阅读说明：本技术 一种抗肿瘤的中药复合物及其制备方法和应用 (Anti-tumor traditional Chinese medicine compound and preparation method and application thereof ) 是由 冯奕斌 陈可瑜 夏文 吴贵辉 陈红羽 冉娜 吴玉春 孙田甜 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗肿瘤的中药复合物及其制备方法和应用。所述抗肿瘤的中药复合物,由下述原料制得,大丁草和红花龙胆；其制备方法为：将大丁草和红花龙胆混合后加提取剂提取,得提取液,将提取液浓缩干燥,得抗肿瘤的中药复合物；或将大丁草和红花龙胆分别加提取剂提取,分别得提取液,将提取液分别浓缩干燥后混合,得抗肿瘤的中药复合物；所述的抗肿瘤的中药复合物可应用于抗肿瘤药品和食品的制备。本发明可以显著抑制肝细胞癌和非小细胞肺癌的浸润和转移。(The invention discloses an anti-tumor traditional Chinese medicine compound and a preparation method and application thereof. The anti-tumor traditional Chinese medicine compound is prepared from the following raw materials, gerbera piloselloides and gentiana carthami; the preparation method comprises the following steps: mixing herba Erodii seu Geranii and radix Gentianae, extracting with extractant to obtain extractive solution, concentrating, and drying to obtain anti-tumor Chinese medicinal composition; or extracting herba Erodii seu Geranii and radix Gentianae with extractant respectively to obtain extractive solutions, respectively concentrating and drying the extractive solutions, and mixing to obtain anti-tumor Chinese medicinal composition; the anti-tumor traditional Chinese medicine compound can be applied to preparation of anti-tumor medicines and foods. The invention can obviously inhibit the infiltration and the metastasis of hepatocellular carcinoma and non-small cell lung cancer.)

一种抗肿瘤的中药复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤中药复合物技术领域，特别是一种抗肿瘤的中药复合物及其制备方法和应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是一种常见的致死性恶性肿瘤，每年导致全世界近100万人死亡，肝细胞癌早期的不可预测和晚期的预后不良导致了肝癌的高死亡率。值得注意的是，只有30％的肝癌患者适合包括肝移植在内的外科治疗。肺癌是全世界排名第一的常见癌症，死亡率高。据估计，癌症死亡率中，肺癌占18.4％。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常见的类型，占肺癌总发病率的85％以上。寻求一种新的抑制肝癌和肺癌生长和转移的药物迫在眉睫。

BL02由大丁草和红花龙胆这2种中药构成。该方剂在中国云南和贵州被广泛运用治疗咳嗽和炎症反应。其抗肿瘤的应用和疗效未见报道。

发明内容

本发明的目的，在于提供了一种抗肿瘤的中药复合物及其制备方法和应用。本发明可以显著抑制肝细胞癌和非小细胞肺癌的浸润和转移。

本发明的技术方案：一种抗肿瘤的中药复合物，由下述原料制得，以重量份计，大丁草1-10份，红花龙胆1-10份。(本发明所述的重量份可以是mg、g、kg等医疗领域公认的重量单位。)

前述的抗肿瘤的中药复合物中，以重量份计，大丁草3-8份，红花龙胆3-8份。

前述的抗肿瘤的中药复合物中，所述大丁草与红花龙胆的重量比为1:1。

前述的抗肿瘤的中药复合物中，所述抗肿瘤的中药复合物中含有1％-3％的芒果苷。

前述的抗肿瘤的中药复合物的制备方法，将大丁草和红花龙胆混合后加提取剂提取，得提取液，将提取液浓缩、干燥，得抗肿瘤的中药复合物；或将大丁草和红花龙胆分别加提取剂提取，分别得提取液，将提取液分别浓缩、干燥后混合，得抗肿瘤的中药复合物；所述提取剂为水或乙醇溶液，所述乙醇溶液为50％-100％的乙醇水溶液；大丁草和红花龙胆混合提取时提取剂与大丁草和红花龙胆的重量比为2-25:1，大丁草和红花龙胆分别提取时提取剂与大丁草或红花龙胆的重量比为2-25:1；提取温度为25-100℃。

前述的抗肿瘤的中药复合物的制备方法中，将大丁草和红花龙胆药材分别粉碎后，混合，加入2-25倍于大丁草和红花龙胆重量的水，加热至90-100℃，加热1-2小时浸提，将得到的水浸提液浓缩、干燥，得抗肿瘤的中药复合物。

前述的抗肿瘤的中药复合物的制备方法中，所述提取剂的量为大丁草和红花龙胆总量的15-25倍。

前述的抗肿瘤的中药复合物的制备方法中，所述提取方法为煎煮提取；所述提取温度为90-100℃，提取时间为2-4小时。

前述的抗肿瘤的中药复合物的制备方法中，将大丁草和红花龙胆分别粉碎后，混合，加水浸泡12-24h，所述水的重量为大丁草和红花龙胆重量的5-10倍，加热至90-100℃，加热0.5-2小时浸提，将得到的水浸提液浓缩、干燥，得抗肿瘤的中药复合物；或将大丁草和红花龙胆分别粉碎后，分别加水浸泡12-24h，所述大丁草中加入5-10倍于大丁草重量的水，所述红花龙胆中加入5-10倍于红花龙胆重量的水，分别加热至90-100℃，加热0.5-2小时浸提，将得到的水浸提液分别浓缩、干燥后混合，得抗肿瘤的中药复合物。

前述的抗肿瘤的中药复合物的制备方法中，所述大丁草和红花红胆为粗粉碎药粉。

前述的抗肿瘤的中药复合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抗肿瘤药物，以抗肿瘤的中药复合物为原料，按常规制剂工艺，加入药学上可接受的辅料，制备成任何一种适合于临床上使用的口服或非口服剂型。

前述的抗肿瘤的中药复合物在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述的抗肿瘤药物，以抗肿瘤的中药复合物为原料，按常规制剂工艺，加入药学上可接受的辅料和其他中药提取物，制备成任何一种适合于临床上使用的口服或非口服剂型。

前述的抗肿瘤的中药复合物在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述的抗肿瘤药物为抑制癌细胞的浸润和侵袭的抗肿瘤药物。

前述的抗肿瘤的中药复合物在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述肿瘤为肝癌、肺癌。

前述的抗肿瘤的中药复合物在制备抗肿瘤食品中的应用，所述的抗肿瘤食品，以抗肿瘤的中药复合物为原料，按常规食品生产工艺，加入食品生产的常规辅料，制备成抗肿瘤食品。

前述的抗肿瘤的中药复合物在制备抗肿瘤食品中的应用，所述的抗肿瘤食品，以抗肿瘤的中药复合物为原料，按常规食品生产工艺，加入食品生产的常规辅料和其他中药提取物，制备成抗肿瘤食品。

前述的抗肿瘤的中药复合物在制备抗肿瘤食品中的应用中，所述食品为保健品，所述保健品单独使用或与其他抗肿瘤治疗药物联用。

前述的抗肿瘤的中药复合物在制备抗肿瘤食品中的应用中，所述保健品为抑制癌细胞的浸润和侵袭的保健品。

与现有技术比较，本发明抗肿瘤的中药复合物对肿瘤的生长和转移有抑制作用。本发明抗肿瘤的中药复合物可以有效抑制肝脏肿瘤向正常组织的浸润生长，经本发明抗肿瘤的中药复合物治疗后，正常组织和肝癌组织的交界处变得更为清晰。本发明抗肿瘤的中药复合物能够显著抑制肝癌的肺转移。本发明抗肿瘤的中药复合物能够显著抑制癌细胞在肺组织内的扩张。本发明抗肿瘤的中药复合物对肿瘤细胞的体外迁移具有广泛的抑制作用。本发明抗肿瘤的中药复合物临床可用于早期肝癌和肺癌病人标准治疗后防止癌细胞转移或复发；或作为癌症病人的辅助治疗增强和巩固疗效；或作为癌末病人防止癌症进一步扩散的三线药物。本发明抗肿瘤的中药复合物可以显著抑制肝细胞癌和非小细胞肺癌的浸润和转移。

附图说明

图1为抗肿瘤的中药复合物和芒果苷标准的HPLC色谱图；

图2为抗肿瘤的中药复合物(1g/kg)和芒果苷(50mg/kg)降低了肝脏肿瘤生长的示意图，其中A为小鼠肝癌体内生长状况示意图，B为治疗终点瘤块示意图，C为治疗过程小鼠体重、肿块尺寸示意图，D为治疗各组肝肿瘤病理切片示意图；

图3为抗肿瘤的中药复合物显著抑制肝癌肺转移的示意图，其中A为肝肿瘤细胞肺转移信号示意图，B为治疗各组肺组织病理切片图；1、2为同组两只小鼠；

图4为抗肿瘤的中药复合物显著抑制癌细胞在肺组织内的扩张的示意图，其中A为荷瘤小鼠肺部肿瘤体内生长示意图，B为治疗终点肺部瘤块示意图；

图5为抗肿瘤的中药复合物对肿瘤细胞的体外生长具有选择性的抑制作用的示意图，其中A为BL02对肝癌细胞系MHCC97L和PLC/PRF/5的细胞毒作用示意图，B为BL02对肺癌肺癌细胞系A549的细胞毒作用示意图；

图6为抗肿瘤的中药复合物对肿瘤细胞的体外迁移具有广泛抑制作用的示意图，图中的浓度表示BL02的药物浓度，其中A为通过侵袭小室的肿瘤细胞示意图，B为通过侵袭小室的肿瘤细胞计数图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实验药材和试剂：

大灯草药材采自中国贵州省。

红花龙胆采自中国贵州省。

肝癌细胞株PLC和肺癌细胞株A549购自美国ATCC公司，肝癌细胞MHCC97L来自香港大学外科学系。

实施例中，BL02指抗肿瘤的中药复合物、MGF指芒果苷。

实验动物：

Athymic裸鼠购自香港大学实验动物中心。

实施例1。抗肿瘤的中药复合物及其制备方法

一种抗肿瘤的中药复合物，由下述原料制得，以重量份计，大丁草1份，红花龙胆10份。

所述抗肿瘤的中药复合物的制备方法：将大丁草和红花龙胆分别粗粉碎后过100目筛，分别加水浸泡18h，大丁草中加入的水的量为大丁草重量的2倍，红花龙胆中加入水的量为红花龙胆重量的2倍，分别加热至90℃，加热0.5小时浸提，将得到的水浸提液分别浓缩，干燥后混合，得抗肿瘤的中药复合物。

用高效液相色谱(美国Thermo Fisher Scientific公司的UHPLC)对该中药复合物进行分析，并采用标准品比对(见图1)。色谱柱温保持在30度，进样量为4μL，流速为1mL/min，流动相A和B分别为0.05％KH2PO4和0.1％H3PO4，相应的为乙腈。梯度洗脱曲线如下：0-4min，95％A；4-7min，88％A；7-13min，85％A；13-28min，80％A；28-32min，78％A；32-35min，60％A。结果表明，该中药复合物中的芒果苷的含量约为1.2％。

实施例2。一种抗肿瘤的中药复合物，由下述原料制得，以重量份计，大丁草10份，红花龙胆1份。

所述抗肿瘤的中药复合物的制备方法：将大丁草和红花龙胆药材分别粗粉碎后过100目筛，混合后加入大丁草和红花龙胆重量25倍的75％的乙醇水溶液，于95℃下回流提取1.5h，将得到的提取液浓缩、干燥，得抗肿瘤的中药复合物。

用高效液相色谱(美国Thermo Fisher Scientific公司的UHPLC)对该中药复合物进行分析，并采用标准品比对(见图1)。色谱柱温保持在30度，进样量为4μL，流速为1mL/min，流动相A和B分别为0.05％KH2PO4和0.1％H3PO4，相应的为乙腈。梯度洗脱曲线如下：0-4min，95％A；4-7min，88％A；7-13min，85％A；13-28min，80％A；28-32min，78％A；32-35min，60％A。结果表明，该中药复合物中的芒果苷的含量约为1.6％。

实施例3。一种抗肿瘤的中药复合物，由下述原料制得，以重量份计，大丁草3份，红花龙胆8份。

所述抗肿瘤的中药复合物的制备方法：将大丁草和红花龙胆药材分别粗粉碎后过100目筛，混合后加入大丁草和红花龙胆重量10倍的乙醇，于30-70HZ强度下超声常温提取2h，将得到的提取液浓缩，干燥后，得抗肿瘤的中药复合物。

用高效液相色谱(美国Thermo Fisher Scientific公司的UHPLC)对该中药复合物进行分析，并采用标准品比对(见图1)。色谱柱温保持在30度，进样量为4μL，流速为1mL/min，流动相A和B分别为0.05％KH2PO4和0.1％H3PO4，相应的为乙腈。梯度洗脱曲线如下：0-4min，95％A；4-7min，88％A；7-13min，85％A；13-28min，80％A；28-32min，78％A；32-35min，60％A。结果表明，该中药复合物中的芒果苷的含量约为1.5％。

实施例4。一种抗肿瘤的中药复合物，由下述原料制得，以重量份计，大丁草8份，红花龙胆3份。

所述抗肿瘤的中药复合物的制备方法：将大丁草和红花龙胆药材分别粗粉碎后过100目筛，混合后加入大丁草和红花龙胆重量5倍的50％的乙醇水溶液，于30-70HZ强度下超声常温提取2h，将得到的提取液浓缩，干燥后，得抗肿瘤的中药复合物。

用高效液相色谱(美国Thermo Fisher Scientific公司的UHPLC)对该中药复合物进行分析，并采用标准品比对(见图1)。色谱柱温保持在30度，进样量为4μL，流速为1mL/min，流动相A和B分别为0.05％KH2PO4和0.1％H3PO4，相应的为乙腈。梯度洗脱曲线如下：0-4min，95％A；4-7min，88％A；7-13min，85％A；13-28min，80％A；28-32min，78％A；32-35min，60％A。结果表明，该中药复合物中的芒果苷的含量约为1.4％。

实施例5。一种抗肿瘤的中药复合物，由下述原料制得，以重量份计，大丁草5份，红花龙胆5份。

所述抗肿瘤的中药复合物的制备方法：将大丁草和红花龙胆药材分别粗粉碎后过100目筛，充分混合后，加入于大丁草和红花龙胆总重量6倍的沸水中煎煮2h，煎煮3次，过滤，合并滤液，并干燥至干得抗肿瘤的中药复合物。

用高效液相色谱(美国Thermo Fisher Scientific公司的UHPLC)对该中药复合物进行分析，并采用标准品比对(见图1)。色谱柱温保持在30度，进样量为4μL，流速为1mL/min，流动相A和B分别为0.05％KH2PO4和0.1％H3PO4，相应的为乙腈。梯度洗脱曲线如下：0-4min，95％A；4-7min，88％A；7-13min，85％A；13-28min，80％A；28-32min，78％A；32-35min，60％A。结果表明，该中药复合物中的芒果苷的含量约为1.7％。

实施例6。抗肿瘤片剂。取实施例5制得的抗肿瘤的中药复合物，按常规工艺，加入药学上可接受的辅料，制备成片剂，每片含抗肿瘤的中药复合物0.5g，一日3次，每次3-4片，用于治疗肝癌或肺癌。

实施例7。抗肿瘤丸剂。取实施例5制得的抗肿瘤的中药复合物，按常规工艺，加入药学上可接受的辅料和其他中药提取物，制备成丸剂，每颗含抗肿瘤的中药复合物0.5g，一日3次，每次3-4颗，用于治疗肝癌或肺癌。

实施例8。抗肿瘤饮品。取实施例5制得的抗肿瘤的中药复合物，按常规工艺，加入食品生产的常规辅料，制备成保健饮品，每瓶10ml，含抗肿瘤的中药复合物0.3g，每日2瓶，用于肝癌或肺癌患者。

实施例9。抗肿瘤的中药复合物抑制小鼠原位肝癌的生长。本实施例中抗肿瘤的中药复合物选用实施例5制得的抗肿瘤的中药复合物。动物研究方案是在香港大学动物委员会的许可下进行的。我们使用的原位移植动物模型是裸鼠(BALB/cAnA-nude)。开始手术前我们会先用***/甲苯嗪的混合液(100mg和10mg/kg)麻醉小鼠。原发性肝癌移植为先将荧光素酶标记的MHCC-97L细胞移植到小鼠皮下，经过2周的生长后将癌组织从小鼠皮下取出，然后移植入小鼠肝左叶。我们通过荧光素酶显像分析系统(IVIS)，每周监测一次肝癌的生长情况。小鼠将连续5-7周用不同剂量的中药复合物或芒果苷进行药效检测。实验结束时，注射过量戊巴比妥(200mg/kg)处死所有实验小鼠。使用载玻片收集石蜡包埋切片(5μm)，然后在二甲苯中脱蜡，并用浓度从100％到70％的梯度酒精(每间隔10％)进行再水化。完成再水化处理后，将载玻片与苏木精一起孵育5分钟，然后在0.25％伊红中孵育1分钟(SigmaAldrich，美国)。随后，将载玻片浸入加拿大香脂(SigmaAldrich，USA)中，在BX43光学显微镜(Olympus，Japan)上观察H&E染色的肝癌组织的形态结构。结果显示该中药复合物(1g/kg)和芒果苷(50mg/kg)降低了肝脏肿瘤的生长(图2A-C)。H&E组织染色结果显示该中药复合物(1g/kg)和芒果苷(50mg/kg)可以有效抑制肝脏肿瘤向正常组织的浸润生长。经过该中药复合物和芒果苷治疗后，正常肝组织和肝癌组织的交界处变得更为清晰(图2D)。

实施例10。抗肿瘤的中药复合物抑制小鼠肝癌的肺转移。本实施例中抗肿瘤的中药复合物选用实施例5制得的抗肿瘤的中药复合物。动物研究方案是在香港大学动物委员会的许可下进行的。我们使用的原位移植动物模型是裸鼠(BALB/cAnA-nude)。开始手术前我们会先用***/甲苯嗪的混合液(100mg和10mg/kg)麻醉小鼠。原发性肝癌移植为先将荧光素酶标记的MHCC-97L细胞移植到小鼠皮下，经过2周的生长后将癌组织从小鼠皮下取出，然后移植入小鼠肝左叶。小鼠将连续5-7周用不同剂量的中药复合物或芒果苷进行药效检测。实验结束时，注射过量戊巴比妥(200mg/kg)处死所有实验小鼠。我们通过荧光素酶显像分析系统(IVIS)，监测一次小鼠肺内的肝肿瘤细胞情况。使用载玻片收集石蜡包埋切片(5μm)，然后在二甲苯中脱蜡，并用浓度从100％到70％的梯度酒精(每间隔10％)进行再水化。完成再水化处理后，将载玻片与苏木精一起孵育5分钟，然后在0.25％伊红中孵育1分钟(SigmaAldrich，美国)。随后，将载玻片浸入加拿大香脂(SigmaAldrich，USA)中，在BX43光学显微镜(Olympus，Japan)上观察H&E染色的肝癌组织的形态结构。图3A显示喂食中药复合物的肝癌小鼠肺内荧光素强度有显着的降低，而喂食芒果苷并没有抑制肺内荧光素信号。图3B*处为肺切片内的肝肿瘤组织，而喂食中药复合物的肝癌小鼠的非切片并无发现明显的肝肿瘤组织。这说明该中药复合物能够显著抑制肝癌肺转移，而芒果苷的抑制肝癌肺转移的效果不明显。提示单用该中药复合物效果优于其中的一个单体成分芒果苷。

实施例11。抗肿瘤的中药复合物抑制肺癌的组织扩张。本实施例中抗肿瘤的中药复合物选用实施例5制得的抗肿瘤的中药复合物。动物研究方案是在香港大学动物委员会的许可下进行的。我们使用的原位移植动物模型是裸鼠(BALB/cAnA-nude)。开始手术前我们会先用***/甲苯嗪的混合液(100mg和10mg/kg)麻醉小鼠。肺癌模型为将A549细胞溶入PBS和基质胶1:1混合的溶液，随后直接注射入小鼠左侧肺叶。小鼠将连续5-7周用不同剂量的中药复合物进行药效检测。实验结束时，注射过量戊巴比妥(200mg/kg)处死所有实验小鼠，将肺取出，观察肺肿瘤的荧光素信号强度。图4A显示喂食中药复合物的小鼠从3周开始有显着的降低肺内荧光素信号强度。图4B显示处死后小鼠的肺内荧光素信号强度，而喂食中药复合物的肺癌小鼠明显减小肺内荧光素信号强度。这说明该中药复合物(1g/kg)能够显著抑制癌细胞在肺组织内的扩张。

实施例12。抗肿瘤的中药复合物对癌细胞的体外生长的抑制作用。本实施例中抗肿瘤的中药复合物选用实施例5制得的抗肿瘤的中药复合物。通过MTT分析不同干预措施后的肝癌(MHCC-97L，PLC/PRF/5)和肺癌细胞(A549)细胞活力。细胞以每孔1*104的细胞密度接种在96孔板中，随后24小时贴壁。然后用不同浓度的药物和时间进行干预。将PBS中的噻唑蓝四唑溴化铵(MTT，5mg/ml)添加到每个孔中，并在37℃下再培养4h。之后，丢弃上清液并添加100μl DMSO以溶解结晶紫。最后用Bio-Rad680酶标仪在575nm处各孔吸光度，最终确定各细胞不同干预后的细胞活性。结果显示该中药复合物对肿瘤细胞的体外生长具有选择性的抑制作用，具体地，对肝癌细胞的生长抑制显著(图5A)，而对肺癌细胞则不明显(图5B)。

实施例13。抗肿瘤的中药复合物对癌细胞的体外迁移的抑制作用。本实施例中抗肿瘤的中药复合物选用实施例5制得的抗肿瘤的中药复合物。首先将密度为1x 105的BL02和其他干预措施预处理的肝癌(MHCC-97L，PLC/PRF/5)和肺癌细胞(A549)细胞接种在涂有基质凝胶基质(5mg/ml，1:1用冷PBS稀释)的Transwell的上室中。下腔室内填充750μl培养基和10％胎牛血清。培养48小时后，用棉签擦拭上腔细胞。侵入室的基底细胞进一步4％多聚甲醛固定2小时，之后用结晶紫染色2小时。然后，在倒置显微镜下观察侵袭细胞的数量。图6显示不同剂量的BL02明显的降低肝癌(MHCC-97L，PLC/PRF/5)和肺癌细胞(A549)细胞的迁移。这说明该中药复合物对肿瘤细胞的体外迁移具有广泛的抑制作用。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。