一种葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖的检验方法
阅读说明：本技术 一种葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖的检验方法 (Method for detecting residual sugar in fermentation liquor in glucose fermentation lactic acid ) 是由 何志华 贾惠丽 朱明伟 樊永乐 胡佳辉 樊希文 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖的检验方法,涉及乳酸检测方法领域,包括步骤一：提取离心发酵液上清液A；步骤二：稀释上清液A,将步骤一制得的上清液A,进行5-50倍数的稀释,放置入生物传感仪检测葡萄糖浓度；步骤三：滴定实验,参照生物传感仪葡萄糖浓度做滴定；步骤四,浓度计算,当发酵液中还原糖含量≤2.5％时,S＝(V0-V)/0.2×0.1,可大幅度提高葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖含量的准确性和平行性。(The invention discloses a method for detecting residual sugar in fermentation liquor in glucose fermentation lactic acid, which relates to the field of lactic acid detection methods and comprises the following steps: extracting supernatant A of the centrifugal fermentation liquid; step two: diluting the supernatant A, diluting the supernatant A prepared in the step one by 5-50 times, and placing the diluted supernatant A into a biosensor to detect the concentration of glucose; step three: in the titration experiment, the glucose concentration of the biosensor is titrated; and step four, calculating the concentration, wherein when the content of reducing sugar in the fermentation liquor is less than or equal to 2.5%, S is (V0-V)/0.2 multiplied by 0.1, and the accuracy and the parallelism of the content of residual sugar in the fermentation liquor in the glucose fermentation lactic acid can be greatly improved.)
技术领域
本发明涉及乳酸检测方法领域，尤其涉及一种用于检测葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖的方法。
背景技术
乳酸(2-羟基丙酸)是一种化合物，生产方法多为细菌发酵法，发酵法的原料一般是玉米淀粉，甘薯淀粉，大米淀粉，也有纤维素等作为原料，主要途径是糖在乳酸菌作用下调节pH6左右，发酵周期35-40小时，,在乳酸菌发酵产生乳酸的过程中，通过对发酵液中残糖的测定，可以控制最佳发酵结束时间，目前对发酵液中残糖量的测定方法费林定糖法，费林定糖法中费林氏与还原糖反应受溶液酸碱度、加热温度、搅拌力度、蒸发量、滴定速度等因素影响，而且滴定终点的判断受人为因素影响较大，同时发酵液中的色度及酸碱度会影响费林定糖法的终点判读，影响测定结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于解决现有发酵液中残糖量的测定方法不准确的问题，提供一种葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖的检验方法，可大幅度提高葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖含量的准确性和平行性。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案是：
一种葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖的检验方法，包括以下步骤：
步骤一：提取离心发酵液上清液A，待葡萄糖发酵乳酸发酵35h时，取发酵液20ml放入离心机内，在转速为3200～3800r/min的离心条件下，离心4～6min，获得上清液A；离心的目的是因为发酵液较浑浊，直接用发酵液稀释会影响生物传感分析仪的检测结果，更会堵塞管道。
步骤二：稀释上清液A，将步骤一制得的上清液A，进行5-50倍数的稀释，放置入生物传感分析仪检测葡萄糖浓度；因生物传感仪的检测葡萄糖浓度范围在1g/L,稀释在仪器的检测范围才能使得检测结果误差在0.2％以下。
步骤三：滴定实验，参照生物传感仪检测的葡萄糖浓度来做滴定；
1)空白滴定，在干燥的250mL锥形瓶中加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂22mg，用0.05mol/L的EDTA(乙二胺四乙酸二钠)标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定；再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，再预加入1g/L的葡萄糖标准溶液10mL，摇匀置于电炉加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，匀速滴入葡萄糖标准溶液直到由蓝色变成无色，即为滴定终点。要保证整个滴定过程3分钟内完成，记录沸腾前后共耗用1g/L葡萄糖标准溶液的毫升值V0；
2)预备滴定，精密吸取发酵液0.20mL，加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂22mg，用0.05mol/L的EDTA(乙二胺四乙酸二钠)标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定。再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，根据生物传感仪葡萄糖含量的高低预加合适的葡萄糖标准溶液数毫升8mL，摇匀置于电炉上加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，用葡萄糖标准溶液1g/L匀速滴定直到由蓝色变成无色，即为滴定终点。要保证整个滴定过程3分钟内完成，记录沸腾前后共耗用1g/L葡萄糖标准溶液的毫升值Vm做用来正式滴定参考用；
3)正式滴定，精密吸取发酵液0.20mL，加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂20mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定；再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，加入比正式滴定耗用量Vm少1mL的葡萄糖标准溶液，摇匀置于电炉上加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，用葡萄糖标准溶液匀速滴定直到由蓝色变成无色，即为滴定终点。要保证整个滴定过程3分钟内完成，记录沸腾前后共耗用1g/L葡萄糖标准溶液的毫升值V；
步骤四，计算公式。S＝(V0-V)/0.2×0.1；
其中，S--葡萄糖含量，％；V0--空白滴定消耗葡萄糖标准液的毫升数，mL；
V--正式滴定消耗葡萄糖标准液的毫升数，mL；0.2--预加发酵液原液的毫升数，mL。
为了进一步优化本发明，可优先选用以下技术方案：
优选的，所述步骤一中离心转速为3500r/min，离心时间为5min。
优选的，所述步骤二中，样液稀释50被，即用移液管精确吸取上清液2ml，用RO水定容到100ml容量瓶中混匀即可。
优选的，所述步骤三中，钙黄绿素指示剂以重量份数计，由1g钙黄绿素、 100g氯化钠混合研磨而成。
本发明的有益效果是：
1、由于葡萄糖发酵产酸，随着发酵周期的增长滴定发酵液中剩余糖含量时，由于酸存在于发酵液中导致检测样液加热时，样液会溅出，本发明解决了残糖滴定加热过程中样液外溅，防止外溅过程中带来的安全隐患。
2、由于葡萄糖发酵产酸，随着发酵周期的增长，发酵液中酸含量较高导致检测时终点颜色变紫色，后经过本想发明避免了颜色变化问题，残糖终点颜色直接由蓝色变成了无色使得判断更直接。
3、通过数据发明改善首先避免了颜色的判断、样液外溅的影响而导致的检测误差，运用本发明使得数据误差控制范围≤0.1％。
具体实施方式
实施例1：
一种葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖的检验方法，包括以下步骤：
步骤一：提取离心发酵液上清液A，待葡萄糖发酵乳酸发酵35h时，取发酵液20ml放入离心机内，在转速为3500r/min的离心条件下，离心5min，获得上清液A；
步骤二：稀释上清液A，将步骤一制得的上清液A，进行5倍数的稀释，放置入生物传感仪检测葡萄糖浓度；
步骤三：滴定实验，参照生物传感仪葡萄糖浓度做滴定；
1)空白滴定，在干燥的250mL锥形瓶中加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂22mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定；再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，再预加入1g/L的葡萄糖标准溶液10mL，摇匀置于电炉加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，匀速滴入葡萄糖标准溶液至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后共耗用葡萄糖标准溶液的毫升值V0；
2)预备滴定，精密吸取发酵液0.20mL，加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂22mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定。再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，根据生物传感仪葡萄糖含量的高低预加合适的葡萄糖标准溶液数毫升8mL，摇匀置于电炉上加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，用葡萄糖标准溶液1g/L匀速滴定至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后消耗葡萄糖标准溶液的毫升值Vm做正式滴定参考用；
3)正式滴定，精密吸取发酵液0.20mL，加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂20mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定；再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，加入比正式滴定耗用量Vm少1mL的葡萄糖标准溶液，摇匀置于电炉上加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，用葡萄糖标准溶液匀速滴定至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后消耗葡萄糖标准溶液的毫升数V；
步骤四，浓度计算，当发酵液中还原糖含量≤2.5％时，S＝(V0-V)/0.2× 0.1；
其中，S--葡萄糖含量，％；V0--空白滴定消耗葡萄糖标准液的毫升数，mL；
V--正式滴定消耗葡萄糖标准液的毫升数，mL；0.2--预加发酵液原液的毫升数，mL。
实施例2：
一种葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖的检验方法，包括以下步骤：
步骤一：提取离心发酵液上清液A，待葡萄糖发酵乳酸发酵35h时，取发酵液20ml放入离心机内，在转速为3500r/min的离心条件下，离心5min，获得上清液A；
步骤二：稀释上清液A，将步骤一制得的上清液A，进行10倍数的稀释，放置入生物传感仪检测葡萄糖浓度；
步骤三：滴定实验，参照生物传感仪葡萄糖浓度做滴定；
1)空白滴定，在干燥的250mL锥形瓶中加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂22mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定；再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，再预加入1g/L的葡萄糖标准溶液10mL，摇匀置于电炉加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，匀速滴入葡萄糖标准溶液至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后共耗用葡萄糖标准溶液的毫升值V0；
2)预备滴定，精密吸取发酵液0.20mL，加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂22mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定。再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，根据生物传感仪葡萄糖含量的高低预加合适的葡萄糖标准溶液数毫升8mL，摇匀置于电炉上加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，用葡萄糖标准溶液1g/L匀速滴定至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后消耗葡萄糖标准溶液的毫升值Vm做正式滴定参考用；
3)正式滴定，精密吸取发酵液0.20mL，加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂20mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定；再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，加入比正式滴定耗用量Vm少1mL的葡萄糖标准溶液，摇匀置于电炉上加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，用葡萄糖标准溶液匀速滴定至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后消耗葡萄糖标准溶液的毫升数V；
步骤四，浓度计算，当发酵液中还原糖含量≤2.5％时，S＝(V0-V)/0.2× 0.1；
其中，S--葡萄糖含量，％；V0--空白滴定消耗葡萄糖标准液的毫升数，mL；V--正式滴定消耗葡萄糖标准液的毫升数，mL；0.2--预加发酵液原液的毫升数， mL。
实施例3：
一种葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖的检验方法，包括以下步骤：
步骤一：提取离心发酵液上清液A，待葡萄糖发酵乳酸发酵35h时，取发酵液20ml放入离心机内，在转速为3500r/min的离心条件下，离心5min，获得上清液A；
步骤二：稀释上清液A，将步骤一制得的上清液A，进行20倍数的稀释，放置入生物传感仪检测葡萄糖浓度；
步骤三：滴定实验，参照生物传感仪葡萄糖浓度做滴定；
1)空白滴定，在干燥的250mL锥形瓶中加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂22mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定；再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，再预加入1g/L的葡萄糖标准溶液10mL，摇匀置于电炉加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，匀速滴入葡萄糖标准溶液至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后共耗用葡萄糖标准溶液的毫升值V0；
2)预备滴定，精密吸取发酵液0.20mL，加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂22mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定。再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，根据生物传感仪葡萄糖含量的高低预加合适的葡萄糖标准溶液数毫升8mL，摇匀置于电炉上加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，用葡萄糖标准溶液1g/L匀速滴定至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后消耗葡萄糖标准溶液的毫升值Vm做正式滴定参考用；
3)正式滴定，精密吸取发酵液0.20mL，加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂20mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定；再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，加入比正式滴定耗用量Vm少1mL的葡萄糖标准溶液，摇匀置于电炉上加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，用葡萄糖标准溶液匀速滴定至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后消耗葡萄糖标准溶液的毫升数V；
步骤四，浓度计算，当发酵液中还原糖含量≤2.5％时，S＝(V0-V)/0.2× 0.1；
其中，S--葡萄糖含量，％；V0--空白滴定消耗葡萄糖标准液的毫升数，mL； V--正式滴定消耗葡萄糖标准液的毫升数，mL；0.2--预加发酵液原液的毫升数， mL。
实施例4：
一种葡萄糖发酵乳酸中发酵液残糖的检验方法，包括以下步骤：
步骤一：提取离心发酵液上清液A，待葡萄糖发酵乳酸发酵35h时，取发酵液20ml放入离心机内，在转速为3500r/min的离心条件下，离心5min，获得上清液A；
步骤二：稀释上清液A，将步骤一制得的上清液A，进行50倍数的稀释，放置入生物传感仪检测葡萄糖浓度；
步骤三：滴定实验，参照生物传感仪葡萄糖浓度做滴定；
1)空白滴定，在干燥的250mL锥形瓶中加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂22mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定；再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，再预加入1g/L的葡萄糖标准溶液10mL，摇匀置于电炉加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，匀速滴入葡萄糖标准溶液至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后共耗用葡萄糖标准溶液的毫升值V0；
2)预备滴定，精密吸取发酵液0.20mL，加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂22mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定。再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，根据生物传感仪葡萄糖含量的高低预加合适的葡萄糖标准溶液数毫升8mL，摇匀置于电炉上加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，用葡萄糖标准溶液1g/L匀速滴定至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后消耗葡萄糖标准溶液的毫升值Vm做正式滴定参考用；
3)正式滴定，精密吸取发酵液0.20mL，加水10mL、20％KOH试液3mL、钙黄绿素指示剂20mg，用0.05mol/L的EDTA标准滴定溶液滴定，背光观察，当黄绿色荧光转变为橙色时即达终点停止滴定；再精确加入碱性酒石酸铜试剂乙、甲液各5mL，玻璃珠数颗，加入比正式滴定耗用量Vm少1mL的葡萄糖标准溶液，摇匀置于电炉上加热使其在2分钟内沸腾，沸腾30秒后，用葡萄糖标准溶液匀速滴定至紫色消失并保证整个过程3分钟内滴定完毕，记录沸腾前后消耗葡萄糖标准溶液的毫升数V；
步骤四，浓度计算，当发酵液中还原糖含量≤2.5％时，S＝(V0-V)/0.2× 0.1；
其中，S--葡萄糖含量，％；V0--空白滴定消耗葡萄糖标准液的毫升数，mL； V--正式滴定消耗葡萄糖标准液的毫升数，mL；0.2--预加发酵液原液的毫升数， mL。
残糖检测实验：
1.降低实验中因样品加热煮沸带来的样液外溅安全隐患
2.结果判定颜色到达终点后更直接，改善因终点误判造成的数据误差。
3.加标回收率公式及结果如上表所示
加标回收率％＝(加标量结果-试样结果)/加标量*100％
4.结果分析
根据实验结果分析：随着发酵进程，葡萄糖含量慢慢降低，此检测方法检测的结果稳定，加标回收率高，说明此方法检测发酵液葡萄糖可行。
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