控制gag与其效应分子之间相互作用的配体及其用途
阅读说明：本技术 控制gag与其效应分子之间相互作用的配体及其用途 (Ligands that control the interaction between GAG and its effector molecules and uses thereof ) 是由 J-M·马莱 S·拉维亚勒 R·马康 A·普罗奇安茨 A·迪纳尔多 D·泰斯塔 于 2019-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及新化合物,所述化合物模拟糖胺聚糖,并且能够控制糖胺聚糖与其效应分子之间的相互作用。本发明的化合物为肽,并且能够阻止或减少至少一种效应分子与至少一种糖胺聚糖的结合。根据本发明的化合物可以用作药物,特别是用于刺激神经发生的药物,更一般地是用于治疗神经系统相关病理的药物。(The present invention relates to novel compounds which mimic glycosaminoglycans and are capable of controlling the interaction between a glycosaminoglycan and its effector molecules. The compounds of the invention are peptides and are capable of preventing or reducing the binding of at least one effector molecule to at least one glycosaminoglycan. The compounds according to the invention can be used as medicaments, in particular for stimulating neurogenesis, more generally for treating pathologies associated with the nervous system.)
背景技术
糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)是天然存在的碳水化合物基分子，其涉及许多细胞过程的调节，包括血液凝固、血管生成、肿瘤生长、神经细胞发育、平滑肌细胞增殖和基因表达，最常通过与效应分子(如细胞因子、生长因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂等)的相互作用实现所述调节。
GAG为重复的两个糖(二糖)单元的线性非分支链，其长度可以高达150个单元，并且在本领域中是熟知且详细描述的。经常(但并非总是)发现GAG与被称为蛋白聚糖(proteoglycan)的结构中的蛋白核心共价结合。蛋白聚糖结构大量存在于细胞表面上，并且与细胞周围的细胞外基质相关。
基于骨架中重复的二糖单元，糖胺聚糖可以分为四种主要类别。通常，一个糖为糖醛酸，另一个为N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺。这些类别由以下四种GAG举例说明：(1)硫酸乙酰肝素(D-葡萄糖醛酸/N-乙酰基-D-葡萄糖胺或N-磺基-D-葡萄糖胺)；(2)硫酸软骨素/硫酸皮肤素(D-葡萄糖醛酸或L-艾杜糖醛酸/N-乙酰基-D-葡萄糖胺)；(3)硫酸角质素(D-半乳糖/N-乙酰基-D-葡萄糖胺)；和(4)透明质酸。除透明质酸以外，所有GAG均含有硫酸酯基团，所述硫酸酯基团与糖的环羟基以各种方式酯化。这些带负电的基团被认为在糖胺聚糖的生物学性质中发挥重要作用。事实上，GAG的天然存在形式(特别是肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素)为复杂杂寡糖，其由不同硫酸化的糖残基的混合物构成。例如，硫酸软骨素(CS)为中枢神经系统(CNS)基质中最丰富的糖胺聚糖(GAG)(Djerbal等人,2017,Glycoconj.34,363-376)，其由蛋白骨架组成，所述蛋白骨架连接有包含数百个二糖重复单元的链。
GAG的吸引人的特征在于它们的多糖单元通过差向异构、N-硫酸化和O-硫酸化以及脱乙酰化而被修饰，因此可以针对相互作用进行微调。
例如，已经证明，在出生后脑发育期间，特定的硫酸化模式对于关键时期的定时(timing)是至关重要的，在所述关键时期期间，特定的神经回路是高度可塑的。如本文所使用，术语“关键时期”是指生物体发育期间的时期，在该时期中，生物体的神经系统能够获得特定的功能能力和/或结构形式，通常至少部分地受外部环境刺激影响。关键时期的定时和持续时间可能取决于受到的环境刺激。例如，缺乏某些环境刺激将延长关键时期。这些关键时期将重塑神经元连接，并且对于适应环境以及学习和行为至关重要。
这些关键时期与神经系统可塑性密切相关。如本文所使用，术语“可塑性”是指神经系统或神经系统的一部分改变(例如重组)其结构和/或功能的能力，通常受环境条件、损伤、经历或持续的神经系统活动影响。可塑性可能涉及神经元或神经胶质细胞的增殖、生长或运动。可塑性可能涉及神经元之间新的突触连接的形成和/或现有突触连接的增强或减弱。可塑性可能涉及神经发生。
已知这些关键时期存在于感觉系统中，如视觉皮层中的双眼视觉或听觉皮层中的音调拓扑图细化(tonotopic map refinement)。它们还存在于运动系统中，甚至存在于脑中更高认知的区域，如人类语言习得。
这些关键时期例如由皮质抑制性GABA能小白蛋白神经元(PV细胞)的成熟而产生，所述成熟由正小齿同源框蛋白2(Orthodenticle homeobox protein 2，Otx2)同源蛋白转录因子驱动。Otx2在大脑皮层外合成，在细胞外环境中运输，并被PV细胞特异性内化。这种内化特异性是由二硫酸化硫酸软骨素(D型(CS-D)或E型(CS-E))介导的，所述二硫酸化硫酸软骨素包含在被称作神经元周围网络(perineuronal net，PNN)的特异性细胞外基质中。
在该关键时期结束后，PV细胞保持成熟，可塑性的内在潜力被主动抑制，导致脑回路稳定化，其伴随着成熟PV细胞周围的神经元周围网络(PNN)的形成。
已进一步证明，在多种神经系统和精神疾病中，关键时期(期间特定神经回路高度可塑)似乎发生了变化，所述疾病包括例如癫痫、精神分裂症、抑郁、自闭症和阿尔茨海默氏病。
此外，在Otx2的一级序列中发现了GAG结合基序(RKQRRER)，揭示了Otx2与PV细胞周围的PNN中所含有的糖胺聚糖(例如二硫酸化的硫酸软骨素)之间的相互作用。Beurdeley等人(2012,J.Neurosci.,32,9429-37)已经进一步证明，皮层输注含有这种“RK”基序的肽将与Otx2竞争GAG结合，消耗成熟PV细胞的Otx2含量，恢复成熟小鼠的视觉皮层可塑性，并挽救弱视小鼠的皮质敏锐度。
Lee等人(2017,Mol.Psychiatry,22,680-688)已经证明，Otx2不仅涉及视觉可塑性，而且还涉及听觉可塑性。
Winter等人(2016,Neural Plast.,3679545)已经证明，PNN中Sema3A的受控中和可能是增强损伤后神经元可塑性和功能修复的重要方法。
Miyata等人(2012,.Nat Neurosci.,15,414-422)和Dick等人(2013,J BiolChem,288,27384-95)已经证明，Otx2和轴突导向因子3A(Semaphorin-3A，Sema-3A)均为视觉皮层可塑性的关键角色，并且具有相似的用于结合二硫酸化硫酸软骨素E型(CS-E)的基序(分别为RKQRRER和RKQRRQR)。
发明人因此得出结论，关键时期和相关的可塑性定时部分地由GAG与其效应分子(例如Otx2或轴突导向因子)的相互作用控制，并提出干扰所述相互作用，以提供用于研究和治疗应用的修改关键时期定时的方法，更特别是修改神经系统的可塑性的方法。因此，有必要提供能够控制GAG与效应分子之间的相互作用的化合物。
从天然来源提取纯化合物以及GAG片段的化学或酶促合成仍然困难且低效。已经努力降低GAG结构和合成的复杂性，例如证明蛋白质与GAG之间的相互作用主要是静电性的，并且最关键的方面是正确的电荷空间分布，但是这些结果仍处于研究水平，无法确定能够控制GAG与效应分子之间的相互作用的化合物。
类似地，已经提出用改性的天然和合成聚合物作为GAG替代物，例如聚丙烯酸酯、聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸、聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS)、聚(乙烯基磺酸酯)(pVS)、硫酸化木质素衍生物、多酚、聚缩水甘油共聚物、具有硫酸酯基的聚(环氧乙烷)-bl-聚(环氧丙烷)-bl-聚(环氧乙烷)(Pluronic F-127)。尽管这些策略显示出一些成功，但它们缺乏序列调控，并且仅显示与蛋白质的非特异性静电相互作用。可替代地，特定的小分子已经被用作GAG模拟物：硫酸化的氨基糖苷、N-杂芳酰基氨基糖、b-环糊精硫酸酯和适体。
因此，本领域仍然非常需要开发能够控制GAG与其效应分子之间的相互作用的新化合物和方法。更特别地，仍然需要用于改变神经系统的可塑性(更特别是用于改变神经系统可塑性的关键时期定时)的替代方法。
因此，本领域非常需要开发能够改变神经系统关键时期定时(更特别是能够改变神经系统的可塑性)的化合物和方法。
类似地，本领域需要改进的治疗方法，其将增强CNS损害后的恢复和/或帮助改善神经精神病学和神经发育障碍中的CNS和认知功能。更特别地，需要新化合物和方法，其在关键的神经系统性质如可塑性中发挥作用，并且可以调节以提供治疗益处。
根据本发明，发明人旨在开发能够控制GAG与其效应分子之间的相互作用的新化合物，更特别是不具有先前开发的聚合物的缺点的新配体。
发明内容
根据第一实施方案，本发明提供一种配体或其任何药学上可接受的盐，所述配体包含通式(I)的多肽或由通式(I)的多肽组成：
(I)[X]n
其中
n为3至50，
X为包含4至6个氨基酸的肽，
X包含选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸，
X包含一个或两个磺基丙氨酸(cysteic acid)，优选两个磺基丙氨酸，
X包含除半胱氨酸以外的至少一种中性氨基酸，
其中所述配体能够与一种效应分子与至少一种糖胺聚糖(GAG)的结合相互作用。
在一个实施方案中，所述配体的特征在于n为3至35，更特别为3至15，优选为3至6。
通式(I)化合物可以为其药学上可接受的盐的形式。特别地，盐的抗衡离子可以选自金属阳离子，如钠、钾、镁、钙、铵或烷基铵。
磺基丙氨酸为一种氨基磺酸，是半胱氨酸的磺酸类似物；即，其为一种具有C末端磺酸基团的氨基酸。在本领域中广泛公开了其合成，并且该化合物是市售可得的。
半胱氨酸为一种天然α-氨基酸，其特征在于存在形成硫醇的巯基-SH基团。半胱氨酸以少量存在于大多数蛋白质中。它在蛋白质中的存在非常重要，因为它能够形成二硫键。硫醇基非常脆弱，因为它容易氧化。它的氧化产生胱氨酸，其由通过二硫键连接的两个半胱氨酸分子组成。更高能的氧化剂可以氧化半胱氨酸产生磺基丙氨酸。
同型半胱氨酸为一种非蛋白原氨基酸，是蛋氨酸或胱硫醚代谢的结果。同型半胱氨酸的名称来自其与半胱氨酸的相似性。事实上，同型半胱氨酸与半胱氨酸的不同之处在于，同型半胱氨酸的侧链包含两个甲基，而半胱氨酸的侧链仅包含一个甲基。在半胱氨酸和同型半胱氨酸中，巯基的反应性相似。
根据一个实施方案，磺基丙氨酸可以被高磺基丙氨酸代替，因此X可以包含一个或两个选自磺基丙氨酸和高磺基丙氨酸的氨基酸，优选两个相同或不同的选自磺基丙氨酸和高磺基丙氨酸的氨基酸。
在另一个实施方案中，配体的特征在于X包含两个磺基丙氨酸。
在另一个实施方案中，配体的特征在于X包含两个高磺基丙氨酸。
在另一个实施方案中，配体的特征在于“除半胱氨酸以外的至少一种中性氨基酸”选自丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和2-氨基异丁酸。
优选地，“除半胱氨酸以外的至少一种中性氨基酸”为丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸，更优选为丙氨酸。
又一个优选的实施方案为配体，特征在于除半胱氨酸以外的中性氨基酸为丙氨酸。
优选地，X包含至少一个且至多2个，优选至多3个，更优选至多4个除半胱氨酸以外的中性氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明的配体的特征在于，选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸位于肽X从C末端开始的第一位置。
在另一个优选的实施方案中，本发明的配体的特征在于，选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸为谷氨酸。
根据一个特别的实施方案，本发明的配体的氨基酸残基可以为D或L或D和L的混合物。
根据一个特别的实施方案，本发明的配体的特征在于X是相同的或不同的。这意味着基序“X”的“n”重复可以包含多个相同的肽基序的重复或多个不同的肽基序的重复，或其混合。不同是指至少一个基序X可以与其他基序X不同。不同是指氨基酸的性质和数量不同。
根据另一个实施方案，配体的特征在于X是相同的。这意味着配体包含相同肽基序X的3至50次，更特别地3至15次，优选3至6次的重复。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的配体的特征在于，X为包含4个氨基酸的肽。
在一个特别的实施方案中，配体的特征在于其为合成的和非天然的。
根据一个优选的实施方案，多肽[X]n中的X选自EACC、ECCA和ECAC，其中C为磺基丙氨酸，A为丙氨酸，E为谷氨酸。
根据一个优选的实施方案，氨基酸为L型。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的配体包含多肽[X]n或由多肽[X]n组成，所述多肽[X]n选自(EACC)n、(ECCA)n和(ECAC)n。
根据一个优选的实施方案，氨基酸为L型。
根据一个优选的实施方案，n为3至6，更优选n为5或6，甚至更优选n为6。
在一个甚至更优选的实施方案中，根据本发明的配体包含多肽[X]n或由多肽[X]n组成，所述多肽[X]n选自(ECCA)n或(ECAC)n。
在一个甚至更优选的实施方案中，根据本发明的配体包含多肽[X]n或由多肽[X]n组成，所述多肽[X]n选自(ECCA)n或(ECAC)n，其中n为3至6，特别地n为5或6，甚至更优选n为6。
根据本发明，多肽[X]n可以为直链的或枝状的。
根据一个特别的实施方案，根据本发明的多肽[X]n为直链的。直链的是指多肽包含根据通过肽键连接的连续氨基酸链重复的连续[X]部分。
根据另一个特别的实施方案，根据本发明的多肽[X]n为枝状的，并且[X]部分，更特别地(ECCA)或(ECAC)部分，被接枝到如下文所描述的聚赖氨酸核心链Kp上。
肽枝状分子(peptide dendrimer)为高分子量的放射状或楔形分子，其包含通过肽键或酰胺键连接的碱性氨基酸，所述碱性氨基酸在分支核心内部和外表面均存在。这给出了有利于多价相互作用(例如，两个配体链，一个蛋白质)的配体的“毛状”呈递("hairy"presentation)，其可能与体内的亲和力和特异性更相关。
因此，多肽可以为梳子的形式，其中主分支核心与多肽[X]n接枝。优选地，分支核心为聚赖氨酸核心链(K)p；其中K为Lys，p为3至8，优选3至5，特别为4；并且所述分支核心与多肽[X]n接枝。
如本文所使用，术语“配体能够与一种效应分子与至少一种糖胺聚糖(GAG)的结合相互作用”是指本发明的配体能够阻止或减少至少一种效应分子与至少一种糖胺聚糖(GAG)的结合。
根据一个优选的实施方案，本发明的配体能够阻止至少一种效应分子与至少一种糖胺聚糖(GAG)的结合。
根据另一个优选的实施方案，本发明的配体能够减少至少一种效应分子与至少一种糖胺聚糖(GAG)的结合。
根据一个优选的实施方案，本发明的配体能够结合至少一种效应分子。
根据一个优选的实施方案，所述效应分子为包含糖胺聚糖结合位点的蛋白质。在本申请中，表述“糖胺聚糖结合位点”是指所述蛋白质中与糖胺聚糖GAG(特别是由硫酸乙酰肝素、肝素或硫酸软骨素组成的GAG)强烈相互作用的区域。该结合口袋通常从蛋白质的碱性侧链对接(fitted)，并包含BBXB基序，其中X是亲水性残基，B选自精氨酸和赖氨酸。可以由技术人员根据已知的技术手段，如蛋白质序列分析、X射线和NMR结构测定来实现糖胺聚糖结合位点的确定。特别地，“糖胺聚糖结合位点”可以为RKQRRER或RKQRRQR。
根据一个优选的实施方案，本发明的配体能够与糖胺聚糖(GAG)结合位点相互作用。
根据另一个优选的实施方案，本发明的配体能够模拟糖胺聚糖(GAG)结合。
根据一个优选的实施方案，本发明的配体能够阻止至少一种糖胺聚糖(GAG)与糖胺聚糖结合位点的结合。
根据另一个优选的实施方案，本发明的配体能够减少至少一种糖胺聚糖(GAG)与糖胺聚糖结合位点的结合。
根据一个优选的实施方案，所述糖胺聚糖GAG选自硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸软骨素。
在一个优选的实施方案中，所述效应分子选自转录因子、生长因子、信号转导因子和凝血级联蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述效应分子选自轴突导向因子和同源蛋白家族，优选为Otx2或轴突导向因子3A。
根据一个优选的实施方案，根据本发明的配体包含多肽[X]n或由多肽[X]n组成，所述多肽[X]n选自(ECAC)5、(ECAC)6、(ECCA)5和(ECCA)6，所述效应分子为同源蛋白家族，优选为Otx2。
根据另一个优选的实施方案，根据本发明的配体包含多肽[X]n或由多肽[X]n组成，所述多肽[X]n选自(ECAC)5和(ECAC)6，所述效应分子为轴突导向因子，优选为轴突导向因子3A。
可以根据常规且熟知的技术来制备根据本发明的配体所包含的多肽[X]n。合成路线可以使用如本领域中已知的在Rink酰胺MBHA树脂上的Fmoc策略。可以在N末端引入6-氨基己酸(Ahx)间隔子，肽基树脂可以被乙酰化(Ac)或被生物素砜(Biot(SO2))酰化。
可以通过TFA将肽从树脂上裂解下来，并在二乙醚中沉淀以获得Ac-Ahx-(X)n-NH2、Ac-Ahx-(X)n-NH2、Biot(SO2)-Ahx-(X)n-NH2或Biot(SO2)-Ahx-(X)n-NH2。可以用过甲酸氧化这些前体以获得磺基丙氨酸肽，然后用氨水中和以获得根据本发明的GAG模拟肽，其中在N末端具有乙酰基或生物素砜，在C末端具有酰胺。可以将粗磺基肽在Sephadex G25上脱盐，纯化(例如通过反相HPLC)并通过质谱表征。这些GAG模拟肽可以作为钠盐在-20℃储存数月。
本发明的目的还在于提供根据任何前述实施方案的如上面所描述的配体，其作为药物的用途。
本发明进一步涉及一种组合物，其包含至少一种如上面所定义的配体和药学上可接受的赋形剂。
如本文所使用，术语“药学上可接受的”是指当适当地施用于动物或人时，不产生不利的、过敏性的或其他不期望的反应的赋形剂。如本文所使用，“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这种赋形剂在药物活性物质中的使用是本领域中熟知的。
将本发明的组合物适当地缓冲，以便在生理的或稍碱性的pH(例如约pH 7至约pH9)适合人使用。合适的缓冲剂包括但不限于磷酸盐缓冲剂(例如PBS)、碳酸氢盐缓冲剂、HEPES和PIPES缓冲剂和/或Tris缓冲剂。本发明的组合物可以进一步包含适合人或动物使用的稀释剂。其优选为等渗的、低渗的或弱高渗的，并且具有相对较低的离子强度。代表性示例包括无菌水、生理盐水(例如氯化钠)、林格氏溶液、葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液、汉克氏溶液以及其他生理上平衡的盐水溶液(参见例如最新版本的Remington:The Science andPractice of Pharmacy,A.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins)。本发明的组合物中包含的药学上可接受的载体还必须能够在制备的条件下和在冷冻(例如-70℃、-20℃)、冷藏(例如4℃)或环境温度的长期储存(即至少一个月，优选至少一年)的条件下保持其稳定性。其他药学上可接受的赋形剂可以用于提供期望的性质，包括例如改变或维持制剂的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、无菌性、稳定性、制剂的溶解速率，改变或维持向人或动物体内的释放或吸收，促进跨血屏障的运输或在特定器官(例如脑)中的透过。
可以将包含本文所描述的任何一种配体的组合物配制用于持续释放或缓慢释放(也被称为定时释放或控制释放)。通常可以使用熟知的技术来制备这种组合物，并通过例如口服、直肠、皮内、鼻内或皮下植入或通过在期望的靶位点植入来施用这种组合物。缓释制剂可以包含化合物，所述化合物分散在载体基质中和/或包含在由控释膜(ratecontrolling membrane)围绕的储器中。
本发明进一步涉及根据任何前述实施方案的配体或组合物，其作为可塑性改变剂(plasticity-modifying agent)的用途。
如本文所使用，术语“可塑性改变剂”是指物质或组合物，其在单独施用至受试者或与一种或多种其他物质或非药物疗法组合施用至受试者后，将导致神经系统至少一部分的可塑性的可检测改变。与在不存在试剂的情况下所观察到的功能和/或结构相比，可以通过神经系统功能和/或结构的改变来证明这种改变。
根据一个优选的实施方案，可塑性改变剂能够重新打开关键时期(例如本发明的可塑性改变剂能够启动关键时期和/或控制关键时期定时和持续时间)。根据另一个优选的实施方案，可塑性改变剂能够引发神经系统或其一部分的可塑性，并且能够改变(例如重组)所述神经系统或其一部分的结构和/或功能。根据另一个优选的实施方案，可塑性改变剂能够刺激神经发生。
本发明进一步涉及一种用于在有需要的受试者中改变神经系统或其一部分的可塑性的方法，包括以有效改变神经系统可塑性的量施用可塑性改变剂的步骤，其中可塑性改变剂为根据本发明的配体或组合物，并与所述有需要的受试者的神经系统或其一部分中一种效应分子与至少一种糖胺聚糖(GAG)的结合相互作用。
本发明进一步涉及一种用于在有需要的受试者中改变神经系统或其一部分的可塑性的方法，包括以有效改变神经系统可塑性的量施用可塑性改变剂的步骤，其中可塑性改变剂为根据本发明的配体或组合物，并阻止或减少所述有需要的受试者的神经系统或其一部分中一种效应分子与至少一种糖胺聚糖(GAG)的结合。
本发明进一步提供用于促进受试者神经系统或其一部分的重组或恢复的方法，包括向有需要的受试者施用可塑性改变剂的步骤，其中以有效促进神经系统重组或恢复的量单独或与一种或多种其他试剂组合施用可塑性改变剂，其中可塑性改变剂为根据本发明的配体或组合物，并与所述有需要的受试者的神经系统或其一部分中一种效应分子与至少一种糖胺聚糖(GAG)的结合相互作用。
本发明进一步提供用于促进受试者神经系统或其一部分的重组或恢复的方法，包括向有需要的受试者施用可塑性改变剂的步骤，其中以有效促进神经系统重组或恢复的量单独或与一种或多种其他试剂组合施用可塑性改变剂，其中可塑性改变剂为根据本发明的配体或组合物，并阻止或减少所述有需要的受试者的神经系统或其一部分中一种效应分子与至少一种糖胺聚糖(GAG)的结合。
可塑性改变剂可以有助于(例如增强)受试者神经系统的恢复或重组和/或促进功能正常化。换言之，神经系统的重组或恢复的程度或功能改善的程度大于没有向受试者施用试剂的情况。
本发明进一步涉及一种用于在有需要的受试者中刺激神经系统或其一部分的神经发生的方法，包括以有效刺激神经发生的量施用可塑性改变剂的步骤，其中可塑性改变剂为根据本发明的配体或组合物，并与所述有需要的受试者的神经系统或其一部分中一种效应分子与至少一种糖胺聚糖(GAG)的结合相互作用。
本发明进一步涉及一种用于在有需要的受试者中刺激神经系统或其一部分的神经发生的方法，包括以有效刺激神经发生的量施用可塑性改变剂的步骤，其中可塑性改变剂为根据本发明的配体或组合物，并阻止或减少所述有需要的受试者的神经系统或其一部分中一种效应分子与至少一种糖胺聚糖(GAG)的结合。
可塑性改变剂可以有助于刺激受试者神经系统的神经发生。换言之，神经发生的程度大于没有向受试者施用试剂的情况。
根据一个优选的实施方案，在这种方法中，所述效应分子为包含糖胺聚糖结合位点的蛋白质。
根据一个优选的实施方案，在这种方法中，所述糖胺聚糖GAG选自硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸软骨素。
在一个优选的实施方案中，在这种方法中，所述效应分子选自转录因子、生长因子、信号转导因子和凝血级联蛋白。
在一个优选的实施方案中，在这种方法中，所述效应分子选自轴突导向因子和同源蛋白家族，优选为Otx2或轴突导向因子3A。
根据一个特别的实施方案，“神经系统或其一部分”表示“中枢神经系统”(CNS)，其包括脑、脊髓、视觉、嗅觉和听觉系统。CNS包括神经元和神经胶质细胞(神经胶质)，所述神经胶质细胞为辅助神经元功能的支持细胞。少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞为CNS内的神经胶质细胞。神经系统的一部分可以是神经系统的任何在功能或结构上定义的部分、部位、区域、单元或组分(这些术语在本文中可互换使用)。神经系统的部分包括皮质、小脑、丘脑、下丘脑、海马、杏仁核、基底神经节(尾状核、壳状核和苍白球)、中脑、脑桥、延髓、神经束等，以及前述的任何子部分。例如，皮质的子区域包括视觉皮质、听觉皮质、体感皮质、内嗅皮质、嗅觉皮质等。应理解，这些区域本身可以由更小的子区域组成。
如本文所使用，术语“恢复”是指过程，其中至少部分地丧失了执行先前所执行功能的能力的神经系统或其部分，至少部分地恢复执行该功能的能力。
如关于神经系统或其一部分所使用的术语“重组”是指过程，其中神经系统的一部分完全或部分承担(即，呈现)该神经系统的该部分先前不执行的功能(例如感觉、运动或认知功能)。功能或任务可以但不一定必须先前由神经系统的不同部分执行。功能重组可以但不一定导致结构重组的一个或多个方面。功能重组也可以被称为功能重排。
根据另一个实施方案，需要开发靶向脉络丛内特定蛋白的非侵入性方法。通过分泌CSF，脉络丛对于脑稳态是重要的，并传递信号(包括Otx2)，所述信号与脑发育、神经发生和可塑性有关。
根据一个特别的实施方案，本发明涉及根据本发明的配体通过改变脉络丛功能来治疗需要其的患者的用途。
在一个优选的实施方案中，本发明的配体为在脉络丛细胞的细胞内空间中有活性的抗Otx2化合物。
在一个优选的实施方案中，本发明的配体能够隔离细胞外环境中的Otx2，因此可以改变眼优势可塑性(ocular dominance plasticity)。
如本文所使用，术语“受试者”是指药剂将被递送至的个体。优选的受试者为哺乳动物，特别是灵长类动物或人。
根据一个特别的实施方案，所述有需要的受试者患有疾病和/或神经系统病症和/或神经系统损伤，更特别是需要刺激神经元可塑性的疾病和/或神经系统病症和/或神经系统损伤。根据一个特别的实施方案，所述疾病和/或神经系统病症和/或神经系统损伤由Otx2或Sema 3A调节。
根据一个特别的实施方案，所述疾病和/或神经系统病症和/或神经系统损伤选自：
-例如脑血管意外后的神经系统损伤、缺血性损伤、出血性损伤、肿瘤性损伤、退行性损伤、外伤性损伤和/或神经发育性损伤；
-事件后的神经系统损伤，如中风或受伤(例如由于意外或手术)后的神经系统损伤；
-疾病和病症，包括但不限于神经退行性疾病，如多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、亚急性硬化性全脑炎、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌肉营养不良、阿尔茨海默氏病、特发性肌张力障碍、脊髓性肌萎缩症或威尔逊氏病；
-营养缺乏或毒素(例如神经毒素、滥用药物)引起的病症；
-神经发育性疾病，如自闭症或阅读障碍，即，至少一部分神经系统无法发育正常结构和/或功能的疾病；
-神经精神疾病，如精神分裂症和双相情感障碍，即，至少一部分神经系统无法达到其典型的认知功能水平的疾病；
-抑郁症、癫痫病；
-影响眼睛或耳朵(即，视觉或听觉)的退行性疾病，例如青光眼或弱视。
如本文所使用，可塑性改变剂的“有效量”是指足以引起期望的生物学应答的可塑性改变剂的量。如本领域普通技术人员将理解的，有效的特定可塑性改变剂的绝对量可以根据因素(如期望的生物学终点、待递送的试剂、靶组织等)而变化。本领域普通技术人员将进一步理解，可以以单剂量施用“有效量”，或者可以通过多剂量施用来达到“有效量”。期望的生物学应答可以为，例如，(i)突触连接、树突或轴突投射的功能或结构重组；(ii)在使突触连接、树突或轴突投射恶化的条件下维持突触连接、树突或轴突投射；(iii)神经或轴突投射系统的再生，或在使神经或轴突投射系统恶化的条件下维持神经或轴突投射系统；(iv)改善需要运动或感觉功能的任务的表现；(v)改善需要认知功能的任务的表现，例如，改善在测量学习和/或记忆的测试中的表现；(vi)运动、感觉和/或认知功能下降的速度减慢。
如本文所使用，关于神经系统或其一部分的术语“功能”在本文中广泛地用于指代由神经系统或其组分所执行的任何功能、作用、任务或活动。该术语包括但不限于处理和召回信息、调节行为、刺激内源性化学物质释放、控制运动功能、接收和处理感官输入、保持意识等的能力。
根据本发明施用的可塑性改变剂的剂量可以取决于受试者的状况，即，疾病和/或神经系统病症和/或神经系统损伤的阶段、由疾病和/或神经系统病症和/或神经系统损伤引起的症状的严重程度、总体健康状况、以及年龄、性别和体重及对医学领域技术人员显而易见的其他因素。如医学领域技术人员所确定的，可以按照适合于待治疗的疾病和/或神经系统病症和/或神经系统损伤的方式施用可塑性改变剂。此外，还可通过因素如患者的状况、患者疾病的类型和严重程度、活性成分的特定形式及施用方法，来确定或调整可塑性改变剂施用的合适持续时间和频率。通常可以使用实验模型和/或临床试验来确定可塑性改变剂的最佳剂量。最佳剂量可以取决于受试者的体重、重量或血容量。通常优选使用足以提供有效治疗的最小剂量。本文所述可塑性改变剂的临床前研究和临床研究的设计和执行完全在相关领域技术人员的技术能力内。
对于神经退行性疾病的治疗，可以将可塑性改变剂局部施用，特别是通过注射或输注局部施用至目标脑部位。还可以使用控释装置，例如连接到植入脑部的导管的渗透微型泵施用可塑性改变剂。
上面引用的所有专利、出版物和数据库条目的公开内容均特别通过引用整体并入本文，其程度与每个这种单独的专利、出版物或条目均被特别且单独指出通过引用并入是相同的。
附图说明
除了上述方案以外，本发明还包含其他方案，所述方案将参考示例性实施方案参照附图在说明书中公开，其中：
图1.配体与Otx2相互作用。(a)与Otx2蛋白孵育或不与Otx2蛋白孵育的生物素化磺基肽的斑点印迹(dot blot，DB)示例。(b)每个数据点至少3次重复实验的DB化学发光的定量。
图2.配体与Otx2的GAG结合位点相互作用。(a)当与hexaCSE和(EC'AC')5孵育后，生物素化IRBP1 DNA探针和Otx2蛋白的电泳迁移率迁移分析(EMSA)显示出迁移损失。(b)与GAG基序肽(RKpep)或对照肽(AApep，SCpep)孵育的(EC'AC')6的斑点印迹(DB)。(c)DB的定量。所有值：N＝3；平均±SEM；用Bonferonni事后检验的单因素方差分析；**P<0.01。
图3.使用成年小鼠视觉皮层裂解物的配体下拉实验。(a)GAG结合基序的比较。(b)用链霉亲和素珠粒上保留的配体下拉后Sema-3A的蛋白质印迹(Western blot，WB)(对照为单独的珠粒)。(c)WB的定量。(d)用与GAG基序肽(RKpep)或对照肽(AApep，SCpep)孵育的(EC'AC')6下拉后Sema-3A的WB。(e)WB的定量。所有值：N＝3；平均±SEM；用Bonferonni事后检验的单因素方差分析；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图4.配体具有体内活性。(a)注入或未注入40fmol(EC'AC')6的成年小鼠初级视觉皮层IV中，多花紫藤凝集素(Wisteria floribunda agglutinin，WFA)(其标记PNN)染色和小白蛋白(PV)染色的代表性图像。(b)WFA+细胞数的定量。(c)PV细胞数的定量。比例尺＝100μm。所有值：N＝3-6；平均±SEM；t检验；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图5.GAG模拟本发明的肽支架：EC'C'A和EC'AC'，其中C'表示磺基丙氨酸。
具体实施方式
实施例
材料和方法：
化合物
通过在Rink酰胺MBHA树脂上的Fmoc策略合成序列(ECCA)n和(ECAC)n(n＝3-6)。在N末端引入6-氨基己酸(Ahx)间隔子，肽基树脂被乙酰化(Ac)或被生物素砜(Biot(SO2))酰化。通过TFA将肽从树脂上裂解下来，并在二乙醚中沉淀以获得Ac-Ahx-(ECAC)n-NH2、Ac-Ahx-(ECCA)n-NH2、Biot(SO2)-Ahx-(ECAC)n-NH2或Biot(SO2)-Ahx-(ECCA)n-NH2。用过甲酸氧化这些前体以获得磺基丙氨酸(C')肽，然后用氨水中和以获得GAG模拟物(EC'AC')n和(EC'C'A)n，其中在N末端具有乙酰基或生物素砜，在C末端具有酰胺。将粗磺基肽在Sephadex G25上脱盐，通过反相HPLC纯化并通过质谱表征。这些GAG模拟肽可以作为钠盐在-20℃储存数月。
斑点印迹
为了进行竞争分析，将400pmol的生物素化配体或hexaCSE在含有1μg的Otx2蛋白(内部)和3μg的RK-、AA-或SC-肽的100mM乙酸铵中在37℃孵育30分钟。然后，将每种溶液点在硝酸纤维素膜上，并通过与链霉亲和素-HRP(ThermoFisher Scientific)的30分钟孵育和随后的化学发光(#34580，ThermoFisher Scientific)反应来检测生物素。将膜用LAS-4000(Fujifilm)数字化，并用ImageJ通过光密度法定量。
凝胶迁移
将Otx2蛋白(0.1μg)在50ng/μl的dIdC，PBS中与40fmol的生物素化IRBP1寡核苷酸和4pmol的(EC'AC')5或hexaCSE在室温孵育30分钟。将样品在TBE中以100V在6％天然聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后在380mA转移到尼龙膜上持续45分钟，并用UV(120,000μJ/cm2，Amersham)交联。使用LightShift化学发光EMSA试剂盒(#89880，ThermoFisherScientific)用于检测，将膜用LAS-4000(Fujifilm)数字化，并用ImageJ通过光密度法定量。
免疫沉淀
解剖成年小鼠的视觉皮层，并将其在均质缓冲液(0.32M蔗糖，5mM HEPES，10mMMgCl2和蛋白酶抑制剂)中裂解。将样品在4℃离心(8分钟，1700g)，并将上清液与5nmol的GAG模拟物在37℃孵育2小时。为了进行竞争分析，将配体与50nmol的RK-、AA-或SC-肽在37℃预孵育30分钟，然后与链霉亲和素偶联的Dynabeads(Life Technologies)在4℃孵育过夜。将装载的珠粒用均质缓冲液洗涤，在Laemmli缓冲液(含有DTT)中在95℃加热10分钟，以分离蛋白质用于蛋白质印迹分析。
蛋白质印迹
将免疫沉淀的蛋白在NuPAGE 4-12％Bis-Tris预制凝胶(Invitrogen)上在200V分离持续1小时，并在400mA转移到甲醇活化的PVDF膜上持续1小时。将膜用5％脱脂奶粉封闭1小时，然后与抗Sema3A第一抗体(兔，1/1000，Millipore)在4℃孵育过夜。将膜洗涤，并与抗兔HRP连接的第二抗体(Cell Signaling)孵育1小时。将膜用LAS-4000(Fujifilm)数字化，并用ImageJ通过光密度法定量。
脑输注和免疫组化
使用Alzet微型渗透泵(0.5μL/h)，向三月龄C57BL/6J小鼠(Janvier)的V1(λ：x＝1.7mm，y＝0mm，z＝0.5mm)中输注不同浓度的配体(4pM、400pM或4μM)持续7天。然后，用PBS和4％多聚甲醛灌注动物。将冷冻切片(20μm)与抗小白蛋白第一抗体(兔，1/500，Swant)和WFA-FITC(1/100，Vector)孵育过夜，然后与抗兔Alexa Fluor-546第二抗体(1/2000，Molecular Probes)孵育1小时。用Leica SP5共聚焦显微镜采集图像，并用ImageJ通过分析定量。
统计分析
使用Prism 6(GraphPad)进行分析。通过t检验进行单项比较，并通过方差分析和随后的Bonferonni事后检验进行多组分析。
结果：
为了评价生物素化的(EC'C'A)n和(EC'AC')n文库对Otx2蛋白的亲和力，我们用硝酸纤维素膜进行了斑点印迹，其中磺基肽的保留需要与蛋白质相互作用(图1a)。尽管Otx2的结合相比于其他基序没有更偏向于某个基序，但亲和力随着n重复的增加而明显增加(图1b)。为了进行比较，用hexaCSE进行了斑点印迹，先前已证明所述hexaCSE结合Otx2并干扰其在小鼠脑中的体内活性。发现具有n＝4或5个重复的序列与hexaCSE等同地与Otx2结合，而发现具有n＝6的那些的结合比hexaCSE好2至3倍。
为了确认生物素化配体通过其先前确定的GAG结合位点与Otx2相互作用，我们进行了DNA追踪和肽结合实验(图2)。在Otx2中，GAG结合基序位于其DNA结合结构域的第一螺旋中，因此GAG分子的特异性结合可能干扰DNA结合。分析表明，(EC'AC')5模拟物能够从Otx2追踪IRBP1 DNA探针，其程度等同于生物素化hexaCSE阳性对照(图2a)。Otx2(RKQRRER)中的GAG结合位点包含精氨酸-赖氨酸对(arginine-lysine doublet)(RK)，当突变为丙氨酸对(alanine doublet)(AA)时，所述精氨酸-赖氨酸对不再与ECM结合，并在Otx2+/AA小鼠模型中引起关键时期缺陷。使用基于该基序的肽(15-mer)进行斑点印迹分析以评估(EC'AC')6是否特异性结合(图2b)。尽管野生型肽(RKpep:RKQRRERTTFTRAQL)保留了配体，但突变的肽(AApep:AAQRRERTTFTRAQL)没有，包含与RKpep相同残基但顺序随机的乱序肽(SCpep:RTQTRFRTRARLEQK)也没有(图2c)。这些分析证明，相互作用不仅是静电性的，还需要特定的残基序列。
为了测量生物素化GAG模拟物的体内活性和特异性，我们进行了生化和免疫组化分析。Otx2和轴突导向因子3A(Sema-3A)均为视觉皮层可塑性的关键角色，并且具有相似的用于结合CS-E的基序(图3a)。我们首先关注Sema-3A，因为皮质Otx2的水平过低，无法通过生物化学方法可靠地检测。通过使用配体在成年小鼠视觉皮层裂解物的下拉实验中，我们发现(EC'AC')5和(EC'AC')6与Sema-3A相互作用，但(EC'C'A)6与Sema-3A不相互作用(图3b-图3c)。RKpep特异性破坏这些裂解物中Sema-3A与(EC'AC')6的相互作用(图3d-图3e)，提示了Sema-3A GAG结合基序的参与。
在成年小鼠视觉皮层中输注(EC'AC')5或(EC'AC')6持续7天后，40fmol导致PNN组装减少(图4a-图4b)。输注高达105倍更多的每种模拟物提供相同的减少。在PV细胞中的Otx2累积与周围PNN的组装之间存在反馈回路；PNN吸引细胞外的Otx2，而PV细胞中的Otx2活性增加PNN表达。这些结果提示，这些配体干扰Otx2信号传导，足以破坏该反馈回路并减少PNN组装。此外已经显示，在成人视觉皮层中干扰Otx2信号传导将逆转PV细胞成熟状态并诱导可塑性。在这里，仅输注(EC'AC')6(>40fmol)导致PV表达显著降低(图4c)。先前已证明，这种适度的降低(>25％)足以重新开启脑的可塑性。
这些下拉和输注实验证实了体外发现，即，更长的配体对GAG结合蛋白具有更高的亲和力；仅当(EC'AC')n模拟物的n＝6时，我们才观察到对PV细胞成熟的充分作用(图4c)。它们还提示，(EC'AC')n和(EC'C'A)n模拟物可以提供特异性和选择性。尽管Otx2在体外对任一基序均不显示偏好(图1b)，但Sema-3A在脑裂解液中与(EC'AC')n基序相互作用，但不与(EC'C'A)n基序相互作用(图3c)。因此，这些GAG模拟物包含有效的静电模式，以重现天然GAG中存在的特定硫酸酯化(sulfation)模式。
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