具体实施方式

I.定义和缩写

在详细地描述本发明的菌株和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。

如本文所用，术语“颗粒”是指物质的致密小微粒。该微粒包含具有一个或多个任选包衣层的核。

如本文所用，术语“核”可与术语“籽”互换，并且包括可以在其上施加附加包衣或附加层的颗粒的整体内部。核可以包含单一材料，诸如盐或糖晶体，或者可以由材料的混合物组成。核可以是惰性的或者可以包含一种或多种酶，作为纯的酶或者混合或嵌入惰性材料基质内的酶的形式。

如本文所用，术语“酶基质核”是指包含酶的颗粒核。酶基质核可进一步包含发酵固体和赋形剂，诸如粘合剂和填充剂。活性酶分散或溶解在整个酶基质核中，并没有在无酶的整体惰性核上成层。

如本文所用，术语“多层颗粒”是指包含核和至少一个包衣层的组合物。核可以是惰性核或酶基质核。

如本文所用，术语“包衣层”和“层”可互换。包衣层通常将核封装，以便形成基本上连续的层，使得核表面具有很少或没有未包衣的区域。颗粒和/或多层颗粒中使用的材料(例如，本文详述的试剂、组分和酶)适合用于食品和/或动物饲料中。所述材料可为食品级或饲料级。

如本文所用，术语“外包衣层”是指多层颗粒的距核最远的包衣层(即，施加的最后一个包衣层)。

如本文所用，术语“酶包衣层”或“酶层”是指包含至少一种酶的酶层。

如本文所用，“孔隙率”是每单位质量的材料中，材料中的空隙体积或空白空间中所含的体积的度量。需要注意的是，一些测试有效地测量了从材料表面可及的“可及空隙”，而未测量任何内部空隙空间。

如本文所用，“无孔”或“低孔隙率”是指通过压汞法(MIP)测定，包衣、包衣颗粒或其他材料的大孔孔隙率小于约0.03cc/g。

如本文所用，在孔隙率的上下文中，“大孔”是指通过压汞法(MIP)测定，直径在0.2至8微米之间的孔隙。

如本文所用，“大孔孔隙率”是指仅大孔的孔隙率，大孔即通过压汞法(MIP)测定直径在0.2至8.0微米之间的那一部分孔隙。

如本文所用，就颗粒包衣而言，“连续”意指未受裂缝、裂纹或孔中断，使得包衣的连续部分的特性控制包衣的特性，与包衣中的裂缝、裂纹或孔相反。包衣的连续性可以通过在扫描电子显微镜(SEM)下观察代表性的颗粒样品来评估。

如本文所用，“圆度”是指Krumbein圆度，即根据Krumbein(Krumbein,W.C.(1941)JSediment.Petrol.[沉积岩石学杂志]11:64)建立的一套示例性图像标准，对物体外部成角度接近数学上完美的圆的外部成角度的严密程度的度量。以0至1的标度测量圆度。具有很多尖角或突起的高度角形物体的圆度值将接近于0，而具有几个尖角的光滑物体的圆度值将接近于1。可以使用带有图像分析软件的光学形态学仪器(诸如Retsch Camsizer XT、Malvern Morphologi G3或Microtrac PartAn 3-D)，在颗粒样品上测量根据Krumbein图像标准的圆度值。

如本文所用，“球形度”是物体形状接近数学上完美的球体形状的严密程度的度量，正式定义为物体的体积与完全容纳该物体的最小球体的体积之比的立方根。以0至1的标度测量球形度。高度伸长的物体的球形度值将接近于0，而紧凑型或球形物体的球形度值将接近于1。可以使用带有图像分析软件的光学形态学仪器(诸如Retsch Camsizer XT、Malvern Morphologi G3或Microtrac PartAn 3-D)，在颗粒样品上测量球形度。

如本文所用，“重量百分比”、“重量分数”、“质量分数”或简称为“分数”是指以％wt/wt或分数wt/wt为基础的质量的相对量，例如，包衣质量与整个颗粒的质量相比的相对量。

如本文所用，“水活度(a_w)”定义为物质中水的分蒸汽压除以给定温度下水的标准态分蒸汽压。它是与周围大气处于平衡状态的固体或液体的测量特征。

如本文所用，“相对湿度(RH)”是在给定温度下水蒸汽的分压与水的平衡蒸汽压之比。

如本文所用，盐的“临界相对湿度(CRH)”定义为周围大气(在某一温度下)的相对湿度，在该相对湿度下材料开始从大气中吸收水分，而低于该相对湿度，它将不吸收大气水分。

如本文所用，“吸水率”是在给定的相对湿度下与周围大气平衡后被固体吸收的水的重量百分比。

如本文所用，术语“发酵固体”是指源自微生物发酵肉汤的干燥或部分干燥的固体，该微生物发酵肉汤被加工以便回收一种或多种有用的目标生物活性物，诸如酶。发酵固体可以源自直接从发酵罐中获得的全细胞肉汤，源自通过过滤或离心去除了细胞的澄清肉汤，例如通过超滤或蒸发进行浓缩，或者例如通过色谱法、沉淀或结晶进行不同程度地纯化。发酵固体因此可以包含除酶活性物以外的杂质，诸如非活性的蛋白质、肽、氨基酸、多糖、糖、盐以及在发酵和下游加工过程中形成的其他残留化合物。发酵固体还可以包含在干燥或造粒过程之后留下的一些残留的游离水或结合水。发酵固体不包括赋形剂，赋形剂是单独定义的(见下文)。

如本文所用，“酶固体”是指包含一种或多种活性酶的干燥或部分干燥的固体。应当理解，发酵固体可以完全或部分包含酶固体，即，发酵固体除了酶固体之外还可以包含大量的杂质。酶固体包含组合物中的所有目标活性酶，但不包括可能存在的较小的或无意的酶活性，但在任何情况下都占酶基质核内发酵固体中存在的总酶固体的不到5％。

如本文所用，“有效载荷”是指颗粒内目标材料的质量分数。在本发明的范围内，根据指定的上下文，目标材料是聚集物中的发酵固体，或仅是酶固体。有效载荷表示为发酵固体或酶固体相对于颗粒总质量的％wt/wt固体。照这样，也可以指“酶有效载荷”或“发酵固体有效载荷”。

如本文所用，术语“赋形剂”是指在加工期间或加工之后但在干燥或造粒之前添加到发酵固体中，以改善所得干燥颗粒的稳定性、处理或物理特性的固体。在这种用途中，赋形剂不计入颗粒的酶有效载荷或发酵固体有效载荷之内。赋形剂包括但不限于：稳定剂、粘合剂、粘度调节剂、表面活性剂、填充剂、润滑剂、干燥剂、湿润剂、色素等。

如本文所用，“低吸湿性”或“非吸湿性”是指通过动态蒸汽吸附或等效方法测量，在60％相对湿度下吸收不超过0.5％w/w的水的材料。

如本文使用的，“蜡”被定义为任何烃、脂肪酸、脂肪醇、或其盐或酯，其不溶于水但可溶于非极性有机溶剂。在欧洲由Deutsche Gesellschaft für Fettwissenschaft(DGF，德国脂肪科学协会(German Association for Fat Science))已经制定了蜡的综合性定义。根据此定义，蜡(i)具有高于40℃的滴落点或熔点。(ii)熔融而不分解；(iii)在高于熔点的10℃下具有不超过10,000mPa·s的熔体粘度；(iv)在粘度方面展现出强的负温度依赖性并且在高于熔点下不趋向于拉丝性(stringiness)；(v)在微小压力下可擦光(polishable)并且具有强的温度依赖的稠度和溶解度；(vi)在20℃下是可捏合或难碎、粗糙至精细结晶、透明至不透明(但不是玻璃状的)、或高度粘性的或液体的，(vii)在50℃与90℃之间熔融(如本发明的组合物和方法中使用的特定蜡，在高达200℃的温度下熔融)，并且形成糊状物或凝胶，并且是热和电的不良导体(即，它们是热和电绝缘体)。

如本文所用，术语“球粒”和“制粒”是指固体、圆形、球形和圆柱形的片剂或球粒以及形成此类固体形状，特别是饲料球粒和固体、挤出动物饲料的方法。已知的动物饲料制粒制造工艺通常包括在室温下将饲料成分一起混合约1分钟至约5分钟，将所得掺和物转移到缓冲仓中，将掺和物运输至蒸汽调节器中，任选地将经蒸汽调节的掺和物转移到膨胀器，将掺和物转移至制粒机或挤出机，最后将球粒转移至球粒冷却器。Fairfield,D.1994.第10章,制粒成本中心(Pelleting Cost Center).在Feed Manufacturing Technology IV[饲料生产技术IV]中.(McEllhiney编辑),美国饲料工业协会(American Feed IndustryAssociation),美国弗吉尼亚州阿灵顿市(Arlington,VA,USA),第110-139页。

如本文所用，术语“经热处理的动物饲料球粒”是指通常在至少90℃的温度下经受热处理(诸如蒸汽调节)至少30秒的磨碎的饲料谷物(诸如玉米或大豆)和补充添加剂(诸如维生素、脂质和酶)的掺和物。然后可以将掺和物挤出以形成动物饲料球粒。

如本文所用，术语“稳定性”是指其中有益地维持或改善了饲料补助(或补充)酶的酶活性或其他功能性质的多种作用中的任一种。饲料酶可以通过显示改善的“回收活性”、“热稳定性”和/或“无活性可逆性”中的任一种来表现出稳定性。“稳定性”可以指在与饲料或饲料球粒组合之前或之后酶组合物中维持的活性。饲料酶的非排他性实例是淀粉酶、植酸酶、蛋白酶和木聚糖酶。

如本文所用，术语“回收活性”或“活性回收率”是指(i)在涉及一种或多种以下应激物的处理后饲料酶的活性：加热、增压、增高pH、降低pH、储存、干燥、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和机械应力)与(ii)处理之前酶的活性的比率。回收活性可以表示为百分比。回收活性百分比计算如下：

如本文所用，“FTU”或“植酸酶转换单位”或“植酸酶活性单位”或“单位”是每分钟能够释放1μmol无机磷的酶的量。根据“分析化学家协会(AOAC)官方方法2000.12”测定植酸酶活性，如“Determination of phytase activity in feed by a colorimetricenzymatic method:collaborative interlaboratory study[通过比色酶法测定饲料中的植酸酶活性：实验室间合作研究]”Engelen,A.J.等人(2001)JAOAC Int.[AOAC国际杂志]84:629-33中所述。简言之，将研磨样品用220mM乙酸钠三水合物、68.4mM氯化钙脱水物、0.01％吐温20(pH 5.5)萃取。然后测定上清液。该测定法在pH 5.5下于37℃测量水稻植酸酶中无机磷酸盐的释放，持续60分钟。用酸性钼酸盐/钒酸盐试剂终止测定，并通过钒钼磷酸的黄色络合物的强度定量磷酸盐。

如本文所用，术语“约”是指参考值的±15％。

为了便于参考，可以将本发明的组合物和方法的要素排列在一个或多个标题下。要注意的是，每个标题下的组合物和方法也适用于其他标题下的组合物和方法。

如本文所使用的，单数冠词“一个/一种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。除非另外说明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

℃ 摄氏度

cc 立方厘米

CFM 立方英尺/分钟

D₅₀ 中值粒径(按体积计)

FTU/g 植酸酶单位/克

g或gm 克

g/L 克/升

g/mol 克/摩尔

mol/mol 摩尔比

hr或h 小时

kg 千克

M 摩尔

mg 毫克

mL或ml 毫升

min 分钟

mM 毫摩尔

μm 微米(micron)

μmol 微摩尔

UFC 超滤浓缩物

SEM 扫描电子显微镜检查/显微镜

％wt/wt 重量百分比

II.无孔酶颗粒

本发明的组合物和方法涉及稳定、高有效载荷、无孔的酶颗粒，这些酶颗粒由于其形状和包衣特征对蒸汽制粒期间的活性损失的抗性提高。高有效载荷的颗粒显然作为降低颗粒酶成本的手段是可取的。先前已经披露了高有效载荷的酶颗粒，但是没有一种颗粒在蒸汽制粒过程中展示出高稳定性，并且没有将颗粒掺混到固体产品中时确保酶良好分布所需的小粒度。已经制成了具有厚包衣的高有效载荷颗粒，但是本发明人发现，厚包衣不能确保对蒸汽处理的足够防护。单独的包衣组合物也不能保证成功。

本发明的组合物和方法涉及具有三个关键特征的颗粒，具体是：

(a)至少10％酶固体的有效载荷；

(b)大孔孔隙率小于约0.03cc/g的连续保护性包衣；以及

(c)在60％RH下的吸水率不超过0.5％。

如本文所述，就颗粒的比孔容而言，孔隙率可以如本文所述，使用透度计通过压汞法(MIP)来测量。令人惊讶的是，并非所有孔隙的大小都与实现本发明的目的有关；直径小于0.2μm或大于8.0μm的孔隙的比容与耐蒸汽性无关。在0.2至8.0μm的限定直径范围内的孔隙在本文中称为“大孔”，并且包衣酶颗粒中这些大孔的比容是提供优异的制粒稳定性的基本特征。

对样品进行压汞法，以评估0.003-400μm区的孔隙率。将除气样品装入Micromeritics AutoPore III的校准的透度计小室中。将透度计密封，安装在仪器中并置于真空下。汞在压力从0-413MPa(0-60,000psia)逐渐增加时进入透度计，并记录入侵(64个数据点)并经由Washburn方程进行分析，接触角值为130°且表面张力为478达因/cm，以生成孔径/体积分布。为了评估样品的稳定性，在仪器上进行了一系列的压汞/退汞实验，以评价再现性/滞后性。

为了被视为具有“低孔隙率”或“无孔”，包衣颗粒必须具有小于约0.03g/cc的大孔孔隙率。低孔隙率，例如，可以通过以下两种特征的组合而实现：(a)光滑酶基质核的球形度至少为0.9，或替代性地或另外地圆度为0.5；和(b)包衣质量分数为至少30％w/w。两种特征似乎都需要；仅具有这两种特征之一不足以使颗粒无孔。尽管在现有技术中已经披露了这些单独特征中的每一种特征，但是都没有描述两种特征的组合对于包衣孔隙率的重要性及其对蒸汽稳定性的影响。另外，通过在球形、圆形核上施加连续包衣，可以获得具有小于约70％w/w的包衣质量分数的无孔颗粒。因此，仅需要中等厚度的包衣，从而实现高净有效载荷并限制了确保对包衣颗粒中的酶进行充分保护所需的成本和时间。

有几种特征将本发明的组合物和方法与先前描述的那些组合物和方法区别开。例如，20000(杜邦工业生物科学公司(DuPont IndustrialBiosciences))、HiPhos GT(诺维信公司(Novozymes)/DSM)和其他颗粒是低孔隙率颗粒，也显示出可接受的蒸汽耐久性。然而，这些颗粒依赖于大量的粘合剂和包衣，或将酶蛋白作为次要组分包埋在基质内，才能赋予蒸汽耐久性。例如，RONOZYME颗粒的蛋白质有效载荷为大约1％-2％w/w，而植酸酶的量为大致0.5％-1％w/w。美国专利公开号20030124224(DSM)描述了具有高酶有效载荷的微粒，但是没有提供如何为这些微粒包衣以使其热稳定的建议或示范。例如，该专利公开中例示的无包衣植酸酶微粒是无保护的，不适合用于蒸汽制粒。相比之下，本发明的颗粒具有小尺寸和高有效载荷，并且必须依赖于相对薄的包衣才能在蒸汽制粒过程中赋予足够的保护。已经发现低孔隙率对于实现该目标至关重要。

III.无孔颗粒的核

本发明的组合物和方法的特征是高有效载荷的酶基质核。本发明的颗粒没有酶必须围绕其成层的惰性核，而是包含整体的酶基质核，其中酶和其他发酵固体(包括酶固体)占据颗粒的中心部分。在一些实施例中，发酵固体占核的大部分，而按照惯例添加以保护酶的赋形剂仅是核的次要组分，例如，最多占核的15％、20％或25％。通过这种方式，以及核和包衣的其他使能特征(诸如形状和孔隙率)，通过消除对非活性、惰性材料的需求，使颗粒有效载荷最大化，而非活性、惰性材料会另外占用在制剂中宝贵的“不动产”，从而降低了活性酶和其他发酵固体的潜在有效载荷。

此外，本发明令人惊讶的方面是，因此可以生产具有所需球形，适于施加连续无孔包衣，而不需要从惰性核或籽开始的此类含低赋形剂、高有效载荷的酶基质核。在诸如喷雾包衣等现有技术方法中，惰性核或籽微粒的大小、形状、光滑度、密度和流化特征在充当“模板”或起始点以确保后续连续铺放酶层和其他包衣层的沉积中起关键作用。同样，令人惊讶的特征是，可以通过从主要包含酶和发酵固体，但仅含一小部分赋形剂的基质微粒开始，注意基质颗粒的形状和包衣的孔隙率，构建一种在不利的储存或处理条件(诸如潮湿环境或蒸汽制粒过程)下保护酶的酶颗粒。现有技术的基质颗粒主要通过在核内使用高水平的保护性赋形剂，未注意核的形状，或者通过施加厚包衣，未注意那些包衣的孔隙率来提供保护。

酶基质核包含纯的酶或与其他发酵固体组合的酶和赋形剂。赋形剂是在加工期间或加工之后但在干燥或造粒之前添加到发酵固体中以改善所得干燥颗粒的稳定性、处理性或物理特性的固体，并且可以包括稳定剂、粘合剂、粘度调节剂、表面活性剂、填充剂、润滑剂、干燥剂、湿润剂、色素等。优选的赋形剂是粘合剂聚合物、粘土和矿物质的非吸湿形式。优选的赋形剂包括但不限于聚合物(诸如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮)、不溶性粘土和矿物质(诸如高岭土、滑石和碳酸钙)、以及无水或低水合盐(诸如硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵)

核的大小对最终颗粒的大小很重要，最终颗粒的大小对含有最终颗粒的饲料产品中目标蛋白质的分布均匀性也很重要。较小的颗粒可确保比大微粒更均匀的分布。优选微粒的平均直径小于600μm，小于550μm，小于500μm，小于450μm，小于400μm，小于350μm，小于300μm或甚至小于250μm，其下限为约100μm。该下限不包括细微粒和喷雾干燥的粉末，所述细微粒和喷雾干燥的粉末包括不充分为球形并且不能包衣以实现本发明目的的微粒。

已经发现，核的形状对最终颗粒的特性有显著影响，甚至是用低孔隙率包衣料进行包衣的颗粒。优选的核的球形度为至少0.9，例如至少0.90，至少0.91，至少0.92，至少0.93，至少0.94，至少0.95，至少0.96，至少0.97或甚至至少0.99。替代性地或另外地，优选的核的圆度为至少0.5，至少0.6，至少0.7或甚至至少0.8。

平均直径、球形度、圆度及核的其他特性可以通过多种方法进行测量，诸如使用样品的扫描电子显微镜检查结合基本的机械测量，即对足够数量的电子显微照片应用简单的标尺，以获得统计上相关的数字。图像处理软件也可以用于自动执行此过程。

本发明的颗粒具有高有效载荷，其包含至少25％、至少30％或甚至至少35％wt/wt的发酵固体，和/或至少10％、至少15％或甚至至少20％的酶固体。

IV.低孔隙率颗粒的包衣

含酶的基质核用至少一个无孔、水溶性或水分散性的包衣层包衣。优选地，包衣是非吸湿性的。一个或多个包衣层中使用的材料应该适合用于食品和/或动物饲料中(参见，例如，US 20100124586、WO 9932595和US 5324649)。包衣应该是连续的，即，其特征在于不存在间隙、裂纹和/或孔，这些间隙、裂纹和/或孔会致使包衣的微米级孔隙率与保护所述核无关。在一些实施例中，含酶的基质核仅用单一包衣进行包衣。

包衣层可以包括以下材料中的一种或多种：无机盐(例如，硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵)、柠檬酸、糖类(例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖)、增塑剂(例如，多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二甲酯)、纤维材料(例如，纤维素和纤维素衍生物，诸如羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、粘土、空白丸芯(糖和淀粉的组合)、硅酸盐、磷酸盐、淀粉(例如，玉米淀粉)、脂肪、油(例如，菜籽油和石蜡油)、脂质、乙烯基聚合物、乙烯基共聚物、聚乙烯基醇(PVA)、增塑剂(例如，多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯和水)、抗结块剂(例如，滑石、粘土、无定形二氧化硅和二氧化钛)、消泡剂(诸如FOAMBLAST和EROL)和滑石。US 20100124586、WO 9932595和US5324649详述了用于包衣层的合适组分。

在一些实施例中，包衣层包含糖类(例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、粒状蔗糖、麦芽糖糊精和果糖)。在一些实施例中，包衣层包含聚合物，诸如聚乙烯醇(PVA)。用于掺入多层颗粒的包衣层中的合适的PVA包括具有低度至高度粘性的部分水解的、完全水解的和中度水解的PVA。在一些实施例中，包衣层包含无机盐，诸如硫酸钠。

包衣层应该是非吸湿性的，通过动态蒸汽吸附(DVS)或等效方法测量，其在60％相对湿度下的吸水率不超过0.5％w/w的水。如在动物饲料的蒸汽制粒中那样，吸湿性包衣在存在湿气的情况下储存期间或在暴露于蒸汽期间将倾向于吸水。水分的吸收将倾向于以孔隙率测量法无法捕获的方式进一步增加包衣颗粒的孔隙率或对水分的渗透性。压汞法(MIP)需要使用干燥的样品，因此无法考虑吸收的水的这种渗透作用。技术人员选择和组合通过DVS测量单独展示出低吸水性，即在60％的相对湿度下吸水率不超过0.5％w/w的材料，容易地配制非吸湿性包衣。使用DVS单独或组合地生成候选包衣的吸湿等温线很简单。食品科学、高分子科学和材料科学的文献中公开了许多材料的吸附等温线。根据该定义的非吸湿性材料的实例包括硫酸钠、氯化钠、碳酸钙。吸湿性材料的实例包括蔗糖、糊精、淀粉、单磷酸二钠和硫酸锌。

应该对包衣层进行选择，使得如本文所述，使用透度计通过压汞法(MIP)测定，颗粒具有小于约0.03cc/g的大孔孔隙率。孔隙率值的实例小于约0.030cc/g，小于约0.028cc/g，小于约0.026cc/g，小于约0.024cc/g，小于约0.022cc/g，小于约0.020cc/g，小于约0.018cc/g，小于约0.016cc/g，小于约0.014cc/g，小于约0.012cc/g，小于约0.010cc/g，并且甚至小于约0.008cc/g。

在一些实施例中，对包衣层进行选择，使得颗粒具有大于50％、大于60％、大于70％或甚至大于80％的临界相对湿度。在一些实施例中，包衣层包含非吸湿性材料并且在60％的相对湿度下，吸水率不超过0.5％wt/wt，不超过0.4％wt/wt，并且甚至不超过0.3％wt/wt。

在一些实施例中，包衣相对于整个颗粒的质量分数为至少30％，至少40％或更大(w/w)。在一些实施例中，包衣的质量分数小于50％(w/w)。

在一些实施例中，包衣包含至少30％的盐(w/w)。在一些实施例中，包衣包含少于60％的盐(w/w)。

V.酶基质核的生产

高有效载荷的酶基质核可以通过任何可以生产适合施加连续无孔包衣的结构良好的球形、圆形微粒的方法制成，而无需添加超过约20％的制剂成分(诸如赋形剂或核材料)。在一个优选的实施例中，用于生产高有效载荷的酶基质核的方法是喷雾造粒，有时称为喷动床造粒，其中通过以下方式来构建酶基质核：将发酵固体和赋形剂喷雾到流化床中，首先形成喷雾干燥的微粒作为核心，随后通过进一步喷雾和成层到起始核心上而构建直径递增的微粒，不需要初始惰性核。适于喷雾造粒的设备的实例是可从格拉特工程技术有限公司(Glatt GmbH)(德国宾岑(Binzen,Germany))获得的Glatt ProCell系统。为了生产适合施加连续无孔包衣的结构良好的微粒，需要高水平的非活性赋形剂或核材料(超过酶基质核的20％-30％w/w以上)的方法不是本发明的合适方法。此类方法不适合本发明，包括但不限于：喷雾干燥、流化床喷雾包衣、流化床附聚、高剪切造粒、挤出、滚圆、旋转雾化、颗粒化(prilling)、结晶和辊压。此类方法不太可能生产出合适的酶基质核。

VI.包含在本发明颗粒中的特定目标蛋白质

许多目标蛋白质适合包含在本发明颗粒中。应该理解的是，颗粒的有效载荷可以由颗粒内所含的总蛋白质的量来定义，理想地所述总蛋白质包括特定目标蛋白质。含有目标蛋白质的许多蛋白质组合物是同质的或“不纯的”，高度富集特定目标蛋白质，但也含有其他蛋白质、细胞裂解物，或甚至整个完整细胞。如其中所述，本发明的颗粒需要至少25％wt/wt的发酵固体或至少10％的酶固体，酶固体包括目标蛋白质。

例示的目标酶是变体布丘氏菌(Buttiauxella)植酸酶，但是植酸酶绝不是唯一可受本发明颗粒保护的酶。本说明书涵盖经受蒸汽制粒的任何酶，包括例如酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、过加氧酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、及其组合。

VII.其他用途

虽然已经描述了本发明的颗粒用于涉及蒸汽制粒的应用中，但是它们无疑在应用中是有用的，特别是在涉及压力性潮湿环境的应用中。此类环境包括在储存期间甚至会经受中等湿度影响的水性液体以及干燥固体。此类应用的具体实例包括固体和液体衣物洗涤剂制剂和自动洗碗制剂。

VIII.各种实施例的组合

可以组合本文所述的组合物和方法的实施例，包括在不同章节标题下描述的那些，以及技术人员显而易见的其他实施例，除非该组合会破坏本发明的组合物和方法的既定目的和优点。

实例

实例1.高有效载荷颗粒的孔隙率和蒸汽稳定性趋势

使用标准方法由来自于布丘氏菌属物种的表达植酸酶变体的里氏木霉(Trichoderma reesei)宿主细胞生产液体酶UFC。在总蛋白质中，基于活性，浓缩物含有约40％wt/wt的植酸酶。使用几种不同的配制方法和赋形剂生产固体酶基质核。随后将这些固体酶基质核在间歇式流化床包衣机中用各种防潮包衣进行包衣，所述防潮包衣包含一种或多种含有聚乙烯醇、滑石、糊精和硫酸钠的喷雾剂。在所有成品颗粒中，基于活性，酶基质核中所含的总发酵固体范围为成品颗粒的20％-60％wt/wt，相当于6％-25％wt/wt的植酸酶。包衣占成品颗粒的40％-80％wt/wt。成品颗粒的植酸酶活性范围为40,000-100,000FTU/g。

将颗粒与动物饲料一起在测试制粒机上制粒，在95℃的温度下调节时间为30s。大孔体积为0.03cc/g或更低的所有高有效载荷颗粒均显示出约70％或更高的制粒回收率，最低的大孔体积通常与最高的活性回收率相关联。制粒回收率高于80％的所有高有效载荷颗粒均具有0.02cc/g或更低的大孔体积。显示出低于60％的制粒回收率的所有高有效载荷颗粒均具有0.04cc/g或更高的大孔体积。这些趋势是无可置疑的，并且在科学和商业上都是相关的。

颗粒另外还经受了实验室规模的蒸汽测试，在100℃饱和蒸汽中的调节时间为12s。大孔体积为0.02cc/g或更低的所有高有效载荷颗粒均显示出约80％或更高的实验室规模蒸汽回收率，最低的大孔体积通常与最高的活性回收率相关联。显示出低于约70％的实验室规模蒸汽回收率的所有高有效载荷颗粒均具有约0.04cc/g或更高的大孔体积。

实例2.使用不同方法生产的酶基质核的比较

如前生产含植酸酶的UFC。使用几种不同的造粒方法和赋形剂生产固体酶基质核，随后将这些固体酶基质核包上防潮包衣。颗粒A和颗粒B的核是通过在Fitzpatrick CCS220装置上辊压生产的，其中向发酵固体中添加了高达60％wt/wt的赋形剂。颗粒C和颗粒D的核是通过在Glatt WST-5流化床包衣机上进行连续流化床喷雾附聚生产的，其中向发酵固体中添加了少于10％wt/wt的赋形剂。颗粒E和颗粒F的核是通过在Glatt ProCell 5实验室系统装置上进行连续流化床喷雾造粒生产的，其中向发酵固体中添加了少于10％wt/wt的赋形剂。

将每组核单独筛分为150-425μm的尺寸范围，随后在Vector VFC-LAB 1装置上于间歇式流化床中进行包衣。每种颗粒的包衣均包括盐层(硫酸钠)和疏水层(PVA/滑石)，两层共同占颗粒的55％-65％wt/wt。每种颗粒的批量大小为1-2kg。在40-50℃的床温下以20-30g溶液/min的速率，由含有20％-30％wt/wt硫酸钠的水溶液喷雾出盐层。在50-55℃的床温下以5-15g悬浮液/min的速率，由含有总共15％-25％wt/wt的滑石和PVA的水性悬浮液喷雾出疏水层。滑石和PVA以约2:1的质量比混合。用于使床流态化的空气流量在20-50CFM之间，这取决于床的总质量。根据需要调整喷雾参数，以使床的附聚或包衣固体的喷雾干燥最小化。所得颗粒表现出在40,000-100,000FTU/g范围内的植酸酶活性。

随后使用两种方法测试颗粒的蒸汽稳定性。首先，将颗粒在实验室规模的蒸汽稳定性测试仪上暴露于100℃的饱和蒸汽12s。其次，在典型的动物饲料制粒机上，用30s的调节时间和95℃的饲料调节温度，用玉米和大豆糊状物将颗粒制粒。

下面表1中汇总了颗粒的孔隙率、粒度和蒸汽稳定性信息，表1进一步包括基于SEM图像的关于颗粒形态的观察结果。该表(和后续所有表)的最后一行标识了所描述的制剂是否落入本发明的组合物和方法范围内。

表1.通过不同方法生产的各种颗粒的蒸汽稳定性

使用辊压法生产的颗粒显示出最高的大孔孔隙率和最低的蒸汽稳定性。只有使用喷雾造粒生产的颗粒表现出在0.03cc/g或更低的期望范围内的孔隙率，并且这些颗粒表现出最大的蒸汽稳定性。使用喷雾附聚法生产的核在SEM下显示出最小的规则性。这些核的大孔孔隙率没有因喷雾包衣而降低到期望的范围，这可能是由于形态具有挑战性。

核的性能与所用赋形剂的量或颗粒中植酸酶的浓度无关。而是，如孔隙率测量所揭示的那样，包衣的质量与最高的蒸汽稳定性相关。必须选择适当的高有效载荷的核生产方法，以便实现低孔隙率包衣和对高温蒸汽条件的稳定性。

实例3.不同喷雾造粒的植酸酶颗粒的包衣

即使使用相同的核生产方法时，控制生产参数也很重要，以便获得可以用低孔隙率包衣料进行包衣的颗粒。下面的表2汇总了两种包衣植酸酶颗粒(指定为G和H)的物理特性和蒸汽性能。使用Retsch Camsizer XT仪器及其所包括的图像处理软件测量核的球形度和圆度，每份样品分析至少10,000个单独颗粒。由含有植酸酶的UFC(如前所述)生产颗粒G和颗粒H的核，然后在连续流化床中使用Glatt ProCell 5实验室系统装置将其喷雾造粒。调整喷雾造粒的参数，使得对于用于生产颗粒H的那些核而言，与用于生产颗粒G的那些核相比，核在ProCell装置中的停留时间更长。随后将核于间歇式流化床中在Vector VFC-LAB1装置上，使用在实例2描述的范围内的包衣参数进行包衣。所得颗粒表现出在90,000-100,000FTU/g范围内的植酸酶活性。

表2.包衣植酸酶颗粒G和颗粒H的物理特性和蒸汽性能

由于其在ProCell喷雾造粒装置中的停留时间较短，用于生产颗粒G的酶核显示出比用于生产颗粒H的核更低的球形度和圆度。在装置中的停留时间越长使酶基质核受到额外的磨损和平滑化。尽管用于生产颗粒G的核的大孔孔隙率相对较低，但是颗粒的球形度差不允许在喷雾包衣期间沉积均匀的无孔包衣。因此，成品颗粒G的包衣具有比成品颗粒H的包衣显著更高的大孔孔隙率。通过实验室规模的蒸汽测试和制粒机测试(两者均如前所述)测量，颗粒G的蒸汽稳定性相应地低于颗粒H的蒸汽稳定性。

实例4.增加喷雾造粒核上的包衣厚度

值得注意的是，在核上沉积了足够低孔隙率的包衣之后，颗粒的附加包衣和有效载荷的减少可能不会进一步改善蒸汽稳定性。下面表3汇总了两种包衣植酸酶颗粒(指定为颗粒J-1和颗粒J-2)的物理特性和蒸汽性能。颗粒J-1和颗粒J-2都是由一组相同的核制成的，所述核是由含有植酸酶的UFC(如前所述)生产的，然后在连续流化床中使用GlattProCell 5实验室系统装置将其喷雾造粒。随后将核于间歇式流化床中在Vector VFC-LAB1装置上，使用在实例2描述的范围内的包衣参数进行包衣。每种颗粒的包衣均包括盐层(硫酸钠)和疏水层(PVA/滑石)，两层共同占颗粒的55％-77％wt/wt。每种颗粒的批量大小为约1-2kg。所得颗粒表现出在40,000-110,000FTU/g范围内的植酸酶活性。

表3.包衣植酸酶颗粒J-1和颗粒J-2的物理特性和蒸汽性能

尽管颗粒J-1的有效载荷是颗粒J-2的有效载荷的两倍以上，并且粒径小16％，但两种包衣颗粒的大孔孔隙率几乎相同。相应地，通过前述的实验室规模的蒸汽测试和制粒机测试所测量的，两种颗粒的总体蒸汽稳定性也相似，并且在这些测定的变异性范围内。施加到颗粒J-2上的附加包衣，大约是颗粒质量的25％，没有进一步增加颗粒的蒸汽稳定性。这些数据表明，与较厚的包衣和降低的有效载荷相比，应用良好的低孔隙率包衣可以赋予相同的蒸汽稳定性，从而强调了孔隙率作为性能参数的重要性。

实例5.在不同包衣条件下施加的包衣的特性

制备了使用两种不同方法包衣的四种具有酶基质核的植酸酶颗粒。酶基质核N是来自一组酶基质核的代表性样品，将这些酶基质核在连续流化床中使用Glatt ProCell 25试验系统装置，使用含植酸酶的UFC(如前所述)进行喷雾造粒。颗粒P、颗粒Q、颗粒R和颗粒S是由一组在相同实验运行中生产的并且全部显示出与酶基质核N相似的孔隙率结果的核生产的。

通过在Vector VFC-LAB 1装置上，使用在实例2描述的范围内的包衣参数，为该组喷雾造粒的核进行包衣而生产颗粒P和颗粒Q。批量大小为约2kg，允许在生产期间小心控制诸如湿度、流化和机械冲击应力等参数。所用的包衣条件与实例2中描述的那些相似。由于床的重量小，机械冲击应力低，同时控制床内的喷雾包衣参数以使水分含量降至最低并生产出尽可能干燥的颗粒，而无需对包衣固体进行喷雾干燥。

颗粒R和颗粒S是通过在较大规模的流化床包衣机上，以约100kg的批量大小，对来自于相同组的喷雾造粒核的核进行包衣而生产的。床重量越大相应地引入越高的机械应力，并且对整个较大的床中所有运行参数的控制较不精细。喷雾溶液的浓度和喷雾温度在实例2中描述的范围内。根据生产过程中床的质量，流化空气在每小时800-1100立方米之间变化。盐溶液以每小时36-60升之间的速率喷雾，而疏水包衣溶液以每小时20-45升之间的速率喷雾。所得的颗粒P、颗粒Q、颗粒R和颗粒S表现出在75,000-95,000FTU/g范围内的植酸酶活性。

下面表4说明了四种植酸酶颗粒的物理特性和蒸汽稳定性，其中酶基质核使用两种不同的方法进行包衣(HG意指均质)。

表4.植酸酶颗粒N、P、Q、R和S的特性

由于对包衣特性最高水平的控制，颗粒P和颗粒Q显示出最低的大孔孔隙率，并相应地显示出高的蒸汽稳定性。如先前所述，在实验室规模和制粒应用测试中，以较大规模在控制最少的条件下生产的颗粒R显示出比颗粒P和颗粒Q更高的大孔孔隙率，和显著更低的蒸汽稳定性。尽管将赋形剂的相同包衣构造应用于相同组的核，并且具有大致相同的最终直径，也是这种结果。颗粒R的大孔孔隙率较高表明包衣质量较差，并且颗粒的蒸汽稳定性相应较低。

还在较大规模的流化床包衣机上以100kg的批量大小生产了颗粒S；然而，要特别注意通过降低流化水平来降低包衣过程中的机械冲击应力。通过将盐喷雾的温度从45℃增加到50℃，以较缓慢的速率喷雾盐，延长包衣之间的干燥时间以及增加额外干燥步骤来降低包衣过程中颗粒的水分含量。降低机械应力和提高水分控制水平有助于改善整个包衣过程中包衣的均一性和质量。与颗粒R相比时，颗粒S相应地显示出更低的大孔孔隙率和改善的蒸汽稳定性水平，更接近于颗粒P和颗粒Q的特性。这些数据表明，生产高质量的核并选择适当水平的赋形剂包衣不足以生产出成功的颗粒；而是，必须小心控制包衣条件才能实现具有低的大孔孔隙率的包衣。

实例6.具有不同吸湿性的包衣的特性

除了沉积低孔隙率的包衣之外，还必须沉积具有低吸湿性的包衣。下面表5说明了使用不同的包衣化学方法进行包衣的三种植酸酶颗粒的物理特性和吸水特性。通过在连续流化床中使用Glatt ProCell 5试验系统装置，使用含植酸酶的UFC(如前所述)进行喷雾造粒来生产酶基质核。然后使用Vector VFC-LAB 1装置以约2kg的批量大小对核进行喷雾包衣。使用不同的化学方法对核进行包衣，其中颗粒T和颗粒U的包衣含有吸湿性化合物麦芽糖糊精，而颗粒V的包衣不含麦芽糖糊精。包衣参数在实例2中描述的范围内。对于颗粒T和颗粒U，不是单独喷雾硫酸钠溶液以沉积盐层，而是使用含有22.5％wt/wt的硫酸钠和2.5％wt/wt的麦芽糖糊精的水溶液。由于成品颗粒的盐层中包衣化学性质的不同，对于成品颗粒而言实现了不同的吸湿性水平。使用Retsch Camsizer XT仪器及其所包括的图像处理软件，测量核的球形度和圆度，每份样品分析至少10,000个单独颗粒。

表5.植酸酶颗粒T、U和V的特性

图1说明了在AquaLab VSA系统中通过动态蒸汽吸附所测量的三种颗粒的吸水特性。所示数据是在25℃下以动态蒸气吸附(DVS)模式收集的，表示使用幅度小于0.01％的两个连续质量变化事件的平衡阈值进行的平衡测量结果。吸水率与每个颗粒中麦芽糖糊精的量相关。显然，颗粒T显示出吸水最快，而颗粒V显示出吸水最慢。相应地，如同在实验室规模和制粒规模下测量的，颗粒V显示出最高的蒸汽稳定性，而颗粒T显示出显著较低的蒸汽稳定性。显示出中等吸水水平的颗粒U的蒸汽稳定性是微不足道的。尽管所有颗粒均显示出可接受的大孔孔隙率，但仍存在这种情况。因此，沉积低孔隙率的包衣是不够的；为了确保在高水分条件下的稳定性，还必须选择赋形剂和包衣的化学性质才能将吸水率减到最小。

实例7：大孔尺寸和蒸汽稳定性

对于以上例示的所有样品，获得了在直径为0.01μm的中孔隙至直径为40μm的大孔的尺寸范围内的汞孔隙率测定法测量值。在此范围内，直径在0.2-8.0μm尺寸范围内的大孔总体积与蒸汽稳定性显示出最佳相关性。在这个目标孔径范围内，将上界设为8μm，因为大于8μm的大孔的测量会因检测单个颗粒之间的间隙而被混淆，对于尺寸为100-400μm的颗粒而言，其间隙可小至约10μm。

下面表6显示了先前例示的四种颗粒C、G、P和S在各孔径范围内的孔隙率。在先前的实例中已经描述了这些颗粒的生产条件。

表6.植酸酶颗粒C、P、G和S的特性

颗粒C和颗粒G表现出在0.2-8.0μm的大孔尺寸范围内的高的大孔体积，而在0.01-0.2μm的孔径范围内的低孔隙体积。这些颗粒显示出的蒸汽稳定性结果差，特别是当用动物饲料制粒时，结果极差。与颗粒C和颗粒G相比，颗粒P和颗粒S具有在0.2-8.0μm的孔径范围内的较低孔隙体积，和在0.01-0.2μm的孔径范围内的较高孔隙体积。与颗粒C和颗粒G相比，这些颗粒显示出大大改善的蒸汽稳定性。这些数据说明，0.2-8.0μm的孔径范围与成品颗粒的蒸汽稳定性最佳相关。在0.01-8.0μm整个孔径范围的总计孔隙体积也与蒸汽稳定性完全无关。