一种检测ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用
阅读说明：本技术 一种检测ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用 (Preparation and application of iridium nanocrystalline electrochemical luminescence sensor for detecting I-type procollagen amino-terminal propeptide ) 是由 杜宇 任祥 刘蕾 刘雪静 张诺 魏琴 鞠熀先 于 2020-12-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种检测Ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用,其特征在于,制备一种水溶性好、生物相容性好、电化学发光效率高的铱纳米晶,以抗体标记的铱纳米晶溶液作为信号探针,研制一种无标记型电化学发光免疫传感器,用于多发性骨髓瘤标志物Ⅰ型前胶原氨基端原肽的快速、灵敏检测,检出限为35 fg/mL,线性范围为100 fg/mL-50 ng/mL,具有特异性强、重现性好、信号稳定等优点。(The invention relates to a preparation method and application of an iridium nanocrystalline electrochemical luminescence sensor for detecting I-type procollagen amino-terminal propeptide, which is characterized in that an iridium nanocrystalline with good water solubility, good biocompatibility and high electrochemical luminescence efficiency is prepared, an iridium nanocrystalline solution marked by an antibody is used as a signal probe to develop a label-free electrochemical luminescence immunosensor for the rapid and sensitive detection of the I-type procollagen amino-terminal propeptide serving as a multiple myeloma marker, the detection limit is 35 fg/mL, the linear range is 100 fg/mL-50 ng/mL, and the iridium nanocrystalline electrochemical luminescence immunosensor has the advantages of strong specificity, good reproducibility, stable signal and the like.)
技术领域
本发明属于纳米材料领域与生物传感技术领域。
背景技术
作为一门由生物、化学、医学、电子技术等多种学科相互交叉而兴起的研究热点，电化学发光免疫分析是电化学发光技术与免疫分析方法的有机结合，制得的免疫传感器具有成本低、选择性好、灵敏度高、分析速度快，易于自动化、微型化与集成化等优点，已被广泛应用于疾病标志物分析、食品安全分析、环境污染分析等领域。
多发性骨髓瘤是一种浆细胞克隆性增殖的恶性肿瘤，会造成骨损害，常伴有骨病的表现。由此可见，寻找一种可以用于多发性骨髓瘤诊断及病情监测的血清无创生物学指标至关重要。研究发现进展期患者血清中Ⅰ型前胶原氨基端原肽PINP含量高于缓解期患者，随着治疗的深入，Ⅰ型前胶原氨基端原肽PINP表达水平明显下降，因此可用于多发性骨髓瘤的辅助诊断。然而，与其有关的免疫分析方法鲜有报道。因此，基于电化学发光免疫分析的优越性，发展一种简单、快速、准确的电化学发光免疫传感器用于测定Ⅰ型前胶原氨基端原肽，具有重要的研究意义与临床应用价值。
近年来，磷光过渡金属配合物的设计与合成成为研究热点。铱类配合物作为配合物家族中最大的一类，在有机电致发光器件的研制中有着广泛应用。凭借极高的电化学发光效率，以三[2-(对甲苯基)吡啶-C2,N]合铱Ir(mppy)3为代表的铱配合物在生物分析领域开始受到关注。但是，Ir(mppy)3水溶性差、易团聚、生物相容性差，极大地限制了其在水相免疫分析中的应用。
发明内容
（1）本发明的目的之一是克服以上缺点，制备一种水溶性好、生物相容性好、电化学发光效率高的铱纳米晶，以抗体标记的铱纳米晶溶液作为信号探针，研制一种无标记型电化学发光免疫传感器；
（2）本发明的目的之二是提供所述免疫传感器的用途，用于多发性骨髓瘤标志物Ⅰ型前胶原氨基端原肽浓度的检测，传感器信号响应迅速、灵敏度高，大大缩短了检测时间，节省了人力、物力、财力，检出限为35 fg/mL，线性范围100 fg/mL-50 ng/mL。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1. 一种检测Ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）铱纳米晶溶液的制备
室温下，将质量为10 ~ 20 mg的铱配合物固体溶解于1 ~ 4 mL四氢呋喃中，配置成质量浓度为5 ~10 mg/mL的铱配合物溶液，量取0.5 ~ 1.5 mL、质量浓度为5 ~10 mg/mL的铱配合物溶液逐滴加入到8.4 ~ 9.4 mL、质量浓度为5 ~ 10 mg/mL的蛋白溶液中，在55oC下，持续搅拌2 ~ 4 h后，然后加入0.1 mL、摩尔浓度为0.1 mol/L的碱溶液调节溶液至特定pH，在37 oC下持续搅拌12 ~ 24 h得到深黄色沉淀，通过超滤离心对产物进行分离、纯化，将最终制得的铱纳米晶分散至5 ~ 7 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中保存备用；
所述铱配合物为三[2-(对甲苯基)吡啶-C2,N]合铱Ir(mppy)3；
所述蛋白溶液为牛血清白蛋白BSA溶液；
所述碱液为氢氧化钠溶液；
所述特定pH的数值为12。
（2）抗体标记的铱纳米晶溶液的制备
向1 mL铱纳米晶溶液中加入50 ~ 70 μL的交联剂，500 ~ 700 μL抗体标准溶液（10 μg/mL），于4 °C下孵化12 ~ 24 h，离心分离得到抗体标记的铱纳米晶溶液，置于4 °C下储存备用；
所述交联剂为质量分数30%的戊二醛溶液。
（3）一种铱纳米晶电化学发光免疫传感器的制备步骤
a. 将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
b. 在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为2 ~ 3 mg/mL的抗体标记的铱纳米晶溶液，将其置于37 °C晾干；
c. 滴加3 μL、质量分数为1 ~ 3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
d. 滴加6 μL、浓度为10 μg/mL或未知浓度的多发性骨髓瘤标志物Ⅰ型前胶原氨基端原肽溶液，将其置于37 °C孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，免疫传感器构建完毕；
（4）一种铱纳米晶电化学发光免疫传感器用于多发性骨髓瘤标志物Ⅰ型前胶原氨基端原肽检测，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 1.0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含25 ~ 45 mmol/L 聚乙烯亚胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电化学发光测试，得到孵化不同浓度Ⅰ型前胶原氨基端原肽时对应的电化学发光信号强度，绘制工作曲线（检出限为35 fg/mL，线性范围100 fg/mL - 50 ng/mL）；
（3）对孵化未知浓度Ⅰ型前胶原氨基端原肽实际样品的传感器进行测试，据此根据工作曲线计算即可得到该实际样品中的Ⅰ型前胶原氨基端原肽浓度。
本发明的有益成果
（1）首次制得一种水溶性好、生物相容性好、电化学发光效率高的铱纳米晶，解决了铱配合物在水相中水溶性差、生物相容性差的问题；
（2）以抗体标记的铱纳米晶溶液作为信号探针，研制一种无标记型电化学发光免疫传感器，用于检测多发性骨髓瘤标志物Ⅰ型前胶原氨基端原肽；
（3）弥补了目前Ⅰ型前胶原氨基端原肽现有电化学发光检测方法的空白，在实际样品检测中，该免疫传感器检出限低至35 fg/mL，线性范围宽至100 fg/mL-50 ng/mL；
（4）研制的免疫传感器具有制备简单、易操作、信号响应迅速、重现性好、绿色环保无污染等优点，对血清中Ⅰ型前胶原氨基端原肽特异性强，在多发性骨髓瘤的早期诊断中有着巨大的潜在应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1. 一种检测Ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用，铱纳米晶溶液的步骤如下：
室温下，将质量为10 mg的三[2-(对甲苯基)吡啶-C2,N]合铱Ir(mppy)3固体溶解于1 mL四氢呋喃中，配置成质量浓度为10 mg/mL的Ir(mppy)3溶液，量取0.5 mL、质量浓度为10 mg/mL的Ir(mppy)3溶液逐滴加入到8.4 mL、质量浓度为5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液中，在55 oC下，持续搅拌2 h后，然后加入0.1 mL、摩尔浓度为0.1 mol/L的碱溶液调节溶液至pH 12，在37 oC下持续搅拌12 h得到深黄色沉淀，通过超滤离心对产物进行分离、纯化，将最终制得的铱纳米晶分散至5 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中保存备用。
实施例2. 一种检测Ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用，铱纳米晶溶液的制备步骤如下：
室温下，将质量为15 mg的三[2-(对甲苯基)吡啶-C2,N]合铱Ir(mppy)3固体溶解于2 mL四氢呋喃中，配置成质量浓度为7.5 mg/mL的Ir(mppy)3溶液，量取1 mL、质量浓度为7.5 mg/mL的Ir(mppy)3溶液逐滴加入到8.9 mL、质量浓度为10 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液中，在55 oC下，持续搅拌3 h后，然后加入0.1 mL、摩尔浓度为0.1 mol/L的碱溶液调节溶液至pH 12，在37 oC下持续搅拌18 h得到深黄色沉淀，通过超滤离心对产物进行分离、纯化，将最终制得的铱纳米晶分散至6 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中保存备用。
实施例3. 一种检测Ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用，铱纳米晶溶液的制备步骤如下：
室温下，将质量为20 mg的三[2-(对甲苯基)吡啶-C2,N]合铱Ir(mppy)3固体溶解于4 mL四氢呋喃中，配置成质量浓度为5 mg/mL的Ir(mppy)3溶液，量取1.5 mL、质量浓度为5 mg/mL的Ir(mppy)3溶液逐滴加入到8.4 mL、质量浓度为10 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液中，在55 oC下，持续搅拌4 h后，然后加入0.1 mL、摩尔浓度为0.1 mol/L的碱溶液调节溶液至pH 12，在37 oC下持续搅拌24 h得到深黄色沉淀，通过超滤离心对产物进行分离、纯化，将最终制得的铱纳米晶分散至7 mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中保存备用。
实施例4. 一种检测Ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用，抗体标记的铱纳米晶溶液按以下步骤制备：
取1 mL上述制备的铱纳米晶溶液，向其中加入50 μL、质量分数为30%的戊二醛作为交联剂，然后加入500 μL浓度为10 μg/mL的抗体标准溶液，在4 °C下孵化12 h后，通过离心分离得到抗体标记的铱纳米晶溶液，置于4 °C下储存备用。
实施例5. 一种检测Ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用，抗体标记的铱纳米晶溶液按以下步骤制备：
取1 mL上述制备的铱纳米晶溶液，向其中加入60 μL、质量分数为30%的戊二醛作为交联剂，然后加入600 μL浓度为10 μg/mL的抗体标准溶液，在4 °C下孵化18 h后，通过离心分离得到抗体标记的铱纳米晶溶液，置于4 °C下储存备用。
实施例6. 一种检测Ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用，抗体标记的铱纳米晶溶液按以下步骤制备：
取1 mL上述制备的铱纳米晶溶液，向其中加入70 μL、质量分数为30%的戊二醛作为交联剂，然后加入700 μL浓度为10 μg/mL的抗体标准溶液，在4 °C下孵化24 h后，通过离心分离得到抗体标记的铱纳米晶溶液，置于4 °C下储存备用。
实施例7. 一种检测Ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用，该免疫传感器的制备步骤如下：
a. 将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
b. 在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为2 mg/mL的抗体标记的铱纳米晶溶液，将其置于37 °C晾干；
c. 滴加3 μL、质量分数为1 %的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
d. 滴加6 μL、浓度为10 μg/mL或未知浓度的多发性骨髓瘤标志物Ⅰ型前胶原氨基端原肽溶液，将其置于37 °C孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，免疫传感器构建完毕。
实施例8. 一种检测Ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用，该免疫传感器的制备步骤如下：
a. 将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
b. 在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为3 mg/mL的抗体标记的铱纳米晶溶液，将其置于37 °C晾干；
c. 滴加3 μL、质量分数为2 %的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
d. 滴加6 μL、浓度为10 μg/mL或未知浓度的多发性骨髓瘤标志物Ⅰ型前胶原氨基端原肽溶液，将其置于37 °C孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，免疫传感器构建完毕。
实施例9. 一种检测Ⅰ型前胶原氨基端原肽铱纳米晶电化学发光传感器的制备及应用，该免疫传感器的制备步骤如下：
a. 将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
b. 在玻碳电极表面滴涂6 μL、浓度为4 mg/mL的抗体标记的铱纳米晶溶液，将其置于37 °C晾干；
c. 滴加3 μL、质量分数为3 %的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，将其置于4 °C晾干；
d. 滴加6 μL、浓度为10 μg/mL或未知浓度的多发性骨髓瘤标志物Ⅰ型前胶原氨基端原肽溶液，将其置于37 °C孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，免疫传感器构建完毕。
实施例10. 一种铱纳米晶电化学发光免疫传感器用于多发性骨髓瘤标志物Ⅰ型前胶原氨基端原肽，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 1.0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含25 mmol/L聚乙烯亚胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电化学发光测试，得到孵化不同浓度Ⅰ型前胶原氨基端原肽时对应的电化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为35 fg/mL，线性范围100 fg/mL - 50 ng/mL；
（3）对孵化未知浓度Ⅰ型前胶原氨基端原肽实际样品的传感器进行测试，据此根据工作曲线计算即可得到该实际样品中的Ⅰ型前胶原氨基端原肽浓度。
实施例11. 一种铱纳米晶电化学发光免疫传感器用于多发性骨髓瘤标志物Ⅰ型前胶原氨基端原肽，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 1.0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含35 mmol/L 聚乙烯亚胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电化学发光测试，得到孵化不同浓度Ⅰ型前胶原氨基端原肽时对应的电化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为35 fg/mL，线性范围100 fg/mL - 50 ng/mL；
（3）对孵化未知浓度Ⅰ型前胶原氨基端原肽实际样品的传感器进行测试，据此根据工作曲线计算即可得到该实际样品中的Ⅰ型前胶原氨基端原肽浓度。
实施例12. 一种铱纳米晶电化学发光免疫传感器用于多发性骨髓瘤标志物Ⅰ型前胶原氨基端原肽，操作步骤如下：
（1）参数设置：超微弱电化学发光仪的光电倍增管高压设置为800 V，电化学工作站循环伏安扫描电位范围设置为0 ~ 1.0 V，扫描速率设置为0.1 V/s；
（2）测试：以银/氯化银电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，以上述方法制备的传感器为工作电极，在10 mL含45 mmol/L 聚乙烯亚胺的磷酸盐缓冲溶液中进行电化学发光测试，得到孵化不同浓度Ⅰ型前胶原氨基端原肽时对应的电化学发光信号强度，绘制工作曲线，其检出限为35 fg/mL，线性范围100 fg/mL - 50 ng/mL；
（3）对孵化未知浓度Ⅰ型前胶原氨基端原肽实际样品的传感器进行测试，据此根据工作曲线计算即可得到该实际样品中的Ⅰ型前胶原氨基端原肽浓度。