一种獐芽菜提取物及其在制备抗抑郁药物中的应用
阅读说明：本技术 一种獐芽菜提取物及其在制备抗抑郁药物中的应用 (Swertia extract and application thereof in preparation of antidepressant drugs ) 是由 师新伟 孙洪发 于 2021-02-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种獐芽菜提取物,其制备方法包括以下步骤：S1：阴干、切碎或粉碎；S2：提取；S3：浓缩,脱脂,柱层析分离,收集洗脱液；S4：浓缩,蒸干有机溶剂,干燥,粉碎,即得獐芽菜提取物。体外药效实验结果显示本发明所提供的獐牙菜提取物对SH-SY5Y细胞具有很好的保护作用,细胞存活率达84.7%,证明其具有显著的抗抑郁作用,动物试验结果显示本发明提供的獐芽菜提取物能明显缓解小鼠“行为绝望”状态,减少其悬浮不动次数以及缩短悬尾不动时间,对于缓解抑郁情绪具有明显的作用。本发明提供的獐牙菜提取物具有很高的抗抑郁活性,可应用于制备抗抑郁药物。(The invention discloses a swertia herb extract, and a preparation method thereof comprises the following steps: s1: drying in the shade, cutting or pulverizing; s2: extracting; s3: concentrating, degreasing, separating by column chromatography, and collecting eluent; s4: concentrating, evaporating organic solvent, drying, and pulverizing to obtain herba Swertiae Bimaculatae extract. The results of in-vitro pharmacodynamic experiments show that the swertia extract provided by the invention has a good protection effect on SH-SY5Y cells, the survival rate of the cells reaches 84.7%, and the swertia extract is proved to have a remarkable anti-depression effect, and the results of animal experiments show that the swertia extract provided by the invention can remarkably relieve the behavior despair state of mice, reduce the suspension immobility times and shorten the suspension immobility time, and has a remarkable effect on relieving depression mood. The swertia extract provided by the invention has high anti-depression activity and can be applied to preparation of anti-depression drugs.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种獐芽菜提取物及其在制备抗抑郁药物中的应用。
背景技术
獐芽菜类药用植物，藏名为“滴达”，是一年生的龙胆科矮小草本药用植物，藏医药书《四部医典》记载：有清热、解毒，清肝利胆的功效。现代药理学证明藏茵陈拥有各种药理活性，包括抗肝脏损伤、抗抑郁、抗结核、抗肿瘤、退黄利胆、抗突变、抗炎、抗病毒、抗氧化、利尿降糖和强心作用。獐芽菜还可以促进小肠运动的作用；调节内分泌或者影响性功能；促进毛发生长，提高皮肤功能；可以代谢人类的肠道细菌；同时对于赤巴病也有很好的疗效。
抑郁症又称抑郁障碍，是一种常见的心境障碍性病症，严重危害人们的身心健康。临床可见心境低落与其处境不相称，情绪的消沉可以从闷闷不乐到悲痛欲绝，自卑抑郁，甚至悲观厌世，可有自杀企图或行为；部分患者在某一时期可出现睡眠障碍，因此有效的防治睡眠障碍对于抑郁情绪的缓解和改善具有重要意义。抑郁症的发病机制错综复杂，涉及的病因有很多种，劳累、饮食不节、精神因素等，均可导致植物神经功能紊乱，胃肠动力紊乱，胃肠激素异常及原发和继发性功能性肠腹泻。现代医学多采用促胃肠动力药，效果不甚理想，近年来中医药在治疗此病方面取得了丰富的经验和较好的疗效，中药已经成为治疗抑郁症的一个新的研究方向和目标。SH-SY5Y细胞（神经母细胞瘤细胞）在治疗抗抑郁、帕金森病等神经系统疾病研究方面应用较为普遍，SH-SY5Y细胞氧化损伤模型常用于抗抑郁药物的筛选研究。
目前治疗抑郁症的药物发展很快，已有许多疗效好、安全度高、使用方便的化学药物问世，但化学药物在治疗抑郁症上普遍存在抗抑郁谱窄、不良反应大、易复发等缺点，如三环类抗抑郁经典代表药——米帕明用药会出现口干，扩瞳，视力模糊，便秘，排尿困难，心动过速、甚至还会出现直立性低血压等副作用。因此，来自天然的植物抗抑郁药物引起了人们的关注。目前中国专利CN 110772564 A已公开一种具有调节抑郁情绪作用的中药提取物组合物及其制备方法和中药制剂。以重量份计，该组合物由下述中药提取物组成：贯叶连翘提取物40~80份，刺五加提取物10~40份，牡丹皮提取物2~20份，该中药提取物组合物对于缓解抑郁情绪具有明显的作用，是一种安全、有效的膳食补充剂。同时还具有助睡眠等作用。中国专利CN1381242A已公开了一种治疗抑郁症的中药药物，该药物的成分为贯叶连翘与刺五加。中国专利CN102670752A公开了一种牡丹皮提取物在制备治疗抑郁症药物中的应用。目前未见以藏药“獐芽菜”提取物用于抗抑郁的报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种獐芽菜提取物及其在制备抗抑郁药物中的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
本发明提供一种獐芽菜提取物，其制备方法包括以下步骤：
S1、将獐芽菜药材阴干，切碎或粉碎，得到獐芽菜寸断或粗粉；
S2、采用乙醇浸渍提取、酸性乙醇浸渍提取或先用稀盐酸溶液浸渍、再用乙醇浸渍提取三种方法中任一种对得到的獐芽菜寸断或粗粉进行提取，得提取液；
S3、将提取液进行浓缩，用有机溶剂脱脂后，进行柱层析分离，收集洗脱液；
S4、将洗脱液进行浓缩，蒸干有机溶剂，干燥、粉碎，即得獐芽菜提取物。
进一步地，步骤S2中采用乙醇浸渍提取的具体操作为：将得到的獐芽菜寸断或粗粉加入到乙醇中浸渍，然后将溶液回流数次，合并提取液；其中，所使用的乙醇的体积为固体体积的6~12倍，体积浓度为70%，浸渍时间为1~6 h；乙醇浸渍液回流的温度为80℃，提取的次数为1~3次，每次提取的时间为1~4 h；
进一步地，步骤S2中采用酸性乙醇浸渍提取的具体操作为：将獐芽菜寸断或粗粉加入酸性乙醇中浸渍，然后将溶液回流数次，合并提取液，用碱调制至中性；其中，所使用的酸性乙醇的pH为1~2，体积为固体体积的6~12倍，体积浓度为50%，浸渍时间为1~6 h；酸性乙醇浸渍液回流的温度为80 ℃，提取的次数为1~3次，每次提取的时间为1~4 h；
进一步地，步骤S2中先用稀盐酸溶液浸渍、再用乙醇浸渍提取的的具体操作为：将獐芽菜寸断或粗粉加入稀盐酸溶液中浸渍，然后将溶液回流数次，弃去稀盐酸溶液提取液，再加入乙醇浸渍，然后将溶液回流数次，合并提取液；其中，所使用的稀盐酸溶液的pH为1~2，体积为固体体积的6~12倍，浓度为3~4wt%，浸渍时间为1~6 h；稀盐酸浸渍液回流的温度为80~100℃，提取的次数为1~3次，每次提取的时间为1~4 h；所使用的乙醇的体积为固体体积的6~12倍，体积浓度为70%，浸渍时间为1~6 h；乙醇浸渍液回流的温度为80℃，提取的次数为1~3次，每次提取的时间为1~4 h。
进一步地，步骤S2中采用酸性乙醇浸渍提取的具体操作中所述碱为饱和烧碱或纯碱溶液。
进一步地，步骤S3的一种具体操作为：将提取液浓缩成浓度为0.5~3.5 g/mL药液，柱层析选择的填料为大孔吸附树脂，选择湿法上柱，在进行洗脱时先用水冲洗1~6 BV柱体积除杂，再用体积浓度为30~90%的乙醇溶液洗脱1~12 BV柱体积，收集洗脱液。
进一步地，步骤S3的另一种具体操作为：将提取液浓缩成浓度为0.5~3.5 g/mL药液，柱层析选择的填料为硅胶，选择干法上柱，在进行洗脱时依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇以及水或按溶剂极性依次配制极性递增的混合溶剂洗脱，收集二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮洗脱部分或混合溶剂洗脱部分。
进一步地，步骤S3中脱脂选用的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一种。
本发明提供的獐芽菜提取物在制备抗抑郁药物方面的应用。
本发明还提供了一种抗抑郁药物制剂，其包含所述獐芽菜提取物和药学上可接受的药物载体或辅料。
进一步地，所述药用载体包括但不局限于：氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，甘油，山梨酯，山梨酸钾，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛酯。
进一步地，所述药物制剂的剂型不限，可以是液体剂型、固体剂型、外用制剂，并以单位剂量形式给药，獐芽菜提取物在药物制剂中的重量含量不低于50%。
进一步地，所述的药物剂型包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂。
本发明所述所述獐芽菜是一年生的龙胆科獐芽菜属草本药用植物，即抱茎獐牙菜（S．franchetiana）、川西獐牙菜（S．mussotii）、、黄花獐牙菜、（S.kingii）四数獐牙菜（S． tetraptera）、印度獐牙菜（S．cliralyita）、普兰獐牙菜（S．purpurascens）、藏獐牙菜（S． racemosa）、红直獐牙菜（S．erythrosticta）、祁连獐牙菜（S．przewalskii）、显脉獐牙菜（S． nervosa）、大籽獐牙菜（S．macrosperma）、狭叶獐牙菜（S．angustifolin）、美丽獐牙菜（S． angustifolia）、轮叶獐芽菜（S. verticillifolia）,二叶獐芽菜（S. bifalia），毛萼獐芽菜（S. purprascens），当药（S．diluta）等。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
（1）本发明提供的獐芽菜提取物，其制备方法步骤简单，所用溶剂毒性更低，通过浸渍加回流的方式，得到的提取物中有效成分含量更高，先经脱脂操作后再进行柱层析分离，脱脂能够直接将一部分非目标产物分离除去，方便后续操作。
（2）本发明提供的獐芽菜提取物，通过体外药效实验证明其对SH-SY5Y细胞具有很好的保护作用，细胞存活率达84.7%，证明本发明的獐芽菜提取物具有显著的抗抑郁作用，为抗抑郁方面的新药开发奠定基础。
（3）本发明提供的獐芽菜提取物能明显缓解小鼠“行为绝望”状态，减少其悬浮不动次数以及缩短悬尾不动时间；与现有技术相比，本发明的獐芽菜提取物或制剂对于缓解抑郁情绪具有明显的作用；此外，本发明提取物及其制剂还具有疏肝利胆等作用，副作用小、无依赖性，服用剂量较少，可制成多种剂型，适合广泛推广。
附图说明
图1獐芽菜提取物对小鼠强迫游泳实验中悬浮不动次数的影响。
图2獐芽菜提取物对小鼠悬尾实验中悬尾不动时间的影响。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例进行详细描述。
除非另行定义，本发明所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。
实施例1
将獐芽菜药材阴干，切碎，得到獐芽菜寸断；准确称取獐芽菜寸断10 g加入到100mL的乙醇（体积浓度70%）中浸渍4 h，浸渍结束后将浸渍液在80 ℃下回流4 h，共回流3次，然后合并提取液；将提取液进行浓缩，浓缩成浓度为1.5 g/mL药液，然后用石油醚对浓缩液进行脱脂，之后使用大孔吸附树脂进行柱层析分离，选择湿法上柱，在进行洗脱时先用水冲洗1~6 BV柱体积除杂，再用体积浓度为30~90%的乙醇溶液洗脱1~12 BV柱体积，收集洗脱液；将洗脱液进行浓缩，蒸干有机溶剂，干燥、粉碎，即得獐芽菜提取物共1.1 g。
实施例2
将獐芽菜药材阴干，粉碎，得到獐芽菜粗粉（40~60目）；准确称取獐芽菜粗粉10 g加入到100 mL的乙醇（体积浓度70%）中浸渍6 h，浸渍结束后将浸渍液在100 ℃下回流2 h，共回流3次，然后合并提取液；将提取液进行浓缩，浓缩成浓度为1.0 g/mL药液，然后用乙酸乙酯对浓缩液进行脱脂，之后使用硅胶进行柱层析分离，选择干法上柱，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇以及水洗脱，收集二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮洗脱部分的洗脱液；将洗脱液进行浓缩，蒸干有机溶剂，干燥、粉碎，即得獐芽菜提取物共2.3 g。
实施例3
将獐芽菜药材阴干，粉碎，得到獐芽菜粗粉（40~60目）；准确称取獐芽菜粗粉10 g加入到100 mL的乙醇（体积浓度70%）中浸渍2 h，浸渍结束后将浸渍液在120℃下回流1 h，共回流3次，然后合并提取液；将提取液进行浓缩，浓缩成浓度为0.5 g/mL药液，然后用乙酸乙酯对浓缩液进行脱脂，之后使用大孔吸附树脂进行柱层析分离，选择湿法上柱，在进行洗脱时先用水冲洗1~6 BV柱体积除杂，再用体积浓度为30~90%的乙醇溶液洗脱1~12 BV柱体积，收集洗脱液；将洗脱液进行浓缩，蒸干有机溶剂，干燥、粉碎，即得獐芽菜提取物共0.68g。
实施例4
将獐芽菜药材阴干，切碎，得到獐芽菜粗粉寸断；准确称取獐芽菜粗粉10 g加入到100 mL的稀盐酸（浓度为3~4wt%）中浸渍4 h，浸渍结束后将浸渍液在80 ℃下回流4 h，共回流3次，弃去稀盐酸提取液；再加入100 mL的乙醇（体积浓度70%）中浸渍2 h，浸渍结束后将浸渍液在120℃下回流1 h，共回流3次，然后合并提取液；将提取液进行浓缩，浓缩成浓度为2.5g/mL药液，然后用乙酸乙酯对浓缩液进行脱脂，之后使用大孔吸附树脂进行柱层析分离，选择湿法上柱，在进行洗脱时先用水冲洗1~6 BV柱体积除杂，再用体积浓度为30~90%的乙醇溶液洗脱1~12 BV柱体积，收集洗脱液；将洗脱液进行浓缩，蒸干有机溶剂，干燥、粉碎，即得獐芽菜提取物共1.3 g。
实施例5
将獐芽菜药材阴干，粉碎，得到獐芽菜粗粉（40~60目）；准确称取獐芽菜粗粉10 g加入到100 mL的酸性乙醇（pH=1，体积浓度为50%）中浸渍6 h，浸渍结束后将浸渍液在80 ℃下回流2 h，共回流3次，然后合并提取液；用饱和烧碱或纯碱溶液调制提取液酸碱度为中性，将提取液进行浓缩，浓缩成浓度为3.0g/mL药液，然后用石油醚对浓缩液进行脱脂，之后使用硅胶进行柱层析分离，选择湿法上柱，选择干法上柱，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇以及水洗脱，收集二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮洗脱部分的洗脱液；将洗脱液进行浓缩，蒸干有机溶剂，干燥、粉碎，即得獐芽菜提取物共2.5g。
实施例6
将獐芽菜药材阴干，切碎或粉碎，得到獐芽菜粗粉（40~60目）；准确称取獐芽菜粗粉10 g加入到100 mL的稀盐酸（浓度为3~4wt%）中浸渍2 h，浸渍结束后将浸渍液在100℃下回流1 h，共回流3次，弃去稀盐酸提取液；再加入到100 mL的乙醇（体积浓度70%）中浸渍2h，浸渍结束后将浸渍液在120℃下回流1 h，共回流3次，然后合并提取液；将提取液进行浓缩，浓缩成浓度为2.5g/mL药液，然后用二氯甲烷对浓缩液进行脱脂，之后使用大孔吸附树脂进行柱层析分离，湿法上柱，选择湿法上柱，在进行洗脱时先用水冲洗1~6 BV柱体积除杂，再用体积浓度为30~90%的乙醇溶液洗脱1~12 BV柱体积，收集洗脱液；将洗脱液进行浓缩，蒸干有机溶剂，干燥、粉碎，即得獐芽菜提取物共1.79 g。
体外试验
取对数生长期、生长状态良好的SH-SY5Y细胞，经PBS清洗，用0.25%胰蛋白酶消化，待细胞趋于变圆，用含15%进口胎牛血清的DMEM培养液冲洗吹打细胞，制成单细胞悬液。以每毫升1×105个细胞接种于96孔培养板中，每孔100 µL（除空白调零孔外），将培养板置于CO2培养箱中继续培养，24 h后模型组和给药组加入含H2O2（终浓度为100 µmol▪L-1）的PBS溶液，构建氧化损伤抑郁模型，空白对照组加入无H2O2的PBS溶液，造模2 h后空白对照组和模型组加入10%血清的培养基100 µL培养，各给药组分别加入10 %血清的含药培养基100 µL。设空白调零组（只加培养基，用于酶标仪调零）、空白对照组、模型组（只加细胞）和给药组（獐牙菜提取物40 mg/mL），设5个复孔。在37℃、5%CO2培养箱中继续培养24h后，每孔吸取细胞上清液50 µL，置-20℃保存，留作测试剂盒用，每孔补加50 µL培养液，继续培养3 h，每孔加入20 µL（5 mg/mL）MTT，继续培养4 h后吸净孔内上清液，每孔加入150 µL DMSO用酶标仪振荡10min，使紫色结晶完全溶解，在492 nm处，测定吸光度（OD）值。结果如表1所示。其中细胞存活率=OD试验组/OD空白对照组×100%。
表1. 各组细胞存活率
组别
OD<sub>492</sub>
细胞存活率（%）
空白对照组
1.37
-
模型组
0.61
44.5
实验组
1.16
84.7
动物试验
试验方法：取小鼠60只，6只一笼，自由饮食饮水，饲养于光线及温湿度控制房间内：温度21±2℃，湿度50±10%，12h/12h明暗周期，所有动物实验操作比照NIH颁布实验动物福利及使用指导原则进行。小鼠适应一周进入实验，每组12只，按照随机区组设计方法分为5组：正常对照组(Control)，氟西汀组(FXT)，獐芽菜提取物小剂量组(TUW-L)，獐芽菜提取物中剂量组(TUW-M)，獐芽菜提取物高剂量组(TUW-H)。正常组灌胃同体积纯净水，其他各组灌胃剂量见结果表格部分说明，每天上午固定时间对小鼠实施灌胃，灌胃体积为0.1mL▪10g-1，给药持续一个月，最后一次灌胃后1h进行行为测定。
（1）小鼠强迫游泳实验
强迫游泳时将所有动物分别放入含23±1 ℃，20cm深水的有机玻璃圆筒中，15min后，将其转移至30℃干燥环境30min（预实验），24h后小鼠被再次放入有机玻璃圆筒内5min（正式实验），这期间用摄像机记录，做完一只小鼠后换水，清洁圆筒。用SMART3.0软件记录悬浮不动次数和悬浮不动潜伏期（表2），结果如图1所示。
表2. 獐牙菜提取物对小鼠强迫游泳实验中悬浮不动次数的影响（x±S.D.）
组别
剂量（mg/kg）
悬浮不动次数
对照组
0
71.27±2.16
氟西汀组
20
57.48±1.15
提取物低剂量组
20
64.13±1.24
提取物中剂量组
40
60.25±0.83
提取物高剂量组
80
58.56±0.79
（2）悬尾实验
悬尾实验时用医用胶带将小鼠尾尖部1/3处悬于悬尾装置上，悬挂处于竖直状态，使其头部正对镜头，离地面约30 cm，摄像记录各组小鼠悬尾实验不动时间，持续6 min，取后4 min计算小鼠悬尾不动时间。不动时间判断为小鼠停止挣扎，呈倒悬垂状态，静止不动（表3），结果如图2所示。
表3. 獐牙菜提取物对小鼠悬尾实验中悬尾不动时间的影响（x±S.D.）
组别
剂量（mg/kg）
悬尾不动时间
对照组
0
80.73±1.62
氟西汀组
20
61.28±1.33
提取物低剂量组
20
64.47±2.28
提取物中剂量组
40
63.86±1.42
提取物高剂量组
80
60.62±0.95
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。