利用CRISPR/Cas9修饰GmFAD2-1A基因获得高油酸含量大豆的方法
阅读说明：本技术 利用CRISPR/Cas9修饰GmFAD2-1A基因获得高油酸含量大豆的方法 (Method for obtaining soybean with high oleic acid content by modifying GmFAD2-1A gene through CRISPR/Cas9 ) 是由 陈莉 侯文胜 付明雪 蔡宇鹏 孙�石 吴存祥 韩天富 于 2020-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了利用CRISPR/Cas9修饰GmFAD2-1A基因获得高油酸的大豆的方法。本发明提供的方法,包括如下步骤：1)用CRISPR/Cas9系统对出发植物中的GmFAD2-1A基因进行基因编辑,且使所述GmFAD2-1A基因发生突变导致翻译蛋白提前终止,得到转基因植物；2)所述转基因植物自交,得到纯合植物,即为目的植物；本发明的实验证明,利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对大豆脂肪酸去饱和酶编码基因GmFAD2-1A进行特定靶点的定点敲除,抑制油酸向亚油酸的转化,为高油酸大豆品种选育提供新材料,为加快高油酸大豆品种的选育具有积极的促进作用。(The invention discloses a method for obtaining high-oleic-acid soybean by modifying GmFAD2-1A gene with CRISPR/Cas 9. The method provided by the invention comprises the following steps: 1) carrying out gene editing on a GmFAD2-1A gene in a starting plant by using a CRISPR/Cas9 system, and enabling the GmFAD2-1A gene to be mutated to cause the termination of a translation protein in advance to obtain a transgenic plant; 2) selfing the transgenic plant to obtain a homozygous plant, namely a target plant; experiments prove that the specific target spot knockout is carried out on the soybean fatty acid desaturase coding gene GmFAD2-1A by using the CRISPR/Cas9 mediated gene editing technology, the conversion from oleic acid to linoleic acid is inhibited, a new material is provided for the breeding of high-oleic acid soybean varieties, and the positive promotion effect is achieved for accelerating the breeding of the high-oleic acid soybean varieties.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用CRISPR/Cas9修饰GmFAD2-1A基因获得高油酸的大豆的方法。
背景技术
大豆油具有巨大的经济价值，广泛应用于食品，饲料和工业中。大豆油中多价不饱和脂肪酸的含量占比最大，而油酸的含量只有约20％，仅占不饱和脂肪酸含量的四分之一。油酸是单不饱和脂肪酸，抗氧化能力较强且稳定性良好，对健康有益处。高油酸的大豆品种具有氧化稳定性较高、保存期长等特点。所以降低多价不饱和脂肪酸含量、提高油酸的含量，培育高油酸大豆品种是大豆品质育种的一个重要目标。种质资源和诱变材料中与油酸含量相关的遗传变异有限，很难通过常规育种的方法获得高油酸含量的大豆材料，给高油酸品种的培育带来很大困难，研究进展缓慢。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备油酸含量高的目的植物的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)用CRISPR/Cas9系统对出发植物中的GmFAD2-1A基因进行基因编辑，且使所述GmFAD2-1A基因发生突变导致翻译蛋白提前终止，得到转基因植物；
2)所述转基因植物自交，得到纯合植物，即为目的植物；
所述目的植物的油酸含量高于所述出发植物；
所述GmFAD2-1A基因是如下(a1)或(a2)或(a3)的DNA分子：
(a1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
(a3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(a4)来源于大豆且与(b1)或(b2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；
所述CRISPR/Cas9系统基因编辑的靶点为序列1第649-672位或对应序列1的第649-672位(对应，是指与序列1同源性高的序列对应序列1第649-672位的位置)。
上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
1)sgRNA，
所述sgRNA的靶序列为序列1第649-672位或对应序列1的第649-672位；
2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。
上述方法中，所述基因编辑为将所述CRISPR/Cas9载体导入所述出发植物中，在本发明的实施例中，CRISPR/Cas9载体为重组载体Cas9-sgRNA，该载体表达sgRNA,sgRNA的靶序列结合区的编码序列为序列1第649-672位，具体构建方法见实施例。
上述方法中，所述目的植物籽粒的油酸含量高于所述出发植物籽粒的油酸含量。
上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，在本发明的实施例中，具体为大豆。
在本发明的实施例中，所述使GmFAD2-1A基因发生突变导致翻译蛋白提前终止的突变形式如下任一种：
1)将序列1第667和668位中间增加一个碱基T，且保持其他核苷酸残基不变，
或，对应于序列1第667和668位中间增加一个碱基T，且保持其他核苷酸残基不变；
2)将序列1第665-666位缺失，且保持其他核苷酸残基不变，
或，对应于序列1第665-666位缺失，且保持其他核苷酸残基不变；
3)将序列1第667位缺失，且保持其他核苷酸残基不变，
或，对应于序列1第667位缺失，且保持其他核苷酸残基不变。
本发明还有一个目的是提供一种制备对GmFAD2-1A基因进行基因编辑的植物的方法。
本发明提供的方法，包括第一个目的方法中的步骤1)。
本发明还有一个目的是提供一种用于提高植物油酸含量的物质。
本发明提供的物质，为用于基因编辑GmFAD2-1A基因的CRISPR/Cas9系统；
所述CRISPR/Cas9系统基因编辑的靶点为序列1第649-672位或对应序列1的第649-672位。
上述物质中，所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
1)sgRNA和cas9蛋白，
所述sgRNA的靶序列为序列1第649-672位或对应序列1的第649-672位；
2)表达所述sgRNA和cas9蛋白的CRISPR/Cas9载体。
上述物质在制备油酸含量高的目的植物或培育油酸含量高的目的植物中的应用也是本发明保护的范围。
本发明还提供了一种GmFAD2-1A突变基因，为以序列1第649-672位或对应序列1的第649-672位作为靶点进行CRISPR/Cas9系统基因编辑后得到的基因；在本发明的实施例中具体举例为如下任一种:
1)将序列1第667和668位中间增加一个碱基T，且保持其他核苷酸残基不变，
或，对应于序列1第667和668位中间增加一个碱基T，且保持其他核苷酸残基不变；
2)将序列1第665-666位缺失，且保持其他核苷酸残基不变，
或，对应于序列1第665-666位缺失，且保持其他核苷酸残基不变；
3)将序列1第667位缺失，且保持其他核苷酸残基不变，
或，对应于序列1第667位缺失，且保持其他核苷酸残基不变。
本发明还提供了一种培育油酸含量高的植物的方法，为培育第一个目的的方法得到的目的植物。
本发明的实验证明，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对大豆脂肪酸去饱和酶编码基因GmFAD2-1A进行特定靶点的定点敲除，抑制油酸向亚油酸的转化，获得油酸含量达40％左右的高油酸含量的大豆突变体材料，为高油酸大豆品种选育提供新材料，为加快高油酸大豆品种的选育具有积极的促进作用。
附图说明
图1为fad2-1a突变体在GmFAD2-1A靶点处的突变类型。
图2为fad2-1a突变体种子中脂肪酸的相对含量。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
栽培大豆Jack，记载在如下文献中：Chen L,Cai Y,Liu X,Yao W,Guo C,Sun S,WuC,Jiang B,Han T,Hou W(2018),Improvement of soybean Agrobacterium-mediatedtransformation efficiency by adding glutamine and asparagine into the culturemedia.International Journal of Molecular Sciences19,3039，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
根癌农杆菌EHA105，记载在如下文献中：Cai Y,Chen L,Liu X,Guo C,Sun S,WuC,Jiang B,Han T and Hou W(2018a),CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis ofGmFT2a delays flowering time in soya bean.Plant Biotechnol J16,176-185，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
MS盐：Phyto Tech，目录号：M524。
MS有机：Phyto Tech，目录号：M533。
B5有机：Phytotech公司，目录号：G219。
B5盐：Phytotech公司，目录号：G768。
YEP固体培养基由溶剂和溶剂组成；各溶质及其在YEP固体培养基中的浓度为：NaCl 5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，15g/L琼脂；溶剂为水。YEP固体培养基的pH为7.0。
发芽培养基(pH5.8)：3.12g/L B5盐、1ml/L B5有机、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂，余量为水。
液体培养基(pH5.4)：0.43g/L MS盐、1ml/L B5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/L L-半胱氨酸、30g/L蔗糖、3.9mg/L 2-吗啉乙磺酸，余量为水。
共培养培养基(pH5.4)：0.43g/L MS盐、1ml/L B5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/L L-半胱氨酸、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、3.9mg/L 2-吗啉乙磺酸，余量为水。
恢复培养基(pH5.4)：3.1g/L B5盐、1ml/L B5有机、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L 6-BA、0.98g/L 2-吗啉乙磺酸、7.5g/L琼脂、4ml/L Fe盐(200×)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。
筛选培养基(pH5.4)：3.1g/L B5盐、1ml/L B5有机、0.98g/L 2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L 6-BA、6mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、4ml/L Fe盐(200×)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。
伸长培养基(pH5.6)：4.0g/L MS盐、1ml/L B5有机、0.6g/L 2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA、1mg/L 6-BA、6mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、4ml/L Fe盐(200×)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。
生根培养基(pH5.7)：2.165g/L MS盐、1ml/L B5有机、0.6g/L 2-吗啉乙磺酸、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。
实施例1、GmFAD2-1A基因编辑CRISPR载体的构建
一、gRNA的获得
从Phytozome数据库获得大豆GmFAD2-1A(序列1)基因组序列。GmFAD2-1A位于10号染色体。利用CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)在线网页工具进行GmFAD2-1A sgRNA靶位点序列的选择。靶点位于GmFAD2-1A的第二外显子区，靶序列为GTGGCCAAAGTGGAAGTTCAAGG(序列1第649-672位)。
靶点设计好后，需要整合到载体上。首先，合成sgRNA的靶点引物，引物序列为：
FAD2-1A-F：5′-TTGGTGGCCAAAGTGGAAGTTCA-3′
FAD2-1A-R：5′-AACTGAACTTCCACTTTGGCCAC-3′
(下划线所示序列为20bp的sgRNA)
在25ul体系中各加入FAD2-1A-F及FAD2-1A-R引物5ul，水15ul，95℃ 3min，0.1℃/s退火至16℃，16℃保持10min，完成退火，得到带有粘性末端的gRNA退火产物。
二、表达sgRNA的载体的制备
取1ul上述一得到的带有粘性末端的gRNA退火产物与cas9/gRNA载体(北京唯尚立德生物科技有限公司，货号：VK005-15，该载体含有Cas9蛋白表达单元)进行T4连接，得到重组载体Cas9-sgRNA，该载体表达sgRNA,sgRNA中的靶序列结合区的编码序列为序列1第649-672位。
实施例2、fad2-1a突变体的获得
一、重组菌的制备
将实施例1制备的重组载体Cas9-sgRNA转入大肠杆菌DH5α，涂于LB+Kan的固体培养基上。挑取单克隆提取质粒，送测序。
测序引物SQ：TGAAGTGGACGGAAGGAAGGAGG，确定插入正确的片段的质粒命名为重组质粒FAD2-1A-sgRNA。
用电转法将重组质粒FAD2-1A-sgRNA转化农杆菌EHA105，提取质粒进行测序验证，将测序验证正确的重组菌株命名EHA-FAD2-1A-sgRNA。
二、农杆菌介导转化
利用农杆菌介导法将构建好的EHA-FAD2-1A-sgRNA转化大豆品种Jack(以下称为野生型大豆)，具体方法为：
1、种子灭菌
1)、取无病虫害和斑点、饱满、均一、干燥的大豆品种Jack种子，完全平铺在培养皿中，然后将培养皿放入干燥器中。
2)、完成步骤1)后，在所述干燥器中放入100ml容量的烧杯，在烧杯中倒入80ml12M次氯酸钠水溶液，再慢慢加入4ml浓盐酸，然后迅速盖上干燥器，用凡士林密封，放置16h，进行氯气灭菌。
2、制备侵染菌液
1)、28℃，培养上述一得到的EHA-FAD2-1A-sgRNA菌液，用液体培养基重悬，得到OD600nm＝0.6的侵染菌液。
2)、将1处理后的种子放入超净台中，在显微镜下，剥去种皮，沿长轴将两个子叶分开，保留带完整胚轴的那片子叶，在其胚轴和子叶连接处进行划伤，一般一个子叶划伤3-5刀，然后在28℃培养箱中，浸染2h。
3)、将子叶内面(平滑面)向上，平铺于已铺有无菌滤纸的共培养培养基上，温度22℃，暗培养5d。
4)、共培养5d后，外植体胚轴伸长到2cm，切掉部分胚轴，使其保留0.5cm。将处理后的外植体放到恢复培养基中，28℃，16h光照/8h黑暗条件下，培养7d。
5)、从恢复培养基中取出外植体，去除新芽，切除部分胚轴，保留0.5cm的胚轴，再将修整后外植体转入到筛选培养基中，28℃，16h光照/8h黑暗条件下培养21d。
6)、经过21d的筛选诱导，外植体产生大量不定芽，剥除子叶和棕色的叶子，将剩余的部分转入伸长培养基中培养，28℃，16h光照/8h黑暗条件下培养。
7)、在伸长培养基中，当丛生芽抽出5-8cm幼茎时，从不定芽基部剪下来；茎基部在1mg/L IBA溶液中沾1min，然后转入生根培养基中培养，28℃，16h光照/8h黑暗条件下培养一周，在茎基部产生大量根后，移栽到盆中，长成的植株为T0代转化大豆。
三、编辑植株的分子检测
提取T0代转化大豆叶片的DNA作为模板进行PCR分子检测，以野生型大豆为对照。
在GmFAD2-1A基因靶位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增并测序。其中，引物FMA-F：5′-TTGAGGGATTGTAGTTCTGTTGG-3′和FMA-R：5′-ACACCAGTGAGAAGGCAACC-3′扩增GmFAD2-1A基因。PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer12.5ul，dNTP Mix(10mM)0.5ul，DNA(200ng/ul)1ul，F(10pmol/ul)1ul，R(10pmol/ul)1ul，Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5ul，ddH2O 8.5ul，总体积25ul。扩增反应体系：95℃3min；95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。PCR产物送公司测序验证。
在靶点位置附近出现套峰为杂合编辑植株，命名为T0代转GmFAD2-1A大豆。
将T0代转GmFAD2-1A大豆播种后收获T1代转GmFAD2-1A大豆的种子，培育，得到T1代转GmFAD2-1A大豆。
采用上述三中PCR分子检测方法检测T1代转GmFAD2-1A大豆，测序结果显示，在T1代转GmFAD2-1A大豆中，突变体植株(FAD2-1A)在靶位点附近产生如下突变，使蛋白翻译提前终止，突变体植株中GmFAD2-1A基因突变类型包括3种：-2bp、+1bp、-1bp(图1)。
T1代转GmFAD2-1A大豆突变体植株中GmFAD2-1A基因突变类型-2bp为将序列表中序列1第665-666位缺失，且保持其他核苷酸不变。
T1代转GmFAD2-1A大豆突变体植株中GmFAD2-1A基因突变类型+1bp为将序列表中序列1第667和668位中间增加一个碱基T，且保持其他核苷酸不变。
T1代转GmFAD2-1A大豆突变体植株中GmFAD2-1A基因突变类型-1bp为将序列表中序列1第667位缺失，且保持其他核苷酸不变。
将上述具有各种GmFAD2-1A基因突变类型的T1代转GmFAD2-1A大豆突变体植株继续培育，直至得到T2代转GmFAD2-1A大豆，播种后收获得到T3代转GmFAD2-1A大豆(fad2-1a纯和突变体)的种子。
四、脂肪酸含量的测定
1、脂肪酸含量测定方法
待测材料：大豆Jack(野生型)、T3代转GmFAD2-1A大豆纯合株系SEA-73、SEA-81和SEA-122。
分别选取T3代转GmFAD2-1A大豆的种子(fad2-1a纯和突变体)各种突变类型的单株进行测定，突变类型见表1。采用气相色谱法对fad2-1a纯和突变体的T3代种子中各种脂肪酸成分的相对含量进行测定。主要检测了包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)五种脂肪酸的含量。
表1为用于测定的突变体编号及其突变类型
大豆脂肪酸的含量通过SHIMADZU气相色谱仪(GC-2010)测定，样品处理及测定方法如下：
大豆豆粉脂肪酸提取：采用加热甲酯化提取法进行脂肪酸提取(范胜栩等,2015)，每个大豆株系选取饱满的大豆种子20粒，用磨样机(Retsch ZM100，Φ＝1.0mm，Rheinische，德国)磨成细粉状后进行样品处理：
称取约0.03g大豆细粉，置于2.0mL无菌离心管中；
吸取1.0mL正己烷到离心管中，放在60℃水浴中20分钟，每5分钟振荡一次。
吸取1.0mL甲醇钠水溶液(0.5mol/L)于每个离心管，在60℃水浴中浸提，振荡10分钟使其完全甲酯化；以13000rpm/min的速度离心2分钟，看到清晰的分层现象。吸取200μL上清液到专用的样品瓶中进行色谱分析，并将其放置于4℃的冰箱中。
转基因大豆株系设置3个重复，每个重复进行3次检测。将3次重复检测的平均值判定为该脂肪酸组分的含量，并且每个转基因大豆株系的脂肪酸组分含量以3次重复的平均值为标准。在气相色谱分析仪检测中出现了5种脂肪酸组分的峰，气化后的不同脂肪酸出峰时间用于区分五种主要脂肪酸成分，不同脂肪酸的含量(相对含量)以不同脂肪酸的峰面积/五种主要脂肪酸峰面积的百分比表示。
气相色谱仪分析检测条件：色谱柱RTX-Wax(30m×0.25×0.25)；注入口温度250℃，氮气54ml/min，氢气40ml/min，空气400ml/min，采用程序升温模式。检测器温度为300℃；采用面积归一化法计算五种主要脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸)的含量。
五种脂肪酸甲酯标准样品:棕榈酸甲酯(methyl palmitate)、硬脂酸甲酯(methylstearate)、油酸甲酯(methyl oleate)、亚油酸甲酯(methyl linoleate)和亚麻酸甲酯(methyl linolenate)，均购自于Sigma公司。
2.突变系种子的脂肪酸变化
气相色谱测定结果如图2所示：与受体品种Jack(野生型)相比，突变系中棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)的含量均发生了变化，各脂肪酸出峰保留时间与标准品一致。
与野生型对照相比，突变体单株种子中的油酸和亚油酸含量均呈显著性差异，fad2-1a纯和突变体种子中的油酸含量增加到Jack的2倍，达到40％左右(表2)。
表2为野生型及fad2-1a突变体的大豆种子中主要脂肪酸的相对含量(％)
上述结果表明，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除大豆GmFAD2-1A基因可以显著提高大豆种子中油酸的含量。同时发现，增加1bp的突变体(SEA-81)比其他突变类型的突变体油酸含量提高得多。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 利用CRISPR/Cas9修饰GmFAD2-1A基因获得高油酸含量大豆的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1977
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ttatgacatg taattgaatt ttttaattat aaaaaataat aaaacttaat tacgtactat 60
aaagagatgc tcttgactag aattgtgatc tcctagtttc ctaaccatat actaatattt 120
gcttgtattg atagcccctc cgttcccaag agtataaaac tgcatcgaat aatacaagcc 180
actaggcatg gtaaattaaa ttgtgcctgc acctcgggat atttcatgtg gggttcatca 240
tatttgttga ggaaaagaaa ctcccgaaat tgaattatgc atttatatat cctttttcat 300
ttctagattt cctgaaggct taggtgtagg cacctagcta gtagctacaa tatcagcact 360
tctctctatt gataaacaat tggctgtaat gccgcagtag aggacgatca caacatttcg 420
tgctggttac tttttgtttt atggtcatga tttcactctc tctaatctct ccattcattt 480
tgtagttgtc attatcttta gatttttcac tacctggttt aaaattgagg gattgtagtt 540
ctgttggtac atattacaca ttcagcaaaa caactgaaac tcaactgaac ttgtttatac 600
tttgacacag ggtctagcaa aggaaacaac aatgggaggt agaggtcgtg tggccaaagt 660
ggaagttcaa gggaagaagc ctctctcaag ggttccaaac acaaagccac cattcactgt 720
tggccaactc aagaaagcaa ttccaccaca ctgctttcag cgctccctcc tcacttcatt 780
ctcctatgtt gtttatgacc tttcatttgc cttcattttc tacattgcca ccacctactt 840
ccacctcctt cctcaaccct tttccctcat tgcatggcca atctattggg ttctccaagg 900
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gtaccaatgg gttgatgatg ttgtgggttt gacccttcac tcaacacttt tagtccctta 1020
tttctcatgg aaaataagcc atcgccgcca tcactccaac acaggttccc ttgaccgtga 1080
tgaagtgttt gtcccaaaac caaaatccaa agttgcatgg ttttccaagt acttaaacaa 1140
ccctctagga agggctgttt ctcttctcgt cacactcaca atagggtggc ctatgtattt 1200
agccttcaat gtctctggta gaccctatga tagttttgca agccactacc acccttatgc 1260
tcccatatat tctaaccgtg agaggcttct gatctatgtc tctgatgttg ctttgttttc 1320
tgtgacttac tctctctacc gtgttgcaac cctgaaaggg ttggtttggc tgctatgtgt 1380
ttatggggtg cctttgctca ttgtgaacgg ttttcttgtg actatcacat atttgcagca 1440
cacacacttt gccttgcctc attacgattc atcagaatgg gactggctga agggagcttt 1500
ggcaactatg gacagagatt atgggattct gaacaaggtg tttcatcaca taactgatac 1560
tcatgtggct caccatctct tctctacaat gccacattac catgcaatgg aggcaaccaa 1620
tgcaatcaag ccaatattgg gtgagtacta ccaatttgat gacacaccat tttacaaggc 1680
actgtggaga gaagcgagag agtgcctcta tgtggagcca gatgaaggaa catccgagaa 1740
gggcgtgtat tggtacagga acaagtattg atggagcaac caatgggcca tagtgggagt 1800
tatggaagtt ttgtcatgta ttagtacata attagtagaa tgttataaat aagtggattt 1860
gccgcgtaat gactttgtgt gtattgtgaa acagcttgtt gcgatcatgg ttataatgta 1920
aaaataattc tggtattaat tacatgtgga aagtgttctg cttatagctt tctgcct 1977
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