具体实施方式

实施例1 thornlessSUS基因克隆

原始实验材料：从多株有刺成年黑果枸杞采集成熟种子，湿润条件下37 ℃催芽24h后于超净工作台中进行表面杀菌（75%酒精处理30-60 S，0.1%升汞处理1-2 min，无菌清水冲洗3-5次），吸干表面水分后横向接种到1/2MS培养基（1/2MS大量元素+1/2MS微量元素+1/2MS铁盐+1/2MS有机成分+2%蔗糖+0.45-0.5%琼脂粉，pH值5.8-6.0）。完全黑暗24-26 ℃条件下待种子萌发后置于12 h光照/12 h黑暗的光周期条件下培养。光由LED灯管提供，强度为48 μmol/m²/s。待无菌种苗发育出10-20片叶时，取幼嫩含1-2叶腋的茎段（去叶）作为外植体，竖向下端朝下插入茎培养基2-3 mm。上述茎培养基为MS培养基含4 % (w/v)蔗糖,0.50 % (w/v) 琼脂粉和0.1-0.2 mg /L 6-BA, pH值5.8. 光周期和温度条件同上述种苗培养。该培养条件下，部分种苗得来的外植体插入培养基的茎切口先产生结节样愈伤，然后愈伤于相同培养基上形成大量不定芽丛；同时腋芽也会迅速萌生丛生芽。待愈伤产生的不定芽丛高度超过1 cm时，切/剪下芽体接种到含0. 2 mg /L IBA的1/2MS培养基诱导生根。待芽体生根且茎发育到含10-20片叶时，再次按照上述方法取茎段作为外植体，诱导不定芽生，切芽诱导生根。如此进行2-6代的再生培养，可以从一粒黑杞成熟种子获得一个组培无性系群体。将瓶内的各个生根无性系群体分别做好标记，置于窗台自然光照下驯化，温度23-28 ℃，待茎干粗壮且叶色深绿时移栽入口径为15 cm的花盆。移栽基质为1草炭：1腐殖土：2菜园土，基质移栽之前装入聚乙烯食用菌袋封口于121 ℃湿热条件下灭菌30-60 min。将组培苗根部培养基清洗干净并置于广谱抗菌药工作液中浸泡5-10 min，之后移栽入盆中基质，并将基质浇透水覆盖带孔塑料膜。注意一瓶移入一盆中。10 d内盆土含水率保持在100%田间持水量，10 d后可逐渐揭开覆盖的塑料膜，盆土含水率保持在90-100%田间持水量。移栽于温室内进行，环境温度为25±2 ℃，光照为散射自然光。待盆苗开始抽新茎时，将其逐渐转移到直射自然光照下，盆土田间持水量仍然保持 90%以上。对移栽且刚恢复生长的各个组培无性系进行盆栽控水试验（温室自然光照下），将每个无性系移栽苗分为两组，将其田间持水量分别控制在90%以上和60%以下。选取一个典型的在＞90%田间持水量条件下保持无刺的无性株系。取其幼嫩尚未木质化的徒长完全无刺茎，去掉叶片，剪取最顶端的三个茎节作为高通量转录组测序（RNA-Seq）和基因克隆的原始实验材料。

通过百迈克公司的RNA-Seq，获得无刺黑果枸杞蔗糖合酶基因（thornlessSUS）部分表达序列。根据此序列，采用软件Primer Premier5设计引物，用于thornlessSUS克隆；引物设计如下：

SUS-F：5'-GGAAAGAATGGCAGCCAGTAG- 3'

SUS-R：5'- CCAGTGTCGGGATAACCAAG- 3'；

采用上述无刺茎节为材料，采用Ultrapure RNA Kit提取总RNA并合成第一链cDNA，具体方法如下：

1）取100-200mg茎节材料在液氮中充分研磨，加入1ml TRIzon Reagent，混匀；

2）加入TRIzon Reagent后反复吹打几次，使样本充分裂解；室温放置5 min，使蛋白核酸复合物完全分离；

3）加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置2min；

4）在4℃下，12000 rpm离心10 min，将位于上层水相中的RNA移到一个新的RNaseFree离心管中；

5）加入200 μl的70%乙醇（无RNase水配制），颠倒混匀；

6）将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中。12000 rpm离心20 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

7）向吸附柱中加入700 μl Buffer RW1，12000 rpm离心20 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

8）向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前加入无水乙醇），12000 rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

9）重复步骤8）；

10）12000 rpm离心2 min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温5-10 min，彻底晾干；

11）将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入20-50 μlRNase-Free Water，室温放置1 min，12000 rpm离心1 min，收集RNA溶液，电泳并采用微量核酸蛋白测定仪确定浓度、完整性和纯度符合实验要求。-70℃—-80℃保存RNA，防止降解。

12）使用M-mlV Reverse Transcriptase（M1701）合成cDNA: 整个反应体系在0.2ml PCR管中进行，反应体系如下：

RNA 5μl

Oligo d(T)₁₅ 1μl

DEPC水 9μl

总体积 15μl

反应过程如下：70℃ 5min，迅速放到冰上，冰浴2min；加入1 μl M-mlV，5 μl M-mlV 5×Reaction Buffer，5 μl dNTP，1 μl RNase，3μl 无菌水（RNase free）；42℃ 60min，4 ℃ 保存。

以上述合成的cDNA作为模板，采用引物对SUS-F和SUS-R进行PCR，体系如下：

cDNA 1μl

SUS-F 0.5μl

SUS-R 0.5μl

Taq 0.25μl

Taq Buffer 2.5μl

dNTP 0.5μl

超纯水 19.75 μl

总体积 25μl

PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；退火温度56 -60 ℃ 30 s，72 ℃ 延伸1 min，35个循环；72℃后延伸5min。

将PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统观察，拍照，胶回收理想片段、连接T载体（pUCm-T Vector试剂盒）转化，送到北京华大基因进行测序。测序结果证明获得的thornlessSUS序列无终止密码子。故采用3’RACE获得thornlessSUS基因的完整CDS。根据上述获得的thornlessSUS基因的部分序列设计上游引物C751：5’-GGGAAACACTGCTCAACG-3’；下游引物选用3’RACE的通用引物B26：5’- GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’；通过PCR方法扩增thornlessSUS基因3’区；PCR反应体系如下：

cDNA 1μl

C751 0.5μl

B26 0.5 μl

Taq 0.25μl

Taq Buffer 2.5 μl

dNTP 0.5 μl

超纯水 19.75 μl

总体积 25 μl

PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；46 ℃ 30 s，退火时间为30 s，72 ℃2min，35个循环；72 ℃ 5min；

将PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳观察基因扩增情况，凝胶成像系统观察，拍照。选择条带单一清晰的PCR产物，胶回收，连接T载体转化后，送至北京华大基因测序。根据测序结果，拼接得到该基因CDS全长序列。将该序列在NCBI上对比分析，预计获得thornlessSUS基因CDS全长。根据全长序列采用软件Primer Premier5设计上游引物F：5’-ATGGCAGCCAGTAGTCTTAGCA-3’和下游引物R-2：5 ’-TAAATCCCAGATAATGTCATCACTT-3’，通过PCR扩增thornlessSUS基因CDS全长。PCR反应体系如下：

cDNA 1μl

F 0.5μl

R-2 0.5μl

Taq 0.25μl

Taq Buffer 2.5μl

dNTP 0.5μl

超纯水 19.75μl

总体积 25μl

PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；设置5个退火梯度，61.4 -55.6 ℃ 30s，72 ℃ 5 min，35个循环；72 ℃ 10min；4 ℃保存；

将PCR产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳观察基因扩增情况，凝胶成像系统观察，拍照。选择条带单一清晰的目标PCR产物，切胶回收，连接T载体转化后，送至北京华大基因测序，获得的thornlessSUS全长CDS序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

上述实验用到的胶回收采用康为世纪生物科技有限公司的DNA凝胶回收试剂盒，具体方法如下：

1）将单一目的DNA条带切下，放入两个2 ml离心管中，并称量胶的重量；

2）向放有胶块的离心管中加入一倍体积的Buffer PG；

3）50℃水浴，每隔2-3 min温和地上下颠倒离心管，直至胶块充分溶解，溶液为黄色；

4）向已装入收集管中的吸附柱中加入200 μl Buffer PS，13000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

5）将步骤3）得到的溶液加入吸附柱中，室温放置2 min，13000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

6）向吸附柱中加入450μl Buffer PW（事先加入无水乙醇），13000 rpm离心1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

7）重复步骤6）；

8）13000 rpm离心1 min ，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

9）将吸附柱放到一个新的1.5 ml离心管中，悬空滴加50 μl Buffer EB，室温放置2min，13000 rpm离心1min，-20℃保存。

10）取1 μl以纯化的DNA片段在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统观察，拍照。

所述的连接T载体转化，均采用pUCm-T载体进行连接，具体方法如下：取0.2 pmol的纯化稀释后的DNA片段与50 ng的pUCm-T载体连接，反应体系如下：

纯化稀释后的DNA片段 5 μl（根据长度和浓度调整体积）

pUCm-T Vector 1 μl

10 x Ligation Buffer 1 μl

50 % PEG 4000 1 μl

T4 DNA Ligase 1 μl

ddH2O 1 μl

总体积 10 μl

16 ℃过夜连接。

上述实验中连接后的产物，均转入大肠杆菌DH5α感受态中进行测序，具体操作步骤如下：

1）将感受态细胞中置于冰水浴中化冻，取5 μl连接产物加入到50 μl的感受态细胞中，轻轻混匀；

2）冰水浴30 min，不要晃动；

3）42 ℃热击60 s，不要晃动；

4）冰水浴2 min，不要晃动；

5）加入500 μl无菌的LB液体培养基；

6）37 ℃，180 rpm震荡复苏60 min；

7）4000 rpm离心1 min，取100 μl菌液涂布在具有Amp抗性（100 mg/l）的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养。

用无菌的白色枪头挑取多个单菌落，加入到添加100 mg/l 的氨苄青霉素（Amp）（生工）的5 ml LB液体培养基中，37 ℃，180 rpm培养12-16 h。取扩大培养的菌液用M13引物（M13-F： 5’-GTTGTAAAACGACGGCCAG-3’; M13-R: 5’-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG-3’）通过PCR的方法验证DNA片段是否成功连接到T载体上。PCR反应体系如下：

单菌落菌液 1μl

M13-F 0.5μl

M13-R 0.5μl

Taq 0.25μl

Taq Buffer 2.5μl

dNTP 0.5μl

超纯水 19.75μl

总体积 25 μl

PCR反应程序为：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s，72 ℃ 5min，35个循环；72 ℃ 10min；4 ℃保存。取3 μl PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，观察基因扩增情况，凝胶成像系统观察，拍照。选择条带单一清晰的PCR产物对应的菌种送至北京华大基因测序。

实施例2 重组载体的构建

原始载体为pRI101AN（张志宏教授课题组保存），通过PCR在GFP基因CDS两端添加5' NdeI 和 3' EcoRI酶切位点及保护碱基，然后通过双酶切和连接的方式，将GFP基因连接至pRI101AN载体，构建载体命名为pRI-GFP（图1A）；

通过PCR的方法在黑果枸杞thornlessSUS基因CDS两端添加5' NdeI 和 3' EcoRI酶切位点及保护碱基，通过NdeI 和 3' EcoRI双酶切及连接将thornlessSUS的CDS连接至pRI101AN载体，得到的重组载体命名为pRI-SUS（图1B）；

在GFP基因两端添加 5' EcoRI 和 3' EcoRI ，通过酶切位点 5' EcoRI 和 3'EcoRI，使用重组的方法将GFP基因克隆至重组载体pRI-SUS中，得到的重组载体命名为pRI-SUSGFP（图1C）。

2、重组载体质粒转入感受态细胞

以上构建完的载体均要转化大肠杆菌并进行验证和测序（华大）以验证序列及方向的正确性；重组载体质粒转入大肠杆菌感受态DH5α中，具体操作步骤如下：

1）将感受态细胞中置于冰水浴中化冻，取三种表达载体的质粒各3 μl加入到50 μl的感受态细胞中，轻轻混匀；

2）冰水浴30 min，不要晃动；

3）42 ℃热击60 s，不要晃动；

4）冰水浴2 min，不要晃动；

5）加入500 μl无菌的LB液体培养基；

6）37 ℃，180 rpm震荡复苏60 min；

7）4000 rpm离心1 min，取100 μl菌液涂布在具有Kana抗性（50 mg/l）的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养。

用无菌的白色枪头挑取多个单菌落，加入到具有Kana抗性（50 mg/l）的5 ml LB液体培养基中，37 ℃，180 rpm培养12-16 h。取扩大培养的菌液，通过PCR的方法检验重组质粒是否转入大肠杆菌感受态DH5α中。

验证pRI-GFP载体的PCR反应体系如下：

单菌落菌液 1 μl

GFP-F5’- TGCTTCAGCCGCTACCCC -3’ 0.5μl

GFP-R 5’- ATCGCGCTTCTCGTTGGG -3’ 0.5μl

Taq 0.25 μl

Taq Buffer 2.5 μl

dNTP 0.5 μl

超纯水 19.75μl

总体积 25μl

PCR反应程序为：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s，72 ℃ 1min，35个循环；72 ℃ 10 min。取3 μl PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，观察基因扩增情况，凝胶成像系统观察，拍照。选择条带单一清晰且长度正确的PCR产物对应的菌液送至北京华大基因测序；GFP基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

验证pRI-SUS载体转化效果的的PCR反应体系如下：

单菌落菌液 1μl

SUS-F 5’-GGAAAGAATGGCAGCCAGTAG -3’ 0.5μl

SUS-R 5’- CCAGTGTCGGGATAACCAAG -3’ 0.5μl

Taq 0.25μl

Taq Buffer 2.5μl

dNTP 0.5 μl

超纯水 19.75μl

总体积 25μl

PCR反应程序为：95℃ 15 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1min，35个循环；72℃10 min；4℃保存。取3 μl PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，观察基因扩增情况，凝胶成像系统观察，拍照。选择条带单一清晰且长度正确的PCR产物对应的菌液送至北京华大基因测序；获得序列与上述thornlessSUS全长CDS序列相同。

验证pRI-SUSGFP载体转化效果的PCR反应体系如下：

单菌落菌液 1 μl

SGFP-F5’- ACCCCTCATGGTTATTTCGCT -3’ 0.5μl

SGFP-R5’- TCACCTTGATGCCGTTCTTCT -3’ 0.5 μl

Taq 0.25μl

Taq Buffer 2.5μl

dNTP 0.5μl

超纯水 19.75μl

总体积 25μl

PCR反应程序为：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，35个循环；72 ℃ 10min。取3 μl PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，观察基因扩增情况，凝胶成像系统观察，拍照。选择条带单一清晰且长度位置正确PCR产物对应的菌液送至北京华大基因测序；载体中SUSGFP融合基因序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

重组载体（质粒）提取方法：将上述序列验证正确的DH5α菌种划线于Kana抗性（50mg/l）的LB固体培养基，置于37 ℃条件下培养至长出单菌落，挑取单菌落接种于液体LB培养基（50 mg/l Kana），于37 ℃，180 rpm活化，使用中科泰瑞生物科技有限公司的质粒提取试剂盒提取菌液质粒，具体操作步骤如下：

1）取4 ml过夜培养的菌液于离心管中，10000 rpm离心1 min，用移液枪尽量吸出上清液，通过两次离心将菌体收集到一个离心管中；

2）向菌体沉淀中加入250 μl溶液PI（事先加入RNaseA），5 μl Lysis Dye，此时溶液为红色，用涡旋振荡器彻底悬浮菌体；

3）向离心管中加入250 μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次，使菌体裂解；

4）向离心管中加入350 μl溶液P3，温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现黄色絮状沉淀，10000 rpm离心10 min；

5）用移液枪将上清液转移到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），10000 rpm离心45s，弃废液；

6）向吸附柱中加入700 μl PW（事先加入无水乙醇），10000 rpm离心45 s，弃废液；

7）向吸附柱中加入500 μl PW（事先加入无水乙醇），10000 rpm离心45 s，弃废液；

8）10000 rpm离心2 min；

9）将吸附柱放入干净的1.5 ml离心管中，加入60 μl溶液EB，室温放置2 min，10000 rpm离心2 min；

将提取的质粒通过电泳等方法验证后置于-20 ℃保存，以备转化农杆菌感受态。

实施例3 受体材料的制备

从多株有刺成年黑果枸杞采集成熟种子，置于湿润无菌纱布中37 ℃催芽24 h后于超净工作台中进行表面杀菌（75%酒精处理30-60 S，0.1%升汞处理1-2 min，无菌清水冲洗3-5次），吸干表面水分后横向接种到1/2MS培养基（MS干粉2.37 g/l+20 g/l蔗糖+ 4.5-5.0g/l琼脂粉，pH值5.8-6.0）。完全黑暗23-27 ℃条件下待种子萌发后置于12 h光照/12 h黑暗的光周期条件下培养。光由LED灯管提供，强度为48 μmol/m²/s。待无菌种苗高度超过8cm且低于11cm时，将植株切为两部分：3-5 cm高的带顶茎和去顶带根下半部分。将两部分接入新鲜配置的不含有任何外源植物激素的1/2MS培养基，待上半部分生根，下半部分侧枝或根孽萌发，且株高达8-11 cm时，再次切下3-5 cm高的带顶茎，并将带顶上部和带根下部再次转接到新鲜配置的不含激素1/2MS培养基，株高再次达8-11 cm，继续按照上述方法切割转接。这样经过4代以上的转接，将生根、生长及繁殖相对快速的株系保留并分别做好标记。将上述繁殖筛选出的无性系幼嫩叶片的尖端部分剪下3-5 mm作为外植体，近轴面朝下接种到MS培养基（MS干粉4.74 g/l+蔗糖40 g/l+琼脂4.8-5.0 g/l， pH=5.8）。将此条件下能通过直接器官发生路径形成完整植株的无性系株系保留，并将直接器官发生获得植株的完全展开的幼嫩叶片尖端部分3-5 mm再次剪下作为外植体，近轴面朝下接种到MS培养基，待叶尖外植体通过直接器官发生形成植株之后，再次切叶尖外植体、接种、繁殖……如此进行10代以上的叶尖直接器官发生，将通过直接器官发生形成的幼嫩植株作为遗传转化的受体提供者。除种子萌发前置于黑暗条件下，其他培养的光周期等光照条件均同种子萌发后条件相同，温度均为25±2 ℃。所用MS干粉及琼脂粉均购自济南市中天组培园艺用品有限公司，蔗糖购自生工。调节pH值采用1M的NaOH（生工），培养基121℃高压灭菌20 min后置于培养室观察7 d，确定无菌且正常之后方可用于接种。

实施例4 选择培养基中卡那霉素筛选浓度的确定

选取状态良好且发育基本一致的黑果枸杞无性系苗，在超净台中用无菌的剪子剪取幼嫩叶片尖端的一半作为外植体。将外植体背面朝上接种到含有不同浓度卡那霉素（Kana，生工）的MS培养基中（MS干粉 4.74 g/l+蔗糖40 g/l+琼脂4.8 g/l，pH=5.6-6.0），培养基的Kana浓度分别设置为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，50，100 mg/l，每个处理接种至少90个外植体。组培室温度为25±2 ℃，调节pH值采用1M的NaOH（生工），培养基121℃高压灭菌20 min后，尚未凝固之前添加过滤除菌（0.22 μm）的Kana母液。培养室光源为LED灯管，光周期为12 h光照/12 h黑暗。结果显示, 7 d后培养基中不添加Kana的对照组及Kanna浓度为1 mg/l，2 mg/l的黑果枸杞叶尖外植体开始生根，14 d后生根率达到最大，最高可达到100 %。10 d后Kanna浓度为3 mg/l的黑果枸杞叶片外植体开始生根，生根率为18.89 %，其余浓度仍无变化。28 d后不添加Kana的对照组及Kanna浓度为1 mg/l，2 mg/l的黑果枸杞叶片外植体开始生芽，生芽率分别为52.22 %，35.56 %，32.22 %。Kanna浓度为3mg/l的黑果枸杞叶片外植体生根后，在根长到1 cm左右时停止生长，且后续无任何芽体产生。接种一段时间后，除已经生芽的对照及Kanna浓度为1 -2 mg/l的黑果枸杞叶片外植体以外，其余处理的黑果枸杞叶片外植体逐渐死亡。Kanna浓度为3 mg/l的黑果枸杞叶片外植体虽然有短根产生，但是根伸长生长受到抑制，且不能产生任何芽体形成植株，最后叶片外植体也逐渐变黄死亡（图2）。因此，本试验选用添加Kanna浓度为3 mg/l的MS培养基作为初始选择培养基。该浓度可以达到筛选目的，且能降低对植物材料的伤害，以达到使转化成功的叶脉切口细胞尽可能生根出芽的目的。

实施例5 头孢噻肟钠使用浓度的确定

采用沈阳农业大学张志宏教授课题组保存的根瘤农杆菌菌株EHA105和LBA4404。将存放在-80℃冰箱的农杆菌置于冰上静置融化，在超净工作台中用无菌的接种丝蘸取少量菌液，划线培养在含有50 mg/l 利福平（Rif）的YEP固体培养基上，27-28 ℃倒置培养2-3d；在超净工作台中用无菌的白色枪头挑取农杆菌单菌落，加入到含有50 mg/l Rif的YEP液体培养基中，27-28 ℃，180-200 rpm震荡培养10 h至OD600约为0.5左右，吸取约100 μl菌液均匀涂抹在含有50 mg/l Rif的YEP固体培养基。将圆形的小滤纸片分别用100、150、200、250、300、350、400、450和500 mg/l的头孢噻肟钠（Cef）溶液浸湿，并置于上述涂抹均匀的固体培养基，27-28 ℃条件下静置过夜培养。过夜观察发现浸有≥300 mg/l Cef溶液的滤纸能够完全抑制农杆菌EHA105和LBA4404生长。故300 mg/l选作筛选培养基中Cef的使用浓度，以抑制农杆菌的再次爆发。500 mg/l选做洗涤液中的Cef的浓度。在单独使用Cef抑制农杆菌的实验中，如发现有农杆菌长出，可联合使用300 mg/l羧苄青霉素和300-700 mg/l的Cef以达到更强的抑制效果。

实施例6 农杆菌感受态的制备

将存放在-80 ℃冰箱的农杆菌EHA105，LBA4404（沈阳农业大学张志宏教授课题组保存）冰上静置融化，在超净工作台中用无菌的接种丝蘸取少量菌液，划线培养在含有50mg/l Rif的YEP固体培养基上，27-28 ℃倒置培养2-3 d；在超净工作台中用无菌的白色枪头挑取农杆菌EHA105，LBA4404单菌落，加入到含有50 mg/l Rif的YEP液体培养基中，28℃，180 rpm震荡培养10 h至OD₆₀₀约为0.5左右，在超净工作台中取5 ml已经活化好的菌液加入到无菌的50 ml离心管中，冰上静置10 min；4 ℃，5000 rpm离心10 min，用移液枪吸去上清液；在超净工作台中向离心管中加入5 ml提前在冰上预冷的25 mM的CaCl₂溶液（过滤器过滤除菌）将菌体重悬，冰上静置20 min，4 ℃，5000 rpm离心10 min，弃上清液；在超净工作台中向离心管中加入1 ml提前预冷的25 mM的CaCl₂溶液，再次重悬菌体，冰上静置20min，农杆菌感受态细胞经液氮速冻后-80 ℃保存备用。

实施例7 重组载体转化农杆菌

在超净台中用移液枪吸取5 μl重组载体（pRI-GFP，pRI-SUS或pRI-SUSGFP）加入到50 μl农杆菌EHA105，LBA4404感受态中，轻轻混匀；冰上静置5 min，放入液氮中速冻1 min；37 ℃水浴5 min，冰浴2 min；在超净工作台中向离心管中加入800 μl YEP液体培养基，28℃，180 rpm震荡培养4 h，5000 rpm室温下离心5 min，用移液枪吸取多余的液体培养基，约留100 μl的液体，重悬菌体，将菌液用无菌的涂菌棒涂布在含有50 mg/l Rif和50 mg/lKana的YEP固体培养基上，27-28 ℃倒置培养2-3 d；在超净工作台中用无菌的接种丝挑取农杆菌单菌落，均匀涂抹在含有50 mg/l Rif和50 mg/l Kana的YEP固体培养基上，28 ℃倒置培养1-2 d；在超净工作台中用白色枪头挑取二转的农杆菌菌苔，通过PCR的方法检验重组质粒是否转入农杆菌感受态，PCR反应体系（菌苔代替菌液，超纯水补充体积到25 μl）和程序与1.2中检验重组质粒是否转入大肠杆菌感受态DH5α中相同；根据电泳结果，选取与目的片段条带长度一致的二转菌落，在28 ℃，180 rpm的摇床上，用含有50 mg/l Rif和50mg/l Kana的5 ml YEP液体培养基中震荡培养，用灭过菌的甘油与菌液1：1保存，用于测序和侵染等后续实验。将测序验证正确的菌种用于后续遗传转化，将含有各种载体的工程菌分别简称为EHA105_pRI-GFP、EHA105_pRI-SUS、EHA105_pRI-SUSGFP、LBA4404_pRI-GFP、LBA4404_pRI-SUS和LBA4404_pRI-SUSGFP。

实施例8 农杆菌介导的遗传转化

一、菌液的制备和侵染

在超净工作台中，用无菌的接种丝蘸取少量EHA105_pRI-GFP、EHA105_pRI-SUS、EHA105_pRI-SUSGFP、LBA4404_pRI-GFP、LBA4404_pRI-SUS或LBA4404_pRI-SUSGFP菌种，划线培养在含有50mg/l Rif和50mg/l Kana的YEP固体培养基上，于27-28 ℃条件下倒置培养2-3 d；在超净台中，用白色枪头挑取农杆菌单菌落，用含有50mg/l Rif和50mg/l Kana的5ml YEP液体培养基中震荡培养18h；在超净台中，用移液枪吸取1ml活化好的菌液加入到50 ml含有50 mg/l Rif和50 mg/l Kana的5 ml YEP液体培养基中继续震荡培养至EHA105_pRI-GFP、EHA105_pRI-SUS和EHA105_pRI-SUSGFP菌液的OD₆₀₀值为0.39-0.61，而LBA4404_pRI-GFP、LBA4404_pRI-SUS或LBA4404_pRI-SUSGFP菌液的OD₆₀₀值为0.39-0.80时，4℃，5000 rpm离心5 min，弃上清液，在超净台中用灭过菌的MS液体培养基（MS干粉 4.74 g/l+蔗糖40 g/l，pH=5.8）1：1重悬菌体，冰上放置1h备用。用MS液体培养基重悬菌体前加入过滤除菌的乙酰丁香酮（AS）致使其终浓度为100 μM，以增加转化效率。

将重悬的菌液倒入灭过菌的培养皿中，将没有经过预培养，预培养1d，预培养2d的黑果枸杞叶尖外植体置于滤纸吸干水分后，分别加入到含有菌液的培养皿中侵染。以上6种菌的侵染时间均设置为5~15min。侵染过程中每隔一段时间轻轻晃动培养皿，促进农杆菌侵染黑果枸杞叶片外植体。侵染结束后，将黑果枸杞叶尖外植体用镊子转移到无菌的滤纸上，吸干多余菌液。以上操作均在超净台中进行。预培养在25±2 ℃的组培室内黑暗条件下进行，同样采用叶尖外植体，背面朝上接种，预培养培养基为MS培养基（MS干粉 4.74 g/l+蔗糖40 g/l+琼脂4.8 g/l），pH值采用NaOH调整到5.8，121℃高压灭菌20min。

二、共培养

将吸干菌液的黑果枸杞叶尖外植体用无菌的镊子采用背面朝上方式接种到共培养培养基中（MS干粉 4.74 g/l+蔗糖40 g/l+琼脂4.8 g/l+100 μM AS，pH=5.8），每个培养皿放置22-23个外植体。继续于上述组培室内暗培养2-3 d，直至叶片外植体周围长出白色农杆菌。

三、选择培养和抗性植株的产生

结束共培养后，用含有500 mg/l 的Cef（0.22 μm无菌滤膜过滤除菌）的无菌水清洗黑果枸杞叶片外植体5-6次，直至外植体周围无农杆菌。将清洗干净的叶尖外植体用镊子转移至无菌的滤纸上，吸干多余的液体后背面朝上接种到选择培养基（MS干粉 4.74 g/l+蔗糖40 g/l+琼脂4.8 g/l+3 mg/l Kana+300 mg/l Cef，pH=5.8）中。培养室光照等条件与“卡那霉素筛选浓度的确定”部分相同。每7 d将更换一次选择培养基。选择培养过程中，培养基中加Kana进行筛选，尽量避免出现逃逸植株。实验设置严格的对照组。经过转化的黑果枸杞叶尖外植体，筛选培养10 d后开始生根，17d后生根率达到最高，而未经过转化的黑果枸杞叶尖外植体在具有Kana（3 mg/l）抗性的选择培养基上逐渐黄化死亡；筛选培养28 d后生根叶尖外植体的根基部开始生芽形成完整抗性小植株（图3）。数据统计显示：（1）EHA105_pRI-GFP遗传转化率高达8.33%；（2）LBA4404_pRI-GFP遗传转化率高达8.33%；（3）LBA4404_pRI-SUS遗传转化率高达16.65%；（4）EHA105_pRI-SUSGFP遗传转化率高达8.33%；（5）LBA4404_pRI-SUSGFP遗传转化率高达8.33%;(6) EHA105_pRI-SUS遗传转化率高达8.33%。上述转化率=筛选培养基上叶尖外植体出芽率/非转基因条件下叶尖外植体的平均出芽率（对照）*100%。本方法未经愈伤阶段获得抗性植株，减少侵染农杆菌再次爆发的危险，周期短，且抗性植株生长健壮。

四、二次筛选抗性植株

为了更加有效避免逃植株的产生，我们进行了二次筛选实验；具体方法是，待上述抗性芽长至高度5 cm左右时，在超净台中，剪取2 cm左右带顶芽茎，接种到抗性生根培养基（MS干粉 2.37 g/l+蔗糖20 g/l+琼脂4.8 g/l+5 mg/l Kana+300 mg/l Cef，pH=5.8）中；经过30 d的培养后，抗性芽生根并能正常生长（图3），不能生根的视为逃逸芽被淘汰。实验设置严格对照组；结果显示几乎所有上步（选择培养）筛选出的抗性材料均能产生根二次形成完整抗性植株。

实施例9 转基因植株的验证

从DNA（PCR）、RNA（RT-PCR）和蛋白（激光共聚焦显微观察GFP）水平对以上筛选出的抗性植株进行鉴定。

一、DNA水平检测

用CTAB法提取抗性植株及未经过转化对照材料的DNA。具体操作步骤如下：

1）分别取100 mg抗性及对照植株叶片于500 μl裂解液中研磨，收集于2 ml离心管中；

2）65 ℃水浴30 min，中间颠倒混匀数次；

3）向离心管中加入等体积的500 μl DNA抽提剂，颠倒混匀；

4）12000 rpm离心10 min；

5）用移液枪吸取上清液于另一个干净的2ml离心管中，加入0.7倍体积350 μl的异丙醇，颠倒混匀，冰浴5 min；

6）12000 rpm离心2 min，弃上清液，管口向下倒置1 min，去除异丙醇；

7）加入500 μl的70 %的无水乙醇漂洗沉淀，12000 rpm离心1 min，弃上清液；

8）重复步骤7）；

9）用移液枪尽量吸出残留的无水乙醇，室温放置数分钟，去除残留的无水乙醇；

10）加入50 μl的TE溶解DNA沉淀，-20 ℃保存。

取3 μl DNA在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，观察DNA提取情况，凝胶成像系统观察，拍照。

以提取的DNA为模板，通过PCR扩增验证转化植株是否为阳性植株。转化pRI-SUSGFP重组载体的植株PCR验证所用引物，PCR反应体系及PCR反应程序与验证重组载体是否转入感受态细胞相同。转化pRI-SUS重组载体的植株PCR验证所用引物为根据Npt II基因部分序列所设计的引物，PCR反应体系如下：

DNA 1 μl

Primer-F （Npt II-F） 0.5μl

Primer-R （Npt II-R） 0.5 μl

Taq 0.25 μl

Taq Buffer 2.5 μl

dNTP 0.5 μl

超纯水 19.75 μl

总体积 25 μl

PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10min；4 ℃保存。取3 μl PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，观察基因扩增情况，凝胶成像系统观察，拍照。

结果发现pRI-SUS转化的抗性植株在4500 bp处扩增出条带，并且条带长度与阳性对照（pRI-SUS载体质粒）一致，未经过转化的对照植株在相同位置上无条带（图4），初步证明获得过表达SUS基因的黑果枸杞转基因植株；被pRI-SUSGFP转化的抗性株植株，扩增出的条带长度与阳性对照（pRI-SUSGFP载体质粒）一致，初步证明获得转融合基因植株（图5中的3、4泳道）。

二、RNA水平检测

利用RNA提取试剂盒Ultrapure RNA Kit，提取抗性及对照植株根、茎、叶的总RNA。使用M-mlV Reverse Transcriptase（M1701）合成cDNA。具体操作步骤与上面相同。

用微量核酸蛋白测定仪检测cDNA浓度，以稀释到相同浓度的cDNA为模板，用内参基因检测cDNA是否可用。PCR反应体系如下：

cDNA 1 μl

Primer-F （Actin-F） 0.5 μl

Primer-R （Actin-R） 0.5 μl

Taq 0.25 μl

Taq Buffer 2.5 μl

dNTP 0.5 μl

超纯水 19.75 μl

总体积 25 μl

PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。取3 μl PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，观察基因扩增情况，凝胶成像系统观察，拍照。

选用经过验证可用的稀释到相同浓度的cDNA为模板，用半定量PCR的方法验证转化植株目的基因表达情况。PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：95℃ 5min；95℃ 30s；58 ℃ 30 s，72℃ 1min，30个循环；72℃10min；4℃保存；取3 μl PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，对比观察目标条带的亮度，凝胶成像系统观察，拍照；结果显示，转基因抗性植株的根、茎、叶中thornlessSUS基因表达水平明显高于未经转化的对照（图6）；说明经过转化，目标基因thornlessSUS在黑果枸杞根茎叶中均呈现过量表达（转录）。

三、GFP荧光检测

在超净台中，用无菌的剪子剪取经载体pRI-GFP和pRI-SUSGFP转化的抗性植株叶片及没经过转化的对照植株叶片，用解剖刀横向剖开叶片，用激光共聚焦显微镜，在550 nm的波长下观察是否有GFP表达。注意控制对照和抗性材料的观察条件完全一致。结果显示被GFP和融合基因SUSGFP转化的抗性植株中均有GFP蛋白表达（图7）。

四、转基因植株的性状改变

本发明发现，CaMV 35S启动子控制下GFP基因在黑果枸杞中异源组成型高表达，可以对植株产生毒副作，瓶内植株出现生长缓慢等不利性状，但是当GFP与thornlessSUS融合为SUS-GFP，并稳定转化黑果枸杞时，成功转基因植株可以正常生长，证明融合了thornlessSUS的GFP，即便仍然呈组成型高表达，对黑果枸杞的毒副作用也显著降低。组成型高表达thornlessSUS的黑果枸杞植株表现出茎干粗、分根孽能力强、须根数量大增等特点（图3D）。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 一种黑果枸杞稳定遗传转化体系及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2412

<212> DNA

<213> 黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)

<400> 1

atggcagcca gtagtcttag cattaaggac cgtttggagg aatccatttt ggctcgtcca 60

gatgaaattt cggcactcaa gtcaagggtt gaaactgaag ggaaaggggt catgaaacca 120

cttgatctct tgaaccattt gatttctgtg aatactaaga agaatggagt aaatgttggt 180

gccagtgcac tcgtggaagt tctcagttgc agccaagaag ctgtgattgt accaccacaa 240

cttgcactag ctgtacgtcc aaggcccggt gtgtgggagt atgtgtcact gaatcttaag 300

acaaagaaag tggctgaatt gagcatcccc aaataccttc aattgaaaga gaacgctgtc 360

gatgaaagtg gaaacgtctt ggaaatggat tttgagccat ttactactgt aactcctcca 420

aagacacttt ctgactccat tggtaatggt ttggagtttc ttaatcgcca tattgcttca 480

acaatgttcc atgacaagga gattgccaag tgcctccttg actttctcag acagcataac 540

tacaaaggaa agtcattgat ggtgaaagaa agcatccaaa gcctggaaag tttccaatat 600

gtcctgaaaa aagcagagga atatctgcac tctctgaatc cagaaactcc atactctaac 660

tttgaatcga aatttgaaga gattggcttg gaaagagggt ggggaaacac tgctcaacgc 720

gtgcaagaaa caatctgtca tttgttgcac ctccttgagg ctcctaatgc atcttccttg 780

gaaaaattcc ttggaagaat cccattggtt ttcaatgttg tcattctcac ccctcatggt 840

tatttcgctc aagaaaacgt ccttggttat cccgacactg gtggccaggt tgtgtacatt 900

cttgatcaag ttccagccat ggagcgtgag atgcttctcc gtttgaagct tcaaggactt 960

gatgatatcc tcccccggat ccttgttgta acaaggctgc tgcctgatgc agttggaacc 1020

acttgtggtg agcgcatgga gaaagtatat ggggcagagc attctcatat tattcgtgtt 1080

ccatttagaa ctgagaaagg aatgttgcgc aaatggatct caagattcga agtctggcca 1140

tacatggaaa ctttcactga ggatgtcgcg gaagaacttg tcaaagagct gcaagctaaa 1200

ccagacttga tcattggaaa ctacagtgag ggaaaccttg ctgcctcctt gttggctaag 1260

aaatttgggg ctactcaatg cacaatagct catgccttgg agaaaaccaa gtatccaaac 1320

tctgaccttt actggaagaa atttgatgac aagtatcatt tctcaagtca gttcagtgct 1380

gatctttttg cgatgaatca cactgatttc atcatcacca gcactttcca agaaatcgct 1440

ggaagcaaga atactgtagg gcagtatgag agccacactg cttttaccat gcctggattg 1500

taccgagtag tccatggaat tgattcattt gatccaaaat tcaacattgt ctcccctggg 1560

gctgatatgt cgatctactt cccttacaca gaaaaggaaa aaaggctaaa caatttccac 1620

ccggaaattg aagaactact ctacagtcct gttgagaaca aagagcacct atgtgtgttg 1680

aaggaccgga acaagccaat tctcttcacc atggcaaggc tagatcgcgt gaagaatcta 1740

acagggctcg ttgaatggta tgccaagaat gcaaggctga gagagcttgt taaccttgtg 1800

gttgttggtg gagacagaag gaaagaatcc aaggatttgg aagagcaagc agagatgaaa 1860

aaaatgtatg accttattga aacctacaac ctgaatggac aattcaggtg gatttcttct 1920

cagatgaatc gtataaggaa cggagagctt taccgatata ttgcagacac gaggggtgct 1980

ttcgttcagc cagctttcta cgaggctttc ggtttgacag ttgttgaatc catgacttgt 2040

ggtttgccaa cttttgctac ttgtaatggt ggaccatttg agattatagt gcatggaaaa 2100

tctggattcc acattgaccc taatcagggt gacaggaatg ctgatctttt ggtcaatttc 2160

tttgagaaat ccaaagaaga tccaagttat tgggataaca tttccaaggg aggcctacaa 2220

cgcatcattg agaagtatac atggcaaatt tattcacaga aagtgatgac attatctggg 2280

atttatggat tctggaagta tgcaaccaca aatgacaaag ttgctagtgc aaagaagcgc 2340

tatctcgaaa tgttttatga acttatgttt aagaaagctg ctgagaaagt tccactggct 2400

attgatgaat ag 2412

<210> 2

<211> 723

<212> DNA

<213> 发光型水螅水母(luminous hydromedusan Aequorea)

<400> 2

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ggcgacgtga acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

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ctcgtgacca ccttcaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

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aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

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tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

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taa 723

<210> 3

<211> 3132

<212> DNA

<213> 黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)

<400> 3

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gccagtgcac tcgtggaagt tctcagttgc agccaagaag ctgtgattgt accaccacaa 240

cttgcactag ctgtacgtcc aaggcccggt gtgtgggagt atgtgtcact gaatcttaag 300

acaaagaaag tggctgaatt gagcatcccc aaataccttc aattgaaaga gaacgctgtc 360

gatgaaagtg gaaacgtctt ggaaatggat tttgagccat ttactactgt aactcctcca 420

aagacacttt ctgactccat tggtaatggt ttggagtttc ttaatcgcca tattgcttca 480

acaatgttcc atgacaagga gattgccaag tgcctccttg actttctcag acagcataac 540

tacaaaggaa agtcattgat ggtgaaagaa agcatccaaa gcctggaaag tttccaatat 600

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