一种乙醇实时控制的低温乙醇分离人血白蛋白的生产方法
阅读说明：本技术 一种乙醇实时控制的低温乙醇分离人血白蛋白的生产方法 (Production method for separating human serum albumin from ethanol at low temperature under real-time control of ethanol ) 是由 黄炎炎 张丽铃 钟世平 黄璠 赵睿 陆河其 邓志华 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种乙醇实时控制的低温乙醇分离人血白蛋白的生产方法,包括融浆、组分I制作、组分II+III制作、组分V制作、组分V精制、超滤、稀配、巴氏灭活、蛋白除菌分装及制品孵育,其中,在组分I制作、组分II+III制作、组分V制作和组分V精制的步骤中实时监测溶液中乙醇的浓度。本发明通过监测反应罐内的液体的密度来判断完全添加乙醇后反应罐内液体的密度是否在符合要求的范围内,通过液体的密度值来反映乙醇的体积比浓度,简单快捷,减少了检测乙醇浓度的工序,而且在人血白蛋白生产方法中实现了乙醇的实时监测和控制,解决了现有技术中乙醇浓度的滞后调整的问题。(The invention relates to a production method for separating human serum albumin from ethanol at low temperature in real time by ethanol, which comprises plasma melting, component I preparation, component II + III preparation, component V refining, ultrafiltration, diluted preparation, pasteurization, protein sterilization and split charging and product incubation, wherein the concentration of ethanol in a solution is monitored in real time in the steps of component I preparation, component II + III preparation, component V preparation and component V refining. The density of the liquid in the reaction tank after the ethanol is completely added is judged whether to be in a range meeting the requirements or not by monitoring the density of the liquid in the reaction tank, the volume specific concentration of the ethanol is reflected by the density value of the liquid, the method is simple and rapid, the process of detecting the ethanol concentration is reduced, the real-time monitoring and control of the ethanol are realized in the human serum albumin production method, and the problem of the lag adjustment of the ethanol concentration in the prior art is solved.)
技术领域
本发明涉及生物制药领域中蛋白质药物的分离及纯化工艺，更具体地说，它涉及一种乙醇实时控制的低温乙醇分离人血白蛋白的生产方法。
背景技术
人血白蛋白是血液制剂的主要产品，也是血浆蛋白生产工艺主干的最终产物。白蛋白在肝细胞合成，合成速度极快，具有分子相对小(分子量66250)、表面积相对较大，分子构形比较对称，结构简单、牢固、富韧性等特点。白蛋白对失血性休克，严重烧伤，脑水肿，肝肾疾病的血症有重要作用。自从Cohn等人于40年代创立低温乙醇人血浆蛋白分离技术以来，血浆蛋白的工业化大生产取得了长足的进展。乙醇是人血白蛋白生产工艺中重要的溶液，起到分离蛋白质的作用，因此在人血白蛋白生产工艺中，乙醇的使用量较大。溶液中乙醇的浓度对人血白蛋白的析出起到关键作用，人血白蛋白只在一定浓度的低温乙醇溶液中才能析出，因此在人血白蛋白的生产工艺中需要严格控制乙醇的浓度，但是现在的人血白蛋白的生产工艺中一般是确定了乙醇的使用量后就不再改变，在生产流程中根据确定的乙醇添加量进行添加，但是现有的生产工艺不能监控乙醇浓度的变化，只能在乙醇浓度有变化影响人血白蛋白的析出时，生产人员才会对乙醇浓度作出调整，但是这种调整是滞后的，不能完全消除对生产的影响，提高了生产成本，但现在没有能实时反映溶液中乙醇浓度的方法，如果进行多次检测来实现实时检测溶液乙醇浓度，这显然是耗时耗力的。因此有必要提出一种可实时检测及控制乙醇浓度的人血白蛋白生产方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种乙醇实时控制的低温乙醇分离人血白蛋白的生产方法，通过实时反映溶液的密度来表示溶液中乙醇的浓度，在人血白蛋白生产方法中实现了乙醇的实时控制，解决了现有技术中乙醇浓度的滞后调整带来生产成本提高的问题。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种乙醇实时控制的低温乙醇分离人血白蛋白的生产方法，包括融浆、组分I制作、组分II+III制作、组分V制作、组分V精制、超滤、稀配、巴氏灭活、蛋白除菌分装及制品孵育，其中，在组分I制作、组分II+III制作、组分V制作和组分V精制的步骤中实时监测溶液中乙醇的浓度，具体生产步骤如下，
融浆，将原料血浆融化，把血浆温度控制在0～4℃之间，离心分离沉淀，去除沉淀后的血浆输送至第一反应罐进行提取分离；
组分I制作，血浆进入第一反应罐后，启动搅拌，滴加缓冲液调节pH值，添加低温乙醇，在第一反应罐内设置密度传感器来监测溶液的密度从而判断乙醇浓度是否符合生产要求，根据密度监测的结果来调整乙醇的添加量，完全添加乙醇后进行离心，离心得组分I沉淀和组分I上清液，组分I沉淀用于制备人纤维蛋白原，组分I上清液进入下一步工序；
组分II+III制作，取组分I上清液至第二反应罐，滴加缓冲液调节组分I上清液的pH值，添加乙醇乙醇，在第二反应罐内设置密度传感器来监测溶液的密度从而判断乙醇浓度是否符合生产要求，根据密度监测的结果来调整乙醇的添加量，然后搅拌和静置，进行压滤，压滤后得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，组分Ⅱ+Ⅲ沉淀用于制备免疫球蛋白，组分Ⅱ+Ⅲ上清液进入下一步工序；
组分IV制作，取组分Ⅱ+Ⅲ上清液至第三反应罐，滴加缓冲液调节组分Ⅱ+Ⅲ上清液的pH值，添加低温乙醇，在第三反应罐内设置密度传感器来监测溶液的密度从而判断乙醇浓度是否符合生产要求，根据密度监测的结果来调整乙醇的添加量，搅拌然后进行静置，进行压滤，压滤后得组分IV沉淀和组分IV上清液；组分IV沉淀废弃，组分IV上清液进入下一步工序；
组分V制作，取组分IV上清液至第四反应罐，滴加缓冲液调节组分IV上清液的pH值，搅拌后进行压滤，压滤后得组分V沉淀和组分V上清液，组分V上清液转移至酒精回收塔回收酒精，组分V沉淀进入下一步的精制工序；
组分V精制，取组分V沉淀至第五反应罐，用5倍注射用水充分溶解，滴加缓冲液调节组分V沉淀溶解液的pH值，添加低温乙醇，在第五反应罐内设置密度传感器来监测溶液的密度从而判断乙醇浓度是否符合生产要求，根据密度监测的结果来调整乙醇的添加量，搅拌后进行压滤，得到组分V纯化液；
超滤，将组分V纯化液浓缩至蛋白含量为15％以上，超滤浓缩结束后，依次氯化钠溶液和氯化钠溶液进行等体积透析，透析结束后，将蛋白浓度浓缩至20％以上，使用NaHCO3调节蛋白液的pH值；
稀配，按20％蛋白浓度进行稀配，分别加入保护剂辛酸钠和氯化钠，补加注射用水至最终稀配量，搅拌均匀；
巴氏灭活，稀配液搅拌均匀后，进行59.5～60.5℃灭活12h，灭活完后，将蛋白液温度降至20～30℃；
蛋白除菌分装及制品孵育，将灭活后的蛋白液用0.2μm的除菌滤芯进行除菌过滤，按要求灌装，将灌装后制品移至30～32℃孵放间孵育14天，孵育完后，进行成品检定。
优选地，所述密度传感器是液体密度传感器DLO-M1。
在其中一个实施例中，在组分I制作的步骤中，添加低于－15℃的50％乙醇至乙醇体积比浓度为8％，根据该乙醇的体积比浓度计算完全添加乙醇后第一反应罐内溶液的密度，如果第一反应罐内的液体浓度低于生产要求，则添加低于－15℃的50％乙醇直至第一反应罐内的液体浓度达到生产要求。
在其中一个实施例中，在组分II+III制作的步骤中，添加低于－15℃的95％乙醇至乙醇体积比浓度为20％，根据该乙醇的体积比浓度计算完全添加乙醇后第二反应罐内溶液的密度，如果第二反应罐内的液体浓度低于生产要求，则添加低于－15℃的95％乙醇直至第二反应罐内的液体浓度达到生产要求。
在其中一个实施例中，在组分IV制作的步骤中，添加低于－15℃的95％乙醇至乙醇体积比浓度为40％，根据该乙醇的体积比浓度计算完全添加乙醇后第三反应罐内溶液的密度，如果第三反应罐内的液体浓度低于生产要求，则添加低于－15℃的95％乙醇直至第三反应罐内的液体浓度达到生产要求。
在其中一个实施例中，在组分V精制的步骤中，添加低于－15℃的25％乙醇至乙醇体积比浓度为10％，根据该乙醇的体积比浓度计算完全添加乙醇后第五反应罐内溶液的密度，如果第五反应罐内的液体浓度低于生产要求，则添加低于－15℃的25％乙醇直至第五反应罐内的液体浓度达到生产要求。
在其中一个实施例中，以流速为1.0～1.2升/分钟的速度添加乙醇。
在其中一个实施例中，添加低于-15℃的乙醇和低于-15℃的纯净水的方式是自动添加，所述密度传感器与PLC控制器电连接，添加低于-15℃的乙醇的装置设置有电磁阀，所述电磁阀与PLC控制器电连接，优选地，PLC控制器是西门子S7-300可编程逻辑控制器；
当密度传感器检测到反应罐内液体浓度低于生产要求时，PLC控制器接收信息，控制电磁阀开启，低于-15℃的乙醇进入反应罐内，反应罐内的液体浓度提高，直至密度传感器检测到反应罐内液体浓度达到生产要求，PLC控制器接收信息，控制电磁阀关闭。
在其中一个实施例中，在组分V精制的步骤中，采用Zeta Plus深层滤芯过滤，该滤芯由著名的滤芯生产商3M公司旗下CUNO公司生产，材质是由木质纤维加无机助滤剂以带正电位树脂固着而成，能够静电吸附带负电的物质于纤维表面，采用该滤芯对内毒素和病毒有一定的脱除能力，而且能够吸附制品中带负电的凝血因子XIIa，降低人血白蛋白制品中的激肽释放酶原激活剂(PKA)含量，为患者安全用药提供了可靠保证。
在其中一个实施例中，在组分II+III制作、组分IV制作、组分V制作和组分V精制的步骤中，压滤时加入硅藻土，进液压力小于或等于0.20Mpa，采用压滤技术替代传统的离心技术进行固液分离，控制进液压力最高不超过0.20Mpa，采用压滤法，其进液速度不需随时调节，出液温度几乎不变，不易导致蛋白变性，而且，压滤过程中使用的助滤剂，如硅藻土等，可以吸附一定的杂质，压滤结束后，还可以通过冲洗滤饼降低沉淀中的杂质，因此，压滤法能显著增加人血白蛋白收率和纯度，提高制品外观质量，分离出来的白蛋白质量稳定，临床使用安全性高，人血白蛋白收率大于29g/L血浆，纯度大于98％。
在其中一个实施例中，在组分II+III制作的步骤中，按每升反应液加入18g硅藻土进行压滤；在组分IV制作的步骤中，按每升反应液加入15g硅藻土进行压滤；在组分V制作的步骤中，按每升反应液加入4g硅藻土进行压滤；在组分V精制的步骤中，按每升反应液加入20g硅藻土进行压滤。
本发明具有以下有益效果：
本发明包括融浆、组分I制作、组分II+III制作、组分V制作、组分V精制、超滤、稀配、巴氏灭活、蛋白除菌分装及制品孵育，其中，在组分I制作、组分II+III制作、组分V制作和组分V精制的步骤中实时监测溶液中乙醇的密度；在正常的生产中，原料的密度是稳定的，乙醇添加量是固定的，因此完全添加乙醇后在反应罐内液体的密度是在一个确定的范围内，通过监测反应罐内的液体的密度来判断完全添加乙醇后反应罐内液体的密度是否在符合要求的范围内，通过液体的密度值来反映乙醇的体积比浓度，简单快捷，减少了检测乙醇浓度的工序，而且在人血白蛋白生产方法中实现了乙醇的实时监测和控制，解决了现有技术中乙醇浓度的滞后调整的问题。
附图说明
图1是本发明的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行详细描述。
值得注意的是，本文所涉及的“上”“下”等方位词均相对于附图视角而定，仅仅只是为了便于描述，不能够理解为对技术方案的限制。
如图1所示，一种乙醇实时控制的低温乙醇分离人血白蛋白的生产方法，包括融浆、组分I制作、组分II+III制作、组分V制作、组分V精制、超滤、稀配、巴氏灭活、蛋白除菌分装及制品孵育，其中，在组分I制作、组分II+III制作、组分V制作和组分V精制的步骤中实时监测溶液中乙醇的浓度，具体生产步骤如下，
融浆，将原料血浆，先用温度低于30℃的75％乙醇喷淋，再用温度低于30℃注射用水冲洗尽酒精并吹干，然后将原料血浆破袋后输送到融浆罐，用30～35℃的水进行夹层循环融浆，血浆融化后，停止水循环，把血浆温度控制在0～4℃之间，离心分离沉淀，去除沉淀后的血浆输送至第一反应罐进行提取分离；
组分I制作，血浆进入第一反应罐后，启动搅拌并控制血浆的温度在0～1℃之间，滴加pH为4.0的缓冲液，控制缓冲液添加的流速小于或等于1.0升/分钟，调节pH值为6.80～7.00，添加低于－15℃的50％乙醇，添加乙醇后第一反应罐内的温度控制在-1～-3℃，在第一反应罐内设置密度传感器，通过密度传感器的数值反映第一反应罐内溶液的密度来判断在组分I制作步骤中完全添加乙醇后第一反应罐内的乙醇浓度是否符合生产要求，如果第一反应罐内的液体浓度低于生产要求，则添加低于－15℃的50％乙醇直至第一反应罐内的液体浓度达到生产要求，如果乙醇浓度符合生产要求，则进行下一工序，如果乙醇浓度不符合生产要求，则反馈乙醇浓度过高或过低的信息，及时调整第一反应罐内乙醇的浓度，完全添加乙醇后进行离心，离心得组分I沉淀和组分I上清液，组分I沉淀用于制备人纤维蛋白原，组分I上清液进入下一步工序；
组分II+III制作，取组分I上清液至第二反应罐，加pH为4.0的缓冲液调节组分I上清液的pH值为6.80～6.85，控制缓冲液添加的流速小于或等于1.0升/分钟，添加低于－15℃的95％乙醇，添加乙醇后第二反应罐内的温度控制在－4～－6℃，在第二反应罐内设置密度传感器，通过密度传感器的数值反映第二反应罐内溶液的密度来判断在本步骤中完全添加乙醇后第二反应罐内的乙醇浓度是否符合生产要求，如果第二反应罐内的液体浓度低于生产要求，则添加低于－15℃的95％乙醇直至第二反应罐内的液体浓度达到生产要求，如果乙醇浓度符合生产要求，则进行下一工序，如果乙醇浓度不符合生产要求，则反馈乙醇浓度过高或过低的信息，及时调整第二反应罐内乙醇的浓度，加完乙醇后，第二反应罐内液体的pH为6.80～7.00，搅拌120分钟以上，然后静置60分钟以上，进行压滤，压滤后得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，组分Ⅱ+Ⅲ沉淀用于制备免疫球蛋白，组分Ⅱ+Ⅲ上清液进入下一步工序；
组分IV制作，取组分Ⅱ+Ⅲ上清液至第三反应罐，加pH为4.0的缓冲液调节组分Ⅱ+Ⅲ上清液的pH值为5.70～5.90，控制缓冲液添加的流速小于或等于1.0升/分钟，第三反应罐内的温度控制在－4～－6℃；添加低于－15℃的95％乙醇，在第三反应罐内设置密度传感器，通过密度传感器的数值反映第三反应罐内溶液的密度来判断在组分IV制作步骤中完全添加乙醇后第三反应罐内的乙醇浓度是否符合生产要求，如果第三反应罐内的液体浓度低于生产要求，则添加低于－15℃的95％乙醇直至第三反应罐内的液体浓度达到生产要求，如果乙醇浓度符合生产要求，则进行下一工序，如果乙醇浓度不符合生产要求，则反馈乙醇浓度过高或过低的信息，及时调整第三反应罐内乙醇的浓度，加完乙醇后，第三反应罐内液体的pH为5.90～6.10，搅拌120分钟以上，然后静置60分钟以上，进行压滤，压滤后得组分IV沉淀和组分IV上清液；组分IV沉淀废弃，组分IV上清液进入下一步工序；
组分V制作，取组分IV上清液至第四反应罐，加pH为4.0的缓冲液调节组分IV上清液的pH值为4.80～5.00，控制缓冲液添加的流速小于或等于1.0升/分钟，第四反应罐内的温度控制在－8℃以下，搅拌120分钟以上，进行压滤，压滤后得组分V沉淀和组分V上清液，组分V上清液转移至酒精回收塔回收酒精，组分V沉淀进入下一步的精制工序，其中，1kg组分V沉淀相当于1L含30％乙醇沉淀溶解液；
组分V精制，取组分V沉淀至第五反应罐，用5倍注射用水充分溶解，加pH为4.0的缓冲液调节组分V沉淀溶解液的pH值为4.50～4.60，控制缓冲液添加的流速小于或等于1.0升/分钟，添加低于－15℃的25％乙醇，在第五反应罐内设置密度传感器，通过密度传感器的数值反映第五反应罐内溶液的密度来判断在组分V精制步骤中完全添加乙醇后第五反应罐内的乙醇浓度是否符合生产要求，如果第五反应罐内的液体浓度低于生产要求，则添加低于－15℃的25％乙醇直至第五反应罐内的液体浓度达到生产要求，如果乙醇浓度符合生产要求，则进行下一工序，如果乙醇浓度不符合生产要求，则反馈乙醇浓度过高或过低的信息，及时调整第五反应罐内乙醇的浓度；添加乙醇后第五反应罐内的温度温度控制在－2～－3℃，搅拌120分钟以上，进行压滤，得到组分V纯化液；
超滤，将组分V纯化液浓缩至蛋白含量为15％以上，超滤浓缩结束后，依次用4倍体积的2～8℃的0.85％氯化钠溶液和5倍体积的2～8℃的0.5％氯化钠溶液进行等体积透析，透析结束后，将蛋白浓度浓缩至20％以上，使用1mol/L NaHCO3调节蛋白液的pH值至6.90～7.10；
稀配，按20％蛋白浓度进行稀配，分别加入保护剂辛酸钠至0.16mmol/g蛋白浓度和氯化钠至最终原液145mmol/L，补加注射用水至最终稀配量，搅拌均匀；
巴氏灭活，稀配液搅拌均匀后，使用60.5℃的夹套循环水升温，当蛋白液温度升至59.5℃时，开始计时，进行59.5～60.5℃灭活12h，灭活完后，将蛋白液温度降至20～30℃；
蛋白除菌分装及制品孵育，将灭活后的蛋白液用0.2μm的除菌滤芯进行除菌过滤，按要求灌装，将灌装后制品移至30～32℃孵放间孵育14天，孵育完后，进行成品检定。
优选地，所述密度传感器是液体密度传感器DLO-M1。
在本实施例中，在组分I制作的步骤中，以流速为1.0～1.2升/分钟的速度添加低于－15℃的50％乙醇至乙醇体积比浓度为8％，根据该乙醇的体积比浓度计算完全添加乙醇后第一反应罐内溶液的密度。
在本实施例中，在组分II+III制作的步骤中，以流速为1.0～1.2升/分钟的速度添加低于－15℃的95％乙醇至乙醇体积比浓度为20％，根据该乙醇的体积比浓度计算完全添加乙醇后第二反应罐内溶液的密度。
在本实施例中，在组分IV制作的步骤中，以流速为1.0～1.2升/分钟的速度添加低于－15℃的95％乙醇至乙醇体积比浓度为40％，根据该乙醇的体积比浓度计算完全添加乙醇后第三反应罐内溶液的密度。
在本实施例中，在组分V精制的步骤中，以流速为1.0～1.2升/分的速度添加低于－15℃的25％乙醇至乙醇体积比浓度为10％，根据该乙醇的体积比浓度计算完全添加乙醇后第五反应罐内溶液的密度。
在本实施例中，添加低于-15℃的乙醇和低于-15℃的纯净水的方式是自动添加，所述密度传感器与PLC控制器电连接，添加低于-15℃的乙醇的装置设置有电磁阀，所述电磁阀均与PLC控制器电连接，优选地，PLC控制器是西门子S7-300可编程逻辑控制器；
当密度传感器检测到反应罐内液体浓度低于生产要求时，PLC控制器接收信息，控制电磁阀开启，低于-15℃的乙醇进入反应罐内，反应罐内的液体浓度提高，直至密度传感器检测到反应罐内液体浓度达到生产要求，PLC控制器接收信息，控制电磁阀关闭。
在本实施例中，在组分V精制的步骤中，采用Zeta Plus深层滤芯过滤，该滤芯由著名的滤芯生产商3M公司旗下CUNO公司生产，材质是由木质纤维加无机助滤剂以带正电位树脂固着而成，能够静电吸附带负电的物质于纤维表面，采用该滤芯对内毒素和病毒有一定的脱除能力，而且能够吸附制品中带负电的凝血因子XIIa，降低人血白蛋白制品中的激肽释放酶原激活剂(PKA)含量，为患者安全用药提供了可靠保证。
在本实施例中，在组分II+III制作、组分IV制作、组分V制作和组分V精制的步骤中，压滤时加入硅藻土，进液压力小于或等于0.20Mpa。
在本实施例中，在组分II+III制作的步骤中，按每升反应液加入18g硅藻土进行压滤；在组分IV制作的步骤中，按每升反应液加入15g硅藻土进行压滤；在组分V制作的步骤中，按每升反应液加入4g硅藻土进行压滤；在组分V精制的步骤中，按每升反应液加入20g硅藻土进行压滤。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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