具体实施方式

本发明基于如下见解：在将细胞、珠等粒子进行分注的情况下，通过利用塑性流体，即使不进行分注中的搅拌操作，也可以抑制所分注的一定分量的粒子的浓度、密度的变动。

本发明还基于如下见解：如果能够进行不使用分注中的搅拌操作的分注，则即使为细胞等有生命的粒子成分或容易破坏的粒子成分，也能够避免搅拌导致的损伤，并且抑制所分注的一定分量的粒子的浓度、密度的变动。

本发明进而基于如下见解：如果能够进行不使用分注中的搅拌操作的分注，则可以抑制气体在贮存部(储存器)中的混入，并抑制分注量的变动。

本发明进而基于如下见解：通过在使用泵和管的分注中利用塑性流体，在管内可进行基于层流的送液，容易维持与吸入时相同的粒子浓度。另外基于如下见解：由于可进行层流中的送液，从而与气相的界面的崩溃被抑制且不易含有气体。

但是，本发明并不限定于这些见解。

[分配方法、分注方法]

本发明在一个方式中涉及一种粒子的分配方法，其包括：使粒子分散于塑性流体中；及分注含有上述粒子的塑性流体。

在本发明的粒子的分配方法中，例如在粒子为细胞的情况下，作为上述塑性流体，可举出在培养基或冻存液中混合后述的特定化合物而制成塑性流体的塑性流体。

因此，换言之，本发明的粒子的分配方法可以如下所述。即，本发明在一个方式中涉及一种分注方法，其包括：将含有粒子的液体的液体制成塑性流体；及分注含有上述粒子的塑性流体。

根据本发明的分配及分注方法，在一个或多个实施方式中，即使不进行搅拌等操作，也可以以一定密度且一定量分配或分注含有粒子的液体(塑性流体)。因此，本发明的分配及分注方法在一个或多个实施方式中包括定量地分配或分注含有粒子的塑性流体。

关于粒子及塑性流体，以下进行说明。

[粒子]

在本发明的分配、分注方法中，粒子是能够以与液体的混合物的形式进行分注的物质。

粒子可以为固体，也可以为液体。

作为粒子的一个或多个实施方式，可举出：细胞、微生物、脂质体、药包粒子、颜料等化妆成分、珠、胶体等。

本发明的分配、分注方法由于无需进行分配中、分注中的搅拌操作，因此，适于在剪切应力(物理应力)上具有敏感性的粒子的分配、分注。但是，粒子并不限定于这些。

作为细胞，可以含有源自动物的细胞及源自植物的细胞。作为细胞的一个或多个实施方式，可举出培养细胞。作为培养细胞，可举出干细胞，作为干细胞，可举出：胚胎干细胞(ES细胞)及人工多能干细胞(iPS细胞)等那样的多能干细胞、或者间充质干细胞、造血干细胞及组织干细胞等那样的多分化能干细胞。

作为珠，可举出：聚合物珠、陶瓷珠、金属珠、金属氧化物珠。作为珠的形态，另外可举出磁性珠、珠载体、磨粒等。

作为胶体，可举出乳液、悬浮液。

在本发明中，粒子的分配包括粒子和液体的混合物的分注。

在本发明中，液体可以是指不是塑性流体的液体及塑性流体这两者。没有特别提及的情况下，液体是指不是塑性流体的液体。

[塑性流体]

在本发明中，塑性流体是指为了使其流动而需要屈服应力的流体、即具有屈服值的流体。塑性流体可以为宾汉流体，也可以为非宾汉流体。在本发明中，塑性流体是指在静置状态下能够抑制分配(分注)目的的粒子的沉降的流体，优选能够保持为不使该粒子沉降的流体。

在本发明中，塑性流体在没有限定的一个或多个实施方式中可以通过将不是塑性流体的液体和特定化合物进行混合而得到。

上述特定化合物为可以将不是塑性流体的液体制成塑性流体的化合物，在没有限定的一个或多个实施方式中，可以使用WO2014/017513中所发明的物质、或下述的物质。

作为用于将不是塑性流体的液体制成塑性流体的特定化合物，没有特别限制，可举出高分子化合物，优选举出具有阴离子性的官能团的高分子化合物。

作为阴离子性的官能团，可举出羧基、磺基、磷酸基及它们的盐，优选羧基或其盐。

上述高分子化合物可以使用具有选自上述阴离子性的官能团中的1种或2种以上的物质。

作为用于将不是塑性流体的液体制成塑性流体的特定化合物的优选的具体例，没有特别限制，可举出10个以上的单糖(例如，三糖、四糖、戊糖、己糖、庚糖等)聚合而成的多糖，更优选举出具有阴离子性的官能团的酸性多糖。在此所说的酸性多糖只要其结构中具有阴离子性的官能团，就没有特别限制，例如为具有糖醛酸(例如：葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)的多糖、在结构中的一部分中具有硫酸基或磷酸基的多糖、或者具有其两者的结构的多糖，不仅包含由天然得到的多糖、而且包含利用微生物所产生的多糖、基因工程上所产生的多糖、或者使用酶人工地合成的多糖。更具体而言，可例示由选自透明质酸、结冷胶、脱酰结冷胶(以下，也有时称为DAG)、中性树胶(rhamsan gum)、定优胶(diutan gum)、黄原胶(キサンタンガム)、卡拉胶、黄原胶(ザンタンガム)、己醣醛酸、墨角藻聚糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝磷脂、硫酸类肝素、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李聚糖及它们的盐中的1种或2种以上构成的多糖。多糖优选为透明质酸、DAG、定优胶、黄原胶、卡拉胶或它们的盐，可以通过低浓度的使用而使粒子浮游，且考虑粒子的回收的容易性时，更优选为DAG。在此所说的盐可举出例如锂、钠、钾之类的碱金属的盐、钙、钡、镁之类的碱土金属的盐或铝、锌、钢、铁、铝、有机碱及氨基酸等的盐。

这些高分子化合物(多糖等)的重均分子量优选为10000～50000000，更优选为100000～20000000，进一步优选为1000000～10000000。例如，该分子量可以以利用凝胶渗透色谱法(GPC)的支链淀粉(日文原文：フルラン)换算来测定。进而，DAG也可以使用进行了磷酸化的物质。该磷酸化可以用公知的方法进行。

上述多糖在一个或多个实施方式中可以组合使用多种(优选2种)。多糖的组合的种类没有特别限定，优选该组合至少含有DAG或其盐。即，在优选的多糖的组合中含有DAG或其盐、及DAG或其盐以外的多糖(例如：黄原胶、海藻酸、卡拉胶、定优胶、甲基纤维素、刺槐豆胶或它们的盐)。作为具体的多糖的组合，可举出DAG和中性树胶、DAG和定优胶、DAG和黄原胶、DAG和卡拉胶、DAG和黄原胶、DAG和刺槐豆胶、DAG和κ-卡拉胶、DAG和海藻酸钠、DAG和甲基纤维素等，但并不限定于这些。

作为特定化合物的进一步优选的具体例，可举出透明质酸、脱酰结冷胶、定优胶、卡拉胶及黄原胶及它们的盐，作为优选例，可举出脱酰结冷胶或其盐。本发明中脱酰结冷胶为以1-3键合的葡萄糖、1-4键合的葡萄糖醛酸、1-4键合的葡萄糖及1-4键合的鼠李糖这4分子的糖为构成单位的直链状的高分子多糖，在以下的通式(I)中，是R₁、R₂均为氢原子、n为2以上的整数表示的多糖。其中，R₁可以含有甘油基，R₂可以含有乙酰基，但乙酰基及甘油基的含量优选为10％以下，更优选为1％以下。

[化学式1]

利用上述特定化合物形成塑性流体的机制是各种各样的，但对脱酰结冷胶的情况进行记载时，脱酰结冷胶在与液体混合时混入液体中的金属离子(例如、钙离子)，形成经由该金属离子的不定形的结构体，使粒子浮游。作为由脱酰结冷胶所制备的塑性流体的液体的粘度在一个或多个实施方式中为8mPa·s以下，优选为4mPa·s以下，考虑到粒子的回收的容易性方面时，更优选为2mPa·s以下。但是，作为塑性流体的液体的粘度没有特别限制，可以大于上述值。

用于制成塑性流体的上述特定化合物也可以用化学合成法来得到，但在该化合物为天然物的情况下，优选通过由含有该化合物的各种植物、各种动物、各种微生物使用常用技术进行萃取及分离精制而得到。在该萃取中，使用水或超临界气体时，可以高效地萃取该化合物。例如，作为结冷胶的制造方法，在发酵培养基上将生产微生物进行培养，将菌体外所生产的粘膜物用通常的精制方法进行回收、干燥、粉碎等工序后，制成粉末状即可。另外，在脱酰结冷胶的情况下，在回收粘膜物时实施碱处理，将键合于1-3键合的葡萄糖残基的甘油基和乙酰基进行脱酰基化之后回收即可。作为精制方法，例如通过将液-液萃取、分级沉降、结晶化、各种离子交换色谱法、使用Sephadex LH-20等的凝胶渗透色谱法、基于利用活性炭、硅胶等的吸附色谱法或薄层色谱法的活性物质的吸附脱附处理、或者将使用反相柱的高效液相色谱法等单独或者以任意的顺序组合并且反复使用，能够除去杂质并进行精制。作为结冷胶的生产微生物的例子，可举出伊乐假单胞杆菌(SPhingomonas elodea)及改变了该微生物的基因而成的微生物，但不限定于此。

在脱酰结冷胶的情况下，可以使用市售的物质、例如三品株式会社制的“KELCOGEL(CPKelco社的注册商标)CG-LA”、三荣源F.F.I株式会社制的“KELCOGEL(CPKelco社的注册商标)”等。另外，作为天然型结冷胶，可以使用三荣源F.F.I株式会社制的“KELCOGEL(CPKelco社的注册商标)HT”等。

[塑性流体中的特定化合物的浓度]

塑性流体中的上述特定化合物的浓度(质量/容量％，以下仅表示为％)取决于特定化合物的种类，可以在能够制成能够保持为在静置状态下不使贮存瓶的细胞沉降的塑性流体的范围内适当设定，通常为0.0005％～1.0％，优选为0.001％～0.4％，更优选为0.005％～0.1％，进一步优选为0.005％～0.05％。例如，脱酰结冷胶的情况下为0.001％～1.0％，优选为0.003％～0.5％，更优选为0.005％～0.1％，进一步优选为0.01％～0.05％，进一步更优选为0.02％～0.05％。黄原胶的情况下为0.001％～5.0％，优选为0.01％～1.0％，更优选为0.05％～0.6％，进一步更优选为0.3％～0.6％。κ-卡拉胶及刺槐豆胶混合系的情况下为0.001％～5.0％，优选为0.005％～1.0％，更优选为0.01％～0.1％，最优选为0.03％～0.05％。天然型结冷胶的情况下，为0.05％～1.0％，优选为0.05％～0.1％。

在将上述多糖多种(优选2种)组合而使用时，该多糖的浓度可以在能够制成能够保持为在静置状态下不使液体中的细胞沉降的塑性流体的范围内适当设定。例如，在使用DAG或其盐、和DAG或其盐以外的多糖的组合的情况下，作为DAG或其盐的浓度，可例示0.005～0.02％、优选0.01～0.02％，作为DAG或其盐以外的多糖的浓度，可例示0005～0.4％、优选0.1～0.4％。作为具体的浓度范围的组合，可例示以下物质。

DAG或其盐：0.005～0.02％(优选0.01～0.02％)

DAG以外的多糖

黄原胶：0.1～0.4％

海藻酸钠：0.1～0.4％

刺槐豆胶：0.1～0.4％

甲基纤维素：0.1～0.4％(优选0.2～0.4％)

卡拉胶：0.05～0.1％

定优胶：0.05～0.1％

需要说明的是，该浓度可以用以下的式子算出。

浓度(％)＝特定化合物的质量(g)/液体的容量(ml)×100

特定化合物也可以利用化学合成法进一步变成其它衍生物，这样得到的该衍生物也可以在本发明所涉及的细胞培养方法中有效地使用。具体而言，在脱酰结冷胶的情况下，将与上述通式(I)表示的化合物的R₁和/或R₂相对应的羟基取代为C1-3烷氧基、C1-3烷基磺酰基、葡萄糖或果糖等的单糖残基、蔗糖、乳糖等的低聚糖残基、甘氨酸、精氨酸等的氨基酸残基等而成的衍生物也可以用于本发明。另外，也可以使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)等交联剂将该化合物进行交联。

特定化合物或其盐可以根据制造条件以任意的晶形存在，可以以任意的水合物的形式存在，但这些晶形或水合物及它们的混合物也包含在本发明的范围内。另外，有时还以含有丙酮、乙醇、四氢呋喃等有机溶剂的溶剂化物的形式存在，但这些形态均包含在本发明的范围内。

特定化合物可以以通过环内或环外异构化而生成的互变异构体、几何异构体、互变异构体或几何异构体的混合物、或它们的混合物的形式存在。本发明中，就上述特定化合物而言，不管是否通过异构化而产生，在具有不对称中心的情况下，可以以分开的光学异构体或以任意的比率含有它们的混合物的形式存在。

在一个或多个实施方式中，作为塑性流体的液体可以通过将上述特定化合物的溶液或分散液添加于液体培养基来制造，但由于根据需要而特定化合物经由离子而集合、或者特定化合物形成三维的网络，因此，优选添加金属离子。作为金属离子，在一个或多个实施方式中，可举出2价的金属离子。作为2价的金属离子，在一个或多个实施方式中，可举出钙离子、镁离子、锌离子、铁离子及铜离子等。金属离子的浓度在一个或多个实施方式中为0.1mM～300mM、0.5mM～100mM、或0.5mM～10mM。

[塑性流体的屈服值]

本发明中使用的塑性流体的屈服值优选为能够保持为在静置状态下不使粒子沉降的程度。从保持粒子的观点考虑，本发明中使用的塑性流体的屈服值优选0.02Pa以上，更优选0.03Pa以上。本发明中使用的塑性流体的屈服值例如为0.2Pa以下或0.1Pa以下。

[自动分注装置]

本发明的分配、分注方法可以优选适用于利用自动分注装置的分注。根据本发明的分配、分注方法，在一个或多个不限定的实施方式中，可抑制利用自动分注装置所分注的等分试样的分注量的偏差、粒子的密度的偏差、及粒子为细胞时的细胞的生存率的偏差中的至少1者。

在本发明中，自动分注装置没有特别限制，可举出用含有液体管及泵的泵机组从贮存部(储存器)吸引而喷出到小瓶或多孔板的类型、或利用能够吸引·喷出的分注移液管头从贮存部分注到多孔板的类型。

在一个或多个实施方式中，本发明的自动分注装置具备控制泵机组及分注移液管头等的控制部。在一个或多个实施方式中，控制部包括以将贮存于贮存部内的分散有粒子的塑性流体定量分注于多个容器的方式控制泵机组及分注移液管头等。

[制造方法]

作为另一方式，本发明涉及一种制造方法，其为具备粒子和上述粒子的容器的制品的制造方法，包含从使分散有上述粒子的塑性流体的贮存部向多个上述容器分注上述塑性流体。

换言之，本发明的制造方法可以如下所述。即，作为另一方式，本发明涉及一种制造方法，其为具备液体和上述液体的容器的制品的制造方法，其中，包括：从上述液体的贮存部向多个上述容器分注上述液体，上述液体为含有粒子的塑性流体。

根据本发明的制造方法，在一个或多个实施方式中，可以制造粒子的量(或浓度)和/或液体的量实质上均匀的制品。根据本发明的制造方法，在一个或多个实施方式中，即使在配置于自动分注装置的贮存部内的上述塑性流体或液体的残量成为分注开始前的20％以下、15％以下、10％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下或1％以下的情况下，也能够以与在分注开始时分注于容器的粒子的量(或浓度)和/或液体的量实质上相同的量进行分注。另外，在配置于自动分注装置的贮存部内的上述塑性流体或液体的残量成为分注量以下的情况下，可以将剩余的全部分注于1个容器。

在一个或多个实施方式中，本发明的制造方法包括将分散有粒子的塑性流体定量地分注于多个容器。在本发明的制造方法中的没有特别限定的一个或多个实施方式中，包括将配置于自动分注装置的贮存部内的上述塑性流体或液体定量地分注于上述多个容器。在一个或多个实施方式中，本发明的制造方法包括使用自动分注装置制造多个定量地分注而成的上述制品。

作为本发明中“定量地分注”，包括以粒子的量(或浓度)和/或液体的量实质上相同的方式分注于多个容器。本发明中“粒子的量(或浓度)实质上相同”是指针对分注于容器的粒子的量(或浓度)(Y_p)相对于所期望的粒子的量(或浓度)(X_p)的相对误差({(X_p-Y_p)/X_p}×100)为±15％以下、±14％以下、±13％以下、±12％以下、±11％以下、±10％以下、±9％以下、±8％以下、±7％以下、±6％以下、±5％以下、±4％以下、±3％以下、±2％以下、±1％以下或±0.55％以下。本发明中“液体的量实质上相同”是指针对所期望的量(X_l)和分注于容器的液体的量(Y)的相对误差({(X_l-Y_l)/X_l}×100)为±10％以下、±9％以下、±8％以下、±7％以下、±6％以下、±5％以下、±4％以下、±3％以下、±2％以下、±1％以下或±0.55％以下。

作为本发明中的“多个容器(或制品)”，没有特别限定，为50以上、60以上、70以上、80以上、90以上或100以上。

作为可以用本发明的制造方法制造的制品，可举出分注有培养细胞、脂质体、或药包粒子等的小瓶制品，另外，可举出化妆品及医药品等。

[组合物]

作为其它的方式，本发明涉及一种组合物，其为用于在本发明的分配方法或制造方法中的分注中使用的组合物，包含用于将液体制成塑性流体的物质，该液体是粒子在其中分散的液体或使粒子分散的液体。

本发明的组合物可以为固体或粉体状，也可以为液体的状态。

作为上述“用于制成塑性流体的物质”，可以使用前述的特定化合物。

本发明的组合物可以进一步含有其它的成分、即上述物质(特定化合物)以外的成分。

作为其它的成分，粒子为细胞的情况下，可举出细胞培养培养基成分、细胞冻存液的成分。细胞培养培养基成分可以根据上述细胞而适当选择。本发明中细胞冻存液可以为细胞冻存用培养基。作为冻存液的成分，可以含有细胞防冻剂、细胞内防冻害剂、细胞外防冻害剂等。

因此，作为其它的方式，本发明涉及一种组合物，其含有细胞冻存液和用于将上述液体制成塑性流体的物质。作为本发明的组合物的一个或多个实施方式，可举出在细胞冻存液中溶解“用于制成塑性流体的物质”而成为塑性流体的细胞冻存液。另外，作为本发明的组合物的另一个或多个实施方式，可举出以细胞冻存液和“用于制成塑性流体的物质”彼此不混合的形态保持的细胞冻存液和“用于制成塑性流体的物质”的组合。

在其它的成分为细胞冻存液的成分的情况下，由于特定化合物经由离子而集合、或者特定化合物形成三维的网络，因此，优选添加金属离子。作为金属离子，在一个或多个实施方式中，可举出2价的金属离子。作为2价的金属离子，在一个或多个实施方式中，可举出钙离子、镁离子、锌离子、铁离子及铜离子等。在一个或多个实施方式中，金属离子的浓度为0.1mM～300mM、0.5mM～100mM、或0.5mM～10mM。

本发明还涉及以下的没有限定的一个或多个实施方式。

[1]一种粒子的分配方法，其包括：

使上述粒子分散于塑性流体中；及

分注含有上述粒子的塑性流体。

[2]根据[1]所述的方法，其中，利用自动分注装置进行上述分注。

[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，上述粒子为细胞。

[4]一种制造方法，其为具备粒子和上述粒子的容器的制品的制造方法，上述制造方法包括：

从分散有上述粒子的塑性流体的贮存部向多个上述容器分注上述塑性流体。

[5]根据[4]所述的制造方法，其中，利用自动分注装置进行上述分注。

[6]根据[4]或[5]所述的制造方法，其中，上述粒子为细胞。

[7]一种组合物，其在[1]～[3]中任一项所述的方法、或[4]～[6]中任一项所述的制造方法中的分注中使用，其中，上述组合物含有用于将液体制成塑性流体的物质，上述液体是粒子在其中分散的液体或使粒子分散的液体。

[8]一种组合物，其包含细胞冻存液和用于将上述液体制成塑性流体的物质。

以下，通过实施例进一步详细地说明本发明，但这些实施例为例示的实施例，本发明并不限于这些实施例。

实施例

准备将贮存部1的储液瓶内的液体经由管道2及泵3分注于多个小瓶4的自动分注装置(图1)。使用该自动分注装置评价分注于小瓶的粒子(珠或细胞)。

[评价模型]

作为对利用自动分注装置而分注制造的培养细胞的小瓶制品的品质进行评价的模型，使用下述式(I)。下述式(I)为求出1个小瓶中的有效的细胞数的指标Y的式(参照图2)。

Y＝(V/V_t)_ts，Fs·(D/D₀)_ts，Fs·(P/P₀) (I)

式(I)中的参数为ts和Fs。ts表示在贮存部的储液瓶中从分注开始至被吸引为止的时间(以下也称为“滞留时间”)(h)，Fs表示储液瓶的振荡速度(s^-1)。

(V/V_t)_ts，Fs为分注量的相对值。V_t为设定的分注量，V为所分注的等分试样的量。

(D/D₀)_ts，Fs为密度的相对值。D₀为分注开始时(ts＝0，分散状态)的等分试样的密度(粒子数(或细胞数)/ml)，D为所分注的等分试样的密度。

(P/P₀)为细胞的生存率，用下述式算出。

(P/P₀)＝α_ts，Fs×β_ts，Fs×γ_ts，Fs

γ_ts，Fs＝n₁/n₀

β_ts，Fs＝n₂/n₁

α_ts，Fs＝n₃/n₂

n₀：初始活细胞数

n₁：分注后的活细胞数

n₂：冷冻·恢复温度(解冻)后的活细胞数

n₃：播种24小时后的贴壁细胞数

γ表示搅拌前后的生存率。

β表示冷冻·恢复温度(解冻)前后的生存率。

α表示在播种前和播种24小时后的贴壁细胞率。

[试验例1：浓度的均匀性]

在储液瓶中放入珠和冻存液(商品名：STEM-CELLBANKER^(R)GMP grade、ZENOAQ制)，制作珠浓度1.0×10⁶beads/ml的珠悬浮液100ml。使用自动移液管和50ml移液管在瓶内迅速地吸移10次使浓度成为均匀。将使浓度成为均匀的瓶设置于图1的自动分注装置的贮存部，将液体管的前端插入于瓶，调整液体管的前端的位置。其后，用自动分注装置在100个冷冻小瓶中分注悬浮液各1ml。使用自动化细胞计数仪测定经分注的小瓶内的珠浓度。参照图3。

将以各种各样的振荡速度(Fs)和滞留时间(ts)在从液体上表面起5mm下方的位置取样时的(D/D₀)示于图4。

如图4所示，在Fs＝0即不进行搅拌时，随着时间的经过，从液体上表面起5mm的位置的样品的珠密度降低。同样的倾向在Fs＝0.1及0.4(s^-1)的振荡速度时也产生。可知在试验例1的条件下，为了将所分注的小瓶的样品密度维持为一定，需要振荡速度Fs＝0.9s^-1以上的搅拌。

对以振荡速度Fs＝0、0.9、及1.6s^-1进行搅拌而分注的100个小瓶，分别算出(D/D₀)。将其结果示于图5。

如图5所示，在Fs＝0即不进行搅拌的情况下，在取样的后半部分的小瓶中珠浓度显著地降低(圆圈部分)。另一方面，通过振荡速度Fs＝0.9s^-1以上的搅拌，在100个小瓶中珠浓度维持为一定。

[试验例2：分注量的均匀性]

用能够一边振荡储液瓶一边进行泵吸引的自动分注装置将100ml的冻存液(商品名：STEM-CELLBANKER^(R)GMP grade、ZENOAQ制)用约30分钟分注于102个小瓶。需要说明的是，从储液瓶的吸引是将液体管的前端固定于从瓶的底面起5mm上方的位置而进行的。

对所分注的102个小瓶，测定分注量。将其结果示于图6。

如图6的(GG(-))所示，在振荡速度Fs＝0、及0.9s^-1的情况下，小瓶中的分注量从最初至最后为大致一定。但是，在振荡速度Fs＝5.8s^-1的情况下，在取样的后半部分，小瓶分注量显著地降低(圆圈部分)。

因此，示出了振荡速度过快时(Fs＝5.8s^-1)，由于起泡被吸入于液体管而有可能后半部分的分注量降低。

由试验例1及2确认了在液体保存液那样的通常的液体的情况下，为了使珠或细胞之类的粒子的浓度在小瓶之间为一定，需要某种程度以上的速度的搅拌，但为了使注入于小瓶的分注量在小瓶之间为一定，需要搅拌的速度不过快。

接着，在储液瓶中放入添加有化合物A(脱酰结冷胶、日产化学社制)的上述冻存液(化合物A的浓度：0.06％)，在无振荡(Fs＝0)的情况下进行，除此之外，与上述同样地进行分注，测定分注量。将其结果示于图6。

如图6的(GG(+))所示，在添加有化合物A的情况下，即，可以通过使用制成塑性流体的冻存液而定量地分注至最后(第101个)。另外，如图6所示，通过使用制成添加有化合物A的塑性流体的冻存液(GG(+))，与未添加化合物A(不是塑性流体的)情况(GG(-))相比，分注时的定量性提高。

[试验例3：细胞的生存率]

使用在T-225烧瓶中培养的hiPS细胞(D2菌株、StemFit培养基)取代试验例1及2的珠(参照图7)。在培养后且分注前、分注后且冷冻前、冷冻和恢复温度后计数活细胞，计数在冷冻和恢复温度后培养24小时后贴壁的细胞，算出生存率(P/P₀)。

确认了在给定的滞留时间ts(1h或4h)中受到的振荡的时间对生存率(P/P₀)带来的影响。将其结果示于图8。

本试验例中所说的ts是指用冻存液制作细胞悬浮液后至冷冻为止的时间。图8中，为ts＝1h的图表，振荡时间为0h及0.5h是指在无振荡及振荡30分钟时取样(分注)、在ts＝1h的时刻被冷冻的情况。ts＝4h的图表也同样。

如图8所示，可知例如在分注花费4小时的情况下，就最初所分注的等分试样和在1～4小时后所分注的等分试样而言，细胞的生存率(P/P₀)大大不同。即，显示出即使为相同的批次，也混合存在根据在分注工序中暴露于振荡的时间而细胞的生存率显著地不同的小瓶(制品)。

[塑性流体的制作]

将以成为2mM的方式加入有氯化钙的冻存液(商品名：STEM-CELLBANKER^(R)GMPgrade、ZENOAQ制)92.5ml放入储液瓶中，使用注射器和注射针，以浓度成为0.06％的方式放入化合物A(脱酰结冷胶、日产化学社制)7.5ml而使其颠倒混合，在冷藏库中保存一夜。

[试验例4：浓度的均匀性(塑性流体)]

在储液瓶中放入装有珠和化合物A的冻存液，制作珠浓度为1.0×10⁶beads/ml的珠悬浮液100ml。使用自动移液管和50ml移液管在瓶内迅速地吸移10次并使浓度成为均匀。将使浓度成为均匀的瓶设置于上述的自动分注装置的贮存部，将液体管的前端插入于瓶，将液体管的前端的位置调整为从液体上表面起5mm下方的位置。其后，用自动分注装置在100个冷冻小瓶中分注悬浮液各1ml。使用自动化细胞计数仪测定所分注的小瓶内的珠浓度。参照图9。

在无振荡(Fs＝0)时，在冻存液中添加化合物A的情况和未添加的情况下，对经分注的小瓶分别算出珠浓度(D/D₀)。将其结果示于图10。

如图10所示，在Fs＝0即不进行振荡、且未添加化合物A的情况下，在取样的后半部分的小瓶中，珠浓度(D/D₀)显著地降低。另一方面，即使在不进行振荡情况下，在添加了化合物A的情况下，也能抑制珠浓度(D/D₀)的降低。

[试验例5：细胞的生存率(塑性流体)]

不进行储液瓶的振荡(Fs＝0)，而使用CaCl₂及化合物A将冻存液制成塑性流体(CaCl₂：2mM、化合物A：0.06％)，除此以外，与试验例3同样地以给定的ts(0～4h)进行分注、冷冻、恢复温度(解冻)、培养。算出搅拌前后的生存率γ(％)、冷冻·恢复温度(解冻)前后的生存率β(％)、再培养播种前与再培养播种24小时后的贴壁细胞率α(％)，进一步测定再培养时的倍增速度μ(h)。将这些结果与未使用化合物A的情况(不制成塑性流体的情况)进行比较并示于图11。

另外，观察再培养的情形，在使用化合物A将冻存液制成塑性流体的情况和未使用化合物A的情况(不制成塑性流体的情况)下进行比较。将其结果示于图12。

如图11及12所示，即使在使用制成塑性流体的冻存液的情况下，上述参数(α、β、γ、μ)也与使用不制成塑性流体的冻存液的情况同样，没有观察到制成塑性流体时的细胞毒性。

由以上的情况确认到：在分注分散有细胞的冻存液时使用塑性流体的情况下，可以不需要搅拌、振荡而抑制所分注的等分试样的分注量及细胞密度的偏差，另外，可以进行维持细胞的品质(生存率等)的同时能够抑制偏差的分注。

[试验例6：细胞的生存率(塑性流体)]

使用下述表1所示的冻存液、CaCl₂及化合物A(脱酰结冷胶、日产化学社制)，用与上述塑性流体的制作同样的步骤制作塑性流体(SCB-GG(+)及SS-GG(+))。

[表1]

使hiPS细胞(1383D2菌株)分散于SCB-GG(+)及SS-GG(+)中，不进行储液瓶的振荡(Fs＝0)，而以给定的ts(0～4h)进行分注、冷冻、恢复温度(解冻)、及培养。算出在分注前后的生存率γ(％)、在冷冻·恢复温度(解冻)前后的生存率β(％)、再培养播种前与再培养播种24小时后的贴壁率α(％)、及细胞电位P/P₀(＝α×β×γ)。将其结果示于图13。

除使用未采用化合物A的情况(不制成塑性流体的情况、SCB-GG(-)及SS-(GG(-)))之外，与上述同样地进行。将其结果示于图13。需要说明的是，为了使细胞的浓度均匀，未使用化合物A的情况(SCB-GG(-)及SS-(GG(-)))下，一边进行储液瓶的振荡(Fs＝0.90s^-1)一边进行分注。

如图13所示，确认到无论是哪种冻存液，制成塑性流体均存在能抑制通过分注及恢复温度等而产生的细胞电位的降低的倾向。