重组人胰岛素前体的酶切转换方法
阅读说明：本技术 重组人胰岛素前体的酶切转换方法 (Enzyme digestion conversion method of recombinant human insulin precursor ) 是由 聂洪霞 刘海峰 黄菁 许波 吕晓林 张金迪 解福生 郝向慧 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了重组人胰岛素前体的酶切转换方法,包括：(1)将初步纯化的重组人胰岛素前体溶液加入缓冲液进行浓度和pH值的调整得到酶切反应底物混合液；(2)向酶切反应底物混合液中加入重组赖氨酰肽内切酶进行重组人胰岛素前体的酶切转换反应。本发明选择重组赖氨酰肽链内切酶作为工具酶,与常用的重组胰蛋白酶相比,单位前体蛋白所需的酶更少,酶切位点单一,酶切过程更高效,使人胰岛素前体的酶切转换效率达到95％以上；在放大酶切时,没有过酶切的顾虑且酶切后获得的目的蛋白纯度更高；重组赖氨酰肽链内切酶酶切最适pH范围离酶切前后蛋白的pI更远,有利于目的蛋白的稳定且对酶切环境中的盐浓度耐受范围更大。(The invention discloses an enzyme digestion conversion method of a recombinant human insulin precursor, which comprises the following steps: (1) adding the preliminarily purified recombinant human insulin precursor solution into a buffer solution for adjusting the concentration and the pH value to obtain a mixed solution of enzyme digestion reaction substrates; (2) and adding recombinant lysyl endopeptidase into the enzyme digestion reaction substrate mixed solution to perform enzyme digestion conversion reaction of the recombinant human insulin precursor. The invention selects recombinant lysyl endopeptidase as tool enzyme, compared with common recombinant trypsin, the enzyme required by unit precursor protein is less, the enzyme cutting site is single, the enzyme cutting process is more efficient, and the enzyme cutting conversion efficiency of the human insulin precursor reaches more than 95%; when the enzyme digestion is amplified, the concern of enzyme digestion is avoided, and the purity of the target protein obtained after enzyme digestion is higher; the optimal pH range of the recombinant lysyl endopeptidase during enzyme digestion is farther from the pI of the protein before and after enzyme digestion, which is beneficial to the stability of the target protein and has larger tolerance range to the salt concentration in the enzyme digestion environment.)
技术领域
本发明涉及胰岛素前体的酶切转换方法，尤其涉及重组人胰岛素前体的酶切转换方法，属于重组人胰岛素前体的酶切转换领域。
背景技术
糖尿病已成为除心脑血管疾病和恶性肿瘤外，第三大威胁人力建库的慢性非传染病。据国际糖尿病联盟(IDF)2017版全球糖尿病概览评估，全球约有4.25亿20-79岁的成人患有糖尿病，其中中国糖尿病患者高达1.144亿，中国已成为全球糖尿病患者人数最多的国家。
目前胰岛素质谱是最有效的糖尿病治疗药物之一，胰岛素的问世，为广大糖尿病患者提供了更好的治疗手段，为提高患者的生活质量起到了重大作用。随着科技的发展，胰岛素的工业化生产从提取动物胰岛素、有机合成胰岛素到现如今的重组人胰岛素及其类似物，经历了巨大的变化。重组人胰岛素及其类似物的生产，一般都是以获得重组人胰岛素及其类似物的前体蛋白为基础，因此，对重组人胰岛素及其类似物的前体蛋白进行初步纯化和酶切就成为了必经的纯化步骤。如中国专利CN101253196A提到的，用胰蛋白酶切割前-胰岛素原、前-胰岛素类似物原或前-胰岛素衍生物原，其中所提到的前-胰岛素原就是胰岛素前体蛋白，但是如果该蛋白的氨基酸序列中含有精氨酸，胰蛋白酶的酶切位点为赖氨酸和精氨酸的羧基端残基，因此很有可能会产生因多切了精氨酸羧基端残基的杂蛋白产生，导致后续样品的杂质增加，增大了样品纯化的难度，且必然会导致样品收率的降低。
因此，开发一种重组人胰岛素及其类似物前体专一、高效的酶切转换方法，提高中间样品的纯度，减少生产杂质和后续纯化工艺的难度，将具有重要的市场价值和应用前景。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种重组人胰岛素前体专一、高效的酶切转换方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明公开了一种重组人胰岛素前体的酶切转换方法，包括(1)将初步纯化的重组人胰岛素前体溶液加入缓冲液进行浓度和pH值的调整得到酶切反应底物混合液；(2)向酶切反应底物混合液中加入重组赖氨酰肽内切酶进行重组人胰岛素前体的酶切转换反应。
作为本发明一种优选的
具体实施方式
，步骤(1)中将初步纯化获得的重组人胰岛素前体溶液中前体蛋白浓度控制为8-25mg/ml；更优选的，控制前体蛋白浓度为15-20mg/ml。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(1)中所述的缓冲液可以是碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液或Tris-盐酸缓冲液中的任意一种，优选为硼砂-氢氧化钠缓冲液；其中，缓冲液的浓度可以0.01-0.05mol/L；优选的，缓冲液的浓度为0.02-0.035mol/L；最优选的，缓冲液的浓度为0.025mol/L。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(1)中所述初纯化获得的重组人胰岛素前体溶液缓冲环境
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(1)中控制酶切反应底物混合液的pH值为8-10.5；优选的，控制酶切反应底物混合液的pH值为9-10。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(1)中将酶切反应底物混合液中重组人胰岛素前体蛋白的终浓度控制为0.02-0.03mol/L。
本发明人通过试验发现，在酶切转换反应中，重组赖氨酰肽链内切酶与重组人胰岛素前体蛋白的比例对于酶切转换效率有显著的影响，本发明通过试验发现，将重组赖氨酰肽链内切酶与重组人胰岛素前体蛋白按照以下配比进行酶切转换反应，有利于提高酶切转换效率：
优选的，重组赖氨酰肽链内切酶：重组人胰岛素前体＝1:15000-1:500(w/w)；更优选的，重组赖氨酰肽链内切酶：重组人胰岛素前体＝1:15000-1:1000(w/w)；最优选的，重组赖氨酰肽链内切酶：重组人胰岛素前体＝1:15000-1:2000(w/w)。
步骤(3)中所述的酶切转换反应的酶切反应的温度可以为15-30℃，优选的，酶切反应温度为20-25℃；所述的酶切反应时间可以为12-48h；优选的，酶切反应时间为18-24h。
本发明所述的初纯化获得的重组人胰岛素前体酶切转换完成时间，是一个酶添加量和酶切温度共同作用的，在一定范围内可变的值。本发明发现，将以下反应条件结合起来进行酶切转换反应时，最能有效提高酶切转换的效率：即，重组赖氨酰肽链内切酶：重组人胰岛素前体＝1:15000-1:500(w/w)，酶切反应的温度为15-30℃，酶切反应时间为12-48h；进一步优选的，重组赖氨酰肽链内切酶：重组人胰岛素前体＝1:15000-1:2000(w/w)，酶切反应的温度为，20-25℃，酶切反应时间为18-24h。
本发明方法通过指定的单一酶切位点酶的作用，能够使人胰岛素前体的酶切转换效率达到95％以上，与使用常规酶的生产工艺相比，提高了酶切转换效率和后续产品的纯度，减少了后续纯化工艺的难度。同时简化了生产工艺，为放大生产提供了很好的生产工艺。
本发明技术方案与现有主流技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明选择重组赖氨酰肽链内切酶作为工具酶，与常用的重组胰蛋白酶相比，使用重组赖氨酰肽链内切酶，单位前体蛋白所需的酶更少，酶切位点单一，酶切过程更高效。
(2)本发明选择重组赖氨酰肽链内切酶作为工具酶，与常用的重组胰蛋白酶相比，使用重组赖氨酰肽链内切酶，在放大酶切时，没有过酶切的顾虑，且酶切后获得的目的蛋白纯度更高，对后续的纯化步骤更有利。
(3)本发明选择重组赖氨酰肽链内切酶作为工具酶，与常用的重组胰蛋白酶相比，重组赖氨酰肽链内切酶酶切最适pH范围离酶切前后蛋白的pI更远，有利于目的蛋白的稳定，且对酶切环境中的盐浓度耐受范围更大。
附图说明
图1实施例1和对比实施例1的酶切后重组人胰岛素蛋白的液相图谱对比。
图2实施例2酶切后重组人胰岛素的UPLC图谱。
图3实施例3酶切后重组人胰岛素的Mass图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1.试验材料及检测方法
1.1试验材料及仪器
三羟甲基氨基甲烷、磷酸等缓冲剂物质购自Sigma公司，氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)等常规试剂购自国药集团化学试剂有限公司，无水硫酸钠(Na2SO4)购自Sigma公司，乙腈(CH3CN，HPLC级)，分析型高效液相仪器为安捷伦1260，分析色谱柱为Kromasil-C18-5μm-(4.6*250mm)。液质联用系统为赛默飞的Q-Exactive-Plus LCMS，UPLC分析柱为Hypersil GOLD(100*2.1-3um)。
1.2检测方法
1.2.1液相检测方法
采用反相层析方法对酶切前后的样品进行检测，仪器为安捷伦1260分析型高效液相，分析色谱柱：Kromasil-C18-5μm-(4.6*250mm)。流动相A为0.2mol/L无水硫酸钠(pH2.3)：乙腈＝90:10，流动相B为水：乙腈＝50:50。流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长280nm，按表1的参数进行梯度洗脱。
表1分析型高效液相的梯度洗脱程序
1.2.2液质检测方法
为了进一步确认酶切效果，确保酶切结果正确，将酶切后的产物进行液质联用的检测方法进行物质确认。
重组人胰岛素前体酶切样品UPLC检测方法：柱子：Hypersil GOLD(100*2.1-3um)，流动相A：0.1％甲酸，流动相B：乙腈，流速：0.3ml/min，柱温：35℃，检测波长280nm，按表2的参数进行梯度洗脱。
表2样品UPLC检测方法的梯度洗脱程序
1.3酶切转换效率
由于酶切转换涉及到物质结构的变化，理论上一摩尔的重组人胰岛素前体，经过酶切后获得一摩尔的酶切后蛋白，因此本发明所提及的酶切转换效率是指试剂获得的酶切后蛋白与理论上应该获得的酶切后蛋白的摩尔量比值，其中理论的酶切后蛋白摩尔量就是酶切前重组人胰岛素前体的摩尔量，重组人胰岛素前体及酶切后蛋白的质量分别根据各自的标准曲线计算获得，相应的，重组人胰岛素前体的摩尔质量为7088，酶切后蛋白的摩尔质量为5721，具体的计算公式如下
实施例1重组人胰岛素前体的酶切转换
取初纯化获得的重组人胰岛素前体溶液适量，高效液相检测样品浓度，计算稀释至浓度15g/L的体积V1，根据该体积加入适量的三羟甲基氨基甲烷搅匀，使其终浓度为0.03mol/L(按稀释后体积计算)，测定pH值，加入适量的纯化水调整样品溶液体积至接近V1，用盐酸调节pH至9.0，最后将溶液体积调整至V1；
计算重组人胰岛素前体蛋白含量，然后按照重组赖氨酰肽链内切酶：重组人胰岛素前体＝1:1000(w/w)的比例，精确称取适量的重组赖氨酰肽链内切酶，边搅拌溶液边加入工具酶，溶解完全后，室温搅拌酶切，此时室温为23℃，之后的24小时内，控制室温维持在23±1℃范围。
初纯化重组人胰岛素前体浓度约25g/L，量取40ml，搅拌加入243.4mg三羟甲基氨基甲烷，加入适量纯化水调整体积至60ml，调节pH至9.03，体积最终调整至66.7ml。
称取1.00mg的重组赖氨酰肽链内切酶，加入上述溶液，搅拌溶解后开始计时，酶切16小时后取样检测，酶切后蛋白纯度91.9％，经计算酶切转换率约87.2％。这说明根据本实施例的酶切转化方法，酶切后重组人胰岛素纯度达90％以上，酶切转换率约87.2％。
实施例2重组人胰岛素前体的的酶切转换
取初纯化获得的重组人胰岛素前体溶液适量，高效液相检测样品浓度，计算稀释至浓度10g/L的体积V2，根据该体积加入适量的硼砂搅匀，使其终浓度为0.02mol/L(按稀释后体积计算)，测定pH值，加入适量的纯化水调整样品溶液体积至接近V2，用氢氧化钠调节pH至9.4，最后将溶液体积调整至V2；
计算重组人胰岛素前体蛋白含量，然后按照重组赖氨酰肽链内切酶：重组人胰岛素前体＝1:10000(w/w)的比例，精确称取适量的重组赖氨酰肽链内切酶，边搅拌溶液边加入工具酶，溶解完全后，室温搅拌酶切，此时室温为20℃，之后的24小时内，控制室温维持在20±1℃范围。
初纯化重组人胰岛素前体浓度约20g/L，量取50ml，搅拌加入123.7mg硼砂加入适量纯化水调整体积至90ml，调节pH至9.39，体积最终调整至100ml。
称取0.1mg的重组赖氨酰肽链内切酶，加入上述溶液，搅拌溶解后开始计时，酶切22小时后取样检测，酶切后蛋白纯度93.1％，经计算酶切转换率约88.4％。这说明根据本实施例的方法，酶切后目的蛋白纯度达90％以上，酶切转换率约88.4％。
实施例3重组人胰岛素前体的酶切转换
取初纯化获得的重组人胰岛素前体溶液适量，高效液相检测样品浓度，计算稀释至浓度20g/L的体积V3，根据该体积加入适量的三羟甲基氨基甲烷搅匀，使其终浓度为0.02mol/L(按稀释后体积计算)，测定pH值，加入适量的纯化水调整样品溶液体积至接近V3，用盐酸或氢氧化钠调节pH至9.5，最后将溶液体积调整至V3；
计算重组人胰岛素前体蛋白含量，然后按照重组赖氨酰肽链内切酶：重组人胰岛素前体＝1:2000(w/w)的比例，精确称取适量的重组赖氨酰肽链内切酶，边搅拌溶液边加入工具酶，溶解完全后，室温搅拌酶切，此时室温为25℃，之后的24小时内，控制室温维持在25±1℃范围。
初纯化重组人胰岛素前体浓度约25g/L，量取40ml，搅拌加入121.13mg三羟甲基氨基甲烷，加入适量纯化水调整体积至45ml，调节pH至9.52，体积最终调整至50ml。
称取0.5mg的重组赖氨酰肽链内切酶，加入上述溶液，搅拌溶解后开始计时，酶切20小时后取样检测，酶切后蛋白纯度92.8％，经计算酶切转换率约87.8％。这说明根据本实施例的方法，酶切后目的蛋白纯度达90％以上，酶切转换率约87.8％。
对比实施例1重组人胰岛素前体的酶切转换
本对比实施例所用的内切酶是重组胰蛋白酶，除此之外的其它条件均与实施例1相同。
经过检测，酶切后蛋白纯度57.2％，经计算酶切转换率约53.7％。
对比实施例2重组人胰岛素前体两步纯化沉淀后酶切
毕赤酵母发酵液，离心，上清过铜离子螯合层析和SP阳离子交换层析获得纯化后的人胰岛素原前体；补加20mM Zn离子沉淀门冬胰岛前体，离心，沉淀用100ml 50mM Tris溶解。高效液相检测样品浓度，计算蛋白含量为1g，盐酸调节pH8.8,按酶与蛋白质量比为1:5000加入赖氨酰内肽酶(Lys-C)0.2mg，30℃搅拌酶切。16小时后，取样RP-HPLC分析，酶切后目的蛋白纯度为90.3％，酶切转换率约87.1％。
对比实施例3重组人胰岛素前体两步纯化沉淀后酶切
毕赤酵母发酵液，离心，上清过铜离子螯合层析和SP阳离子交换层析获得纯化后的人胰岛素原前体；补加20mM Zn离子沉淀门冬胰岛前体，离心，沉淀用100ml 25mM硼砂溶解。高效液相检测样品浓度，计算蛋白含量为1g，氢氧化钠调节pH8.8,按酶与蛋白质量比为1:5000加入赖氨酰内肽酶(Lys-C)0.2mg，30℃搅拌酶切。16小时后，取样RP-HPLC分析，酶切后目的蛋白纯度为95.6％，酶切转换率约92.1％。
对比实施例4重组人胰岛素前体两步纯化沉淀后酶切
毕赤酵母发酵液，离心，上清过铜离子螯合层析和SP阳离子交换层析获得纯化后的人胰岛素原前体；补加20mM Zn离子沉淀门冬胰岛前体，离心，沉淀用100ml 25mM硼砂溶解。高效液相检测样品浓度，计算蛋白含量为1g，氢氧化钠调节pH9.5,按酶与蛋白质量比为1:5000加入赖氨酰内肽酶(Lys-C)0.2mg，25℃搅拌酶切。18h取样RP-HPLC分析，酶切后目的蛋白纯度为98.4％，酶切转换率约95.3％。
对比实施例5重组人胰岛素前体两步纯化沉淀后酶切
毕赤酵母发酵液，离心，上清过铜离子螯合层析和SP阳离子交换层析获得纯化后的人胰岛素原前体；补加20mM Zn离子沉淀门冬胰岛前体，离心，沉淀用100ml 25mM硼砂溶解。高效液相检测样品浓度，计算蛋白含量为1g，氢氧化钠调节pH9.5,按酶与蛋白质量比为1:5000加入赖氨酰内肽酶(Lys-C)0.2mg，20℃搅拌酶切。24h取样RP-HPLC分析，酶切后目的蛋白纯度为98.1％，酶切转换率约94.7％。
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