水凝胶形成聚合物的总浓度。

如本文中所用，术语“滴眼剂组合物”通常是指具有各种组件或成分的滴眼剂产品(例如，呈液态的)。例如，滴眼剂组合物可包含由一种或多种聚合物形成的水凝胶，并且滴眼剂组合物可以从容器中挤出。在一些情况下，滴眼剂组合物可包含水凝胶形成聚合物。

如本文中所用，术语“储能模量G’”通常指测量的储能，代表弹性部分。

如本文中所用，“损耗模量G””通常指测量的损耗能量，代表粘性部分。

如本文中所用，术语“挤压力”通常是指从容器中挤出材料所需的力。例如，将本公开的组合物或水凝胶从瓶中挤出所需的力。

如本文中所用，术语“屈服应变”通常是指材料开始塑性变形的应变，而屈服点是非线性(弹性和塑性)变形开始的点。在屈服点之前，材料将发生弹性变形，并在施加的应力消除后恢复至其原始形状。

如本文中所用，术语“亲水性”通常指对水具有亲和力，能够吸收水或被水润湿。亲水性分子或分子的一部分是其与水和其它极性物质的相互作用在热动力学上比它们与油或其它疏水溶剂的相互作用更有利的分子。

如本文中所用，术语“平均修饰度(DM)”通常指聚合物中具有侧基的重复单元的百分比。DM可反映水凝胶形成聚合物衍生物的修饰程度。

如本文中所用，术语“交联剂”通常指通过键将一个聚合物链连接到另一个聚合物链的剂。交联剂可通过共价键或非共价键实现交联。“聚合物链”可指合成聚合物或天然聚合物(诸如蛋白质)。在聚合物化学中，当合成聚合物被“交联”时，通常意味着聚合物的整个主体已经暴露于交联方法。机械性能的最终改变很大程度上取决于交联密度。交联可通过由热、压力、pH值的变化或辐射引发的化学反应形成。

如本文中所用，术语“眼部病症或疾患”通常指眼部疾病及其病症。眼病症或疾患可选自但不限于红眼、夜盲症、弱视、斜视、眼球震颤、色盲、葡萄膜炎、老花眼、飞蚊症、干眼症、过度流泪、白内障、青光眼、视网膜病症(例如年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、视网膜脱离)、结膜炎、角膜疾病、眼睑问题、视力变化和隐形眼镜问题。在一些情况下，眼部病症或疾患可以是干眼综合征和/或隐形眼镜不适。

如本文中所用，术语“生物相容的”通常是指通过不具有毒性、伤害性或生理反应性和/或不引起免疫排斥而与活组织或活系统相容的条件。

术语“约”在数值的上下文中使用时，通常指高于或低于指示值小于1％至15％(例如，小于1％、小于2％、小于3％、小于4％、小于5％、小于6％、小于7％、小于8％、小于9％、小于10％、小于11％、小于12％、小于13％、小于14％或小于15％)的值。

在提供数值范围(例如，数字范围)的情况下，要理解的是，该范围的上限和下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定)以及所述范围内的任意其它所述或居间的数值都包括在本发明中。

这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小的范围内，并且也包括在本发明中，服从于所述范围内的任何特别排除的限值。当所述范围包括上下限值之一或两者时，排除那些所包括的界限之一或两者的范围也包括在本发明中。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在实践或测试本发明中也可使用与本文描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述引用与所引述的出版物相关的方法和/或材料。

如本文中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“和(and)”以及“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“一个(a)颗粒”包括多个这样的颗粒，提及“该(the)序列”包括提及一个或多个本领域技术人员已知的序列及其等同物，等等。

本领域技术人员在阅读本公开后将会理解，本文所描述和示出的每个单独实施方案都具有分立的组件和特征，而不脱离本发明的范围或精神的情况下，所述组件和特征可以容易地与其它几个实施方案中的任一个的特征分离或组合。可以以所引用事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行任何引用的方法。这旨在为所有此类组合提供支持。

本公开提供了滴眼剂组合物和使用该组合物治疗或缓解眼部病症或疾患的方法，以及制备和使用该组合物的方法。更具体地，本公开提供了包含能够形成水凝胶的聚合物的组合物，以及制备和使用该组合物的方法。

一方面，本公开提供了滴眼剂组合物。所述滴眼剂组合物可包含一种或多种水凝胶形成聚合物。此类水凝胶形成聚合物可具有至少3dL/g(例如，至少约5dL/g、至少约8dL/g、至少约10dL/g、至少约12dL/g、至少约15dL/g、至少约16dL/g、至少约17dL/g、至少约18dL/g、至少约19dL/g、至少约20dL/g、至少约25dL/g或更多)的特性粘度[η]。例如，用Ubbelohde粘度计测量。在一些实施方案中，特性粘度[η]由差动粘度计测量。或者，特性粘度[η]可根据特性粘度和分子量之间建立的关系由Mark–Houwink方程计算。

组合物中一种或多种水凝胶形成聚合物(例如，那些特性粘度[η]至少为3dL/g的水凝胶形成聚合物)的总浓度为C_T。C_T可为至多约5mg/ml(例如，至多约4mg/ml、至多约3mg/ml、至多约2mg/ml、至多约1.5mg/ml、至多约1mg/ml、至多约0.9mg/ml、至多约0.8mg/ml、至多约0.7mg/ml、至多约0.6mg/ml、至多约0.5mg/ml、至多约0.4mg/ml、至多约0.3mg/ml、至多约0.2mg/ml、至多约0.1mg/ml或更低)。例如，C_T可为约0.05mg/ml至约5mg/ml(例如，约0.1mg/ml至约5mg/ml、约0.2mg/ml至约5mg/ml、约0.3mg/ml至约5mg/ml、约0.4mg/ml至约5mg/ml、约0.5mg/ml至约5mg/ml、约0.6mg/ml至约5mg/ml、约0.7mg/ml至约5mg/ml、约0.8mg/ml至约5mg/ml、约0.9mg/ml至约5mg/ml、约1.0mg/ml至约5mg/ml、约1.0mg/ml至约4mg/ml、约1.0mg/ml至约3mg/ml、约1.0mg/ml至约2mg/ml、约0.3mg/ml至约0.8mg/ml、约0.3mg/ml至约0.6mg/ml或约0.3mg/ml至约0.5mg/ml)。

例如，滴眼剂组合物可包含各种聚合物，其中一些能够参与水凝胶形成(例如，水凝胶形成聚合物)。在水凝胶形成聚合物中，一些具有至少3dL/g的特性粘度[η]，并且那些具有至少3dL/g的特性粘度[η]的水凝胶形成聚合物的总浓度C_T可以是至多约5mg/ml(例如，至多约4mg/ml,至多约3mg/ml、至多约2mg/ml、至多约1.5mg/ml、至多约1mg/ml、至多约0.9mg/ml、至多约0.8mg/ml、至多约0.7mg/ml、至多约0.6mg/ml、至多约0.5mg/ml,至多约0.4mg/ml、至多约0.3mg/ml、至多约0.2mg/ml、至多约0.1mg/ml或更少)。例如，那些特性粘度[η]至少为3dL/g的水凝胶形成聚合物的总浓度C_T可以为约0.05mg/ml至约5mg/ml(例如，约0.1mg/ml至约5mg/ml、约0.2mg/ml至约5mg/ml、约0.3mg/ml至约5mg/ml、约0.4mg/ml至约5mg/ml、约0.5mg/ml至约5mg/ml、约0.6mg/ml至约5mg/ml、约0.7mg/ml至约5mg/ml、约0.8mg/ml至约5mg/ml、约0.9mg/ml至约5mg/ml、约1.0mg/ml至约5mg/ml、约1.0mg/ml至约4mg/ml、约1.0mg/ml至约3mg/ml、约1.0mg/ml至约2mg/ml、约0.3mg/ml至约0.8mg/ml、约0.3mg/ml至约0.6mg/ml或约0.3mg/ml至约0.5mg/ml)。

在一些情况下，最初，滴眼剂组合物中的水凝胶形成聚合物可以以非交联形式存在(例如，水凝胶尚未形成)，并且在某些处理之后(例如，在例如37℃下孵育一定时间例如12小时或更长时间后)，一些水凝胶形成聚合物可以化学和/或物理交联以形成水凝胶。在某些实施方案中，几乎所有水凝胶形成聚合物化学和/或物理交联以形成水凝胶。

因此，在一些情况下，滴眼剂组合物可以包含已经形成的水凝胶。在此类情况下，至少一些水凝胶形成聚合物包含在形成的水凝胶的组合物中。例如，滴眼剂组合物中的水凝胶形成聚合物可包括已经形成水凝胶的聚合物，以及尚未结合至水凝胶但能够在特定反应条件下(例如，在37℃下孵育一段时间，例如12小时后)形成水凝胶的聚合物。在此类情况下，已包含在水凝胶中的水凝胶形成聚合物和还未包含在水凝胶中的水凝胶形成聚合物的总浓度C_T可以至多为约5mg/ml。

在一些情况下，滴眼剂组合物中几乎所有的水凝胶形成聚合物可能已经形成水凝胶(例如，通过化学和/或物理交联)。

根据本公开的水凝胶可具有一个或多个特定的特征/性质。

例如，水凝胶可具有不超过约10.0Pa(例如，不超过约8.0pa,不超过约7.0pa,不超过约6.0pa、不超过约5.0pa、不超过约4.0pa、不超过约3.0pa、不超过约2.0pa、不超过约1.0pa、不超过约0.8pa、不超过约0.7pa、不超过约0.6pa、不超过约0.5pa或更低)的储能模量G’，如在动态振荡剪切测试中测得的。

本公开的水凝胶可具有不超过约10.0Pa(例如，不超过约8.0Pa、不超过约7.0Pa、不超过约6.0Pa、不超过约5.0Pa、不超过约4.0Pa、不超过约3.0Pa、不超过约2.0Pa、不超过约1.0Pa、不超过约0.8Pa、不超过约0.7Pa、不超过约0.6Pa、不超过约0.5Pa或更低)的损耗模量G”，如在动态振荡剪切测试中测得的。

本公开的水凝胶可具有不超过约0.2Pa·s(例如，不超过约0.1Pa·s、不超过约0.08Pa·s、不超过约0.07Pa·s、不超过约0.06Pa·s、不超过约0.05Pa·s或不超过约0.04Pa·s)的复数粘度，如在动态振荡剪切测试中在低于约100rad/s(例如，低于约90rad/s,低于约80rad/s,低于约70rad/s,低于约50rad/s,低于约40rad/s,低于约30rad/s,低于约20rad/s,低于约10rad/s或更低)的频率下测得的。

当水凝胶从瓶(例如Tears Naturale Free 0.6ml吹填密封(BFS)一次性使用瓶)中被挤出时，本公开的水凝胶可具有约4N至约45N(例如，约4N至约45N、约5N至约45N、约6N至约45N、约7N至约45N、约8N至约45N、约9N至约45N、约10N至约45N、约12N至约45N、约15N至约45N、约20N至约45N、约25N至约45N、约30N至约45N、约35N至约45N或约40N至约45N)的挤压力。

如在动态振荡应变扫描测试中测得的，本公开的水凝胶可具有至少约10％(例如，至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约50％、至少约80％或更大)的屈服应变。

例如，在动态振荡剪切测试中，可向材料施加正弦力(例如，应力)，并且可以测量得到的位移(应变)。对于完全弹性的固体，产生的应变和应力可以完全同相。对于纯粘性流体，应变相对于应力可以有90度的相位滞后。具有介于两者之间的特性的粘弹性聚合物在测试期间可能具有相位滞后，并且可以相应地计算储能模量。

挤压力可通过迫使(例如挤压)滴眼剂组合物(例如，包括本公开的水凝胶)离开容器(诸如滴眼剂瓶)来测试。滴眼剂瓶可具有至少约0.1ml(例如，至少约0.2ml、至少约0.3ml、至少约0.4ml、至少约0.5ml、至少约0.6ml、至少约0.7ml、至少约0.8ml、至少约0.9ml、至少约1.0ml、至少约1.1ml、至少约1.2ml、至少约1.3ml、至少约1.4ml、至少约1.5ml、至少约2.0ml或更多)的体积。滴眼剂瓶可由选自以下的材料制成：PET、乙缩醛、HDPE、LDPE、尼龙、PBT、PEEK、聚丙烯、PPS、PTFE、PVDF和UHMW-PE。滴眼剂瓶可具有至少约0.01mm(例如，至少约0.05mm、至少约0.1mm、至少约0.15mm、至少约0.2mm、至少约0.25mm、至少约0.3mm、至少约0.35mm、至少约0.4mm、至少约0.45mm、至少约0.5mm、至少约0.55mm、至少约0.6mm、至少约0.7mm、至少约0.8mm、至少约0.9mm、至少约1.0mm或更大)的口径。滴眼剂瓶可具有螺帽、针帽或其它合适类型的帽。在一些实施方案中，滴眼剂瓶是Tears NaturaleFree 0.6ml吹填密封(BFS)一次性使用瓶。

动态机械分析仪(DMA)可用于测量储能模量，也可用于动态振荡剪切测试。在另一个实例中，DMA分析仪可包括位移传感器(诸如线性可变差动变压器)，其可以测量作为仪器探头移动通过磁芯的结果的电压变化。DMA分析仪还可包括温度控制系统或熔炉、驱动马达(例如，用于探针加载的线性马达，其可为所施加的力提供负载)、驱动轴支撑件和引导系统，以作为从马达到样品的力的引导，以及一个或多个样品夹具，以保持被测样品。

可使用不同类型的DMA分析仪。例如，可使用强制共振分析仪或自由共振分析仪。自由共振分析仪可通过悬挂和摆动样品来测量被测样品的阻尼的自由振荡。强制共振分析仪可以强制样品以某一频率振荡，并且可以可靠地进行温度扫描。分析仪可同时进行应力(力)和应变(位移)控制。例如，在应变控制中，可以移动探针，并且可以通过实施力平衡传感器来测量样品的最终应力，所述力平衡传感器可以利用不同的轴。在应力控制中，可以施加设定的力，并且可以改变几个其它实验条件(温度、频率或时间)。应力和应变可通过扭转或轴向分析仪施加。使用扭转分析仪，以扭转运动的方式施加力。轴向分析仪可用于弯曲、拉伸和/或压缩测试。

可采用多种测试模式(诸如温度扫描测试、频率扫描测试、应变扫描测试或其组合)来探测聚合物的粘弹性。例如，在应变扫描测试中，通过逐渐增加振荡幅度，可以进行应变扫描测量。储能模量和损耗模量随应变增加的变化可用于材料表征，以及确定材料线性应力-应变状态的上限。

多种力学性质可通过DMA来确定。这些性质包括储能模量(G’)、损耗模量(G”)、复数模量(G*)、损耗角(tan(δ))、复数粘度(η*)、其同相分量(η’)和异相分量(η”)、复柔量(J^*)、储能柔量(J’)、损耗柔量(J”)等。

在一些情况下，水凝胶可具有不超过其储能模量G’的约100％(例如，不超过约100％，不超过约90％，不超过约80％，不超过约70％，不超过约60％，不超过约50％，不超过约40％，不超过约30％，不超过约20％，不超过约10％，不超过约5％，不超过约3％，不超过约2％，不超过约1％或更少)的损耗模量G”，如在动态振荡剪切测试中测得的。

在一些情况下，聚合物可以是亲水性的和/或水溶性的。

在一些情况下，聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)可以选自多糖、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羟乙酯、弹性蛋白、胶原、其衍生物及其任意组合。例如，滴眼剂组合物中的聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)可包含以下物质中的一种或多种：多糖、一种或多种类型的聚丙烯酸衍生物、聚甲基丙烯酸羟乙酯、一种或多种类型的聚甲基丙烯酸羟乙酯衍生物、弹性蛋白、一种或多种类型的弹性蛋白衍生物、胶原和一种或多种类型的胶原衍生物。

在一些情况下，聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)可以选自透明质酸、瓜尔胶、淀粉、壳聚糖、硫酸软骨素、藻酸盐、羧甲基纤维素、其衍生物及其任意组合。例如，滴眼剂组合物中的聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)可包含以下物质中的一种或多种：透明质酸、一种或多种类型的透明质酸衍生物、瓜尔胶、一种或多种类型的瓜尔胶衍生物、淀粉、一种或多种类型的淀粉衍生物、壳聚糖、一种或多种类型的壳聚糖衍生物、硫酸软骨素、一种或多种类型的硫酸软骨素衍生物、藻酸盐、一种或多种类型的藻酸盐衍生物、羧甲基纤维素和一种或多种类型的羧甲基纤维素衍生物。在一些实施方案中，滴眼剂组合物中的聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)包含以下物质中的一种或多种：透明质酸和一种或多种类型的透明质酸衍生物。

本公开的聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)可包括用一种或多种修饰物修饰的衍生物，所述修饰物选自丙烯酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、N-羟基琥珀酰亚胺、醛、酮、碳二亚胺、碳酸酯、碘乙酰基、巯基烟酰胺、醌、硫醇、胺及其任意组合。例如，聚合物可包括一种或多种多糖衍生物，其可以是用丙烯酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、N-羟基琥珀酰亚胺、醛、酮、碳二亚胺、碳酸酯、碘乙酰基、巯基烟酰胺、醌、硫醇和/或胺修饰的多糖。在一些情况下，聚合物可包括一种或多种聚丙烯酸衍生物，其可以是用丙烯酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、N-羟基琥珀酰亚胺、醛、酮、碳二亚胺、碳酸酯、碘乙酰基、巯基烟酰胺、醌、硫醇和/或胺修饰的聚丙烯酸。在一些情况下，聚合物可包括一种或多种聚甲基丙烯酸羟乙酯衍生物，其可以是用丙烯酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、N-羟基琥珀酰亚胺、醛、酮、碳二亚胺、碳酸酯、碘乙酰基、巯基烟酰胺、醌、硫醇和/或胺修饰的聚甲基丙烯酸羟乙酯。在一些情况下，聚合物可包括一种或多种弹性蛋白衍生物，其可以是用丙烯酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、N-羟基琥珀酰亚胺、醛、酮、碳二亚胺、碳酸酯、碘乙酰基、巯基烟酰胺、醌、硫醇和/或胺修饰的弹性蛋白。在一些情况下，聚合物可包括一种或多种胶原衍生物，其可以是用丙烯酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、N-羟基琥珀酰亚胺、醛、酮、碳二亚胺、碳酸酯、碘乙酰基、巯基烟酰胺、醌、硫醇和/或胺修饰的胶原。

在一个实施方案中，聚合物包括用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸衍生物(HA-SH)，在一些情况下，HA-SH可以在适当的条件下形成基于HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶。在另一个实施方案中，聚合物包括用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸衍生物(HA-VS)，在一些情况下，HA-VS可以在适当的条件下形成基于HA-VS的聚合物-聚合物型水凝胶。在另一个实施方案中，聚合物包括用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸衍生物，以及用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸衍生物，在一些情况下，透HA-SH和HA-VS可以在适当的条件下相互反应形成聚合物-聚合物型水凝胶。

在一些情况下，衍生物可具有约3％至约50％(例如，约3％至约50％、约4％至约50％、约5％至约50％、约6％至约50％、约7％至约50％、约8％至约50％、约9％至约50％、约10％至约50％、约20％至约50％、约30％至约50％、约40％至约50％等)的平均修饰度(DM)。

在一些情况下，滴眼剂组合物可包含至少第一聚合物衍生物和第二聚合物衍生物。第一聚合物衍生物可包含第一修饰，第二聚合物衍生物可包含第二修饰。第一修饰可以不同于第二修饰。第一聚合物衍生物能够与第二聚合物衍生物反应形成水凝胶。例如，第一聚合物衍生物可以是用一个或多个乙烯基砜基团修饰的聚合物(例如，透明质酸)。第二聚合物衍生物可以是用一个或多个硫醇基团修饰的聚合物(例如，透明质酸)。

在一些情况下，组合物中第一聚合物衍生物与第二聚合物衍生物之间的质量比可以为约10:1至约1:10(例如，10:2、10:3、10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、10:9、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10)。

在一些情况下，组合物中第一聚合物衍生物和第二聚合物衍生物之间的摩尔比可以为约10:1至约1:10(例如，10:2、10:3、10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、10:9、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10)。

在一些情况下，组合物中第一聚合物衍生物与第二聚合物衍生物之间的体积比可以为约10:1至约1:10(例如，10:2、10:3、10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、10:9、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10)。

在一些情况下，第一聚合物衍生物可以具有第一DM，第二聚合物衍生物可具有第二DM，并且第一DM与第二DM之间的比率可以为约10:1至约1:10(例如，10:2、10:3、10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、10:9、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10)。

在一些情况下，组合物中的第一聚合物衍生物和第二聚合物衍生物可具有如本公开中限定的质量比、如本公开中限定的摩尔比、如本公开中限定的体积比和/或如本公开中限定的DM比。

在一些情况下，第一修饰和第二修饰可以各自独立地选自丙烯酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、N-羟基琥珀酰亚胺、醛、酮、碳二亚胺、碳酸酯、碘乙酰基、巯基烟酰胺、醌、硫醇、胺及其任意组合。第一修饰和第二修饰可以彼此不同。

在一些情况下，第一聚合物衍生物可以是用一个或多个乙烯基砜基团(或用包含一个或多个乙烯基砜基团的分子)修饰的本公开的聚合物，第二聚合物衍生物可以是用一个或多个硫醇基团(或用包含一个或多个硫醇基团的分子)修饰的本公开的聚合物。第一聚合物衍生物能够与第二聚合物衍生物反应形成水凝胶。

在实例中，第一聚合物衍生物可以是用一个或多个乙烯砜基团修饰的透明质酸，第二聚合物衍生物可以是用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸，并且第一聚合物衍生物可以能够与第二聚合物衍生物反应形成水凝胶。

在一些情况下，第一聚合物衍生物可以是用一个或多个硫醇基团(或用包含一个或多个硫醇基团的分子)修饰的本公开的聚合物，第二聚合物衍生物可以是用一个或多个乙烯基砜基团(或用包含一个或多个乙烯基砜基团的分子)修饰的本公开的聚合物。第一聚合物衍生物能够与第二聚合物衍生物反应形成水凝胶。

在实例中，第一聚合物衍生物可以是用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸，第二聚合物衍生物可以是用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸，并且第一聚合物衍生物可以能够与第二聚合物衍生物反应形成水凝胶。

在一些情况下，聚合物的平均分子量可为约100,000至约5,000,000道尔顿(例如，约120,000至约5,000,000道尔顿、约200,000至约5,000,000道尔顿、约300,000至约5,000,000道尔顿、约400,000至约5,000,000道尔顿、约500,000至约5,000,000道尔顿、约600,000至约5,000,000道尔顿、约670,000至约5,000,000道尔顿、约1,000,000至约5,000,000道尔顿、约1,500,000至约5,000,000道尔顿、约2,000,000至约5,000,000道尔顿、约2,500,000至约5,000,000道尔顿、约2,600,000至约5,000,000道尔顿、约3,000,000至约5,000,000道尔顿、约3,500,000至约5,000,000道尔顿、约3,600,000至约5,000,000道尔顿、约2,000,000至约4,000,000道尔顿、约2,500,000至约3,500,000道尔顿、约2,600,000至约3,600,000道尔顿、约1,000,000至约2,600,000道尔顿、约800,000至约2,600,000道尔顿、约700,000至约2,500,000道尔顿、约670,000至约2,600,000道尔顿或约600,000至约2,500,000道尔顿)。

在一些情况下，滴眼剂组合物还可包含不同于一种或多种聚合物的交联剂。例如，交联剂可以是小分子交联剂、大分子交联剂或其组合。

在一些情况下，交联剂可以是小分子交联剂。小分子交联剂可包括含有选自丙烯酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、羟基琥珀酰亚胺、醛、酮、多碳二亚胺、碳酸酯、碘乙酰基、巯基烟酰胺、醌、硫醇、胺及其任意组合的基团的分子。

在一些情况下，交联剂可以是大分子交联剂。大分子交联剂可包括含有选自丙烯酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、羟基琥珀酰亚胺、醛、酮、多碳二亚胺、碳酸酯、碘乙酰基、巯基烟酰胺、醌、硫醇、胺及其任意组合的基团的大分子。

在一些情况下，交联剂可选自二硫苏糖醇、二半胱氨酸、PEG-二硫醇、4或8臂-PEG硫醇、二乙烯基砜、双(乙烯基磺酰基)甲烷、PEG-VS和4或8臂聚PEG-VS。

在具体实例中，聚合物是用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸(例如HA-VS)。交联剂是多硫醇小分子，例如DTT、双半胱氨酸等，或者其末端基团被硫醇官能化的大分子，例如PEG-二硫醇或4或8臂-PEG硫醇。当满足一定的反应条件时，通过使HA-VS与交联剂反应，可以形成HA-VS水凝胶-交联剂型水凝胶。

在具体实例中，聚合物是用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸(例如，HA-SH)。交联剂为多乙烯基砜小分子，例如DVS、双(乙烯基磺酰基)甲烷等，或者其末端基团用VS官能化的大分子，例如PEG-VS或4或8臂-PEGVS。当满足一定的反应条件时，通过使HA-SH与交联剂反应，形成HA-SH水凝胶-交联剂型水凝胶。

在一些情况下，滴眼剂组合物可以不含不同于其中的聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)的任何交联剂。例如，本公开的聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)可在它们之间形成化学和/或物理交联，并且滴眼剂组合物中不包含额外的交联剂。在一些实施方案中，滴眼剂组合物不含任何小分子交联剂。

滴眼剂组合物可包含磷酸盐缓冲液。例如，磷酸盐缓冲液可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

滴眼剂组合物的pH值可为约3.5至约9.0(例如，约4.0至约9.0、约4.5至约9.0、约5.0至约9.0、约5.5至约9.0、约6.0至约9.0、约6.5至约9.0、约7.0至约9.0、约7.5至约9.0、约8.0至约9.0、约8.5至约9.0、约7.0至约7.8或约7.4)。

在一些情况下，滴眼剂组合物可以是生物相容的。例如，其在生物(活的)组织或生物(活的)系统中不会表现出显著的毒性、损伤或免疫排斥。

在本公开中，滴眼剂组合物可通过以下方法制备：提供包含至少第一聚合物衍生物和第二聚合物衍生物的组合物，其中第一聚合物衍生物包含第一修饰，第二聚合物衍生物包含第二修饰，第一修饰不同于第二修饰，并且第一聚合物衍生物能够与第二聚合物衍生物反应形成水凝胶。所述方法还可包括使组合物经受使得能够形成水凝胶的条件。

在一些实施方案中，所述处理包括在约30℃至约45℃下(例如，在约32℃至约40℃，在约35℃至约40℃，诸如在约37℃下)孵育组合物。

在一些情况下，所述方法可包括交联组合物中的聚合物，以产生包含在本公开的滴眼剂组合物中的水凝胶。例如，使得能够形成水凝胶的条件也可以使组合物中的聚合物交联。在一些情况下，交联可包括在约20℃至约50℃、约25℃至约50℃、约30℃至约50℃、约31℃至约50℃、约32℃至约50℃、约33℃至约50℃、约34℃至约50℃、约35℃至约50℃、约36℃至约50℃、约37℃至约50℃、约38℃至约50℃、约39℃至约50℃、约40℃至约50℃或约45℃至约50℃下孵育组合物中的聚合物。在一些实施方案中，交联包括在约30℃至约40℃，例如约35℃至约39℃的温度下，例如在约37℃下孵育组合物中的聚合物。在一些情况下，交联可包括将组合物中的聚合物孵育至少1小时，例如，至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约7小时、至少约8小时、至少约9小时、至少约9.5小时、至少约10小时、至少约10.5小时、至少约11小时、至少约12小时、至少约13小时、至少约14小时、至少约15小时、至少约16小时、至少约17小时、至少约18小时、至少约19小时、至少约20小时、至少约24小时或更长时间。

例如，所述方法可包括：1)制备第一聚合物群体(或第一聚合物衍生物)和第二聚合物群体(或第二聚合物衍生物)(例如，第一聚合物群体中的聚合物可包含用一个或多个乙烯基砜基团修饰的透明质酸；并且第二聚合物群中的聚合物可以包含用一个或多个硫醇基团修饰的透明质酸)，调节pH值(例如，通过加入缓冲溶液)；2)将第一聚合物群体(或第一聚合物衍生物)的聚合物与第二聚合物群体(或第二聚合物衍生物)的聚合物以预设比例混合，组合物中聚合物的浓度是如本公开所限定的；以及3)在允许形成根据本公开的水凝胶的条件下孵育混合物。

在一些情况下，滴眼剂组合物可以是人工泪液、隐形眼镜再润湿剂或润滑剂。

在一些情况下，滴眼剂组合物还可包含治疗活性剂，例如用于治疗或减轻眼病症或疾患的剂。

另一方面，本公开涉及在有此需要的受试者中治疗或缓解眼病症或疾患的方法，包括给受试者施用有效量的本公开的滴眼剂组合物。

另一方面，本公开涉及用于在有此需要的受试者中改善眼部舒适度或缓解眼部干燥的方法，包括给受试者施用有效量的滴眼剂组合物。

施用可包括将一滴或多滴滴眼剂组合物施用在受试者的眼部区域上或施用到受试者的眼部区域。在一些情况下，所述方法可包括通过将有效量的滴眼剂组合物从滴眼剂瓶中挤出到受试者的角膜表面来施用滴眼剂组合物。

受试者可以包括人和非人动物，诸如狗、兔子或其它动物。

另一方面，本发明涉及用于在有此需要的受试者治疗或缓解眼病症或疾患，和/或用于在有此需要的受试者中改善眼部舒适度或缓解眼部干燥的滴眼剂组合物。

另一方面，本发明涉及滴眼剂组合物在制造用于改善眼睛舒适度或缓解眼睛干燥和/或用于治疗或缓解眼病症或疾患的产品方面的用途。

在一些情况下，眼部病症或疾患选自干眼综合征和隐形眼镜不适。

本公开的滴眼剂组合物可具有以下优异性能：更好的剂(例如，药物活性剂)的受控释放和更长的作用时间、更好的生物相容性、更长的储存时间和/或良好的临床试验结果。

实施例

阐述以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是他们的发明的范围，也不旨在表示下面的实验是所有或唯一进行的实验。已努力确保所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力等于或接近大气压。可以使用标准缩写，例如kb，千碱基或数千碱基；pl，皮升或数皮升；s或sec，秒或数秒；min，分钟钟或数分钟；h或hr，小时或数小时等。

实施例1HA样品的测量

1.1.[η]的测量

[η]可使用毛细管粘度计直接测量。例如，用Ubbelohde粘度计测量三个透明质酸样品，即样品A、样品B和样品C。这些HA样品购自Bloomage Freda Biopharm Co.Ltd.(上海，中国)。由供应商按照欧洲药典测量聚合物。表1显示了用Ubbelohde粘度计测量的样品A、样品B和样品C的特性粘度([η])。

表1：用Ubbelohde粘度计测量的特性粘度([η])

1.2聚合物分子量的估计

使用以下的Mark-Houwink-Sakurada方程式，由用Ubbelohd粘度计测得的特性粘度值计算聚合物的分子量(MW)：

[η]＝K_M(MW)^a

其中对于给定的聚合物-溶剂对，K_M和a(Mark-Houwink-Sakurada指数)是常数。

样品A、B和C的分子量分别计算为2.6MDa、670KDa和120KDa。

实施例2聚合物衍生物的制备

2.1 HA-VS的制备

如由Yu和Chau(Biomacromolecules 2015,16(1),56–65)所述，用侧基VS修饰透明质酸(HA)。简言之，将透明质酸溶解在去离子水(DI水)中。浓度为1mg/ml至40mg/ml，取决于HA的分子量(MW)。对于高MW HA(例如MW>500kDa)，浓度较低(例如1mg/ml至5mg/ml)，对于低MW HA(例如，MW<500kDa)，浓度较高(例如5mg/ml至40mg/ml)。

完全溶解后，向聚合物溶液中逐滴加入5M NaOH，最终浓度为0.1M。在剧烈混合下立即加入二乙烯基砜(DVS)。或者，首先将DVS以1mg(DVS)/8ml(水)溶解在去离子水中，并立即加入到剧烈混合的聚合物中。透明质酸的DVS与羟基(OH)之间的摩尔比至少为1.25:1。对于低浓度的HA，摩尔比为6:1或更高。反应时间的选择取决于目标修饰度(DM)。对于给定的反应时间，修饰度也取决于HA和DVS的浓度、温度和最终的NaOH浓度。

对于HA样品C(分子量为120kDa)，HA浓度为20mg/ml，HA的DVS与OH之间的摩尔比为1.5:1；对于HA样品B(分子量为670kDa)，HA浓度为10mg/ml，HA的DVS与OH之间的摩尔比约为3:1；对于HA样品A(分子量为2.6MDa)，HA浓度为2.5mg/ml，HA的DVS与OH之间的摩尔比约为6:1。

通过加入6M HCl停止反应。聚合物通过使用透析袋的膜分离或针对DI水(约pH5.5)或用HCl调节的约pH 4的酸性DI水的切向流过滤来纯化。纯化的聚合物以溶液形式在4℃下储存。为了测定修饰度(DM)，将HA-VS冻干并通过¹HNMR测定。

2.2 HA-SH的制备

如由Yu和Chau(Biomacromolecules 2015,16(1),56–65)所述，用侧基SH基团修饰透明质酸(HA)。简而言之，首先将HA修饰为HA-VS(如实施例2.1所述)。用N₂吹扫HA-VS溶液至少20分钟。将相对于VS基团10倍摩尔过量或制备0.05M DTT溶液所需的量(取决于哪个DTT浓度更高)的二硫苏糖醇(DTT)以约400mg/ml溶解在水中(pH约为5.5)，并用N₂吹扫至少5分钟，并加入到HA-VS溶液中。HA-VS/DTT的pH值约为4，并且系统继续用N₂吹扫。然后，用N₂吹扫为HA-VS体积的1/10的0.5M磷酸盐缓冲液(PB)至少5分钟，并加入到HA-VS/DTT溶液中。让反应进行至少25分钟。通过加入1M HCl将pH值降至3.5-4.5来停止反应。聚合物通过使用透析袋的膜分离或针对DI水或用HCl调节的pH为4的DI水的切向流过滤来纯化。纯化的聚合物以溶液形式在4℃下储存。修饰度(DM)通过对HA-SH进行¹HNMR和Ellmans测定来测定。

乙烯基磺化透明质酸(HA-VS)的合成如图1所示。并且根据图2合成了硫醇化透明质酸(HA-SH)。

实施例3水凝胶形成

3.1基于HA-VS/HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶的形成

首先测定HA-VS和HA-SH的浓度。将已知体积的聚合物溶液冷冻干燥，并测量聚合物的干重。干聚合物至少为4mg，以确保精确测量。或者，如前所述(Oueslati et al.,CTABturbidimetric method for assaying hyaluronic acid in complex environments andunder cross-linked form,Carbohydrate Polymers,2014)，通过CTAB测定测量聚合物浓度。然后通过添加0.5M PB将已知浓度的HA-VS和HA-SH调节至pH 7.4。PB的最终浓度约为0.02M-0.05M。然后用25％NaCl调节重量摩尔渗透压浓度。然后将聚合物以不同的目标体积比和质量比混合，并通过加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)调节至目标浓度。

将聚合物在37℃下孵育至少10小时以形成水凝胶。水凝胶形成反应如图3所示。

对于平均分子量为约2.6MDa、特性粘度[η]为约39.2dL/g(如由Ubbelohde粘度计测得的)的透明质酸聚合物，用于形成本公开的基于HA-VS/HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶的HA聚合物(包括HA-SH和HA-VS两者)的浓度可以低至约0.4mg/ml(即，水凝胶中的含水量大于约99.96％)。

在本公开中，基于实施例1.1中样品A的HA聚合物(平均分子量约为2.6MDa，特性粘度[η]约为39.2dL/g)制备HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8和A9。对于样品A1、A2、A3和A4，水凝胶形成聚合物的C_T(例如，HA-VS和HA-SH的总浓度)分别为约1.2mg/ml、0.8mg/ml、0.5mg/ml和0.27mg/ml，HA-VS和HA-SH的DM分别为约10％，HA-VS与HA-SH之间的摩尔和质量比为1:1。对于样品A5，通过以1:1的DM比和1:1的质量比混合HA-VS和HA-SH来形成水凝胶，组合物中的水凝胶形成聚合物的总浓度C_T约为0.5mg/ml，HA-VS和HA-SH的DM分别约为20％。对于样品A6，通过以1:1的DM比和1:1的质量比混合HA-VS(具有8％的DM)和HA-SH(具有8％的DM)来形成水凝胶，组合物中的水凝胶形成聚合物的总浓度C_T约为0.45mg/ml。对于样品A7，通过以1:1的DM比和1:1的质量比混合HA-VS(具有30％的DM)和HA-SH(具有30％的DM)来形成水凝胶，组合物中的水凝胶形成聚合物的总浓度C_T约为0.4mg/ml。对于样品A8，通过将HA-VS(具有约10％的DM并且为0.6mg/ml)和HA-SH(具有约5％的DM并且为0.3mg/ml)混合来形成水凝胶，C_T约为0.9mg/ml。对于样品A9，通过将HA-VS(具有约15％的DM并且为0.6mg/ml)和HA-SH(具有约10％的DM并且为0.3mg/ml)混合来形成水凝胶，C_T约为0.9mg/ml。

基于实施例1.1中样品B的HA聚合物(平均分子量约为670kDa，特性粘度[η]约为14dL/g)制备HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品B1和B2。对于样品B1和B2，HA聚合物(包括HA-SH和HA-VS两者)的C_T分别约为1.8mg/ml和1.08mg/ml。HA-SH和HA-VS的DM为30％，HA-SH与HA-VS之间的摩尔比和质量比为1:1。

基于实施例1.1中样品C的HA聚合物(平均分子量约为120kDa，特性粘度[η]约为3.7dL/g)制备HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品C1。对于C1样品，HA聚合物(包括HA-SH和HA-VS两者)的C_T约为3.96mg/ml。HA-SH和HA-VS的DM为30％，HA-SH与HA-VS之间的摩尔比和质量比为1:1。

3.2基于HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶的形成

使用HA聚合物(重均分子量约为2.6MDa，特性粘度[η]约为39.2dL/g)的样品A。根据实施例2.2制备HA-SH。通过加入0.5M的PB将HA-SH调节至pH 7.4。PB的最终浓度约为0.02M-0.05M。聚合物的DM约为10％。然后通过加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)将聚合物调节至目标浓度。以约1.7mg/ml的C_T制备HA-SH聚合物-聚合物型水凝胶的样品F。

将聚合物在37℃下孵育至少10小时以形成水凝胶。

3.3聚合物-小分子交联剂型水凝胶的形成

以3:1的摩尔比(DTT:VS)将DTT与HA-VS混合(基于样品A的HA聚合物制备HA-SH)。30分钟后形成水凝胶。将水凝胶针对双去离子水透析2天并收集。HA-VS的重均分子量约为1.9MDa，特性粘度[η]约为24.5dL/g，总聚合物(例如，水凝胶形成聚合物)浓度C_T约为3.8mg/ml。透明质酸-VS的DM为20％。所得HA-SH/DTT水凝胶命名为HA-SH/DTT水凝胶的样品H。

实施例4水凝胶表征

4.1制备的水凝胶样品的模量

(1)测量用水凝胶样品的制备

如实施例3所述混合水凝胶形成聚合物，然后将混合的聚合物均匀地铺在50mm(D)×1mm(H)的模具上。通过用石蜡薄膜覆盖金属板，将模具粘附在金属板上。将带有聚合物的模具放置在潮湿的室内，并使水凝胶能够形成。为了形成水凝胶，将聚合物在37℃下保持24小时。水凝胶(即，基于HA-VS/HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶)形成后，将整个石蜡膜-模具-凝胶组件从金属板分离，并安装在50mm的平板夹具上。然后移除模具，将石蜡膜和形成的水凝胶留在夹具上。然后将石蜡膜牢牢地包裹在底板上。将该装置装载到DMA机器((ARESRheometer,TA Instruments,New Castle,DE)上，并用直径为50mm的平行板测量机械性能。

或者，如实施例3所述混合水凝胶形成聚合物，然后在离心管中于37℃下孵育至少10小时(例如，24小时，除非另有说明)。然后，将形成的水凝胶(即，基于HA-SH/HA-SH聚合物-聚合物型水凝胶)装载到锥板、双间隙或同心圆筒夹具的下板或下桶上，并用AntonPaar流变仪测量机械性能。

(2)基于HA-VS/HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶的模量

根据实施例2.1和2.2对透明质酸聚合物的三个样品(即上述实施例1.1和1.2中描述的样品A、B和C)进行修饰，并且根据实施例3.1将经修饰的聚合物用于形成本公开的水凝胶，根据实施例4.1测量形成的水凝胶。为了确定聚合物是否形成水凝胶而不是保留为聚合物溶液，使用了DMA测量和/或直接观察(以观察样品是否像水一样流动，并且不能安装到DMA机器上)。对于DMA测量，在线性粘弹性区域(LVR区域)与G”值相比更高的G’值(例如，G”/G’<1)被用作水凝胶形成的指示。

结果概括于下表2中。在凝胶的LVR区域测量机械性能。本发明人惊奇地发现，当组合物中水凝胶形成聚合物的特性粘度[η]相对较高(例如，如通过Ubbelohde粘度计所测得的，至少约3dL/g)，并且组合物中水凝胶形成聚合物(例如，HA-SH和HA-SH-)的总浓度C_T相对较低(例如，低于约5mg/ml，诸如1.2、0.8、0.5、1.8、1.08和3.96mg/ml)时，可形成非常软的水凝胶，如通过水凝胶的G’和G”所显示的。G’和G”不超过10.0Pa，G”小于G’，表明水凝胶的形成。

表2.不同水凝胶制剂的凝胶形成

图4显示了根据实施例3.1制备的基于HA-VS/HA-SH聚合物-聚合物型水凝胶的样品A1、A2和A3的模量(使用频率扫描测试)，水凝胶的模量通过具有同心双间隙夹具的AntonPaar MCR502流变仪测量。对于所有测试，应变均为1％。

图5显示了使用具有同心双间隙夹具的Anton Paar MCR502，根据实施例3.1制备的基于HA-SH/HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶的样品A8的模量(使用应变扫描测试)。频率为1rad/s。基于HA-VS/HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶样品A8的C_T为0.9mg/ml，低于5mg/ml。G’和G”都不超过10.0Pa。并且G”小于G’，表明水凝胶的形成。

图6A和图6B显示了使用具有50mm锥板夹具的Anton Paar MCR302，根据实施例3.1制备的基于HA-SH/HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶的样品A9的模量和复数粘度(使用应变和频率扫描测试)。应变扫描测试的频率为5rad/s，频率扫描测试的应变为5％。基于HA-VS/HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶的样品A9的C_T为0.9mg/ml，低于5mg/ml。G’和G”都不超过10.0Pa。并且G”小于G’，表明水凝胶的形成。

(3)HA-SH聚合物-聚合物水凝胶的模量

图7A和图7B示出了根据实施例3.2制备的10％DM的HA-SH聚合物-聚合物型水凝胶的样品F的应变扫描测试和频率扫描测试。在图7中，G’、G”和Eta^*分别指储能模量、损耗模量和复数粘度。使用具有50mm锥形板夹具的Anton Paar MCR 302流变仪测量水凝胶。应变扫描测试以5rad/s测量，频率扫描测试以5％应变测量。HA-SH聚合物-聚合物型水凝胶的样品F的C_T为1.7mg/ml，低于5mg/ml。G’和G”都不超过10.0Pa。并且G”小于G’，表明水凝胶的形成。

(4)HA-SH聚合物-小分子交联剂型水凝胶的模量

图8A和图8B示出了根据实施例3.3制备的HA-SH/DTT水凝胶的样品H的应变扫描测试和频率扫描测试。应变扫描测试以1rad/s测量，频率扫描测试以5％应变测量，其中G’、G”和Eta^*分别指储能模量、损耗模量和复数粘度。HA-SH/DTT水凝胶的样品H的C_T为3.8

mg/ml，低于5mg/ml。G’和G”都不超过10.0Pa。并且G”小于G’，表明水凝胶的形成。

上述结果表明，对于所有测试的水凝胶，储能模量(G’)高于其相应的损耗模量(G”)，并且在频率为约00.1rad/s至约10rad/s的动态振荡剪切测试中，G’的值相对恒定，表明该材料确实是凝胶(即，非常软的固体状交联网络)，而不是粘性溶液。

4.2水凝胶的屈服应变

屈服应变可通过应变扫描测试来估计(图5～8)。例如，图5和图7中的结果显示水凝胶具有相对高的屈服应变(约30％)和低的屈服应力(约0.1至约1Pa)。

4.3挤出本公开的眼睛组合物所需的力

在本实施例中，根据实施例3.1制备的基于HA-SH/HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶的样品A5用于测试挤出本公开的眼睛组合物所需的力。

将商业人工泪液(例如Refresh和Tears Naturale)或本公开的滴眼剂组合物分别装载到Tears Naturale Free 0.6m吹填密封(BFS)一次性使用瓶中。通过Instron 5567 H1540测量将本公开的人工泪液或滴眼剂组合物从瓶中挤出所需的压缩力。压缩测试在100N的负荷下进行。增加力至第一滴从瓶中挤出，此时，立即停止测试。将第二滴和第三滴从各自的瓶中挤出所需的力以相同的方式进行。图9A-图9C分别示出了从瓶中挤出第1滴、第2滴和第3滴RefreshTears Naturale和本公开的滴眼剂组合物所需的力。发现将本公开的滴眼剂组合物从Tears Naturale Free 0.6ml吹填密封(BFS)一次性使用瓶中挤出的挤压力约为7～16N。这些结果表明，挤出本公开内容的滴眼剂组合物所需的挤压力与挤出商业人造泪液所需的挤压力相似。

4.4水凝胶的回收率

(1)应变扫描测试

由于屈服点低，人们可能已经预料到本公开的水凝胶在机械上不稳定。令人惊讶的是，本公开的水凝胶的机械性在破坏之前和之后可以是相似的。在本实施例中，根据实施例3.1制备的基于HA-SH/HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶的样品A3用于通过应变扫描测试来测试水凝胶的回收率。

将基于HA-VS/HA-SH的聚合物-聚合物型水凝胶的样品A3装载到Anton PaarMCR502上的同心双间隙夹具中。在进行0至5000％的应变扫描测试以破坏水凝胶之前和之后，进行时间扫描测试(1％应变和1rad/s)以估计水凝胶的模量。每次测量前，将水凝胶平衡约5分钟。破坏前的G’和G”分别约为0.11Pa和0.02Pa，破坏后分别为0.11Pa和0.05Pa。结果表明，破坏前后的模量基本相同。

(2)通过滴眼剂瓶挤出以模拟真实生活场景

水凝胶还通过滴眼剂瓶挤出进行机械破坏，以模拟真实生活场景。在本实施例中，将来自Nemera的特殊的多剂量滴眼剂瓶(Pureflow 1500)用来呈现更糟糕的情况。与常规瓶子相比，瓶盖的特殊设计具有更长、更曲折和更窄的通道，用于滴眼剂从瓶子流到外面。由于水凝胶的屈服点很低，挤出过程中产生的大变形预计会破坏水凝胶结构。并且在本实施例中使用了以下水凝胶：(1)根据实施例3.1制备的基于HA-VS/HA-SH聚合物-聚合物型水凝胶的样品A3；(2)根据实施例3.1制备的HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶样品的样品E。

为了评价挤出破坏对水凝胶机械性能的影响，将HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶样品的样品A3和样品E从滴眼剂瓶(Pureflow 1500)中逐滴地挤压到双间隙夹具中，并通过Anton Paar流变仪测量机械性能。HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶样品的样品A3和样品E的结果分别如图10A和图10B所示。“挤出前”表示直接测量水凝胶的模量。“挤出后”表示在水凝胶从滴眼剂瓶中挤出后测量水凝胶的模量。结果表明，从瓶中挤出本公开的水凝胶不会显著改变其模量。

4.5水凝胶的复数粘度

如图6-8所示，水凝胶的频率扫描测试表明水凝胶的复数粘度在相对较低的频率下变小(例如，在约10-100rad/s的频率下η^*<0.01)。由于眨眼的剪切速率很高，约在50–1200s^-1(Jossic et al.,The fluid mechanics of shear-thinning tear substitutes,J.Non-Newtonian Fluid Mech.161(2009)1–9)，这些数据表明，根据本公开的实施例制备的水凝胶在施用于眼睛后，将通过眨眼而容易扩散。

实施例5本公开的滴眼剂组合物的角膜前保留

5.1 VS活性染料的合成

通过在本公开的聚合物上标记荧光染料，使本公开的水凝胶发荧光。硫醇修饰的荧光素用作染料实例。在HOBT/HBTU的催化下，通过使氨基荧光素与N-乙酰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸在DMF中反应制得该染料。将产物在乙醚中沉淀3次，并真空干燥。用TFA:H₂O:TIPS(18:1:1)对干燥的产物进行脱保护，持续1小时。将最终产物在乙醚中沉淀，真空干燥，并在4℃下储存。通过质谱测定反应的进程。

5.2荧光染料的缀合

在一个实例中，通过加入1.5M pH 8.8的Tris缓冲液将HA-VS调节至pH 8.8，最终缓冲液浓度为0.15M。用N₂吹扫溶液至少30分钟。然后，将根据实施例5.1制备的或购自GLBiochem(Shanghai)Ltd.的乙烯基砜活性染料(半胱氨酸-赖氨酸二肽，其赖氨酸侧链的氨基与荧光素缀合，并且氨基端基团被酰胺封端，或AC-Cys-Lys(FAM))溶解在Tris缓冲液中，并加入到聚合物中反应12小时。对于低DM(例如DM＝8％)聚合物，染料与VS基团之间的摩尔比可以高达1:1，因为缀合效率不高，并且反应不会覆盖所有的VS基团。在理想情况下，反应后至少80％的VS基团不应被染料覆盖。然后将聚合物针对用HCl调节至pH 4的去离子水透析。纯化的荧光标记聚合物的储存条件与HA-SH的相同然后，将荧光标记的HA-VS与HA-SH混合，并使水凝胶形成水凝胶(如实施例3所述)。

5.3动物制剂

1.5岁的NZW兔用于体内角膜前保留研究。首先通过肌内注射(0.8mL/kg体重)比率为1:1的2％甲苯塞嗪/10％氯胺酮的混合物来麻醉兔子。当实验进行超过1小时时，通过每小时注射0.6mL/kg体重的赛拉嗪/氯胺酮混合物进一步麻醉兔子。

5.4荧光成像系统

如图11所示，成像系统包括激发模块(包括A、B、C和D)和发射检测模块(包括E)。除透镜外，所有组件均购自Edmund Optics Singapore Pte.Ltd.(Singapore)。所有镜片均由Newport Corp(U.S.A.)捐赠。激发模块包括光源(A)，其以可调节的强度水平照射全光谱光(B)，用于光传输的光缆(C)，聚焦透镜，和467-498nm带通滤波器(D)。激发模块发射聚焦的蓝光照亮整个兔眼。467-498nm的波段波长覆盖了FITC的峰值激发波长。发射检测模块(E)包括524-544nm带通滤波器(其覆盖FITC的发射波长)、聚焦透镜和130万像素单色CCD相机。

5.5成像系统的检测范围

单色CCD相机对荧光信号的检测范围有限。太强的信号会使光电传感器饱和，而太弱的信号则无法捕捉。为了最大化检测范围，当发射强度低但仍高于检测限时，使用至少两个激发强度(一个与先前时间点相同，一个更高)来获取图像。该程序可用于扩展检测范围，因为在所有激发强度水平下，发射强度与染料浓度线性相关。图12A～图12C示出了来自成像系统的标准曲线。空心三角形：表示照度(Ii)＝4；空圆圈：Ii＝5；空钻菱形：Ii＝最大值(max)。荧光信号强度被绘制为荧光素浓度的函数。将溶解在0.1M 0.1M PB(磷酸盐缓冲液)中的F-HA-VS(荧光HA-VS，HA-VS的MW为29kDa)用于制备系列稀释液以用于产生标准曲线。将50μL的溶液分配到96孔板中，通过成像系统进行荧光测量。

在实践中，实验通常在照明强度水平4开始，这允许实践者跟踪荧光素信号，直至其减少到其初始荧光强度的约1％。在最大照明强度下，荧光素的检测限为0.01nmol/ml。对于每个实验，t＝0时的荧光信号强度被定义为100％。聚合物随时间推移的清除率以随时间推移的百分比变化的形式表示。基于假设一级消除动力学的曲线拟合来计算T1/10，其为荧光信号下降至其初始荧光强度的十分之一所需的时间量。

5.6水凝胶应用以及荧光信号的检测和定量

通过在预定的光照强度和时间点对眼表面成像来监测荧光素标记的水凝胶的保留。实验是在暗室中进行的。在滴入水凝胶或溶液之前，在照明强度4级、5级和最大下测量每只眼睛的背景荧光。然后，将50μl水凝胶滴入角膜中心。滴入后，用手眨眼睛，将溶液或水凝胶均匀地涂在眼表面。基于荧光信号强度选择合适的照明强度。例如，通常使用照明强度4成像0分钟。当荧光信号在7分钟时较弱时，将图像分别记录在照明强度4级和5级下，而将15分钟的图像记录在照明强度5级和最大值。在每个强度-时间点，使用FlyCapture 2.7(Point Grey Research,Inc.,USA)拍摄36张照片，并随机选择5张进行荧光信号量化。图像由ImageJ1.84v处理。测量包括角膜和结膜在内的整个眼睛的区域平均灰度信号。

在本实施例中，除在水凝胶形成之前在聚合物上标记荧光染料外，使用根据实施例3.1制备的HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品A6。除此以外，两种基于HA的制剂(含有5mg/ml 1500kDa HA的较稠的制剂(HA溶液1)和含有0.4mg/ml 2.6MDa HA的较稀的制剂(HA溶液2))的清除行为也使用当前的成像系统进行了研究。结果如图13所示。如可从图13看出的，HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品A6的清除率明显低于其它人工泪液(例如HA溶液1和HA溶液2)。约35％的HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品A6在5小时后仍保留在角膜前间隙。根据Greaves等人，人工泪液通常显示约30秒的清除半衰期(Greaves等人，A comparison of the precorneal residence of an artificial tearpreparation in patients with keratoconjunctivitis sicca and normal volunteersubjects using gamma scintigraphy,ACTA OPHTHALMOLOGICA,69(1991)432-43)。上述结果表明，本公开的眼用组合物显示出比其它人工泪液或基于HA的制剂更低的清除率。图14A～图14D显示了HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的荧光标记样品A6在不同时间点的代表性图像。持续至少3小时观察到强荧光信号。

实施例6药物从水凝胶中的受控释放

通过在预定的照明强度和时间点对眼表面成像来监测水凝胶中封装的模型药物荧光素的保留。除在水凝胶形成之前加入非反应性荧光素分子外，根据实施例3.1制备HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品A7的非荧光标记水凝胶。进行实验，并根据实施例5测量荧光信号。将保留数据与两个对照组(溶解在PBS和HA溶液(C_T与水凝胶相似)中而不是封装在水凝胶中的荧光素分子)进行比较。图15A～图15I示出了HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品A7的测试结果，图16A～图16D示出了溶解在PBS和HA溶液中的荧光素分子的测试结果。图17显示了HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品A7和溶解在PBS和HA溶液中的荧光素分子的荧光强度。图15显示样品A7的荧光信号在眼睛表面保持至少5小时，而图16显示溶解在PBS和HA溶液中的荧光素的荧光信号在5分钟内在眼表面消失。图15～图17显示，包封在本公开的水凝胶中的小分子相比于溶解在PBS缓冲液或HA的水溶液中的分子表现出更长的药物保留时间。

实施例7体内生物相容性

在啮齿动物(24小时)和兔子(1周)的眼表面上评价本公开的滴眼剂组合物的体内生物相容性。测试结果如图18所示。如图18A～图18B所示，包含HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品A7的滴眼剂组合物被良好耐受。具体来说，角膜和晶状体是透明的，未观察到炎症，也没有检测到眼部不适的迹象。

类似地，在施用包含根据实施例3.1制备的HA-SH/HA-VS聚合物－聚合物型水凝胶的样品A7的滴眼剂组合物之前和之后，目测检查小鼠的眼睛。如图19A～图19D所示，在水凝胶滴注后对眼睛进行长达24小时的监测，未观察到诸如角膜充血或变白的总体反应。

实施例8水凝胶的体外生物相容性

为了评价体外生物相容性，将类似于本公开的水凝胶与眼细胞ARPE19一起孵育，并通过活/死亡测定进行测试。为了挑战生物相容性，用具有29kDa、20％DM的透HA-VS和HA-SH制备水凝胶，HA-VS与和HA-SH之间的质量/摩尔比和体积比为1:1，并且C_T约为15％的浓度。然后将获得的水凝胶与细胞一起孵育1天。所述浓度为动物研究中使用的本公开的浓度的约300倍。发现水凝胶与眼细胞相容，在所有5个重复中有超过99.5％的细胞染色呈活的，如图20A～图20C所示。

实施例9水凝胶在健康受试者中的生物相容性研究

这项研究是由兽医眼科专家进行的。招募5只健康的狗进行研究。使用根据实施例3.1制备的HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品A9。用包含HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶的样品A9的滴眼剂组合物滴注狗，每天两次，一次在早上，一次在晚上，持续6天。滴眼剂组合物的施用量各不相同，分别地，第1-2天为250μl，第3-4天为200μl，第5-6天为80μl。将如图21所示的调查问题分发给宠物主人，用于所测试的滴眼剂组合物方案的主观评估。

调查结果如图22A～图22D所示。发现包含本公开的水凝胶的滴眼剂组合物被狗良好地耐受，并且被宠物主人很好地接受。关于不良事件，一个主人在施用滴眼剂组合物后观察到呈绿色的分泌物，兽医专家确定这与本公开的水凝胶/滴眼剂组合物的施用无关。除此之外，大多数宠物主人还发现很容易从包装中挤出水凝胶。并且所有宠物主人都发现水凝胶可以覆盖大部分眼睛表面。

实施例10滴眼剂组合物的犬临床试验

这项研究是由兽医眼科专家进行的。被诊断患有干眼综合征并在一年多的时间里每天进行4-6次人工泪液联合环孢霉素治疗的狗患者被纳入研究。根据既往环孢素治疗的临床结果，将患者分为两组，环孢素反应组和环孢素无反应组。将两个组都切换到每天两次本公开的滴眼剂水凝胶(由根据实施例3.1制备的HA-SH/HA-VS聚合物-聚合物型水凝胶样品的样品A9组成)与环孢菌素的组合。在研究开始时和正好用水凝胶治疗1个月后，专家对包括睑痉挛、分泌物、角膜染色和Schirmer测试在内的7种临床体征进行了评分。分级标准如表3所示。

表3：研究中使用的分级标准

发现本公开的滴眼剂组合物/水凝胶被所有狗良好地耐受，并被狗主人很好地接受，因为本公开的滴眼剂组合物需要较少的滴注频率，滴注次数从每天6次减少到每天2次。临床结果表明水凝胶能够在测试期期间保持治疗效果(如图23所示)。在图23A-23G中，“之前缓解的(Res before)”是指在施用本公开的滴眼剂组合物之前对环孢菌素有反应的患者。“之后缓解的(Res after)”是指在施用本公开的滴眼剂组合物后对环孢菌素有反应的患者。“之前无(Non before)”是指在施用本公开的滴眼剂组合物之前对环孢菌素无反应的患者。“之后非无(Non after)”是指在施用本公开的滴眼剂组合物之前对环孢菌素无反应的患者。每个患者的分级如图中所示，条带给出了所有患者的平均值。研究发现，至少对一些狗来说，经过1个月的治疗后，临床体征得到了改善。

为了评价新的治疗对细胞水平的影响，利用印迹细胞法(IC)从狗患者中收集结膜细胞。将切成半圆形的滤纸用高压灭菌器灭菌。治疗前和治疗后1个月，将滤纸压在患者结膜上约1秒钟，然后立即在4％多聚甲醛中固定。对收集的细胞的MMP-9(与干眼病相关的炎症标志物)进行免疫化学染色。结果如图24A～图24C所示。“之前无”是指在施用本公开的滴眼剂组合物之前对环孢菌素无反应的患者。“之后无”是指在施用本公开的滴眼剂组合物后对环孢菌素无反应的患者。每名患者的分级如图24A所示，条带显示所有患者的平均值。图24A表明，即使对于对环孢菌素无反应的狗，水凝胶也能轻微降低炎症水平。图24B～图24C显示了一只狗在应用水凝胶1个月之前和之后的细胞(其中细胞核被强荧光信号染色)中炎症标志物(细胞核的强荧光信号周围的弱荧光信号)的染色图像。观察到炎症细胞显著减少。

虽然本文中已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说，显然此类实施方案仅仅是作为实例提供的。本发明不受说明书中提供的具体实例的限制。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但本文中的实施方案的描述和示出并不意味着以限制的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文中阐述的取决于各种条件和变量的具体描述、配置或相对比例。应当理解，在实践本发明时，可以采用本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明也将覆盖任何这样的替代、修改、变化或等同物。下面的权利要求旨在限定本发明的范围，并且这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构由此被覆盖。