一种广东紫珠多糖的提取方法
阅读说明：本技术 一种广东紫珠多糖的提取方法 (Extraction method of callicarpa kwangtungensis chun polysaccharide ) 是由 王振辉 牛超 张真真 杨兰萍 孔继川 周德军 翟洋洋 于 2021-01-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及植物提取分析技术领域,具体来说是一种广东紫珠多糖的提取方法,先将广东紫珠采用微波醇提方法进行有效成分提取,再进行大分子的分离,继续采用高效逆流色谱分离,最后采用柱层析洗脱分离技术得到广东紫珠多糖。本发明先进行有效成分的提取,得到浸膏,再将浸膏内的鞣质、蛋白质、树脂、蜡纸等胶体不稳定成分去除,又经由高效逆流色谱处理后将不溶于水的有机物去除,保留的水溶性物质中含有水溶性多糖、水溶性氨基酸和多肽,最后采用柱层析洗脱分离技术将广东紫珠多糖进行有效分离,得到纯度高的广东紫珠多糖。(The invention relates to the technical field of plant extraction and analysis, in particular to a method for extracting Callicarpa kwangtungensis Chun polysaccharide. The invention firstly extracts effective components to obtain an extract, removes colloid unstable components such as tannin, protein, resin, wax paper and the like in the extract, removes water-insoluble organic matters after high-efficiency countercurrent chromatography treatment, effectively separates the callicarpa kwangtungensis chun polysaccharide by adopting column chromatography elution separation technology to obtain the callicarpa kwangtungensis chun polysaccharide with high purity, wherein the reserved water-soluble substances contain water-soluble polysaccharide, water-soluble amino acid and polypeptide.)
技术领域
本发明涉及植物提取分析技术领域，具体来说是一种广东紫珠多糖的提取方法。
背景技术
广东紫珠是马鞭草科、紫珠属落叶灌木，高约2米；叶片卵状长椭圆形至椭圆形，顶端长渐尖至短尖，基部楔形，边缘有细锯齿，背面灰棕色，两面密生暗红色或红色细粒状腺点，分布于中国河南、江苏、安徽、浙江、江西、湖南、湖北、广东、广西、四川、贵州、云南等地以及越南；生于海拔200-2300米的林中、林缘及灌丛中，该种根或全株入药，能通经和血、治月经不调、虚劳、白带、产后血气痛、感冒风寒等症。
现有技术对广东紫珠药材的药效物质基础研究主要集中在已经发现的小分子化学成分上，随着研究的深入，对广东紫株内的大分子研究逐渐受到重视，其中包括广东紫珠水溶性多糖的提取，而现有技术的方法提取的多糖中杂质较多，组分复杂，难以实现广东紫珠多糖的高效应用。
发明内容
针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种广东紫珠多糖的提取方法，本发明先进行有效成分的提取，得到浸膏，再将浸膏内的鞣质、蛋白质、树脂、蜡纸等胶体不稳定成分去除，又经由高效逆流色谱处理后将不溶于水的有机物去除，保留的水溶性物质中含有水溶性多糖、水溶性氨基酸和多肽，最后采用柱层析洗脱分离技术将广东紫珠多糖进行有效分离，得到纯度高的广东紫珠多糖。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种广东紫珠多糖的提取方法，包括如下步骤：
(1)广东紫珠采用微波醇提方法进行有效成分提取，得到浸膏：
(2)大分子的分离：
天然澄清剂A组分：将天然澄清剂溶解于蒸馏水中制成1wt％的溶液A；
天然澄清剂B组分：将天然澄清剂溶解于1wt％的冰醋酸溶液中，制成1wt ％的溶液B；
将步骤(1)的浸膏溶于水制成1-2wt％的溶液，于90-110℃下，按体积比 100：2-3滴加溶液B，混合1-2h后按体积比100：6-10滴加溶液A，静置2-3h 后取出，离心，取上清液，得一次提纯物；
(3)高效逆流色谱分离：
按照如下体积比量取水：乙酸乙酯＝8-10:2-3，充分混合均匀后分层得到上相和下相，上相作为固定相，下相作为流动相，将步骤(2)的一次提纯物进行高效逆流色谱分离，得到二次提纯物；
(4)柱层析洗脱分离：
将步骤(3)的二次提纯物完全溶解于去离子水中，过DEDA纤维素DE-52 离子交换柱，依次用0.1-1.0mol/L硫酸铵溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，得到广东紫珠多糖。
优选的，所述步骤(1)微波醇提的方法为：将广东紫珠洗净烘干并粉碎后，加入4-6倍体积的50-70wt％乙醇溶液中，先回流2-3h后，于功率150-250W条件下微波继续加热5-15min，冷却至室温后减压浓缩，得到浸膏。
优选的，所述步骤(2)的天然澄清剂为II型ZTC1+1天然澄清剂或澄清剂 KBT-ZTC。
优选的，所述步骤(3)高效逆流色谱分离过程中，泵入固定相时的流速为 40-60mL/min，泵入流动相时的流速为5-8mL/min。
优选的，所述步骤(3)高效逆流色谱分离过程中，主机旋转的转速为 2500-3500rpm。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
1、本发明先采用微波醇提的方式对广东紫珠中的有机成分进行了提取，减压蒸馏后使得广东紫珠中的有机成分形成浸膏；再采用天然澄清剂进行提取，天然澄清剂主要去除鞣质、蛋白质、树脂、蜡纸等胶体不稳定成分，对有效成分如黄酮、生物碱、甙类、皂苷类、萜类、多糖、氨基酸、多肽、维生素、矿物质等不影响，且经过天然澄清剂A溶液和天然澄清剂B溶液处理后，胶体不稳定成分驱除率达到90％以上，另外采用天然澄清剂还克服了现有技术的sevag法造成的消耗大量溶剂、可引起多糖降解等技术缺陷；
剩余的有效成分如黄酮、生物碱、甙类、皂苷类、萜类、多糖、氨基酸、多肽、维生素、矿物质等采用高效逆流色谱分离方式进行分离，并将广东紫珠提取物内水溶性化合物与有机化合物进行有效分离，进一步对广东紫珠提取物进行提纯，提纯后的水溶性多糖内还含有水溶性氨基酸和多肽，此时再采用柱层析洗脱分离技术，对紫株多糖进行分离，紫株多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等组成，此时采用柱层析洗脱分离，采用盐析法，根据不同多糖在不同盐浓度中溶解度的不同而将其分离出来，继而与氨基酸、多肽进行分离得到纯度高的广东紫珠多糖。
2、与现有技术相比，本发明先进行有效成分的提取，得到浸膏，再将浸膏内的鞣质、蛋白质、树脂、蜡纸等胶体不稳定成分去除，又经由高效逆流色谱处理后将不溶于水的有机物去除，保留的水溶性物质中含有水溶性多糖、水溶性氨基酸和多肽，最后采用柱层析洗脱分离技术将广东紫珠多糖进行有效分离，得到纯度高的广东紫珠多糖。
附图说明
图1为以葡萄糖为标准品获得的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例，用以较佳的实施例配合详细的说明。
实施例1
一种广东紫珠多糖的提取方法，包括如下步骤：
(1)广东紫珠采用微波醇提方法进行有效成分提取，将广东紫珠洗净烘干并粉碎后，加入4倍体积的70wt％乙醇溶液中，先回流2h后，于功率150W条件下微波继续加热15min，冷却至室温后减压浓缩，得到浸膏：
(2)大分子的分离：
天然澄清剂A组分：将II型ZTC1+1天然澄清剂溶解于蒸馏水中制成1wt％的溶液A；
天然澄清剂B组分：将II型ZTC1+1天然澄清剂溶解于1wt％的冰醋酸溶液中，制成1wt％的溶液B；
将步骤(1)的浸膏溶于水制成1wt％的溶液，于90℃下，按体积比100：3 滴加溶液B，混合1h后按体积比100：10滴加溶液A，静置2h后取出，离心，取上清液，得一次提纯物；
(3)高效逆流色谱分离：
按照如下体积比量取水：乙酸乙酯＝8:3，充分混合均匀后分层得到上相和下相，上相作为固定相，下相作为流动相，将步骤(2)的一次提纯物进行高效逆流色谱分离，得到二次提纯物；泵入固定相时的流速为40/min，泵入流动相时的流速为8mL/min，主机旋转的转速为2500rpm；
(4)柱层析洗脱分离：
将步骤(3)的二次提纯物完全溶解于去离子水中，过DEDA纤维素DE-52 离子交换柱，依次用0.1-1.0mol/L硫酸铵溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，得到广东紫珠多糖。
实施例2
一种广东紫珠多糖的提取方法，包括如下步骤：
(1)广东紫珠采用微波醇提方法进行有效成分提取，将广东紫珠洗净烘干并粉碎后，加入5倍体积的60wt％乙醇溶液中，先回流2.5h后，于功率200W 条件下微波继续加热10min，冷却至室温后减压浓缩，得到浸膏：
(2)大分子的分离：
天然澄清剂A组分：将澄清剂KBT-ZTC溶解于蒸馏水中制成1wt％的溶液 A；
天然澄清剂B组分：将澄清剂KBT-ZTC溶解于1wt％的冰醋酸溶液中，制成1wt％的溶液B；
将步骤(1)的浸膏溶于水制成1.5wt％的溶液，于100℃下，按体积比 100：2.5滴加溶液B，混合1.5h后按体积比100：8滴加溶液A，静置2.5h后取出，离心，取上清液，得一次提纯物；
(3)高效逆流色谱分离：
按照如下体积比量取水：乙酸乙酯＝9:2.5，充分混合均匀后分层得到上相和下相，上相作为固定相，下相作为流动相，将步骤(2)的一次提纯物进行高效逆流色谱分离，得到二次提纯物；泵入固定相时的流速为50mL/min，泵入流动相时的流速为6mL/min，主机旋转的转速为3000rpm；
(4)柱层析洗脱分离：
将步骤(3)的二次提纯物完全溶解于去离子水中，过DEDA纤维素DE-52 离子交换柱，依次用0.1-1.0mol/L硫酸铵溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，得到广东紫珠多糖。
实施例3
一种广东紫珠多糖的提取方法，包括如下步骤：
(1)广东紫珠采用微波醇提方法进行有效成分提取，将广东紫珠洗净烘干并粉碎后，加入6倍体积的50wt％乙醇溶液中，先回流3h后，于功率250W条件下微波继续加热5min，冷却至室温后减压浓缩，得到浸膏：
(2)大分子的分离：
天然澄清剂A组分：将II型ZTC1+1天然澄清剂溶解于蒸馏水中制成1wt％的溶液A；
天然澄清剂B组分：将II型ZTC1+1天然澄清剂溶解于1wt％的冰醋酸溶液中，制成1wt％的溶液B；
将步骤(1)的浸膏溶于水制成2wt％的溶液，于110℃下，按体积比100： 2滴加溶液B，混合2h后按体积比100：6滴加溶液A，静置3h后取出，离心，取上清液，得一次提纯物；
(3)高效逆流色谱分离：
按照如下体积比量取水：乙酸乙酯＝5:1，充分混合均匀后分层得到上相和下相，上相作为固定相，下相作为流动相，将步骤(2)的一次提纯物进行高效逆流色谱分离，得到二次提纯物；泵入固定相时的流速为60mL/min，泵入流动相时的流速为5mL/min，主机旋转的转速为3500rpm；
(4)柱层析洗脱分离：
将步骤(3)的二次提纯物完全溶解于去离子水中，过DEDA纤维素DE-52 离子交换柱，依次用0.1-1.0mol/L硫酸铵溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩后，得到广东紫珠多糖。
结果与分析
以葡萄糖为标准品，采用高效液相色谱仪(HPLC)，分别测定各浓度 0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL及0.05mg/mL下的标准曲线图；
配制浓度为0.03mg/mL的实施例2的广东紫珠多糖，取1μL注入至高效液相色谱仪(HPLC)内，获得吸光度，以葡萄糖为标准品获得的标准曲线图如图1所示；
再分别以甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖为标准品，采用上述相同方法，分别获得不同的标准曲线图，根据标准曲线图中的吸光度值，计算得到广东紫珠多糖中的葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖的含量比为23.66： 0.981：20.14：4.52：1.47。
多糖提取率的计算公式为：将测得的吸光度A，代入回归方程，计算出广东紫珠多糖的提取率和多糖得率，实施例1-3的广东紫珠多糖提取率和多糖得率如表1所示：
多糖提取率(％)＝样品的浓度×样品定容之后的体积/原料的质量
多糖得率(％)＝[多糖稀释液浓度(mg/mL)×稀释倍数×250mL]/[广东紫珠粉干重(g)×103]
表1广东紫珠多糖的提取率和多糖得率研究
结果表明，本发明多糖得率达到了40％以上，相比于现有技术的多糖得率为本发明的多糖得率得到了明显的提升。
显然，本领域的技术人员可以对发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
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