一种Aptamer和上转换纳米粒修饰共聚物及合成与应用
阅读说明：本技术 一种Aptamer和上转换纳米粒修饰共聚物及合成与应用 (Aptamer and upconversion nanoparticle modified copolymer, synthesis and application ) 是由 杜永忠 王君 徐晓玲 应晓英 于 2020-12-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种Aptamer和上转换纳米粒修饰共聚物及合成与应用。Aptamer和上转换纳米粒修饰共聚物主要由Aptamer,上转换纳米粒和聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸共聚物组成,通过将聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸共聚物溶于DMSO中,然后加入均匀分散于DMSO中的氨基化上转换纳米粒,制得上转换纳米粒修饰共聚物,将两端马来酰亚胺修饰的聚乙二醇及Aptamer溶于TE缓冲液中,然后加入上转换纳米粒修饰共聚物制得目的物。所述的Aptamer和上转换纳米粒修饰共聚物无小分子细胞毒类药物参与,能在近红外光照下诱导肿瘤细胞表面受体聚集,触发凋亡信号通路,在体内外具有良好的抗肿瘤疗效。(The invention provides an Aptamer and upconversion nanoparticle modified copolymer, and synthesis and application thereof. The method mainly comprises the steps of dissolving a poly (2-hydroxyethyl methacrylate) -cinnamic acid copolymer in DMSO (dimethyl sulfoxide), adding aminated upconversion nanoparticles uniformly dispersed in the DMSO to prepare the upconversion nanoparticle modified copolymer, dissolving polyethylene glycol modified by maleimide at two ends and the Aptamer in TE buffer solution, and adding the upconversion nanoparticle modified copolymer to prepare a target object. The Aptamer and upconversion nanoparticle modified copolymer does not participate in micromolecular cytotoxic drugs, can induce the aggregation of tumor cell surface receptors under near-infrared illumination, triggers an apoptosis signal path, and has good anti-tumor curative effects in vivo and in vitro.)
技术领域
本发明属化合物及合成方法，涉及一种Aptamer和上转换纳米粒修饰共聚物及合成方法，具体涉及Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物及其合成方法，以及Aptamer和上转换纳米粒修饰共聚物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症已经成为严重威胁健康的首要问题，全球癌症死亡人数占总死亡人数的近六分之一，已经超过心脑血管发病率成为目前全世界的主要死亡原因之一。目前临床上治疗肿瘤的手段主要包括外科手术治疗、放疗、化疗以及生物免疫治疗等，此外，还有一些肿瘤辅助治疗手段如肿瘤热疗、射频治疗以及介入治疗等也在逐渐应用。虽然随着医疗科技的进展，这些治疗方法已经取得了一定效果，但是由于受到肿瘤预防机制、病因学基础研究、肿瘤早期诊断技术等因素的制约，它们在治疗肿瘤的过程中依然存在着局限性，总体形势依然严峻。
采用传统药物制剂方式给药，药物的生物药剂学性质主要受到化疗药物本身分子结构的影响，在治疗中存在疗效低、毒性大的问题。现有小分子药物体内分布的非选择性，导致了能够进入分子靶标的药物分子数量有限；而在正常组织的大量分布，又促使药物毒副作用的产生。
肿瘤的靶向治疗被认为是提高药物疗效、降低毒副作用的有效手段，主要包括分子靶向治疗，以及以载体技术为代表的靶向化疗两种。分子靶向治疗主要利用肿瘤组织或细胞具有的特异性结构分子为靶点，使用能与这些靶标分子特异性结合的药物杀伤肿瘤细胞，在发挥更强抗肿瘤活性的同时，减少对正常细胞的毒副作用。近年来开发的一系列针对肿瘤细胞增殖信号转导通路的分子靶向药物如克唑替尼、厄罗替尼和威罗菲尼等在不同的肿瘤中取得了较好的治疗效果，但其原发性或获得性耐药却限制了其临床的广泛应用。而纳米载体技术的靶向化疗，主要利用实体瘤的高通透性和滞留效应(EnhancedEermeability and Retention Effect，EPR)实现对肿瘤组织的被动靶向以及通过配体或抗体的进一步修饰，实现肿瘤组织的主动靶向。这些纳米载体药物，在时间轴上的优势是能够改变药物的释放速率，包括对于难溶性药物的增溶作用及对药物的缓释或控释作用；从空间轴上来说，其能够改变药物的体内分布，使药物在某些靶器官组织蓄积，在一定程度上减少对某些敏感组织和细胞的毒副作用。但对已成功上市的制剂研究发现，这些制剂的确发挥了增溶作用，改变了药物的体内分布，提高了药效，然而药物对于肿瘤组织的靶向效率并未达到设计的预期目标，化疗药物的毒副作用仍然无法有效避免。
受体是细胞膜上或细胞内能识别生物活性分子并与之结合的成分，它能把识别和接收的信号正确无误地放大并传递到细胞内部，进而引起生物学效应。研究表明，当细胞膜表面的受体通过多价配体交联后会引发细胞内产生一系列的生物事件，如改变神经元细胞间的通讯过程，影响体内激素的摄取及免疫系统功能，此外，还会对细胞间的黏附、激活以及凋亡等过程产生影响。有研究报道指出，表皮生长因子受体(EGFR)间的交联可能是诱导DNA合成的必要信号之一；交联人血浆样树突状细胞表面受体后可以显著调节α-干扰素的表达。此外，近年来格外引起国内外学者研究兴趣的是，当细胞膜表面高表达的非内化性受体发生高度交联后可以直接诱导肿瘤细胞发生凋亡，该过程不需要小分子细胞毒类化疗药物的参与，因而可以在杀灭肿瘤细胞的同时避免化疗药物的毒副作用，为肿瘤的治疗提供了一种新型的治疗模式。
现有利用受体交联诱导肿瘤细胞凋亡的方式主要包括以下几种：①通过对单克隆抗体(mAb)的结构进行结构改造，形成同源/异源二聚体或多聚体后靶向细胞表面高表达受体促使其发生交联。②通过单克隆抗体单体靶向细胞后，应用抗单克隆抗体(二抗)进行二次靶向来诱导细胞表面高表达受体发生交联。③在纳米医学领域中通过采用仿生策略诱导受体交联。其基本原理是通过在合成的聚合物骨架侧链上接枝具有互补序列的寡核苷酸、反向平行的的卷曲-螺旋多肽等基序，利用基序之间的互补配对进行生物识别过程。首先将部分基序通过抗体(或适配体)修饰后靶向细胞表面高表达的受体，然后将接枝有互补序列的聚合物进行二次靶向，互补结合后的寡核苷酸链或卷曲—螺旋多肽可以进一步引起细胞表面的受体发生交联，进而诱导细胞发生凋亡。但上述采用的受体交联方式都存在一定的缺陷性，如应用单克隆抗体进行受体交联需要对单抗的结构进行改造，分离提纯较复杂，技术要求高，且大部分单抗作用的发挥在很大程度上仍然需要依赖补体介导的细胞毒作用(CDC)及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，利用结构改造后的单抗作用于体内直接诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤效果的疗效受到限制；此外，为了达到更好疗效，采用仿生策略诱导受体交联通常需要将抗体(适配体)修饰部分预先靶向细胞表面的受体，再将互补部分进行二次靶向给药，容易造成脱靶效应，体内应用受到限制。
发明人前期应用可逆加成-断裂链转移(reversible addition fragmentationchain transfer，RAFT)原理，应用2-羟基乙基甲基丙烯酸酯(Hema)为原料合成了聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)，然后在其支链上引入碳碳双键，并在聚合物链的一端修饰能够靶向CD20受体的适配体，构建成为大分子单体。随后将该CD20靶向性大分子单体作用于人源Raji细胞，在引发剂过硫酸铵(APS)及四甲基乙二胺(TEMED)作用下引发大分子单体聚合，诱导Raji细胞表面高表达的CD20受体发生交联。研究结果显示，其可以有效诱导细胞发生凋亡，体外具有良好的抗肿瘤效果。但遗憾的是，碳碳双键的聚合反应需要在引发剂的催化下进行，而该引发剂具有较大的毒性，体内应用具有局限性。
上转换纳米粒子(Upconversion nanoparticles，UCNP)是一类有着反斯托克斯发射的纳米粒子，它通过吸收长波长的光而放出短波长的光，可以被穿透深度更深的近红外光激发并且拥有从紫外到近红外的多发射谱带。另外，上转换纳米材料在近红外激发并且在近红外发射的机制使其两个工作窗口都属于“生物组织光窗口”的范围及其具有稳定性好、生物毒性低和发光强度高等优点。上转换纳米粒这种可以被单一的近红外光激发，多谱带发射这一独特特性，可以成为一个理想的纳米平台用于生物成像、药物递送的追踪和组织深部的治疗，还可以将治疗与监测相结合。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种Aptamer和上转换纳米粒修饰共聚物，即Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物，其化学结构中的聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)分子中含有下式(R1)、(R2)和(R3)所表示的结构单元：
聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)的分子量为1～100kDa，其中m和n是所述聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)的聚合度(m+n＝7～769)，其侧链部分羟基被肉桂酸(R1)取代，肉桂酸接枝率为1～50％(m＝4～31)。
PEG为聚乙二醇(分子量132Da)。
R2是上转换纳米粒UCNP，粒径约为40nm，由稀土氯化盐RECl3·6H2O(RE＝79.5％钇(Y),20％镱(Yb),0.5％铥(Tm))与十八烯、油酸通过溶剂热法合成，在980nm红外光激发下可以发射出波长为280～380nm的紫外光。
R3是特异性靶向人B细胞淋巴瘤Raji细胞表面高表达CD20受体的寡核苷酸适配体Aptamer，其序列为：
5’-CTCCTCTGACTGTAACCACGCCGTATGTCCGAAATACGGAGAACAGCACTCATATGCAAGCCATACGCGGAGGTGCACGCGCATAGGTAGTCCAGAAGCC-3’。
本发明的第二个目的是提供Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的合成方法，具体通过以下方案实现：
(1)上转换纳米粒(UCNP)的合成及氨基化修饰：
以稀土氯化物为原料，通过溶剂热法制备上转换纳米颗粒(UCNP)：将1mmol稀土氯化盐RECl3·6H2O(RE＝79.5％Y,20％Yb,0.5％Tm)、15ml十八烯及6ml油酸(OA)置入100ml三口烧瓶中，在通入氩气保护的情况下，升温到160℃保持40min，确保固体物质完全溶解。然后将体系的温度自然冷却到室温，将溶有0.15g氟化铵和0.1g氢氧化钠的10mL无水甲醇混合液缓慢滴加到三口烧瓶中，在50℃、剧烈搅拌条件下反应30min，随后在通入氩气保护，减压除去反应混合液中的甲醇；待甲醇除净后，迅速升温到300℃，保持90min；反应结束后自然冷却到室温，用过量的无水乙醇沉淀产物，所得沉淀产物经无水乙醇离心洗涤3次，得到上转换纳米粒UCNP。在此基础上，采用配体交换法对UCNP进行氨基修饰：将200mg的2-氨基乙基磷酸二氢盐(AEP)分散在10ml去离子水与乙醇的混合溶液中(去离子水：乙醇＝3:1，v/v)，然后将5ml UCNP环己烷分散液(2mg/ml)逐滴滴加到上述混合溶液中，室温搅拌反应48h；离心取沉淀即得氨基修饰的UCNP。
(2)聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)的合成：精密称取0.012～0.56g 2-氰基-2-丙基苯并二硫，0.01g 4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)，量取0.95ml的2-羟基乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)及2.56ml的二氧六环，将上述混合物装入含有磁力搅拌子的25ml三颈瓶中，泵入氮气30min以除去系统中的氧气，然后将烧瓶放入已预热至80℃的油浴中，在N2保护下反应12h，随后将反应液暴露于空气中冷却至室温。最后将10倍量的预冷却乙醚加入上述反应液中沉淀产物，所的沉淀用乙醚离心清洗3次，所得固体沉淀在50℃真空干燥箱中干燥24h，得聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)固体粉末。
(3)聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸嫁接物的合成：精密称取肉桂酸6～40mg，肉桂酸摩尔数5倍量的二环己基碳二亚胺(DCC)及4-二甲氨基吡啶(DMAP)置于15ml三颈瓶中，加入5ml无水DMSO超声溶解后，在60℃下搅拌0.5h以活化羧基，然后加入50mg用2ml无水DMSO溶解的聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)，反应体系在60℃下搅拌反应24h。终反应液冷却至室温后，转移至透析袋(MWCO:1kDa)中，用纯水持续透析48h以除去副产物及未反应的DCC及DMAP。透析袋内液体经离心(2000rpm,15min)分离后，收集上清经冷冻干燥得聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸嫁接物粉末。
(4)上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的合成：精密称取聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物50mg，溶于2ml DMSO中；另取聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物摩尔数6倍量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于2ml DMSO中。将上述两溶液混合，在60℃下搅拌0.5h以活化羧基，然后加入均匀分散于DMSO中的氨基化上转换纳米粒子5ml(2mg/ml)。将上述反应体系在60℃下搅拌反应48h后，终反应液14000rpm/min离心15min，取沉淀。再加入去离子水，14000rpm/min离心15min，重复3次，去除副产物及未反应的EDC和NHS。冷冻干燥后得上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物粉末。
(5)Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的合成：采用环己胺对上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物另一端的硫酯键进行氨解，生成巯基，以两端马来酰亚胺修饰的聚乙二醇(Mal-PEG-Mal)为链接剂，通过巯基和马来酰亚胺的迈克尔加成反应，将巯基修饰的CD20靶向性适配体Aptamer修饰在聚合物链的末端，得到Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸-接枝共聚物。精密称取上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物50mg，用5ml无水四氢呋喃(THF)分散，然后加入相对于硫酯键过量的环己胺，在N2保护下室温反应12h后，终反应液用10倍过量已预冷正己烷沉淀，然后离心(14000rpm/min，15min)，并将沉淀用正己烷清洗3次，将沉淀放入真空干燥箱中烘干后置于-20℃冰箱中保存备用。将0.1μM的Mal-PEG-Mal溶于1ml的TE缓冲液(pH＝8)，然后将0.02μM溶于1mlTE缓冲液中的5’-SH-Aptamer缓慢滴加至上述溶液中，并向上述体系加入终浓度为1mM的磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)，防止巯基氧化，在37℃搅拌下反应12h。混合溶液在分子量为3.5kDa的透析袋中用去离子水持续透析24h，去除未反应的Mal-PEG-Mal。收集上述透析液，将10mg分散在5ml去离子水中的上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物分散液缓慢滴加至上述溶液中，室温下搅拌反应24h。终反应液经高速离心得Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物粉末。
本发明的第三个目的是提供Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤为B细胞淋巴瘤。
本发明在前期研究基础上，通过在合成的(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)聚合物侧链羟基上嫁接肉桂酸基团，以及在聚合物两端分别接枝特异性靶向细胞表面高表达CD20受体的Aptamer及上转换纳米粒，制备Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物。该共聚物无小分子细胞毒类药物参与，通过CD20适配体Aptamer特异性靶向Raji细胞后，应用波长为980nm的红外激发光照射肿瘤细胞或组织，可保证对肿瘤组织的深部穿透；此外，UCNP受到红外光激发产生的紫外光引发肉桂酸的光二聚反应促使CD20受体发生聚集，可诱导肿瘤细胞发生凋亡，实现肿瘤的安全高效治疗。
本发明所制备得到的Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物无小分子细胞毒类药物参与，通过适配体Aptamer特异性靶向到肿瘤细胞或组织，然后应用波长为980nm的红外激发光照射肿瘤细胞或组织，UCNP受到红外光激发产生的紫外光引发肉桂酸的光二聚反应促使细胞表面高表达受体发生聚集，可诱导肿瘤细胞发生凋亡，发挥抗肿瘤疗效，避免了化疗药物的毒副作用和多次化疗造成的肿瘤耐药性。其中UCNP的应用解决了肉桂酸光二聚反应所需的紫外光波长短、组织穿透性差的问题。
附图说明
图1.上转换纳米粒(UCNP)的理化性质表征。其中图A.上转换纳米粒(UCNP)的透射电子显微镜照片；图B.上转换纳米粒(UCNP)在环己烷溶液中的发射光谱。
图2.上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物交联前后透射电子显微镜照片。图A.上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物交联前透射电子显微镜照片；图B.上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物经980nm红外光照交联后的透射电子显微镜照片
图3.Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物细胞毒性研究。图A.Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物；图B.980nm红外光；图C.Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物加980nm红外光。
图4.荷Raji淋巴瘤细胞裸鼠肿瘤体积生长曲线。图A.生理盐水；图B.980nm红外光；图C.Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物；图D.Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物加980nm红外光。
具体实施方式
本发明结合附图和实施实例作进一步的说明。
实施例一：Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的制备
1.上转换纳米粒UCNP的合成及氨基化修饰：以稀土氯化物为原料，通过溶剂热法制备上转换纳米颗粒(UCNP)：将1mmol稀土氯化盐RECl3·6H2O(RE＝79.5％Y,20％Yb,0.5％Tm)、15ml十八烯及6ml油酸(OA)置入100ml三口烧瓶中，在通入氩气保护的情况下，升温到160℃保持40min，确保固体物质完全溶解。然后将体系的温度自然冷却到室温，将溶有0.15g氟化铵和0.1g氢氧化钠的10mL无水甲醇混合液缓慢滴加到三口烧瓶中，在50℃、剧烈搅拌条件下反应30min，随后在通入氩气保护，减压除去反应混合液中的甲醇；待甲醇除净后，迅速升温到300℃，保持90min；反应结束后自然冷却到室温，用过量的无水乙醇沉淀产物，所得沉淀产物经无水乙醇离心洗涤3次，得到上转换纳米粒UCNP。采用动态光散射法测定UCNP的平均粒径为41.5nm；应用荧光分光光度计测定UCNP在980nm红外光照射下可以发射出280-380nm的紫外光。图1为所得上转换纳米粒的透射电子显微镜照片及发射光谱。在此基础上，采用配体交换法对UCNP进行氨基修饰：将200mg的2-氨基乙基磷酸二氢盐(AEP)分散在10ml去离子水与乙醇的混合溶液中(去离子水：乙醇＝3:1，v/v)，然后将5ml UCNP环己烷分散液(2mg/ml)逐滴滴加到上述混合溶液中，室温搅拌反应48h；离心取沉淀即得氨基修饰的UCNP。
2.聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)的合成：精密称取0.012g 2-氰基-2-丙基苯并二硫，0.01g 4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)，量取0.95ml的2-羟基乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)及2.56ml的二氧六环，将上述混合物装入含有磁力搅拌子的25ml三颈瓶中，泵入氮气30min以除去系统中的氧气，然后将烧瓶放入已预热至80℃的油浴中，在N2保护下反应12h，随后将反应液暴露于空气中冷却至室温。最后将10倍量的预冷却乙醚加入上述反应液中沉淀产物，所的沉淀用乙醚离心清洗3次，所得固体沉淀在50℃真空干燥箱中干燥24h，得聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)固体粉末。通过凝胶渗透色谱法，测定聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)的平均分子量为100kDa。
3.聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸嫁接物的合成：精密称取肉桂酸6mg，肉桂酸摩尔数5倍量的二环己基碳二亚胺(DCC)及4-二甲氨基吡啶(DMAP)置于15ml三颈瓶中，加入5ml无水DMSO超声溶解后，在60℃下搅拌0.5h以活化羧基，然后加入50mg用2ml无水DMSO溶解的聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)，反应体系在60℃下搅拌反应24h。终反应液冷却至室温后，转移至透析袋(MWCO:1kDa)中，用纯水持续透析48h以除去副产物及未反应的DCC及DMAP。透析袋内液体经离心(2000rpm,15min)分离后，收集上清经冷冻干燥得聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸嫁接物粉末。经核磁共振氢谱，测定肉桂酸的接枝率为1％。
4.上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的合成：精密称取聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物50mg，溶于2ml DMSO中；另取聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物摩尔数6倍量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于2ml DMSO中。将上述两溶液混合，在60℃下搅拌0.5h以活化羧基，然后加入均匀分散于DMSO中的氨基化上转换纳米粒子5ml(2mg/ml)。将上述反应体系在60℃下搅拌反应48h后，终反应液14000rpm/min离心15min，取沉淀。再加入去离子水，14000rpm/min离心15min，重复3次，去除副产物及未反应的EDC和NHS。冷冻干燥后得上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物粉末。
5.Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的合成：采用环己胺对上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物另一端的硫酯键进行氨解，生成巯基，以两端马来酰亚胺修饰的聚乙二醇(Mal-PEG-Mal)为链接剂，通过巯基和马来酰亚胺的迈克尔加成反应，将巯基修饰的CD20靶向性适配体Aptamer修饰在聚合物链的末端，得到Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸-接枝共聚物。精密称取上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物50mg，用5ml无水四氢呋喃(THF)分散，然后加入相对于硫酯键过量的环己胺，在N2保护下室温反应12h后，终反应液用10倍过量已预冷正己烷沉淀，然后离心(14000rpm/min，15min)，并将沉淀用正己烷清洗3次，将沉淀放入真空干燥箱中烘干后置于-20℃冰箱中保存备用。将0.1μM的Mal-PEG-Mal溶于1ml的TE缓冲液(pH＝8)，然后将0.02μM溶于1mlTE缓冲液中的5’-SH-Aptamer缓慢滴加至上述溶液中，并向上述体系加入终浓度为1mM的磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)，防止巯基氧化，在37℃搅拌下反应12h。混合溶液在分子量为3.5kDa的透析袋中用去离子水持续透析24h，去除未反应的Mal-PEG-Mal。收集上述透析液，将10mg分散在5ml去离子水中的上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物分散液缓慢滴加至上述溶液中，室温下搅拌反应24h。终反应液经高速离心得Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物粉末。
实施例二：Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的制备
1.上转换纳米粒UCNP的合成及氨基化修饰：以稀土氯化物为原料，通过溶剂热法制备上转换纳米颗粒(UCNP)：将1mmol稀土氯化盐RECl3·6H2O(RE＝79.5％Y,20％Yb,0.5％Tm)、15ml十八烯及6ml油酸(OA)置入100ml三口烧瓶中，在通入氩气保护的情况下，升温到160℃保持40min，确保固体物质完全溶解。然后将体系的温度自然冷却到室温，将溶有0.15g氟化铵和0.1g氢氧化钠的10mL无水甲醇混合液缓慢滴加到三口烧瓶中，在50℃、剧烈搅拌条件下反应30min，随后在通入氩气保护，减压除去反应混合液中的甲醇；待甲醇除净后，迅速升温到300℃，保持90min；反应结束后自然冷却到室温，用过量的无水乙醇沉淀产物，所得沉淀产物经无水乙醇离心洗涤3次，得到上转换纳米粒UCNP。采用动态光散射法测定UCNP的平均粒径为41.5nm；应用荧光分光光度计测定UCNP在980nm红外光照射下可以发射出280-380nm的紫外光。在此基础上，采用配体交换法对UCNP进行氨基修饰：将200mg的2-氨基乙基磷酸二氢盐(AEP)分散在10ml去离子水与乙醇的混合溶液中(去离子水：乙醇＝3:1，v/v)，然后将5ml UCNP环己烷分散液(2mg/ml)逐滴滴加到上述混合溶液中，室温搅拌反应48h；离心取沉淀即得氨基修饰的UCNP。
2.聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)的合成：精密称取0.56g 2-氰基-2-丙基苯并二硫，0.01g 4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)，量取0.95ml的2-羟基乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)及2.56ml的二氧六环，将上述混合物装入含有磁力搅拌子的25ml三颈瓶中，泵入氮气30min以除去系统中的氧气，然后将烧瓶放入已预热至80℃的油浴中，在N2保护下反应12h，随后将反应液暴露于空气中冷却至室温。最后将10倍量的预冷却乙醚加入上述反应液中沉淀产物，所的沉淀用乙醚离心清洗3次，所得固体沉淀在50℃真空干燥箱中干燥24h，得聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)固体粉末。通过凝胶渗透色谱法，测定聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)的平均分子量为1kDa.
3.聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸嫁接物的合成：精密称取肉桂酸40mg，肉桂酸摩尔数5倍量的二环己基碳二亚胺(DCC)及4-二甲氨基吡啶(DMAP)置于15ml三颈瓶中，加入5ml无水DMSO超声溶解后，在60℃下搅拌0.5h以活化羧基，然后加入50mg用2ml无水DMSO溶解的聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)，反应体系在60℃下搅拌反应24h。终反应液冷却至室温后，转移至透析袋(MWCO:1kDa)中，用纯水持续透析48h以除去副产物及未反应的DCC及DMAP。透析袋内液体经离心(2000rpm,15min)分离后，收集上清经冷冻干燥得聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸嫁接物粉末。经核磁共振氢谱，测定肉桂酸的接枝率为50％.
4.上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的合成：精密称取聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物50mg，溶于2ml DMSO中；另取聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物摩尔数6倍量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于2ml DMSO中。将上述两溶液混合，在60℃下搅拌0.5h以活化羧基，然后加入均匀分散于DMSO中的氨基化上转换纳米粒子5ml(2mg/ml)。将上述反应体系在60℃下搅拌反应48h后，终反应液14000rpm/min离心15min，取沉淀。再加入去离子水，14000rpm/min离心15min，重复3次，去除副产物及未反应的EDC和NHS。冷冻干燥后得上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物粉末。
5.Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的合成：采用环己胺对上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物另一端的硫酯键进行氨解，生成巯基，以两端马来酰亚胺修饰的聚乙二醇(Mal-PEG-Mal)为链接剂，通过巯基和马来酰亚胺的迈克尔加成反应，将巯基修饰的CD20靶向性适配体Aptamer修饰在聚合物链的末端，得到Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸-接枝共聚物。精密称取上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物50mg，用5ml无水四氢呋喃(THF)分散，然后加入相对于硫酯键过量的环己胺，在N2保护下室温反应12h后，终反应液用10倍过量已预冷正己烷沉淀，然后离心(14000rpm/min，15min)，并将沉淀用正己烷清洗3次，将沉淀放入真空干燥箱中烘干后置于-20℃冰箱中保存备用。将0.1μM的Mal-PEG-Mal溶于1ml的TE缓冲液(pH＝8)，然后将0.02μM溶于1mlTE缓冲液中的5’-SH-Aptamer缓慢滴加至上述溶液中，并向上述体系加入终浓度为1mM的磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)，防止巯基氧化，在37℃搅拌下反应12h。混合溶液在分子量为3.5kDa的透析袋中用去离子水持续透析24h，去除未反应的Mal-PEG-Mal。收集上述透析液，将10mg分散在5ml去离子水中的上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物分散液缓慢滴加至上述溶液中，室温下搅拌反应24h。终反应液经高速离心得Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物粉末。
实施例三：Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的制备
1.上转换纳米粒UCNP的合成及氨基化修饰：以稀土氯化物为原料，通过溶剂热法制备上转换纳米颗粒(UCNP)：将1mmol稀土氯化盐RECl3·6H2O(RE＝79.5％Y,20％Yb,0.5％Tm)、15ml十八烯及6ml油酸(OA)置入100ml三口烧瓶中，在通入氩气保护的情况下，升温到160℃保持40min，确保固体物质完全溶解。然后将体系的温度自然冷却到室温，将溶有0.15g氟化铵和0.1g氢氧化钠的10mL无水甲醇混合液缓慢滴加到三口烧瓶中，在50℃、剧烈搅拌条件下反应30min，随后在通入氩气保护，减压除去反应混合液中的甲醇；待甲醇除净后，迅速升温到300℃，保持90min；反应结束后自然冷却到室温，用过量的无水乙醇沉淀产物，所得沉淀产物经无水乙醇离心洗涤3次，得到上转换纳米粒UCNP。采用动态光散射法测定UCNP的平均粒径为41.5nm；应用荧光分光光度计测定UCNP在980nm红外光照射下可以发射出280-380nm的紫外光。在此基础上，采用配体交换法对UCNP进行氨基修饰：将200mg的2-氨基乙基磷酸二氢盐(AEP)分散在10ml去离子水与乙醇的混合溶液中(去离子水：乙醇＝3:1，v/v)，然后将5ml UCNP环己烷分散液(2mg/ml)逐滴滴加到上述混合溶液中，室温搅拌反应48h；离心取沉淀即得氨基修饰的UCNP。
2.聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)的合成：精密称取0.42g 2-氰基-2-丙基苯并二硫，0.01g 4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)，量取0.95ml的2-羟基乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)及2.56ml的二氧六环，将上述混合物装入含有磁力搅拌子的25ml三颈瓶中，泵入氮气30min以除去系统中的氧气，然后将烧瓶放入已预热至80℃的油浴中，在N2保护下反应12h，随后将反应液暴露于空气中冷却至室温。最后将10倍量的预冷却乙醚加入上述反应液中沉淀产物，所的沉淀用乙醚离心清洗3次，所得固体沉淀在50℃真空干燥箱中干燥24h，得聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)固体粉末。通过凝胶渗透色谱法，测定聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)的平均分子量为32kDa。
3.聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸嫁接物的合成：精密称取肉桂酸17.63mg，肉桂酸摩尔数5倍量的二环己基碳二亚胺(DCC)及4-二甲氨基吡啶(DMAP)置于15ml三颈瓶中，加入5ml无水DMSO超声溶解后，在60℃下搅拌0.5h以活化羧基，然后加入50mg用2ml无水DMSO溶解的聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)，反应体系在60℃下搅拌反应24h。终反应液冷却至室温后，转移至透析袋(MWCO:1kDa)中，用纯水持续透析48h以除去副产物及未反应的DCC及DMAP。透析袋内液体经离心(2000rpm,15min)分离后，收集上清经冷冻干燥得聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸嫁接物粉末。经核磁共振氢谱，测定肉桂酸的接枝率为12.5％。
4.上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的合成：精密称取聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物50mg，溶于2ml DMSO中；另取聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物摩尔数6倍量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于2ml DMSO中。将上述两溶液混合，在60℃下搅拌0.5h以活化羧基，然后加入均匀分散于DMSO中的氨基化上转换纳米粒子5ml(2mg/ml)。将上述反应体系在60℃下搅拌反应48h后，终反应液14000rpm/min离心15min，取沉淀。再加入去离子水，14000rpm/min离心15min，重复3次，去除副产物及未反应的EDC和NHS。冷冻干燥后得上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物粉末。
5.Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的合成：采用环己胺对上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物另一端的硫酯键进行氨解，生成巯基，以两端马来酰亚胺修饰的聚乙二醇(Mal-PEG-Mal)为链接剂，通过巯基和马来酰亚胺的迈克尔加成反应，将巯基修饰的CD20靶向性适配体Aptamer修饰在聚合物链的末端，得到Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸-接枝共聚物。精密称取上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物50mg，用5ml无水四氢呋喃(THF)分散，然后加入相对于硫酯键过量的环己胺，在N2保护下室温反应12h后，终反应液用10倍过量已预冷正己烷沉淀，然后离心(14000rpm/min，15min)，并将沉淀用正己烷清洗3次，将沉淀放入真空干燥箱中烘干后置于-20℃冰箱中保存备用。将0.1μM的Mal-PEG-Mal溶于1ml的TE缓冲液(pH＝8)，然后将0.02μM溶于1mlTE缓冲液中的5’-SH-Aptamer缓慢滴加至上述溶液中，并向上述体系加入终浓度为1mM的磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)，防止巯基氧化，在37℃搅拌下反应12h。混合溶液在分子量为3.5kDa的透析袋中用去离子水持续透析24h，去除未反应的Mal-PEG-Mal。收集上述透析液，将10mg分散在5ml去离子水中的上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物分散液缓慢滴加至上述溶液中，室温下搅拌反应24h。终反应液经高速离心得Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物粉末。
实施例四：
1.上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物体外交联研究。
精密称取4mg实施例三中得到的上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物，分散于5ml去离子水中(800μg/ml)，然后用980nm近红外光(功率：2W/cm2)照射30min，应用透射电子显微镜观察近红外光照前后上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物的形态。结果如图2所示，近红外光照后上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物之间发生了交联，平均粒径约为300nm，粒径显著增大。
2.Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物抗肿瘤治疗作用研究
(1)Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物体外抗肿瘤疗效考察
精密称取5mg实施例三中得到的上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物，分散于1ml去离子水中(5mg/ml)。以CD20受体阳性的人B细胞淋巴瘤Raji细胞为模型细胞，将其接种于96孔板中，接种密度为5x103/孔，在孵箱中(37℃,5％CO2)培养过夜。然后每孔加入上述配置的上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物分散液，使其在细胞中的终浓度分别为50、100、200、400、800、1000μg/mL(每组浓度设置6个复孔)。在培养箱中共孵育6h后用980nm红外激光照射细胞30min(功率：2W/cm2，每照射10min间隔5min，防止培养基过热)，继续孵育24h后，采用CCK8法检测细胞存活率：往每孔受试孔加入10μL CCK-8溶液后，将培养板置于培养箱中继续孵育4h，然后用多功能酶标仪在450nm波长处检测吸光度值，按下式计算细胞生长抑制率：
细胞生长抑制率(％)＝(1-AT/AC)×100％
式中，AT为实验组450nm处的吸光值，AC为空白对照组450nm处的吸光值。结果如图3所示，与对照组相比，实验组细胞存活率显著降低，细胞生长抑制率约为77％，表明上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物在980nm红外光照下在体外具有良好的抗肿瘤活性。
(2)Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物体内抗肿瘤疗效考察。
应用实施例三中得到的Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物进行瘤内注射考察其体内抗肿瘤疗效。构建荷Raji淋巴瘤的裸鼠移植瘤模型，当肿瘤体积长至约100mm3时，将小鼠随机分成4组，每组6只。分别按照如下方式进行处理，开始治疗时记录为第0天。A组：对照组(第0、7、13天每只裸鼠瘤内注射生理盐水100μl)；B组：980nm红外光(第1、8、14天应用980nm红外光对肿瘤部位进行局部照射30min；功率：2W/cm2，每照射10min间隔5min，防止皮肤过热)；C组：Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物(第0、7、13天每只裸鼠瘤内注射总剂量为1mg的Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物)；D组：Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物加980nm近红外光照(第0、7、13天每只裸鼠瘤内注射总剂量为1mg的Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物，并于第1、8、14天应用980nm红外光对肿瘤部位进行局部照射30min；功率：2W/cm2，每照射10min间隔5min，防止皮肤过热)。对荷瘤裸鼠监测27天，隔天测量肿瘤体积，制作肿瘤体积生长曲线。结果如图4所示，与对照组相比，Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物加980nm红外光照组肿瘤生长速率显著减慢，肿瘤抑制率约为83.1％，表明Aptamer和上转换纳米粒修饰聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)-肉桂酸接枝共聚物在980nm红外光照射下具有良好的体内抗肿瘤疗效。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种Aptamer和上转换纳米粒修饰共聚物及合成与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 100
<212> DNA
<213> 根据人B细胞淋巴瘤Raji细胞表面高表达CD20受体设计的特异性靶向CD20受体的寡核苷酸序列(人工序列)
<400> 1
ctcctctgac tgtaaccacg ccgtatgtcc gaaatacgga gaacagcact catatgcaag 60
ccatacgcgg aggtgcacgc gcataggtag tccagaagcc 100