具体实施方式

本发明的详细说明：

除非另有说明，本发明教导的实践将使用在本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。此类技术在以下文献中得到充分解释，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版(Sambrook等人,1989)；Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成](M.J.Gait编辑,1984；Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学当前方案](F.M.Ausubel等人,编辑,1994)；PCR:The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应](Mullis等人,编辑,1994)；Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual[基因转移和表 达：实验室手册](Kriegler,1990)，和The Alcohol Textbook[醇教科书](Ingledew等人,编辑,第五版,2009)，以及Essentials of Carbohydrate Chemistry and Biochemistry [碳水化合物化学与生物化学基础](Lindhorste,2007)。

除非在本文中另有定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本发明教导所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典]，第二版,JohnWiley and Sons[约翰威利父子公司],纽约(1994)，以及Hale和Markham,The Harper Collins Dictionary of Biology[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约(1991)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的通用词典。与本文所述的那些类似或等效的任何方法和材料可用于本发明教导的实践或测试中。

本文提供的数值范围包括限定所述范围的数值在内。

定义：

如本文所使用的，“α(1-3)葡聚糖”是指在葡萄糖单体之间含有α1-3键的寡糖或多糖。

术语“葡糖基转移酶(glucosyl transferase或glucosyl transferaseenzyme)”、“GTF酶”、和“GTF”在本文可互换使用。葡糖基转移酶催化从蔗糖合成名为葡聚糖的高分子量D-葡萄糖聚合物。根据CAZy(碳水化合物活性酶)数据库(Cantarel等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]37:D233-238,2009)，将GTF酶分类在糖苷水解酶家族70(GH70)下。

关于多肽，术语“野生型”、“亲本”或“参比”是指在一个或多个氨基酸位置处不包含人为取代、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸，术语“野生型”、“亲本”或“参比”是指不包含人为核苷酸变化的天然存在的多核苷酸。然而，注意编码野生型、亲本、或参比多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本、或参比多肽的任何多核苷酸。

参比野生型多肽应理解为包括多肽的成熟形式。“成熟”多肽或其变体是其中不存在信号序列的多肽或变体，例如，在多肽表达期间或之后从未成熟形式的多肽切割。

关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然存在的或人为的氨基酸取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参比多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参比多肽或多核苷酸的特性将从上下文中显而易见。

术语“重组”当用于提及主题细胞、核酸、蛋白质或载体时，表明受试者已经从其天然状态被修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或以不同于自然界发现的水平或在不同于自然界发现的条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列不同在于一个或多个核苷酸，和/或有效地连接到异源序列，例如表达载体中的异源启动子。重组蛋白质与天然序列的不同可在于一个或多个氨基酸，和/或与异源序列融合。包含编码葡糖基转移酶的核酸的载体是重组载体。

术语“回收的”、“分离的”和“单独的”是指从如天然存在的与其天然相关的至少一种其他材料或组分中除去的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸、或者其他指定材料或组分。其“分离的”多肽包括但不限于含有在异源宿主细胞中表达的分泌多肽的培养液。

术语“聚合物”是指连接在一起的一系列单体基团。聚合物由单个单体的多个单元组成。如本文所使用的术语“葡萄糖聚合物”是指作为聚合物连接在一起的葡萄糖单元。只要存在至少三个葡萄糖单元，葡萄糖聚合物就可以含有非葡萄糖的糖，例如乳糖或半乳糖。

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换地使用。当此类氨基酸序列显示出活性时，它们可以被称为“酶”。使用针对氨基酸残基的常规单字母或三字母密码，采用标准氨基端-至-羧基端取向(即N→C)表示氨基酸序列。

术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以是化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个密码子来编码具体的氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码具体氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，核酸序列以5′-至-3′取向呈现。

关于细胞使用的术语“转化”，“稳定转化”和“转基因”意指细胞包含整合到其基因组中或作为通过多代维系的附加体的非天然(例如异源)核酸序列。

在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。

“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经引入了表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码目的多肽(例如，葡糖基转移酶)的多核苷酸的生物体。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括从细胞产生的原生质体。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指不是天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译两者。

“选择性标记”或“可选择标记”是指能够在宿主中被表达以促进选择携带所述基因的宿主细胞的基因。可选择标记的实例包括但不限于在宿主细胞上赋予代谢优势(如营养优势)的抗微生物剂(例如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或基因。

“载体”是指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

“表达载体”是指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列与能够在适合的宿主中影响DNA表达的适合控制序列有效地连接。此类控制序列可以包括影响转录的启动子，控制转录的任选的操纵子序列，编码mRNA上适合的核糖体结合位点的序列，增强子以及控制转录和翻译终止的序列。

术语“有效地连接”意指：指定组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并列)。例如，调控序列与编码序列有效地连接，使得编码序列的表达受调控序列的控制。

“信号序列”是与蛋白质的N-末端部分附接的氨基酸序列，所述氨基酸序列有利于蛋白质在细胞外的分泌。细胞外的蛋白质的成熟形式缺乏在分泌过程中被切除的信号序列。

“生物学活性的”是指具有指定生物活性，例如酶活性的序列。

术语“比活性”是指在特定条件下每单位时间通过酶或酶制剂可转化为产物的底物的摩尔数。比活性通常表示为单元(U)/mg蛋白质。

如本文所使用的，“序列同一性百分比”意指当使用具有默认参数的CLUSTAL W算法比对时，特定序列具有与指定的参比序列中的氨基酸残基相同的至少一定百分比的氨基酸残基。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTALW算法的默认参数是：

与参比序列相比，缺失被视为不同一的残基。包括在任一末端发生的缺失。例如，相对于成熟多肽，具有成熟617残基多肽的C-末端的五个氨基酸缺失的变体将具有99％的序列同一性百分比(612/617相同的残基×100，四舍五入到最接近的整数)。此类变体将被与成熟多肽具有“至少99％序列同一性”的变体所涵盖。

“融合”多肽序列通过两个受试多肽序列之间的肽键连接，即有效地连接。

术语“丝状真菌”是指所有丝状形式的真菌亚门(Eumycotina)，特别是子囊菌亚门(Pezizomycotina)物种。

术语“约”是指参考值的±5％。

“乳糖酶处理的奶(lactase treated milk)”意指经乳糖酶处理以减少乳糖量的奶。

“降乳糖奶(reduced lactose milk)”意指其中乳糖的百分比为约2％或更低的奶。

“无乳糖奶”意指其中乳糖的百分比为约0.5％或更低的奶。

术语“GTFJ”意指具有如SEQ ID NO:1所示的序列的葡糖基转移酶。

术语“GTF300”意指具有如SEQ ID NO:2所示的序列的葡糖基转移酶。

如本文所使用的术语酸奶或发酵奶制品的“质地”意指酸奶厚度和/或口感的感官知觉或两者。质地的“改善”意指厚度增加和/或口感的感官知觉增强或两者。除非另有说明，如本文所使用的酸奶或发酵奶饮料的“厚度”意指以10Hz的剪切速率提取的表观黏度。因此，在10Hz的剪切速率下表观黏度的增加表明厚度的增加。以200Hz的剪切速率提取的表观黏度与“口感”相关。因此，在200Hz的剪切速率下表观黏度的增加表明口感的增加。

额外的突变

在一些实施例中，本发明的葡糖基转移酶进一步包括可提供另外的性能或稳定性益处的一个或多个突变。示例性的性能益处包括但不限于：增加的热稳定性、增加的储存稳定性、增加的溶解度、改变的pH曲线、增加的比活性、经修饰的底物特异性、经修饰的底物结合、经修饰的pH依赖性活性、经修饰的pH依赖性稳定性、增加的氧化稳定性、和增加的表达。在一些情况下，性能益处是在相对较低的温度下实现的。在一些情况下，性能益处是在相对较高的温度下实现的。

此外，本发明的葡糖基转移酶可以包含任何数量的保守氨基酸取代。下表中列出了示例性保守氨基酸取代。

保守氨基酸取代

读者将理解，一些前述保守突变可以通过遗传操作产生，而其他通过用遗传或其他方式将合成的氨基酸引入多肽中产生。

本发明的葡糖基转移酶可以是“前体”、“未成熟”或“全长”的，在这种情况下，它们包含信号序列；或“成熟”的，在这种情况下，它们缺乏信号序列。成熟形式的多肽通常是最有用的。除非另有说明，否则本文使用的氨基酸残基编号是指相应葡糖基转移酶多肽的成熟形式。只要所得的多肽保留葡糖基转移酶活性，本发明的葡糖基转移酶多肽也可被截短以去除N-末端或C-末端。

本发明的葡糖基转移酶可以是“嵌合”或“杂合”多肽，因为其包括第一葡糖基转移酶多肽的至少一部分和第二葡糖基转移酶多肽的至少一部分。本发明的葡糖基转移酶多肽可进一步包括异源信号序列，即允许跟踪或纯化等的表位。示例性异源信号序列来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(AmyE或AprE)、和链霉菌属(Streptomyces)CelA。

葡糖基转移酶的产生

本发明的葡糖基转移酶可以在宿主细胞中产生，例如通过分泌或细胞内表达。在将葡糖基转移酶分泌到细胞培养基中后，可以获得包含葡糖基转移酶的培养细胞材料(例如，全细胞培养液)。任选地，葡糖基转移酶可以从宿主细胞中分离，或甚至从细胞培养液中分离，这取决于最终葡糖基转移酶所需的纯度。可以根据本领域熟知的方法克隆和表达编码葡糖基转移酶的基因。合适的宿主细胞包括细菌、真菌(包括酵母和丝状真菌)和植物细胞(包括藻类)。特别有用的宿主细胞包括黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。其他宿主细胞包括细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，以及链霉菌属(Streptomyces)和大肠杆菌(E.Coli)。

宿主细胞还可以表达编码同源或异源葡糖基转移酶(即，与宿主细胞不同物种的葡糖基转移酶)或一种或多种其他酶的核酸。葡糖基转移酶可以是变体葡糖基转移酶。另外，宿主可以表达一种或多种辅酶、蛋白质、肽。

载体

可以构建包含编码葡糖基转移酶的核酸的DNA构建体以在宿主细胞中表达。由于遗传密码中熟知的简并性，编码相同氨基酸序列的变体多核苷酸可以用常规技术进行设计和制备。优化用于特定宿主细胞的密码子也是本领域熟知的。可以将编码葡糖基转移酶的核酸掺入载体。可以使用熟知的转化技术(例如以下公开的那些)将载体转移至宿主细胞中。

载体可以是可以转化到宿主细胞中并在宿主细胞内复制的任何载体。例如，包含编码葡糖基转移酶的核酸的载体可以在作为繁殖和扩增载体的手段的细菌宿主细胞中转化并复制。载体也可以被转化到表达宿主中，使得编码核酸可以被表达为功能性葡糖基转移酶。用作表达宿主的宿主细胞可以包括，例如，丝状真菌。

可以将编码葡糖基转移酶的核酸有效地连接到适合的启动子，其允许在宿主细胞中转录。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以来源于编码与宿主细胞同源抑或异源的蛋白质的基因。用于指导编码葡糖基转移酶的DNA序列的转录(特别是在细菌宿主中)的示例性启动子是大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于在真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是衍生自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米氏根瘤菌(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米氏根瘤菌脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉三糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。当编码葡糖基转移酶的基因在细菌物种(如大肠杆菌)中表达时，可以从，例如，包括T7启动子和噬菌体λ启动子的噬菌体启动子中选择适合的启动子。用于在酵母物种中表达的适合的启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子以及毕赤酵母(Pichia pastoris)AOX1或AOX2启动子。cbh1是来自里氏木霉的内源诱导型启动子。参见Liu等人(2008)“Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei bycellobiohydrolase I gene(cbh1)promoter optimization[纤维二糖水解酶I基因(cbh1)启动子优化改善里氏木霉中的异源基因表达],”Acta Biochim.Biophys.Sin(Shanghai)[生物化学与生物物理学报(上海)]40(2):158-65。

编码序列可以有效地连接到信号序列。编码信号序列的DNA可以是与待表达的葡糖基转移酶基因天然相关或来自不同属或物种的DNA序列。可以将包含DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列引入真菌宿主细胞，并且可以来源于相同的来源。例如，信号序列是有效地连接到cbh1启动子的cbh1信号序列。

表达载体还可以包含合适的转录终止子，以及在真核生物中，包含有效地连接至编码变体葡糖基转移酶的DNA序列的聚腺苷酸化序列。终止序列和聚腺苷酸化序列可以适当地来源于与启动子相同的来源。

所述载体可以进一步包含使得所述载体能够在宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、和pIJ702的复制起点。

载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可以包含曲霉属选择标记，例如amdS、argB、niaD和xxsC，引起潮霉素抗性的标记，或者选择可以通过共转化(如本领域已知的)实现。参见，例如，国际PCT申请WO 91/17243。

细胞内表达在某些方面可能是有利的，例如，当使用某些细菌或真菌作为宿主细胞产生大量葡糖基转移酶用于随后的富集或纯化时。葡糖基转移酶的细胞外分泌至培养基中还可用于制备包含分离的葡糖基转移酶的培养的细胞材料。

表达载体典型地包括克隆载体的组分，例如像允许载体在选择的宿主生物体中自主复制的元件和用于选择目的一个或多个表型可检测的标记。表达载体通常包含控制核苷酸序列，例如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地抑制子基因或一个或多个激活子基因。另外，表达载体可包含编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列能够将葡糖基转移酶靶向宿主细胞细胞器(如过氧化物酶体)或靶向具体宿主细胞区室。这样的靶向序列包括但不限于序列SKL。对于在控制序列的指导下进行表达，将葡糖基转移酶的核酸序列以关于表达的适当方式与控制序列有效地连接。

用于分别连接编码葡糖基转移酶的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件，并将它们插入到含有复制所需信息的适合的载体中的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港实验室],1989,和第3版,2001)。

宿主细胞的转化和培养

包含DNA构建体或表达载体的分离的细胞有利地用作重组产生葡糖基转移酶的宿主细胞。通过将DNA构建体(以一或多个拷贝)整合到宿主染色体中，可以方便地用编码酶的DNA构建体转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能在细胞中稳定保持。可以根据常规方法，例如，通过同源或异源重组，将DNA构建体整合到宿主染色体中。可替代地，可以用如上所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。

适合的细菌宿主生物的实例是革兰氏阳性细菌物种，如芽孢杆菌属(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(原嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；链霉菌属(Streptomyces)物种，如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；乳酸细菌物种，包括乳球菌属物种(Lactococcus sp.)，如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)；明串珠菌属物种(Leuconostoc sp.)；片球菌属物种(Pediococcus sp.)；和链球菌属物种(Streptococcus sp.)。可替代地，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物。

适合的酵母宿主生物可以选自生物技术相关的酵母物种，例如但不限于酵母物种，如毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、汉逊酵母属物种(Hansenula sp.)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowinia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种或者酵母属(Saccharomyces)物种，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或者属于裂殖酵母属的物种，例如，粟酒裂殖酵母(S.pombe)。甲基营养型酵母物种菌种毕赤酵母可以用作宿主生物。可替代地，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适合的宿主生物包括曲霉属(Aspergillus)的物种，例如，黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillustubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。可替代地，镰刀菌属(Fusarium)物种(例如，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum))或根瘤菌属(Rhizomucor)物种(如米氏根瘤菌(Rhizomucor miehei))的菌种可以用作宿主生物。其他适合的菌株包括嗜热菌属(Thermomyces)和毛霉菌属(Mucor)物种。此外，木霉属物种可以用作宿主。转化曲霉属宿主细胞的适合的程序包括，例如，EP 238023中描述的程序。真菌宿主细胞表达的葡糖基转移酶可以被糖基化，即，将包含糖基部分。糖基化模式可以与野生型葡糖基转移酶中存在的相同或不同。糖基化的类型和/或程度可能改变酶和/或生化特性。

从表达宿主缺失基因是有利的，其中可以通过转化的表达载体治愈基因缺陷。已知方法可用于获得具有一种或多种失活基因的真菌宿主细胞。可以通过完全或部分缺失，通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式使得所述基因被阻止表达功能性蛋白来完成基因灭活。已克隆的、来自木霉属物种或其他丝状真菌宿主的基因可以缺失，例如，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。基因缺失可通过本领域已知方法通过将待失活的所需基因的形式插入质粒中来完成。

将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括技术例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，例如脂质转染介导的和DEAE-糊精介导的转染；与磷酸钙DNA沉淀一起孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；以及原生质体融合。通用转化技术是本领域已知的。参见，例如Sambrook等人(2001)，同上。异源蛋白质在木霉属中的表达描述于例如美国专利号6,022,725。对于曲霉属菌种的转化，还参考了Cao等人(2000)Science[科学]9:991-1001。可以用载体系统构建遗传稳定的转化体，由此编码葡糖基转移酶的核酸被稳定整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知技术选择并纯化转化体。

表达

产生葡糖基转移酶的方法可以包括在有利于产生所述酶的条件下如上所述培养宿主细胞，并从细胞和/或培养基中回收所述酶。

用于培养细胞的培养基可以是适合于所考虑的宿主细胞生长并获得葡糖基转移酶表达的任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分可从商业供应商获得或可以根据公开的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中所述)来制备。

从宿主细胞中分泌的酶可以用于全培养液制剂中。在本发明的方法中，可以使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的用过的全发酵液的制备，从而导致葡糖基转移酶的表达。因此，发酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基和允许葡糖基转移酶能够被表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)。术语“用过的全发酵液”在本文中定义为包括培养基、胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应当理解，术语“用过的全发酵液”还涵盖已经使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。

从宿主细胞中分泌的酶可方便地通过熟知的程序从培养基中回收，所述程序包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，并借助于盐(例如硫酸铵)沉淀培养基的蛋白质组分，然后使用色谱法，例如离子交换色谱法、亲和色谱法等。

可以将在载体中编码葡糖基转移酶的多核苷酸有效地连接到控制序列，所述控制序列能够通过宿主细胞提供编码序列的表达，即所述载体是表达载体。可以例如通过添加其他转录调控元件来修饰控制序列，以使由控制序列指导的转录水平对转录调节因子更有应答。控制序列尤其可以包含启动子。

宿主细胞可以在允许表达葡糖基转移酶的合适条件下培养。所述酶的表达可以是组成型的，使得它们能被连续产生，或诱导型的，需要刺激来启动表达。在诱导型表达的情况下，当需要时可通过例如向培养基中添加诱导物质，例如地塞米松或IPTG或槐糖来启动蛋白质生产。多肽也可以在体外无细胞系统(例如TNT^TM(普洛麦格公司(Promega))兔网织红细胞系统)中重组生产。

富集和纯化葡糖基转移酶的方法

发酵、分离和浓缩技术是本领域熟知的，并且可使用常规方法来制备含葡糖基转移酶多肽的溶液。

发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种悬浮固体(包括剩余的粗发酵材料)，以便获得葡糖基转移酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心然后超滤、提取或色谱法等。

期望浓缩含葡糖基转移酶多肽的溶液以优化回收。使用未浓缩的溶液需要增加孵育时间以收集富集或纯化的酶沉淀物。

使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液，直至获得所需的酶水平。含酶溶液的浓缩可以通过在本文中所讨论的技术中的任一种来实现。富集和纯化的示例性方法包括但不限于旋转鼓式真空过滤和/或超滤。

GTF酶

通过向适当的蔗糖溶液中添加GTF酶而产生的葡聚糖聚合物可以是可溶性的或不溶性的。葡聚糖的溶解度取决于许多因素，包括α1,3键的百分比、α1,6键合的百分比和聚合物长度(DP_n)。参见例如美国专利号8,871,474，其通过引用以其全文并入本文(‘474专利)。

GTF的其他产物(副产物)可以包括葡萄糖(其中葡萄糖从葡糖基-GTF酶中间体复合物水解)、各种可溶性低聚糖(DP2-DP7)、以及明串珠菌二糖(其中葡糖基-gtf酶中间体复合物的葡萄糖连接到果糖)。明串珠菌二糖是由通过α-1,5键连接的葡萄糖和果糖构成的二糖。葡糖基转移酶的野生型形式通常(在N-末端至C-末端方向上)含有信号肽、可变结构域、催化结构域、和葡聚糖结合结构域。

例如，在本发明的某些实施例中，葡糖基转移酶可以衍生自链球菌属(Streptococcus)物种、明串珠菌属(Leuconostoc)物种或乳杆菌属(Lactobacillus)物种。可衍生葡糖基转移酶的链球菌属物种的实例包括唾液链球菌(S.salivarius)、表兄链球菌(S.sobrinus)、牙链球菌(S.dentirousetti)、汗毛链球菌(S.downei)、变异链球菌(S.mutans)、口腔链球菌(S.oralis)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)和血链球菌(S.sanguinis)。可衍生葡糖基转移酶的明串珠菌属物种的实例包括肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)、阿米巴氏明串珠菌(L.amelibiosum)、阿根廷明串珠菌(L.argentinum)、肉明串珠菌(L.carnosum)、柠檬明串珠菌(L.citreum)、乳脂明串珠菌(L.cremoris)、葡聚糖明串珠菌(L.dextranicum)和果糖明串珠菌(L.fructosum)。可衍生葡糖基转移酶的乳杆菌属物种的实例包括嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、干酪乳杆菌(L.casei)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、清酒乳杆菌(L.sakei)、短乳杆菌(L.brevis)、布赫内氏乳杆菌(L.buchneri)、发酵乳杆菌(L.fermentum)和罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)。

根据本发明的一个方面，已经确定产生不溶性葡聚糖的GTF酶是特别优选的。不溶性葡聚糖是不溶于水溶液的葡聚糖。如‘474专利中所述，不溶性葡聚糖聚合物往往具有相对于α1,6键而言较高百分比的α1,3键，且DP_n至少为100。根据本发明的一个方面，以下GTF酶可用于形成不溶性葡聚糖聚合物：GTFJ、GTF300、GTF0874、6855、2379、7527、1724、0544、5926、4297、5618、2765、0427、2919、2678、和3929。

本发明的优选实施例

根据本发明的一个方面，提供了一种使用葡糖基转移酶在乳制品中产生葡萄糖聚合物以提供增加的质地的方法。所述方法从形成的葡萄糖聚合物提供高的、坚固和光滑的质地。如上所述，在本发明的上下文中，质地意指厚度和/或口感。如上所述，淀粉在酸奶工业中广泛使用以为酸奶提供质地。本发明的方法令人惊讶地提供了淀粉和其他稳定剂的替代品，用于增加酸奶的质地。

根据本发明的一个方面，添加的蔗糖被转化为葡萄糖聚合物和果糖。当葡萄糖聚合物增加酸奶的质地时，果糖使酸奶具有果糖甜味。果糖不仅改善了酸奶的质地，还增强了酸奶的适口性和味道。

在某些司法管辖区域，例如酶等组分可能需要将最终产品标记为具有该组分作为成分。在本发明的一方面，因为奶可以加热(包括巴氏杀菌)使GTF失活，所以可以将GTF视为加工助剂。令人惊讶地，已经发现，由本发明提供的增加的质地不会被加热(甚至在高达95℃加热6分钟)破坏。

在本发明的另一个方面中，发现在中性pH在奶中产生的葡萄糖聚合物可能具有不均衡或不均匀的外观。在发酵过程期间接种培养物后，pH下降，并且发现发酵期间存在的葡萄糖聚合物具有更均匀、有光泽的外观。

如上所述，经常将稳定剂添加到酸奶中以增加质地。除了由于成分的成本而增加费用外，当将酸奶倒入较小的容器中以分配到消费者时，添加的稳定剂(例如淀粉)需要特殊的处理程序。酸奶制造商通常必须将酸奶冷却至8℃之后再运出以分配到商店。尽管可以使用冷却板快速分批冷却酸奶，但对于含有稳定剂的酸奶不可行。如果含有稳定剂的酸奶在填充到供消费者购买的独立容器前分批冷却至8℃，那么由该稳定剂提供的质地将在填充过程期间被剪切力破坏。以这种方式损失的质地无法恢复，从而破坏了最初添加稳定剂的全部意义。

含稳定剂的酸奶必须填充到20℃至25℃的容器中。一旦含有稳定剂的酸奶被填充到容器中，它可以被冷却至约8℃并运输。然而，这种方式的冷却较慢，并且在提供冷却设备方面导致运输延迟和费用增加。

根据本发明的一个方面，人们发现含有产生的葡萄糖聚合物的酸奶可在填充前冷却至5℃。此特征可节省大量成本。

在本发明的另一方面，可以将含有产生的葡萄糖聚合物的酸奶与稳定剂(例如淀粉或果胶)组合，以提供长保质期、高度稳定、质地增加的酸奶。稳定剂也可用于防止因在低pH加热酸奶而引起的蛋白质沉淀。

酸奶的蛋白质和脂肪含量可以出于成本和/或感知健康原因的考虑而改变。例如，脂肪为酸奶提供质地和期望的味道。然而，出于健康原因，消费者可能更喜欢低脂酸奶或甚至脱脂酸奶。根据本发明产生的葡萄糖聚合物可以通过减少或消除脂肪来弥补质地损失。增加酸奶蛋白质含量也是增加质地的一种方法。然而，增加酸奶蛋白质含量会产生费用。根据本发明，已经发现，本发明的葡萄糖聚合物可以代替所添加的蛋白质提供质地或提供所添加的蛋白质之外的质地。

根据本发明的一个方面，提出了一种用于制备具有改善的质地的酸奶产品的方法，改善的质地为增加的厚度和/或口感，所述方法具有以下步骤：提供奶；向所述奶中添加蔗糖以形成增甜奶；使所述增甜奶与葡糖基转移酶接触以形成不溶性葡萄糖聚合物；接种起子培养物；以及发酵以提供所述具有改善的质地的酸奶产品，所述改善的质地为增加的厚度和/或增加的口感。

优选地，所述奶是牛奶。优选地，所述奶选自由以下组成的组：生奶、预巴氏杀菌的奶、全脂奶、脱脂奶、复原奶、乳糖酶处理的奶、降乳糖奶、无乳糖奶和炼奶。在其他优选的实施例中，所述奶是生奶。

优选地，所述方法具有将所述奶均质化和巴氏杀菌的额外的步骤。在本发明的一个优选的方面，所述与葡糖基转移酶接触的步骤在均质化和巴氏杀菌步骤之后进行。在又另一个优选的实施例中，所述与葡糖基转移酶接触的步骤在均质化和巴氏杀菌步骤之前进行。

优选地，添加所述蔗糖以构成约0.1％至12％(w/w)。更优选地，添加所述蔗糖以构成约2％至8％(w/w)。在仍更优选的实施例中，添加所述蔗糖以构成约4％至6％(w/w)。

优选地，所述葡糖基转移酶是与选自由以下组成的组的酶具有至少70％序列同一性的酶：GTFJ(SEQ ID NO:1)、GTF300(SEQ ID NO:2)、GTF0874(SEQ ID NO:3)、GTF6855(SEQID NO:4)、GTF2379(SEQ ID NO:5)、GTF7527(SEQ ID NO:6)、GTF1724(SEQ ID NO:7)、GTF0544(SEQ ID NO:8)、GTF5926(SEQ ID NO:9)、GTF4297(SEQ ID NO:10)、GTF5618(SEQID NO:11)、GTF2765(SEQ ID NO:12)、GTF2919(SEQ ID NO:13)、GTF2678(SEQ ID NO；14)、和GTF3929(SEQ ID NO:15)。更优选地，所述葡糖基转移酶是与选自由以下组成的组的酶具有至少80％序列同一性的酶：GTFJ(SEQ ID NO:1)、GTF300(SEQ ID NO:2)、GTF0874(SEQ IDNO:3)、GTF6855(SEQ ID NO:4)、GTF2379(SEQ ID NO:5)、GTF7527(SEQ ID NO:6)、GTF1724(SEQ ID NO:7)、GTF0544(SEQ ID NO:8)、GTF5926(SEQ ID NO:9)、GTF4297(SEQ ID NO:10)、GTF5618(SEQ ID NO:11)、GTF2765(SEQ ID NO:12)、GTF2919(SEQ ID NO:13)、GTF2678(SEQ ID NO；14)、和GTF3929(SEQ ID NO:15)。仍更优选地，所述葡糖基转移酶是与选自由以下组成的组的酶具有至少90％序列同一性的酶：GTFJ(SEQ ID NO:1)、GTF300(SEQ IDNO:2)、GTF0874(SEQ ID NO:3)、GTF6855(SEQ ID NO:4)、GTF2379(SEQ ID NO:5)、GTF7527(SEQ ID NO:6)、GTF1724(SEQ ID NO:7)、GTF0544(SEQ ID NO:8)、GTF5926(SEQ ID NO:9)、GTF4297(SEQ ID NO:10)、GTF5618(SEQ ID NO:11)、GTF2765(SEQ ID NO:12)、GTF2919(SEQID NO:13)、GTF2678(SEQ ID NO；14)、和GTF3929(SEQ ID NO:15)。在又更优选的实施例中，所述葡糖基转移酶是与以下具有至少95％序列同一性的酶：GTFJ(SEQ ID NO:1)、GTF300(SEQ ID NO:2)、GTF0874(SEQ ID NO:3)、GTF6855(SEQ ID NO:4)、GTF2379(SEQ ID NO:5)、GTF7527(SEQ ID NO:6)、GTF1724(SEQ ID NO:7)、GTF0544(SEQ ID NO:8)、GTF5926(SEQ IDNO:9)、GTF4297(SEQ ID NO:10)、GTF5618(SEQ ID NO:11)、GTF2765(SEQ ID NO:12)、GTF2919(SEQ ID NO:13)、GTF2678(SEQ ID NO；14)、和GTF3929(SEQ ID NO:15)。在仍更优选的实施例中，所述葡糖基转移酶选自由以下组成的组：GTFJ(SEQ ID NO:1)、GTF300(SEQID NO:2)、GTF0874(SEQ ID NO:3)、GTF6855(SEQ ID NO:4)、GTF2379(SEQ ID NO:5)、GTF7527(SEQ ID NO:6)、GTF1724(SEQ ID NO:7)、GTF0544(SEQ ID NO:8)、GTF5926(SEQ IDNO:9)、GTF4297(SEQ ID NO:10)、GTF5618(SEQ ID NO:11)、GTF2765(SEQ ID NO:12)、GTF2919(SEQ ID NO:13)、GTF2678(SEQ ID NO；14)、和GTF3929(SEQ ID NO:15)。仍更优选地，所述葡糖基转移酶是GTFJ(SEQ ID NO:1)。

优选地，所述葡糖基转移酶以约0.005mg/100ml奶至15mg/100ml奶的量存在于所述奶中。更优选地，所述葡糖基转移酶以约0.03mg/100ml奶至约12.5mg/100ml奶的量存在。

优选地，所述GTFJ以约0.033mg/100ml奶至约12.5mg/100ml奶的量存在。更优选地，所述GTFJ以约0.3mg/100ml奶至约5.0mg/100ml奶的量存在。

在其他优选的实施例中，所述葡糖基转移酶是GTF300(SEQ ID NO:2)。优选地，所述GTF300以约0.033mg/100ml至约12.5mg/100ml奶的量存在。更优选地，所述GTF300以约0.3mg/100ml奶至约5mg/100ml奶的量存在。

优选地，所述增加的质地是增加的厚度。优选地，与对照样品(不加GTF酶)相比，所述厚度增加30％或更多。更优选地，所述厚度增加50％或更多。仍更优选地，所述厚度增加70％或更多。在又更优选的实施例中，所述厚度增加90％或更多。更优选地，所述厚度增加100％或更多。仍更优选地，所述厚度增加110％或更多。在最优选的实施例中，所述厚度增加120％或更多。

在其他优选的实施例中，所述增加的质地是增加的口感。优选地，与对照样品(不加GTF酶)相比，所述口感增加30％或更多。更优选地，所述口感增加50％或更多。仍更优选地，所述口感增加70％或更多。在又更优选的实施例中，所述口感增加90％或更多。仍更优选地，所述口感增加100％或更多。在又更优选的实施例中，所述口感增加110％或更多。在最优选的实施例中，所述口感增加120％或更多。

根据本发明的一个方面，所述奶是低脂奶，以提供低脂酸奶。在本发明的一个更优选的方面中，所述奶是脱脂奶，以提供脱脂酸奶。

在本发明的另一个优选方面中，将所述奶的蛋白质含量调节至至少约3％(w/w)。更优选地，将所述奶的蛋白质含量调节至至少约3.5％。仍更优选地，将所述奶的蛋白质含量调节至至少约3.7％(w/w)。在其他优选的实施例中，将所述奶的蛋白质含量调节至至少约3.8％(w/w)。在仍更优选的实施例中，将所述奶的蛋白质含量调节至至少约3.9％(w/w)。在其他还优选的实施例中，将所述奶的蛋白质含量调节至至少约4.0％(w/w)。

在本发明的另一个方面，所述方法包括以下的进一步步骤：将所述酸奶冷却至5℃至10℃的温度以提供冷冻的酸奶；以及将所述冷冻的酸奶倒入预成型的容器中。优选地，所述容器提供一人份的酸奶。本发明该方面的优选实施例如上所述。

在本发明的另一个方面中，提出了一种根据上述方法中任一项制备的酸奶。优选地，所述酸奶含有果胶。

在本发明的另一个方面中，所述奶包含至少4％乳糖(w/w)。优选地，所述奶包含至少4.5％乳糖。

在本发明的另一个方面中，提出了一种制备具有改善的质地的减糖食物产品(reduced sugar food product)的方法，所述方法包括以下步骤：提供包含蔗糖和乳糖的食品基质；以及使所述食品基质与葡糖基转移酶接触以形成不溶性葡萄糖聚合物。

优选地，所述食品基质中的蔗糖为约0.1％至约12％(w/w)。更优选地，所述蔗糖为约2％至约8％(w/w)。仍更优选地，所述蔗糖为约4％至约6％(w/w)。

优选地，所述食品基质中的乳糖为约0.1％至约12％(w/w)。更优选地，所述乳糖为约2％至约8％(w/w)。仍更优选地，所述乳糖为约4％至约6％(w/w)。

优选地，所述食品基质中的改善的质地是增加的厚度和/或增加的口感。

优选地，所述食品基质是乳制品、饮料、面团或面包、糖果、发酵饮料、调料、调味汁、或加工肉。

优选的葡糖基转移酶如上所述。

本文的一些实施例涉及如目前公开的方法，但是其中至少一种果糖基转移酶代替如本文公开的葡糖基转移酶使用或除本文公开的葡糖基转移酶之外还使用至少一种果糖基转移酶。本文中的“果糖基转移酶”(或“果糖蔗糖酶”)是指能够将果糖从蔗糖底物转移至糖类受体(例如蔗糖或果聚糖)，从而产生葡萄糖和果糖基化的糖类产物(例如果聚糖，如2,1-β-果聚糖[菊糖]或2,6-β-果聚糖[左聚糖(levan)])的酶。鉴于使用果糖基转移酶，本文的奶组合物的蔗糖被转化为果聚糖而不是葡聚糖，并且产生了游离葡萄糖而不是游离果糖。本文中的果糖基转移酶的实例分类在酶学委员会(E.C.)第2.4.1.9号(例如，菊粉蔗糖酶(inulosucrase))或2.4.1.99(例如，左聚糖蔗糖酶(levansucrase))下的那些。另外的实例包括果糖基转移酶，如美国专利号5952205、5641667和6872555中任一项公开的，将所述专利通过引用并入本文。预期在乳制品或其他食物产品中原位使用果糖基转移酶产生果聚糖允许产生具有至少改善的质地、膳食纤维、和/或益生元品质的产品。可替代地，可以将果聚糖直接添加至乳制品或其他食物产品中；例如，这种果聚糖可以是任何前述果糖基转移酶的产物。

本文的一些实施例涉及如目前公开的方法，但是其中至少一种葡聚糖蔗糖酶代替如本文公开的葡糖基转移酶使用或除本文公开的葡糖基转移酶之外还使用至少一种葡聚糖蔗糖酶。本文的葡聚糖蔗糖酶是指能够从蔗糖合成右旋糖酐(例如，包含至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％α-1,6糖苷键的水溶性α-葡聚糖)和果糖的葡糖基转移酶类型，并且通常归类于EC 2.4.1.5下。在一些方面，葡聚糖蔗糖酶可产生具有约、至少约、或不大于约2500万、5000万、1亿、2亿、5亿或8.5亿道尔顿的重均分子量(Mw)的右旋糖酐。在一些情况下，葡聚糖蔗糖酶可以产生包含以下的右旋糖酐：(i)约87wt％-93wt％在位置1和6处连接的葡萄糖；(ii)约0.1wt％-1.2wt％在位置1和3处连接的葡萄糖；(iii)约0.1wt％-0.7wt％在位置1和4处连接的葡萄糖；(iv)约7.7wt％-8.6wt％在位置1、3和6处连接的葡萄糖；以及(v)约0.4wt％-1.7wt％在以下位置处连接的葡萄糖：(a)位置1、2和6，或(b)位置1、4和6；并且具有约5000万-2亿道尔顿的Mw和约200-280nm的z-平均回转半径。在一些情况下，葡聚糖蔗糖酶可产生具有约、至少约、或不大于约10、25、50、75、100、105、110、150、200、250、300、400、500、600、或700的聚合度(DP)或重均DP(DPw)的右旋糖酐。在一些情况下，右旋糖酐可以包含1％-50％α-1,2分支(每个分支通常是单个葡萄糖单元)，其中此类分支是在右旋糖酐合成期间由葡聚糖蔗糖酶本身(其进一步具有α-1,2分支活性)添加的。具有某些前述能力的葡聚糖蔗糖酶的实例(例如，GTF 0768、GTF 8117、GTF 6831、GTF 5604、DSR-E)如美国专利申请公开号2016/0122445、2017/0145120、2018/0282385、2017/0218093和2010/0284972中任一项公开的，将所述专利全部通过引用并入本文。预期在乳制品或其他食物产品中原位使用葡聚糖蔗糖酶产生右旋糖酐允许产生具有至少改善的膳食纤维和/或益生元品质的产品。可替代地，可以将右旋糖酐直接添加至乳制品或其他食物产品中；例如，这种右旋糖酐可以是任何前述葡聚糖蔗糖酶的产物。

本文的一些实施例涉及如目前公开的方法，但是其中至少一种生产变体(工程化的)α-1,3-葡聚糖的葡糖基转移酶代替如本文公开的葡糖基转移酶使用或除本文公开的葡糖基转移酶之外还使用至少一种生产变体(工程化的)α-1,3-葡聚糖的葡糖基转移酶。这种变体葡糖基转移酶可以产生α-1,3葡聚糖(例如，包含至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％α-1,3糖苷键的水不溶性α-葡聚糖)，并且在一些方面，葡聚糖产物与由酶的非变体对应物(例如亲本酶)产生的α-1,3-葡聚糖相比具有更低或更高的分子量，和/或以更高的产率产生。适合的亲本酶的实例在本文公开为GTF-J、GTF0874、GTF6855、GTF2379、GTF7527、GTF1724、GTF0544、GTF5926、GTF4297、GTF5618、GTF2765、GTF0427、GTF2919、GTF2678和GTF3929；值得注意的是，GTF300(SEQ IDNO:2)是GTF6855(SEQ ID NO:4)的变体。在一些方面，产生变体α-1,3-葡聚糖的葡糖基转移酶可以产生不溶性α-1,3-葡聚糖(其具有约或小于约300、280、260、240、220、200、180、160、140、120、100、80、60、50、40、30、25、20、15、或11的DP或DPw)和/或可以如美国专利申请号16/295,423(如原始提交的)中公开的，将所述专利通过引用并入本文。例如，关于产生较低分子量的α-1,3-葡聚糖(例如，DP或DPw<300)，适合的取代位点和在这些位点的具体取代的实例可以包括美国专利申请号16/295,423的表3或4中列出的与不溶性α-1,3-葡聚糖产品的DPw降低约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或85％相关的那些中任一项。例如，关于产生较高分子量的α-1,3-葡聚糖，适合的取代位点和在这些位点的具体取代的实例可以包括美国专利申请公开号2019/0078062(通过引用并入本文)的表3、4、或5中列出的与不溶性α-1,3-葡聚糖产品的DPw增加约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、或60％相关的那些中任一项。例如，关于以更高的产率产生α-1,3-葡聚糖，适合的取代位点和在这些位点的具体取代的实例可以包括美国专利申请公开号2019/0078063(通过引用并入本文)的表3、6、或7中列出的与(i)明串珠菌二糖生产降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％，和/或(ii)葡聚糖产率增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、或150％相关的那些中任一项。预期在乳制品或其他食物产品中原位使用变体葡糖基转移酶产生α-1,3-葡聚糖允许产生具有至少改善的质地、膳食纤维、和/或益生元品质的产品。可替代地，可以将如由本文的变体葡糖基转移酶产生的(或可从本文的变体葡糖基转移酶产生的)α-1,3-葡聚糖直接添加至乳制品或其他食物产品。

在一些方面，处于右旋糖酐-α-1,3-葡聚糖嵌段共聚物形式的α-1,3-葡聚糖可以直接添加至奶或其他乳制品中。此类嵌段共聚物的实例公开于国际专利申请公开号WO2017/079595或美国专利申请公开号2019/0185893中，将所述专利申请通过引用并入本文。在一些方面，右旋糖酐-α-1,3-葡聚糖嵌段共聚物的右旋糖酐组分(例如，用以产生嵌段共聚物的右旋糖酐)包含：(i)约87wt％-93wt％在位置1和6处连接的葡萄糖；(ii)约0.1wt％-1.2wt％在位置1和3处连接的葡萄糖；(iii)约0.1wt％-0.7wt％在位置1和4处连接的葡萄糖；(iv)约7.7wt％-8.6wt％在位置1、3和6处连接的葡萄糖；以及(v)约0.4wt％-1.7wt％在以下位置处连接的葡萄糖：(a)位置1、2和6，或(b)位置1、4和6；并且具有约5000万-2亿道尔顿的Mw和约200-280nm的z-平均回转半径。在一些方面，可以使用如美国专利申请公开号2016/0122445中公开的GTF 0768产生右旋糖酐-α-1,3-葡聚糖嵌段共聚物的右旋糖酐组分。在一些方面，右旋糖酐-α-1,3-葡聚糖嵌段共聚物包含约或至少约50wt％、55wt％、60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、或90wt％右旋糖酐。预期将右旋糖酐-α-1,3-葡聚糖嵌段共聚物直接添加至乳制品或其他食物产品可以为产品提供至少改善的质地、膳食纤维、和/或益生元品质。

本文的一些实施例涉及减少食物产品或食物前体产品的热量含量、和/或增加食物产品或食物前体产品的膳食纤维含量的方法。该方法可以包括在适合的条件下用第一磷酸化酶和第二磷酸化酶处理含糖类的食物产品或食物前体产品，其中所述糖类(存在于食物产品或食物前体产品中)是哺乳动物(例如，人)可消化(即热量)的糖类并包括葡萄糖，并且所述第一磷酸化酶将哺乳动物可消化的糖类转化为包括α-葡萄糖-1-磷酸盐(α-G1P)的产品，并且所述第二磷酸化酶使所述α-G1P与糖类受体反应以产生哺乳动物不消化(即非热量)的糖类。该方法减少了食物产品或食物前体产品的热量含量和/或增加了食物产品或食物前体产品的膳食纤维含量。该方法的特征可以包括例如如美国专利申请公开号2017/0327857或美国专利申请号16/383,820(如原始提交的)中公开的任一项，将所述专利申请通过引用并入本文。本文的“磷酸化酶”是指根据CAZy(碳水化合物活性酶)数据库属于糖基水解酶94(GH94)家族的特定类别的酶(cazy.org网站；参见Cantarel等人,2009,NucleicAcids Res.[核酸研究]37:D233-238，通过引用并入本文)。通常，这种磷酸化酶催化以下反应： 第一磷酸化酶用作底物以产生α-G1P的哺乳动物可消化的糖类通常包含具有一个或多个葡萄糖残基的二糖、寡糖或多糖；这样的一个或多个葡萄糖残基被第一磷酸化酶用来制备α-G1P。本文的第一磷酸化酶的实例包括淀粉磷酸化酶(EC 2.4.1.1)和蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)，其分别使用淀粉和蔗糖以产生α-G1P。本文中的第二磷酸化酶使用α-G1P(由第一磷酸化酶产生)和糖类受体来产生哺乳动物(例如人)不能消化的寡糖或多糖。这种不消化的糖类的实例是β-葡聚糖(例如，包含至少约90％、95％或100％的β-糖苷键的寡糖或多糖)。在一些方面，本文的糖类受体包含β-1,4糖苷键和/或第二磷酸化酶是产生β-1,4-葡聚糖(例如，包含至少约90％、95％或100％的β-1,4糖苷键)的纤维糊精磷酸化酶。在一些方面，糖类受体包含β-1,3糖苷键，且第二磷酸化酶是产生β-1,3-葡聚糖(例如，包含至少约90％、95％或100％的β-1,3糖苷键)的β-1,3-葡聚糖磷酸化酶。在一些方面，用第一磷酸化酶和第二磷酸化酶同时处理食物产品或食物前体产品，或以逐步(step-wise)方式从第一磷酸化酶开始处理食物产品或食物前体产品。

根据本发明的另一方面，发现用葡糖基转移酶处理含有含蔗糖乳制品的产品将蔗糖转化为聚葡萄糖和果糖。这导致最终乳制品中总糖分子(蔗糖、果糖、葡萄糖等)的重量浓度降低。产生的聚葡萄糖可以是连接葡萄糖环中碳1至6的α或β葡萄糖键。具体地讲，对于α(1-3)葡聚糖而言，聚合度高于5时，它变得不溶且可以用作膳食纤维而有益健康。

在本发明的另一个方面中，提出了一种减少食物产品或食物前体产品的热量含量、和/或增加食物产品或食物前体产品的膳食纤维含量的方法，所述方法包括以下步骤：在适合的条件下用葡糖基转移酶处理含有蔗糖的食物产品或食物前体产品，以将所述食物产品或食物前体产品的蔗糖转化为α-葡聚糖，从而减少所述食物产品或食物前体产品的热量含量和/或增加所述食物产品或食物前体产品的膳食纤维含量。

优选地，在所述处理步骤之后的食物产品或食物前体产品中蔗糖的重量浓度为在所述处理步骤之前存在的食物产品或食物前体产品中蔗糖的重量浓度的0％-80％。更优选地，在所述处理步骤之后的食物产品或食物前体产品中蔗糖的重量浓度为在所述处理步骤之前存在的食物产品或食物前体产品中蔗糖的重量浓度的0％-30％。

优选地，所述α-葡聚糖具有5-5000的DPw。

优选地，所述α-葡聚糖是α-1,3-葡聚糖。

更优选地，所述α-1,3-葡聚糖具有至少50％的α-1,3键和5-1600的DPw。

优选地，所述食物产品或食物前体产品包含乳成分。

用于本发明该方面的优选的糖基转移酶如上所述。

本公开在以下实例中进一步详细描述，所述实例不意欲以任何方式限制本公开所要求保护的范围。附图意在被考虑为本公开说明书和描述的组成分。提供下列实例以说明但不限制所要求保护的公开内容。

实例

实例1 GTFJ

GTFJ是衍生自具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的唾液链球菌SK126的葡糖基转移酶。GTFJ是在枯草芽孢杆菌中重组产生的。

实例2 GTF300

GTF300具有相对于GTFJ的以下主链取代：A510D:F607Y:R741S:D948G。GTF300的氨基酸序列在SEQ ID NO:2中示出。GTF300也是在枯草芽孢杆菌中重组产生的。

实例3：标准酸奶程序

通过添加来自BBA拉克塔利斯公司(Lactalis)(拉瓦勒，马耶讷省，法国)的脱脂奶粉(33％蛋白质、1.2％脂肪、54％碳水化合物)、来自(爱氏晨曦公司(Arla Foods)，丹麦)的奶油(38％脂肪)、和蔗糖(砂糖(Granulated Sugar)500，北欧糖公司(Nordic Sugar A/S)，丹麦)，将储存在4℃-6℃的预巴氏消毒(72℃持续15s)的散装共混脱脂奶(0.1％脂肪)(爱氏晨曦公司，丹麦)标准化至所需的蛋白质(％w/w)、脂肪(％w/w)和蔗糖(％w/w)含量。然后将标准化的奶在标准板式热交换巴氏杀菌器中进行巴氏杀菌和均质化。在65℃以200巴进行均质化，并在95℃进行巴氏杀菌6分钟，然后将奶冷却至43℃。以20DCU/100L的接种率用嗜热起子培养物接种奶。使用CINAC多通道pH系统(Ysebaert公司，弗雷皮永(Frépillon)，法国)进行发酵，所述系统每5分钟监测一次pH变化。进行发酵直至pH为4.60，并将产物在酸奶板式热交换器(斯必克流体技术公司(SPX Flow Technology)，萨塞克斯郡，英国)和YTRON-ZP剪切泵系统(YTRON工艺技术公司(YTRON Process Technology)，拜德恩多夫，德国)上冷却至24℃。将所得搅拌型酸奶储存在4℃-6℃以进行进一步的黏度测量。

实例4：测量表观黏度的方法

使用旋转流变测试以评估搅拌型酸奶的黏度。使用锥板测量系统，用安东帕(Anton Paar)MCR302流变仪(安东帕公司(Anton Paar GmbH)，奥斯特菲尔登，德国)获得流动曲线。测试方法是受控剪切速率测试(CSR)，其中控制剪切速率并测量所得剪切应力。施加到样品上的剪切速率间隔为0.1-200s^-1，它定义了上升曲线，而反向操作说明了下降曲线(200-0.1s^-1)。将测量点持续时间的值选择为至少与对上升曲线有效的倒数剪切速率的值一样长。测试在10℃的恒定温度下进行，并且每个样品一式两份进行分析。将水浴连接至流变仪以确保等温条件。

从流动曲线评估表观黏度，其适用于剪切应力与剪切速率之比随剪切速率变化的流体。在10Hz或200Hz的剪切速率下提取表观黏度。以剪切速率10Hz提取的表观黏度表明样品的“厚度”。以200s^-1(200Hz)的剪切速率提取的表观黏度与“口感”的感官知觉相关。

实例5：在接种步骤添加GTF300

在4升规模的酸奶生产中研究了GTF300的质地效果。将新鲜奶标准化为4.0％(w/w)蛋白质和1.0％(w/w)脂肪、8.0％(w/w)的蔗糖，如实例3所述进行均质化和巴氏杀菌。如图1中示意性地呈现，在接种步骤中添加了GTF300[2.5mg/100g奶]。分别使用YO-MIX 860、YO-MIX 495和YO-MIX 465作为起子培养物(可从杜邦公司获得)。在5℃分别储存5天和28天后，如实例4中所述通过旋转流变测试评估GTF300的质地效果。图2A至2C(5天)和图3A至3C(28天)呈现了三种不同的起子培养物发酵对未酶化的和添加GTF300的酸奶样品黏度的影响。GTF300的添加为所研究的所有三种起子培养物在整个剪切范围上提供了增强的剪切应力值。与对照相比，2.5mg GTF300/100ml奶的添加导致YM 860、YM 495、和YM 465的表观黏度在第5天分别增加103％、122％、116％。质地的增加在第28天保持不变，并且实际上是增加了。

已经确定，GTF300为酸化至pH 4.6期间添加起子培养物而形成的凝胶网络产生的质地提供了额外的质地。此外，GTF300提供的质地可以承受由发酵奶的搅拌、泵送和冷却引起的机械剪切应力，并且这种质地增加在储存5天后得以保持，并且还在酸奶的整个保质期内保持。

实例6：在热处理和均质化之前添加GTF300

如实例5所示，在接种步骤中添加GTF300时，其质地效果是明显的。研究添加GTF300和随后的质地发展是否可以在基础奶(base milk)的巴氏灭菌和均质化之前确定，并且是否可以在这种加工之后保持是有意义的。

因此，将GTF300酶[3.75mg/100ml奶]添加到有含8％(w/w％)蔗糖的基础奶中，然后在5℃孵育24小时。随后，如实例3中所述进行巴氏杀菌和均质化。生产流程如图4中示意性地呈现。分别使用YO-MIX 860、YO-MIX 495、YO-MIX 465、和YO-MIX 204作为起子培养物。保质期7天和28天后，如实例4中所述评估表观黏度。图5A-5D(7天)和图6A-6D(28天)示出了未酶化的和GTF300处理的样品的所得流动曲线。GTF300的添加使YO-MIX 860、YO-MIX 495、YO-MIX 465和YO-MIX 204的表观黏度在第7天分别增加72％、47％、62％、和51％。这种质地的增加在第28天保持，参见图6A-6D(28天)。

令人惊讶地，观察到由GTF300建立的质地效果可以抵抗均质化和巴氏杀菌工艺的机械剪切。因此，在孵育步骤期间形成的质地能够承受上述加工步骤，并且还能够承受发酵结束时冷却过程产生的剪切。

实例7：向2％和4％蔗糖酸奶中添加GTF300

在实例6中，研究了GTF300对蔗糖含量为8％的酸奶的质地效果。这促使对蔗糖含量较低的酸奶中GTF300的质地效果进行研究。因此，研究了GTF300在含2％和4％蔗糖的酸奶中的性能。

将奶分别标准化为4％(w/w)蛋白质、1％(w/w)脂肪、和2％或4％(w/w)蔗糖，并如实例3所述进行巴氏杀菌和均质化。就蔗糖含量而言，GTF300的剂量与实例6中的相同。另外，还研究了剂量加倍。将GTF300添加到奶中，然后是在5℃孵育24小时的孵育步骤，之后如图4所示进行巴氏杀菌和均质化。如实例4中所述研究了GTF300的质地性能，并且第7天的结果呈现于图7A至7B中。

GTF300的质地效果对于2％和4％的蔗糖含量都是明显的。对于含有4％蔗糖的酸奶，以1.88％蔗糖和3.76％蔗糖添加的GTF300的添加使表观黏度分别增加74％和61％。对于含有2％蔗糖的酸奶，以1.88％蔗糖和3.76％蔗糖添加GTF300使表观黏度分别增加15％和30％。

即使在降低的蔗糖水平下，也可以通过添加GTF300来大幅增加质地。

实例8：将GTF300酸奶冷却至5℃，而不是24℃

在酸奶工业中，以两相方式冷却含有稳定剂(例如淀粉)的搅拌型酸奶。首先，将发酵奶轻轻搅拌以获得均匀的基质，然后通常冷却至20℃至24℃。然后填充酸奶杯并将其冷藏储存保持10-12小时的时间段，以冷却至8℃以下。在20℃至24℃的温度用酸奶填充酸奶杯并且然后冷却对于维持由淀粉添加的质地而言至关重要。就这一点而言，将酸奶冷却至8℃并且然后填充，特别是如果在泵和板式热交换器的剪切作用下进行冷却，可能会导致酸奶凝胶变弱。此外，在储存期间可能发生乳清分离。因此，测试由在发酵奶中的GTF300形成的质地是否可以抵抗冷却至5℃以及在冷却和灌装期间可能产生的剪切力是有意义的。

将奶标准化为4％(w/w)蛋白质、2％(w/w)脂肪、和8％(w/w)蔗糖，并如实例3所述进行巴氏杀菌和均质化。如图1中示意性地呈现，在接种步骤增加了GTF300[3.75mg/100ml奶]的添加。如实例4所述，在7天后评估了GTF300(当填充至杯中时)在分别冷却至5℃和24℃的发酵奶中的质地效果。

与冷却至24℃的未酶化的酸奶样品相比，当冷却至24℃和5℃，GTF300的添加使表观黏度增强89％和92％。由GTF300提供的质地对在5℃冷却不敏感，并提供与在24℃填充的GTF300酸奶相同的质地(参见图8)。

实例9：将GTF300添加到水模型系统中

在添加乳糖(992BG100，爱氏晨曦公司，丹麦)和/或蔗糖(砂糖(Granulated Sugar)500，北欧糖公司，丹麦)的水模型系统中获得GTF300的效果。通过在磁力搅拌器上搅拌样品，将蔗糖和乳糖内容物溶解在水中。将样品保持在5℃直至黏度分析。

在5℃放置24小时后，通过测量布氏黏度(Brookfield viscosity)(转子S62，30rpm，30秒)来评估黏度。

表1.以2.5mg/100ml奶的剂量加GTF300的模型系统的布氏黏度。在5℃下24小时后评估布氏黏度(转子S61或转子S62，30rpm，30秒)。

如上所示，没有蔗糖，GTF300无法制备聚合物。如所期望的，通过在水性培养基中包含8％蔗糖来形成葡聚糖聚合物。然而，令人惊讶地，确定了在乳糖存在下葡聚糖的形成大幅增加。

实例10：在接种步骤添加GTFJ

在4升规模的酸奶生产中研究了GTFJ的质地效果。将新鲜奶和奶油标准化为4.0％(w/w)蛋白质和1.0％(w/w)脂肪、8％(w/w)蔗糖，如实例3所述进行均质化和巴氏杀菌。在接种步骤中以几种剂量(v/w％)添加GTFJ[0.33mg/100ml奶、0.66mg/100ml奶、0.98mg/100ml奶、1.31mg/100ml奶]。

所用的起子培养物是YO-MIX 860。储存7天后，如实例4所述通过旋转流变测试评估GTFJ的质地效果。图9A中呈现了第7天的未酶化的和添加GTFJ的酸奶样品的结果。GTFJ的添加在所有应用的剂量下都增强了厚度。添加0.33mg/100ml奶(0,05％酶)、0.66mg/100ml奶(0,1％酶)、0.98mg/100ml奶(0,15％酶)、1.31mg/100ml奶(0,2％酶)使厚度分别增加62％、92％、154％、和223％。在图9B中，将GTFJ的质地效果与蛋白质的质地效果进行了比较。可以看出，将GTFJ[0.98mg/100ml奶/0,15％酶]添加到3.7％蛋白质酸奶中在整个剪切速率范围上增加了剪切应力。比较了添加GTFJ[0.98mg/100ml奶]的3.7％蛋白质酸奶样品与未酶化的4.0％蛋白质酸奶样品的流动曲线，可以发现向3.7％蛋白质酸奶样品中添加GTFJ可以模拟4.0％蛋白质酸奶样品的流动曲线。3.7％未酶化的酸奶样品的表观黏度为67Pa。GTFJ的添加使表观黏度增加了45％至97Pa。4.0％未酶化的酸奶样品的表观黏度为95Pa。

实例11：乳糖掺入聚合物中及对聚合物形成速率的影响

材料和方法

样品制备和光度测量

在添加乳糖(992BG100，爱氏晨曦公司，丹麦)和/或蔗糖(砂糖(Granulated Sugar)500，北欧糖公司，丹麦)的水模型系统中研究了乳糖对GTF300的影响。通过在磁力搅拌器上搅拌样品，将蔗糖和/或乳糖内容物(各为5％)溶解在100mL水中。所有糖溶解后，将0.2％GTF300添加到样品中。将样品再混合30s，然后在25℃在不搅拌或混合的条件下孵育长达48h。另外，将含有在奶中5％蔗糖的奶样品(UHT-奶，1.5％脂肪，爱氏晨曦公司，丹麦)与含水样品同样地制备。如有必要，用乙酸将所有样品的pH调节至6.7。

孵育24h和48h后，将250μL含水样品转移至微量滴定板，并且与未添加酶的样品相比，在340nm处光度测量(Multiskan^TMFC微孔板光度计，赛默飞世尔科技公司(ThermoFischer Scientific)，美国)吸附变化。

可溶性糖的测量

分析所有样品(水样品和奶样品)的可溶性糖(乳糖和蔗糖)的组成。

糖的定量通过HPLC进行。在HPLC分析之前，将样品在水中稀释10倍，并以13.000rpm离心10分钟。随后，将475μL上清液与25μL在水中的20％核糖混合。核糖在定量和分析期间作为内标。将如此制备的样品与25μL Carrez试剂I(在100mL水中的15g三水合六氰合铁(II)酸钾)和25μL Carrez II(在100mL水中的30g七水硫酸锌)混合。将样品混合并随后以13.000rpm离心10min。之后，将280μL的上清液通过0.22μm的滤板过滤，并用于注射至HPLC。

HPLC分析在装备有DGP-3600SD双梯度分析泵、WPS-3000TSL恒温自动进样器、TCC-3000SD恒温柱温箱和RI-101折光率检测器(Shodex，JM科学公司(JM Science))的DionexUltimate 3000HPLC系统(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))上进行。使用Chromeleon数据系统软件(7.2版)进行数据采集和分析。每个样品的进样量设置为10μL。将样品保持在20℃恒温自动进样器隔室中。在70℃，使用装备有保护柱(RSO寡糖60x 10mm柱，Ag⁺4％交联，菲罗门公司(Phenomenex)，荷兰)的RSO寡糖200x 10mm柱(Ag⁺4％交联(菲罗门公司，荷兰))进行色谱分析。用重蒸馏水以0.29mL/min的流速洗脱柱。在整个分析中保持0.29mL/min的等度流速，总运行时间为65min。通过折光率检测器(RI-101，Shodex，JM科学公司)监测洗脱液，并通过相对于给定标准品的峰面积的峰面积进行定量。将待定量的糖用作定量标准。

结果

表2：加有在水中0.2％剂量的GTF300的模型系统在340nm处的吸收增加。

如上所示，在24h后，与仅含乳糖的样品相比，含有乳糖和蔗糖的样品的吸收增加了64％。相反，当乳糖作为唯一存在的糖时，未检测到吸收增加。因此，单独的乳糖不能被酶转化。然而，乳糖似乎充当糖基-酶复合物的受体，导致更快的转化/聚合物形成。然而，在48h后，仅含蔗糖的样品与含有蔗糖和乳糖的样品的吸收相当。

表3：在25℃的不同孵育时间后，加有在水或奶中0.2％剂量的GTF300的模型系统上清液中蔗糖和乳糖的浓度。

如上所示，在仅含5％乳糖和GTF300的样品中，乳糖含量稳定。乳糖作为唯一存在的糖时不会被酶转化，并且不会形成聚合物或单糖。相反，在水中的蔗糖被GTF300转化。在24h和48h后，分别检测到剩余浓度为初始蔗糖水平的52％和16％。如果水样品中同时存在蔗糖和乳糖，则24h后蔗糖水平降至其初始值的40％，并且48h后样品中未检测到蔗糖。同时，上清液中的乳糖水平在24h和48h后分别降低了11％和18％。没有检测到可表明乳糖水解的额外的葡萄糖或半乳糖。因此，乳糖能够充当糖基-酶复合物的受体。形成了含有乳糖的不溶性糖聚合物，并且上清液中的乳糖浓度降低。令人惊讶地，与含有在水中的乳糖和蔗糖的样品相比，在奶中这种作用甚至进一步增加。此处，分别在24h和48h后检测到剩余蔗糖浓度为原始值的4％和0％。乳糖浓度在24h后降低了24％，并且在48h后降低了25％。因此，奶基进一步促进了乳糖掺入。

形成的聚合物中乳糖的掺入在HPLC色谱图中也是可见的(参见图10)。通常，与不存在乳糖的蔗糖相比，在存在乳糖的情况下形成了更高量的可溶性聚合物(DP3-DP7)。此外，当存在乳糖时，可溶性聚合物随后会从柱上洗脱下来(多达30s)，并且峰不像仅蔗糖时那样对称，而是伸舌峰和/或肩峰。因此，具有相同聚合度的一种类型以上的糖聚合物在相似的时间从柱上洗脱下来。

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