阅读说明：本技术 一种响应面法优化超声提取线叶龙胆中多指标性成分的方法 (Method for optimizing ultrasonic extraction of multi-index components in gentiana lineata by response surface method ) 是由 林丽 晋玲 郑贵森 陈红刚 高素芳 赵凌豪 王国劳 刘立 赵文龙 王振恒 崔治家 于 2019-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种响应面法优化超声提取线叶龙胆中多指标性成分的方法,包括步骤：A、粉碎线叶龙胆全草；B、粉末放入锥形瓶中,以固液比为20-60:1的比例加入水、无水乙醇、甲醇、50％-75％甲醇；C、常温下超声提取10-50min,得提取液；D、提取液3000r/s下离心20min,得到含有多指标性成分的上清液。本发明优化得到提取线叶龙胆中多指标性成分的最佳提取溶剂为甲醇,溶液浓度为60％,提取时间为40min,溶剂体积为15mL,固液比30:1。本发明实现一次性提取线叶龙胆多种指标性成分的目的,具有精度和效率高的优点,可用于线叶龙胆质量的综合评价,并为线叶龙胆的综合利用、开发提供依据。(The invention discloses a method for optimizing and extracting multi-index components in gentiana lineata by a response surface method, which comprises the following steps: A. pulverizing whole plant of Gentiana scabra Bunge; B. putting the powder into a conical flask, and adding water, absolute ethyl alcohol, methanol and 50-75% methanol according to the solid-to-liquid ratio of 20-60: 1; C. ultrasonic extracting at room temperature for 10-50min to obtain extractive solution; D. centrifuging the extractive solution at 3000r/s for 20min to obtain supernatant containing multiple index components. The optimal extraction solvent for extracting the multi-index components in the gentiana straminea maxim is methanol, the concentration of the solution is 60%, the extraction time is 40min, the volume of the solvent is 15mL, and the solid-to-liquid ratio is 30: 1. The method realizes the purpose of extracting multiple index components of the gentiana straminea at one time, has the advantages of high precision and efficiency, can be used for comprehensively evaluating the quality of the gentiana straminea, and provides a basis for comprehensive utilization and development of the gentiana straminea.)

一种响应面法优化超声提取线叶龙胆中多指标性成分的方法

技术领域

本发明属于植物成分提取技术领域，具体涉及一种响应面法优化超声提取线叶龙胆中多指标性成分的方法。

背景技术

龙胆属隶属于龙胆目Gentianales龙胆科Gentianceae，全世界大约有400余种，广布全球，主产北温带以及热带高山地区。我国有22属，大约500多种，其中共有12属70多种供药用。龙胆属为年生或多年生草本。在龙胆科中该属的植物种类最多，龙胆属植物可供观赏、医药等多种用途，且多为传统藏药。藏药“榜间”是龙胆属多种药用植物的总称，是具有代表性的常用大宗藏药材，具有治毒病，各种热症，喉炎热闭的功效，疗效确切，运用广泛。

线叶龙胆(学名:Gentiana farreri Balf.f.)又称蓝花龙胆、“榜间恩保”、“龙胆花”，分布于中国大陆的四川、西藏、甘肃、青海等地，生长于海拔2，410米至4，600米的地区，叶小，花淡蓝色，多生长在灌丛中、高山草甸以及沼泽草滩。“榜间”来源于龙胆科龙胆属多种药用植物，是具有代表性的常用大宗藏药材，功效为治毒病，各种热症，喉炎热闭。目前，10余家藏药企业拥有14个国药准字号的藏药复方制剂，分别是十味龙胆花颗粒(胶囊)、三味龙胆花片丸、十五味龙胆花丸(散)；“龙胆花”商品药材在青海、四川、西藏、甘肃等地药材市场和土特产门市出售，是内地最常用的藏药材之一。然则就功效来看“榜间”分类不同其功效有异，“榜间恩保”性偏凉，就使用现状看，“榜间”基原品种复杂，有相互替代使用的情况。

线叶龙胆经研究发现全草中主要成分有裂环环烯醚萜苷类、黄酮类及三萜类等。

响应面设计是一种有效的统计和优化方法，与传统的均匀设计与正交设计相比，响应面法具有试验精度高、试验次数少、数学模型预测性好等优点，且能反映各因素与响应值之间的关系。

发明内容

本发明的目的是提供一种响应面法优化超声提取线叶龙胆中多指标性成分的方法，对线叶龙胆多指标性成分提取工艺进行优化，为线叶龙胆药材中多指标性成分分析提供研究基础。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种响应面法优化超声提取线叶龙胆中多指标性成分的方法，包括如下步骤：

A、将线叶龙胆全草粉碎成粉末，过60目药筛，备用；

B、将粉末放入锥形瓶中，以固液比为20-60:1的比例加入水、无水乙醇、甲醇、50％-75％甲醇；

C、常温下超声提取10-50min，得提取液；

D、提取液3000r/s下离心20min，得到含有多指标性成分的上清液。

利用响应面法优化得到提取线叶龙胆中多指标性成分的最佳提取溶剂为甲醇，溶液浓度为60％，提取时间为40min，溶剂体积为15mL，固液比30:1。

所述指标性成分包括马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6'-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、异荭草苷、异牡荆苷、熊果酸和齐墩果酸。

响应面法优化超声提取线叶龙胆中多指标性成分的方法，所述响应面法的步骤如下：

(1)单因素筛选：分别按溶剂浓度、溶剂体积和提取时间三个单因素设计单因素试验；

(2)响应面法设计：以线叶龙胆中指标性成分的紫外吸收值为响应值，运用Design-Expert软件在步骤(1)中单因素筛选的基础上进行二次响应面回归分析实验，得到模拟方程和决定系数如下：

马钱苷酸的模拟方程为：

y＝4.76-0.55*A-0.069*B+0.062*C+0.0218AB-0.049*AC+6.864*BC-0.29*A²+0.13*B²+0.16*C²，决定系数R²＝0.997；

獐牙菜苦苷的模拟方程为：

y＝4.82-0.3*A-0.04*B+0.051*C+4.65AB-0.031*AC+8.837*BC-0.091*A²+0.041*B²+0.077*C²，决定系数R²＝0.9565；

龙胆苦苷的模拟方程为：

y＝4.65+0.27*A-0.048*B+0.022*C-0.012*AB-0.022*AC+0.029*BC+0.44*A²+0.093*B²+0.16*C²，决定系数R²＝0.9806；

獐牙菜苷的模拟方程为：

y＝4.78-0.52*A-0.038*B+0.043*C+5.793AB-0.029*AC+0.011*BC-0.34*A²+0.15*B²+0.13*C²，决定系数R²＝0.9961；

异荭草苷的模拟方程为：

y＝7.73+0.16*A-0.056*B-0.14*C+0.16AB-0.22*AC+0.08*BC+0.11*A²-0.22*B²+0.13*C²，决定系数R²＝0.9245；

异牡荆苷的模拟方程为：

y＝7.8+0.09*A-0.067*B-0.045*C+0.15AB-0.087*AC+0.064*BC+0.069*A²-0.14*B²+0.067*C²，决定系数R²＝0.9008；

6'-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷的模拟方程为：

y＝4.79-0.25*A-0.066*B+0.048*C-0.046AB-3.709*AC-6.38*BC-0.11*A²+0.11*B²+0.078*C²，决定系数R²＝0.8966；

熊果酸的模拟方程为：

y＝4.67+0.27*A-8.13*B+0.043*C-0.028AB-0.027*AC-9.527*BC+0.18*A²-0.12*B²-0.13*C²，决定系数R²＝0.9721；

齐墩果酸的模拟方程为：

y＝4.67+0.27*A-8.13*B+0.043*C-0.028AB-0.027*AC-9.527*BC+0.18*A²-0.12*B²-0.13*C²，决定系数R²＝0.9721；

上述式中的y为各成分的紫外吸收值，变量参数A为溶剂浓度，变量参数B为提取时间，变量参数C为溶剂体积；经计算确定最佳溶剂浓度为60％，提取时间为40min，溶剂体积为15mL。

中药化学成分的提取分离是研究中药化学成分的基础。这一过程一般应在生物活性或药理学指标跟踪下进行。提取分离方法应根据被提取成分的主要理化性质和考虑各种提取分离技术的原理和特点进行选定，使所需要的成分能充分地得到提取和分离。

从线叶龙胆几大类化学成分为主线进行在影响其成分因素上着手设计，达到其成分提取完全，成本低，低毒高效，便于操作。

(1)溶剂种类的选择

溶剂提取法它是根据被提取成分的溶解性能，选用合适的溶剂和方法来提取。其作用原理是溶剂穿透药材粉末的细胞膜，溶解溶质，形成细胞内外溶质浓度差，将溶质渗出细胞膜，达到提取目的。因此，根据线叶龙胆中9种成分的特点，采用甲醇为溶媒，可以最大限度的提取所有成分。

(2)溶剂浓度的选择及料液比的选择

溶剂的选择，溶剂按极性可分为三类，即亲脂性有机溶剂，亲水性有机溶剂和水。根据相似相容性的原则，以最大限度地提取所需要的化学成分，溶剂的沸点应适中易回收，低毒安全。甲醇是最常用的溶剂，因为它能与水按任意比例混合，又能大多数亲脂性有机溶剂混合，渗入药材细胞能力较强，根据料液比，能溶解大多数线叶龙胆成分的种类，从而选择亲水性有机溶剂甲醇为60％，料液比为30︰1，为最佳。

(3)提取方式的选择

提取方法就是选择合适的溶剂和方法，通过物理作用使得物质的溶解过程。超声提取的原理主要包括机械作用、热学作用及空化作用，是利用超声波辐射产生的强烈的空化效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌等多种作用，增加物质分子运动的频率和速度、溶剂的穿透力，从而加速目标成分进入溶剂。超声提取可极大地提高提取效率，节约溶剂，避免高温对提取成分的影响。根据线叶龙胆成分特点及提取效率，采用超声提取工艺，缩短了提取时间、降低了提取温度，其原因是超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，都可加速有效成分进入溶剂，从而提高了提出率，缩短了提取时间，并且免去了高温对提取成分的影响，不失为一种较为先进的提取手段。因此，在筛选过程中最佳提取方法为超声提取。功率在50kHz，温度在20℃。

(4)提取时间的选择

在提取时间的选择上，采用单因素轮换试验法考察了超声时间、温度、因素对超声法提取的影响。最后得出最佳时间为40min。这样即时间短节省能源又是提取得率最高。

本发明相较于现有技术的有益效果为：

本发明通过单因素筛选选取合适的参数水平，并运用三因素三水平的响应面分析法对线叶龙胆超声提取工艺的溶剂浓度、溶剂体积、提取时间进行考察，构建了线叶龙胆中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷、6'-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、熊果酸和齐墩果酸九种成分的二次多项模拟方程，并绘制出三维曲面图，根据所得到的模型，找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最佳值：在线叶龙胆量为0.5g的基础上，根据优化提取条件进行，结果显示，在溶剂浓度60％，甲醇用量15mL(液料比为30:1)，提取时间40min的条件下，线叶龙胆中9种成分总体提取效果最佳，在该工艺条件下，线叶龙胆化学成分的提取效果更为全面、充分，与现有提取技术相比，工艺稳定、方法简单、提取时间短，原料利用率高，尤其实现一次性提取线叶龙胆多种指标性成分的目的，具有精度和效率高的优点，可用于线叶龙胆质量的综合评价，并为线叶龙胆的综合利用、开发提供依据。

附图说明

图1为溶剂浓度对提取效果的影响示意图；

图2为溶剂体积对提取效果的影响示意图；

图3为提取时间对提取效果的影响示意图；

图4为溶剂浓度和溶剂体积对马钱苷酸提取影响的响应面图；

图5为溶剂浓度和提取时间对马钱苷酸提取影响的响应面图；

图6为溶剂体积和提取时间对马钱苷酸提取影响的响应面图；

图7为溶剂浓度和溶剂体积对獐牙菜苦苷提取影响的响应面图；

图8为溶剂浓度和提取时间对獐牙菜苦苷提取影响的响应面图；

图9为溶剂体积和提取时间对獐牙菜苦苷提取影响的响应面图；

图10为溶剂浓度和溶剂体积对龙胆苦苷提取影响的响应面图；

图11为溶剂浓度和提取时间对龙胆苦苷提取影响的响应面图；

图12为溶剂体积和提取时间对龙胆苦苷提取影响的响应面图；

图13为溶剂浓度和溶剂体积对獐牙菜苷提取影响的响应面图；

图14为溶剂浓度和提取时间对獐牙菜苷提取影响的响应面图；

图15为溶剂体积和提取时间对獐牙菜苷提取影响的响应面图；

图16为溶剂浓度和溶剂体积对异荭草苷提取影响的响应面图；

图17为溶剂浓度和提取时间对异荭草苷提取影响的响应面图；

图18为溶剂体积和提取时间对异荭草苷提取影响的响应面图；

图19为溶剂浓度和溶剂体积对异牡荆苷提取影响的响应面图；

图20为溶剂浓度和提取时间对异牡荆苷提取影响的响应面图；

图21为溶剂体积和提取时间对异牡荆苷提取影响的响应面图；

图22为溶剂浓度和溶剂体积对6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷提取影响的响应面图；

图23为溶剂浓度和提取时间对6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷提取影响的响应面图；

图24为溶剂体积和提取时间对6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷提取影响的响应面图；

图25为溶剂浓度和溶剂体积对熊果酸提取影响的响应面图；

图26为溶剂浓度和提取时间对熊果酸提取影响的响应面图；

图27为溶剂体积和提取时间对熊果酸提取影响的响应面图；

图28为溶剂浓度和溶剂体积对齐墩果酸提取影响的响应面图；

图29为溶剂浓度和提取时间对齐墩果酸提取影响的响应面图；

图30为溶剂体积和提取时间对齐墩果酸提取影响的响应面图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。

一种响应面法优化超声提取线叶龙胆中多指标性成分的方法，包括如下步骤：

A、将线叶龙胆全草粉碎成粉末，过60目药筛，备用；

B、将粉末放入锥形瓶中，以固液比为20-60:1的比例加入水、无水乙醇、甲醇、50％甲醇或75％甲醇；

C、常温下超声提取10-50min，得提取液；

D、提取液3000r/s下离心20min，得到含有指标性成分的上清液。

优选例：

一种响应面法优化超声提取线叶龙胆中多指标性成分的方法，其特征在于包括如下步骤：

A、将线叶龙胆全草粉碎成粉末，过60目药筛，备用；

B、将粉末放入锥形瓶中，以固液比为30:1的比例加入质量浓度为60％的甲醇溶液；

C、常温下超声提取40min，得提取液；

D、提取液3000r/s下离心20min，得到含有指标性成分的上清液。

一、准备工作

1、仪器设备

紫外可见分光光度仪(岛津UV-2600型)；比色皿(石英材质，宜兴市荜辉玻璃仪器厂)；万能高速粉碎机(FW200型，北京科伟永兴仪器有限公司)；离心机(BECKMAN Avanti J-26XP,美国贝克曼)；电子天平(万分之一型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司)；DHG-9123A电热鼓风恒温干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；KQ-250TDB型高频数控超声波清洗器(昆仑山超声仪器有限公司)；移液管(天波TB9EX，20℃，5mL)；容量瓶(50mL)；锥形瓶(100mL)。

2、试剂

无水乙醇(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)，甲醇(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)，屈臣氏蒸馏水。

3、材料

所用样品经鉴定为龙胆科植物线叶龙胆Gentiana farreri Balf.f.的干燥地上部分。单因素实验及响应面优化实验所用样品均为甘肃甘南合作产线叶龙胆地上全草。

4、线叶龙胆紫外波长的选择

马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、异荭草苷、异牡荆苷、熊果酸和齐墩果酸9种成分最大吸收波长见表1。

表1线叶龙胆9种成分最大吸收波长

Table 1The maximum absorption wavelength of 9ingredients ingentiana

二、试验设计与实施例

1、单因素筛选

称取定量线叶龙胆全草，在不同溶剂浓度、体积以及提取时间下超声提取，离心取上清液在紫外分光光度计上进行全波长扫描，在马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6'-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、龙胆苦苷、异荭草苷、异牡荆苷、熊果酸和齐墩果酸九种成分最大吸收波长下读取吸收值，以紫外分光光度计测得紫外吸收值为评价指标，分别考察不同的溶剂浓度(无水乙醇，水，甲醇，50％甲醇，75％甲醇)、溶剂体积(10mL，15mL，20mL，25mL，30mL)和提取时间(10min，20min，30min，40min，50min)对线叶龙胆提取效率的影响。

实施例1：溶剂浓度对提取效果的影响

称取约0.5g线叶龙胆全草于锥形瓶中，分别加入水、无水乙醇、甲醇、50％甲醇、75％甲醇20mL(液料比40:1)，常温下超声提取30min，3000r/s离心20min，取上清液于紫外分光光度计下测量，每组条件做三个平行，取平均值，测量结果见表2和图1，最优条件为75％甲醇。

表2溶剂浓度对提取效果的影响

实施例2：溶剂体积(液料比)对提取效果的影响

称取约0.5g线叶龙胆全草于锥形瓶中，分别加入10mL，15mL，20mL，25mL，30mL75％甲醇，常温下超声提取30min，3000r/s离心20min，取上清液于紫外分光光度计下测量，每个条件做三个平行，取平均值，测量结果见表3和图2，最优条件为10mL。

表3溶剂体积(液料比)对提取效果的影响

实施例3：提取时间对提取效果的影响

称取约0.5g线叶龙胆全草于锥形瓶中，加入75％甲醇10mL(液料比20:1)，常温下超声提取，提取时间分别为10min、20min、30min、40min、50min，3000r/s离心20min，取上清液于紫外分光光度计下测量，每个条件做三个平行，取平均值，测量结果见表4和图3，最优条件为30min。

表4提取时间对提取效果的影响

由实施例1-3可见，单因素最佳工艺为：溶剂浓度：75％甲醇，溶剂体积：10mL，提取时间：30min。

2、响应面法优化超声提取工艺

(1)响应面法优化设计

在单因素试验基础上，确定溶剂浓度、溶剂体积和提取时间3个因素的水平值，运用Design-Expert8.0.6.1软件进行Box-Behnken响应面设计和数据分析，具体实验因素与各水平值见表5。

表5响应面实验因素及水平

Table 5 Factors and levels of response surface test

根据Box-Behnken的组合设计原理，采用Design-Expert8.0.6.1软件设计3因素3水平共17个实验，其中中心点重复5次实验；以紫外吸收值为响应值，具体实验设计方案与结果见表6。

表6响应面实验条件及结果

Table 6 Conditions and resultsof response surface test

(2)二次响应面回归模型分析

采用Design-Expert软件对试验数据进行二次响应面回归分析，由此可求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联方程，分析得到的9种成分紫外吸收值与各因变量的模拟方程与决定系数R²见表7：

表7模拟方程及决定系数

Table 7 simulated variance and coefficient of decision

由表7可看出马钱苷酸R²＝0.997、獐牙菜苦苷R²＝0.9565、龙胆苦苷R²＝0.9806、獐牙菜苷R²＝0.9961、异荭草苷R²＝0.9245、异牡荆苷R²＝0.9008、6'-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷R²＝0.8966、熊果酸R²＝0.9721、齐墩果酸R²＝0.9721，说明该回归模型的拟合情况较好，试验值与预测值较为接近，模型的可靠性可通过方差分析及相关系数来考察；

表8马钱苷酸二次响应面回归模型方差分析

Table 7Loganin acid two response surface regression model analysis ofvariance

注：＊＊＊P<0.001，差异极显著；＊＊P<0.01，高度显著；＊P<0.05显著

表9獐牙菜苦苷二次响应面回归模型方差分析

Table 9 swertiamain two response surface regression model analysis ofvariance

注：＊＊＊P<0.001，差异极显著；＊＊P<0.01，高度显著；＊P<0.05显著

表10龙胆苦苷二次响应面回归模型方差分析

Table 10gentiopicrosidetwo response surface regression model analysisof variance

注：＊＊＊P<0.001，差异极显著；＊＊P<0.01，高度显著；＊P<0.05显著

表11獐牙菜苷二次响应面回归模型方差分析

Table 11 swertiamain two response surface regression model analysisof variance

注：＊＊＊P<0.001，差异极显著；＊＊P<0.01，高度显著；＊P<0.05显著

表12异荭草苷二次响应面回归模型方差分析

Table 12Isoorientin two response surface regression model analysis ofvariance

注：＊＊＊P<0.001，差异极显著；＊＊P<0.01，高度显著；＊P<0.05显著

表13异牡荆苷二次响应面回归模型方差分析

Table 13 isovitexin two response surface regression model analysis ofvariance

注：＊＊＊P<0.001，差异极显著；＊＊P<0.01，高度显著；＊P<0.05显著

表14 6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷二次响应面回归模型方差分析Table 14 6'-O-β-D-glucosylgentiopicrosidetwo response surface regression model analysis ofvariance

注：＊＊＊P<0.001，差异极显著；＊＊P<0.01，高度显著；＊P<0.05显著

表15熊果酸二次响应面回归模型方差分析

Table 15 ursolic acid two response surface regression model analysisof variance

注：＊＊＊P<0.001，差异极显著；＊＊P<0.01，高度显著；＊P<0.05显著

表16齐墩果酸二次响应面回归模型方差分析

Table 16 oleanolic acid two response surface regression modelanalysis of variance

注：＊＊＊P<0.001，差异极显著；＊＊P<0.01，高度显著；＊P<0.05显著

由响应面方差分析表可以看出，该模型中，马钱苷酸P<0.0001，獐牙菜苦苷P＝0.0006，龙胆苦苷P<0.0001，獐牙菜苷P<0.0001，异荭草苷P＝0.0062，异牡荆苷P＝0.0087，6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷P＝0.0099，熊果酸P＝0.0001，齐墩果酸P＝0.0001，均小于0.001，说明该二次方程模型极显著。失拟项马钱苷酸P＝0.2751，獐牙菜苦苷P＝0.5289，龙胆苦苷P＝0.4677，獐牙菜苷P＝0.1761，异荭草苷P＝0.055，异牡荆苷P＝0.3746，6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷P＝0.9348，熊果酸P＝0.2888，齐墩果酸P＝0.2888，均不显著，表明本实验所得二次回归方程高度显著，方程对试验拟合程度较好、误差小，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测。该模型的纯误差的均方值马钱苷酸0.004，獐牙菜苦苷0.022，龙胆苦苷0.018，獐牙菜苷0.0035，异荭草苷0.018，异牡荆苷0.02，6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷0.073，熊果酸0.011，齐墩果酸0.011，值均较小，说明此模型有效，可以用来预测该提取工艺的工艺条件。由对检验值F可知，各因素对因变量影响的大小依次为：溶剂浓度(A)＞提取时间(C)＞溶剂体积(B)。

(3)响应面图分析

运用Design-Expert8.0.6.1软件对试验数据进行三元二次回归拟合分析所得响应面及等高线图组可直观地反映各因素及其交互作用对9种成分提取率的影响结果。其中等高线的形状可以反映俩因素间交互作用的强弱，椭圆形表示俩因素间交互作用较强，圆形表示较弱。等高线的疏密以及响应曲面的坡度可以反映各因素对提取率变化的影响大小，其中响应曲面的坡度较陡和等高线较密集表示影响较大，响应曲面的坡度较缓和等高线较稀疏表示影响较小。

图4、7、10、13、16、19、22、25和28分别显示了提取时间位于中心水平时，溶剂浓度和溶剂体积交互作用对马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷、6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、熊果酸、齐墩果酸提取率的影响，其中由图4、7、13、22、25和28可知，溶剂浓度和溶剂体积对马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、熊果酸、齐墩果酸提取率的交互作用较弱，由图10、16和19可知溶剂浓度和溶剂体积对龙胆苦苷、异荭草苷、异牡荆苷提取率的交互作用较强。图4、7、13、22、25和28分别显示溶剂体积变化对马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、熊果酸、齐墩果酸提取率变化的影响相对较小，表现为响应曲面的坡度较缓和等高线较稀疏；溶剂浓度变化对提取率变化的影响较大，表现为响应曲面的坡度较陡和等高线较密集，图10、16和19显示溶剂体积变化对龙胆苦苷、异荭草苷、异牡荆苷提取率变化的影响相对较大，表现为响应曲面的坡度较陡和等高线较密集，溶剂浓度变化对提取率变化的影响较小，表现为响应曲面的坡度较缓和等高线较稀疏；

图5、8、11、14、17、20、23、26和29分别显示了溶剂体积位于中心水平时，溶剂浓度和提取时间交互作用对马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷、6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、熊果酸、齐墩果酸提取率的影响提取率的影响，其中由图5、8、14、23、26和29可知，溶剂浓度和提取时间对马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、熊果酸、齐墩果酸提取率的交互作用较弱，由图11、17和20可知溶剂浓度和提取时间对龙胆苦苷、异荭草苷、异牡荆苷提取率的交互作用较强。图5、8、14、17、20、23、26和29分别显示提取时间变化对马钱苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷、6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、熊果酸、齐墩果酸提取率变化的影响相对较小，表现为响应曲面的坡度较缓和等高线较稀疏，溶剂浓度变化对提取率变化的影响较大，表现为响应曲面的坡度较陡和等高线较密集，图11显示提取时间变化对龙胆苦苷提取率变化的影响相对较大，表现为响应曲面的坡度较陡和等高线较密集，溶剂浓度变化对提取率变化的影响较小，表现为响应曲面的坡度较缓和等高线较稀疏；

图6、9、12、15、18、21、24、27和30分别显示了溶剂浓度位于中心水平时，提取时间和溶剂体积交互作用对马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷、6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、熊果酸、齐墩果酸提取率的影响，其中由6、9、12、18、21、27和30可知，提取时间和溶剂体积对马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、异荭草苷、异牡荆苷、熊果酸、齐墩果酸提取率的交互作用较强；由图15和24可知提取时间和溶剂体积对獐牙菜苷和6-0-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷提取率的交互作用较弱。图6、9、15、18、21、24、27和30显示提取时间变化对马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷、熊果酸、齐墩果酸提取率变化的影响相对较小，表现为响应曲面的坡度较缓和等高线较稀疏，溶剂体积变化对提取率变化的影响较大，表现为响应曲面的坡度较陡和等高线较密集，图12显示提取时间变化对龙胆苦苷提取率变化的影响相对较大，表现为响应曲面的坡度较陡和等高线较密集，溶剂浓度变化对提取率变化的影响较小，表现为响应曲面的坡度较缓和等高线较稀疏。

(4)最优条件筛选

运用Design-Expert软件进行Box-Behnken响应面实验设计，根据优化提取条件最后所得的最佳提取条件见表17。

表17响应面法所得最优提取条件

Table 17 optimal extraction conditions of response surface method

由上可见，在线叶龙胆量为0.5g的基础上，根据优化提取条件进行结果显示，在溶剂浓度60％，甲醇用量15mL(液料比；30:1)，提取时间40min的条件下，线叶龙胆中9种成分总体提取效果最佳。

(5)验证实验

为验证响应面法所得结果的可靠性，对模型优化的工艺条件进行验证，响应面法优化最优条件为：溶剂浓度60％，溶剂体积：14.14mL，提取时间：40min。考虑到实验的可行性与便捷性，选择工艺参数:溶剂浓度60％，溶剂体积：15mL，提取时间：40min进行实验3次，取平均值，实验结果与预测结果见表18。

表18验证实验测量值与预测值

Table 18 validation test measured and predicted values