一种鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽tyw4及其应用
阅读说明：本技术 一种鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽tyw4及其应用 (Nautilus nautilus hemocyanin derived antibacterial peptide TYW4 and application thereof ) 是由 包永波 袁春 张扬 于 2020-11-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽TYW4及其应用。氨基酸序列如下所示：Arg Val Phe Ala Gly Phe Leu Arg His Gly lle Lys Arg Ser Arg。本发明通过分子改造已有鹦鹉螺血蓝蛋白天然衍生抗菌肽S4,创造出衍生抗菌肽TYW4,对得到的抗菌肽进行抗菌检测,发现其杀菌活力明显提高。衍生抗菌肽TYW4对溶藻弧菌A056及副溶血性弧菌2013V-1174的MIC分别为60μM、100μM,而且具有较好的α螺旋结构。本发明不仅为进一步了解鹦鹉螺免疫防御机制,提高其应用价值奠定了基础,还为研制新型抗菌药物提供了一种新的途径。(The invention discloses a nautilus hemocyanin derived antibacterial peptide TYW4 and application thereof. The amino acid sequence is shown as follows: arg Val Phe Ala Gly Phe Leu Arg His Gly lle Lys Arg Ser Arg. According to the invention, the existing nautilus snail hemocyanin naturally-derived antibacterial peptide S4 is molecularly modified to create derived antibacterial peptide TYW4, and the antibacterial activity of the obtained antibacterial peptide is obviously improved by carrying out antibacterial detection on the obtained antibacterial peptide. The MICs of the derivative antibacterial peptide TYW4 to Vibrio alginolyticus A056 and Vibrio parahaemolyticus 2013V-1174 are respectively 60 mu M and 100 mu M, and the derivative antibacterial peptide has a better alpha helical structure. The invention not only lays a foundation for further understanding the immune defense mechanism of the nautilus and improving the application value of the nautilus, but also provides a new way for developing novel antibacterial drugs.)
技术领域：
本发明属于应用海洋生物技术领域，具体涉及一种鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽及其应用。
背景技术：
鹦鹉螺是一种生活在西太平洋深水中的头足类软体动物，其血蓝蛋白是一个350kDa多肽亚基的环状十聚体，由7个不同功能单位(FU-a到FU-g)组成。鹦鹉螺代表了头足纲中现存的最古老的分支，它们在微生物种类繁多的海洋环境下的生存至今，表明它们的先天免疫系统是有效而强大的。
抗菌肽(AMPs)作为一类分布广泛的小分子多肽，是海洋无脊椎动物先天免疫系统的重要组成部分。在微生物的数量最多可达106个细菌/毫升和109个病毒/毫升的海水中，抗菌肽可利用其广谱抗菌活性帮助海洋无脊椎动物快速识别和杀灭入侵细菌、病毒等病原微生物。近年来有报道称软体动物血蓝蛋白不仅具有输氧功能，还可通过多种方式参与机体免疫防御。
细菌耐药性的出现，说明传统抗生素的效力正在减小，这愈加凸显了研究新型抗菌物的必要性。抗菌肽因其具有广谱活性，种类多，不易产生抗性突变等特点，而被认为在医药、食品等领域有着广阔的应用前景。然而天然抗菌肽与传统抗生素相比，其抗菌活性还不够理想。因此，设计全新抗菌肽或者分子改造已有天然抗菌肽是创造高活力抗菌肽的有效途径。
发明内容
：本发明的第一个目的在于提供一种具有非常好的抗菌作用的鹦鹉螺血蓝蛋白抗菌肽的衍生肽TYW4。
本发明的鹦鹉螺血蓝蛋白抗菌肽的衍生肽TYW4，其氨基酸序列如下所示：
Arg Val Phe Ala Gly Phe Leu Arg His Gly lle Lys Arg Ser Arg，具体如SEQID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供上述鹦鹉螺血蓝蛋白抗菌肽的衍生肽TYW4在制备抗菌药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种抗菌药物，其含有上述鹦鹉螺血蓝蛋白抗菌肽的衍生肽TYW4作为活性成分。
所述的抗菌药物是治疗海洋性细菌感染性疾病药物。
所述的抗菌药物是抗副溶血性弧菌2013V-1174或溶藻弧菌A056的药物。
本发明通过分子改造已有鹦鹉螺血蓝蛋白天然衍生抗菌肽S4，创造出衍生抗菌肽TYW4，对得到的抗菌肽进行抗菌检测，发现其杀菌活力明显提高。衍生抗菌肽TYW4对溶藻弧菌A056及副溶血性弧菌2013V-1174的MIC分别为60μM、100μM，而且具有较好的α螺旋结构。本发明不仅为进一步了解鹦鹉螺免疫防御机制，提高其应用价值奠定了基础，还为研制新型抗菌药物提供了一种新的途径。
附图说明：
图1.抗菌肽S4对溶藻弧菌的抑制作用；
图2.抗菌肽S4对副溶血性弧菌的抑制作用；
图3.抗菌肽TYW4对溶藻弧菌的抑制作用；
图4.抗菌肽TYW4对副溶血性弧菌的抑制作用；
图5.抗菌肽TYW4的三维结构；
图6.抗菌肽S4的3D模型。
具体实施方式
：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明所涉及的菌种：大肠杆菌DH5α、溶藻弧菌A056、副溶血性弧菌2013V-1174均来自中国科学院南海海洋研究所。
本发明所涉及的抗菌肽TYW4、S4都先用无菌水稀释成浓度为0.01mol/L的母液，在进行MIC实验前再稀释成所需浓度梯度的抗菌肽溶液(使用1×PBS稀释)。
实施例1：
结合使用AntiBP Server、CAMP和APD3三个在线软件预测鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽。使用的三个在线软件中的第一个是抗菌肽服务器(AntiBP)(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/antibp/index.html)，它可以结合鹦鹉螺血蓝蛋白序列寻找潜在的AMPs。然后利用抗菌肽收集服务器(CAMP)(http://www.camp.bicnirrh.res.in/)进一步筛选AMPs。最后用抗菌肽计算器和预测仪(APD3)(http://aps.unmc.edu/AP/)对AMPs进行验证，因为APD3可以得到AMPs的两亲性和电荷性。
如下表1所示，总共预测得到1.5～2.0kDa的AMPs 43个。考虑到大量已知的AMPs具有近似α-螺旋的二级构象结构或β-旋转，通过APD3软件预测，选择其中可能具有α-螺旋结构的6个潜在的AMPs(S1、S2、S3、S4、S5和S6)。
表1鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽的预测
续表1
上述6个潜在的AMPs(S1、S2、S3、S4、S5和S6)中进行抗菌活性验证，具体步骤为：
a、先将置于-80℃保存的致病菌(大肠杆菌DH5α、溶藻弧菌A056)分别进行小量活化(用接种环蘸取少量菌液于LB培养基上进行平板划线)，37℃过夜培养后挑取平板上的单菌落于50ml LB液体培养基中，37℃下摇床培养6-8h直至对数生长期。最后置于4℃冰箱中保存。
b、分别取1μL活化后的菌液，再加入1000μL 1×PBS进行稀释(原菌液为105-6CFU/mL)。
c、菌液等体积与不同浓度梯度(0μM、100μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM)的稀释肽(PBS稀释)混合(菌体3μL+稀释肽3μL)，室温下孵育2.5h。孵育结束后，将混合液(菌体3μL+稀释肽3μL)置于LB琼脂(12孔板)上，37℃孵育过夜。孵育结束后对菌落进行计数(以PBS作为阴性对照)。实验一式三份，至少重复三次。实验结果如表2。
表2六个潜在抗菌肽的抑菌效果
注：-表示无抗菌活性
由表2可知，鹦鹉螺血蓝蛋白天然衍生抗菌肽S4对大肠杆菌和溶藻弧菌均有抑制作用，但抑菌效果并不十分理想。
一、抗菌肽S4对溶藻弧菌A056最小抑制浓度(MIC)的测定
(1)分别取1μL活化后的溶藻弧菌A056，再加入1000μL 1×PBS进行稀释(原菌液为105-6CFU/mL)。
(2)稀释后的菌液等体积与不同浓度梯度(0μM、100μM、200μM、250μM、300μM)的抗菌肽S4混合(菌体3μL+稀释肽3μL)，室温下孵育2.5h。孵育结束后，将混合液(菌体3μL+稀释肽3μL)置于LB琼脂(12孔板)上，37℃孵育过夜(10～11h)。孵育结束后对菌落进行计数(以PBS作为阴性对照)。实验一式三份，至少重复三次。实验结果如图1。由图1可知，抗菌肽S4对溶藻弧菌A056最小抑制浓度(MIC)为250μM。
二、抗菌肽S4对副溶血性弧菌2013V-1174最小抑制浓度(MIC)的测定
(1)分别取1μL活化后的副溶血性弧菌2013V-1174，再加入1000μL 1×PBS进行稀释(原菌液为105-6CFU/mL)。
(2)稀释后的菌液等体积与不同浓度梯度(0μM、100μM、125μM、200μM、225μM)的抗菌肽S4混合(菌体3μL+稀释肽3μL)，室温下孵育2.5h。孵育结束后，将混合液(菌体3μL+稀释肽3μL)置于LB琼脂(12孔板)上，37℃孵育过夜(10～11h)。孵育结束后对菌落进行计数(以PBS作为阴性对照)。实验一式三份，至少重复三次。实验结果如图2。由图2可知，抗菌肽S4对副溶血性弧菌2013V-1174最小抑制浓度(MIC)为200μM。
通过SWISSMODEL在线服务器(https://swissmodel.expasy.org/interactive)对抗菌肽S4的氨基酸序列进行三维结构预测，随后在PyMol软件中打开进行编辑，得到抗菌肽S4在鹦鹉螺血蓝蛋白中的位置的3D模型如图6所示。
实施例2：
以鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽S4序列中的β折叠部位氨基酸序列RVFAGF为基础，选用带正电的精氨酸来替换S4的β转角部位中的两个疏水性氨基酸L和A。设计得到了鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽TYW4，其氨基酸序列为：
具体如SEQ ID NO.1所示。
其分子量为1800.13Da，疏水率为40％，带电荷量为+5.25。通过I-TASSER在线服务器(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)进行预测的抗菌肽TYW4三维结构如图5所示。
鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽TYW4委托合肥国肽生物科技有限公司合成，纯度为95％以上。
1、鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽TYW4对溶藻弧菌A056最小抑制浓度(MIC)的测定
(1)分别取1μL活化后的溶藻弧菌A056，再加入1000μL 1×PBS进行稀释(原菌液为105-6CFU/mL)。
(2)稀释后的菌液等体积与不同浓度梯度(0μM、10μM、25μM、30μM、50μM、60μM、70μM)的抗菌肽TYW4混合(菌体3μL+稀释肽3μL)，室温下孵育2.5h。孵育结束后，将混合液(菌体3μL+稀释肽3μL)置于LB琼脂(12孔板)上，37℃孵育过夜(10～11h)。孵育结束后对菌落进行计数(以PBS作为阴性对照)。实验一式六份，至少重复六次。实验结果如图3。
由图3可知，抗菌肽TYW4对溶藻弧菌A056最小抑制浓度(MIC)为60μM。
2、鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽TYW4对副溶血性弧菌2013V-1174最小抑制浓度(MIC)的测定
(1)分别取1μL活化后的副溶血性弧菌2013V-1174，再加入1000μL 1×PBS进行稀释(原菌液为105-6CFU/mL)。
(2)稀释后的菌液等体积与不同浓度梯度(0μM、20μM、30μM、40μM、60μM、80μM、90μM、100μM、110μM)的抗菌肽TYW4混合(菌体3μL+稀释肽3μL)，室温下孵育2.5h。孵育结束后，将混合液(菌体3μL+稀释肽3μL)置于LB琼脂(12孔板)上，37℃孵育过夜(10～11h)。孵育结束后对菌落进行计数(以PBS作为阴性对照)。实验一式六份，至少重复六次。实验结果如图4。
由图4可知，抗菌肽TYW4对副溶血性弧菌2013V-1174最小抑制浓度(MIC)为100μM。
序列表
<110> 浙江万里学院
中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种鹦鹉螺血蓝蛋白衍生抗菌肽TYW4及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Val Phe Ala Gly Phe Leu Arg His Gly Ile Lys Arg Ser Arg
1 5 10 15