具体实施方式

以下，对本发明的动物用的口腔用组合物进行详细说明。本申请中，“乳香树汁”是指从漆树科的黄连木属乳香黄连木(Pistacia lentiscus)采集的树汁，如背景技术中所述，其主要成分为乳香二烯酮酸、异乳香二烯酮酸、三萜类、醛类、醇类、聚β-月桂烯等。“乳香树脂”是指将乳香树汁自然干燥并凝固而成的物质。“乳香精油”是指通过水蒸气蒸馏法或干馏将乳香树汁或乳香树脂中的挥发性成分(主要为萜类)精油化而成的物质。此外，除非另有说明，则“％”均为重量百分比。

首先，对乳香树脂进行说明。在本发明的动物用的口腔用组合物中，乳香树脂为对牙周病相关细菌(特别是Porphyromonas gulae)显示抗菌作用的重要的构成要素。如上所述，乳香树脂使用对乳香树汁进行自然干燥而成的物质。并且，自然干燥的时间只要为1天以上，则没有特别限定。

另外，该组合物中，将乳香树脂溶解于溶剂中而进行使用。由于乳香树脂本身不溶于水，且研究了该组合物采用凝胶或液体等各种剂型时与各种添加剂的相容性，因此使乳香树脂溶解于溶剂。

作为用于溶解乳香树脂的溶剂，能够使用乙醇、甘油、二丙二醇、1,3-丁二醇、三甘油脂肪酸酯(源自脂肪酸的部分的碳原子数为8～18左右，其中碳原子数最好为8～12)三(辛酸/癸酸)甘油酯、脂肪酸单甘油酯(源自脂肪酸的部分的碳原子数为8～18左右，其中碳原子数最好为8～12)、单癸酸甘油酯、脂肪酸酯(源自脂肪酸的部分的碳原子数为8～18左右，其中碳原子数最好为8～12)、肉豆蔻酸异丙酯、异辛酸乙酯、辛基十二醇肉豆蔻酸酯、高级醇(碳原子数为8～22左右)、油醇、山梨糖醇酐脂肪酸酯(源自脂肪酸的部分的碳原子数为8～18左右，其中碳原子数最好为8～12)、蔗糖脂肪酸酯(源自脂肪酸的部分的碳原子数为8～18左右，其中碳原子数最好为8～12)等溶剂。

另外，当将乳香树脂用于本发明的动物用的口腔用组合物时，使其相对于溶剂为均相体系溶液即可。以下，将该均相体系溶液记作“乳香树脂液”。乳香树脂液的浓度最好为5～60％。并且，若该浓度为5％以下，则无法获得对Porphyromonas gulae的抗菌效果，若该浓度为60％以上，则会成为非均相体系溶液，且尽管杀菌效果的减弱不比浓度为5％以下时多，但对Porphyromonas gulae的杀菌效果也会减弱。

关于乳香树脂液的制备方法，只要遵守上述浓度，则通过常规方法进行即可。并且，关于乳香树脂的溶解温度，只要考虑到溶剂的沸点等，则可适当提高温度，也可以视情况为常温。另外，最好将乳香树脂溶解于溶剂后进行过滤，制成乳香树脂液而进行使用。

另外，相对于本发明的动物用的口腔用组合物的总量，乳香树脂液的含量最好为0.1～50％。并且，换算为乳香树脂本身时，若乳香树脂液的含量为0.1％以下，则对Porphyromonas gulae的杀菌效果减弱或不显示其杀菌效果。此外，若乳香树脂液的含量为50％以上，则即使对Porphyromonas gulae的杀菌效果充分，也会存在宠物的患部周围的组织等引发某种炎症或过敏反应的担忧，且视情况还会存在对Porphyromonas gulae的杀菌效果较之该浓度范围内的杀菌效果发生减弱的可能性。

接着，对乳香精油进行说明。并且，如上所述，乳香精油使用通过水蒸气蒸馏或干馏而将乳香树汁或树脂中的挥发性成分(主要为萜类)精油化而成的物质即可。另外，精油化通过常规方法进行即可。

相对于本发明的动物用的口腔用组合物的总量，乳香精油的含量最好为0.01～1.0％。若乳香精油的含量为1.0％以上，则与乳香树脂液的情况相同，会存在宠物的患部周围的组织等引发某种炎症或过敏反应的担忧，且视情况还会存在对Porphyromonas gulae的杀菌效果减弱的可能性。并且，即使本发明的动物用的口腔用组合物中不含有乳香精油，即仅为乳香树脂时，也对Porphyromonas gulae显示杀菌效果，但若含有乳香精油则可获得更良好的杀菌效果。此外，通过添加乳香精油而发挥预防口臭的作用。另外，这是由于乳香精油的含量为0.01％以下时，不显示预防口臭的效果。

并且，本发明的动物用的口腔用组合物通过进一步含有粒度分布的众数为1.0μm以下的乳酸菌作为有效成分而成立。此处所述的“粒度分布的众数”为表示细菌大小(菌体长度)的指标的值，是指测定菌体的粒径(菌体长度)时，粒度分布中的相对频率最大的粒径。换言之，记作“众数为1.0μm以下”时，是指菌体的长度为0.1～5μm的范围的细菌。并且，菌体的长度可通过电子显微镜等公知技术进行测定。若众数为1.0μm以上，则虽然对Porphyromonas gulae显示灭活效果，但对该细菌类的纳入数量急剧减少，因此最好制成1.0μm以下而进行使用。另外，本发明中使用的乳酸菌使用公知技术(例如参考国际专利公开第2009/157073号)进行制备即可。

关于本发明的动物用的口腔用组合物中使用的乳酸菌，可列举出短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、短乳杆菌凝聚亚种(L.brevis subspecies coagulans)、嗜酸乳杆菌(L.acidphilus)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、马里乳杆菌(L.mali)、植物乳杆菌(L.plantarum)、布氏乳杆菌(L.buchneri)、干酪乳杆菌(L.casei)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、镓乳杆菌(L.gallinarum)、噬淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、开菲尔乳杆菌(L.kefir)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)等乳酸菌属细菌类；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)等乳球菌属细菌类；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)等肠球菌属细菌类；两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、短双歧杆菌(B.breve)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)等双歧杆菌属细菌等。其中，优选乳酸菌属细菌类，其中，作为菌株，优选短乳杆菌(L.brevis)的菌株FERM BP-4693。另外，该乳酸菌优选使用死菌。这是由于制备成本发明中使用的乳酸菌时，其制备容易，且即使为死菌也可发挥充分的所需的杀菌效果。

此外，本发明的动物用的口腔用组合物中，相对于该动物用的口腔用组合物的总量，优选含有0.01～1.0％的所述乳酸菌。若小于0.01％，则乳酸菌无法发挥使Porphyromonas gulae灭活的效果。此外，若为1.0％以上，则会影响所述细菌类的纳入数量。

此外，本发明的动物用的口腔用组合物的剂型可从牙膏、凝胶、液体牙膏、粉末牙膏、漱口水、膜剂、口香糖、宠物食品用添加物或意式面食(pasta)中选择。

此外，以与本发明的动物用的口腔用组合物相同的掺合条件，能够进一步制成动物用的牙周病预防剂及动物用的口臭预防剂。

关于本发明的动物用的口腔用组合物及使用了该组合物的动物用的牙周病预防剂以及动物用的口臭预防剂，可以以上述方式实施，但也可含有各种添加剂。以下，对该添加剂进行说明。

作为该添加剂的一个例子，通过进一步掺合木瓜提取物和/或壳聚糖从而制成本发明的动物用的口腔用组合物。这些物质与上述乳酸菌显示协同效应。

木瓜提取物为来自天然木瓜果实的提取物，为将天然木瓜的果实磨碎并用乙醇等溶剂浸渍而提取的提取物，木瓜的果实可以为成熟的木瓜，也可以为青色状态的未完全成熟的木瓜。该木瓜提取物发挥作为润湿剂的作用，能够保持口腔内的湿润，且特别是未完全成熟的木瓜富含木瓜蛋白酶。该木瓜蛋白酶易于去除牙齿表面上或存在于牙与牙龈之间的牙垢，可更有效地发挥利用乳酸菌使Porphyromonas gulae灭活的效果。该木瓜提取物的掺合量没有特别限定，相对于本发明的口腔用组合物的总量，最好为0.005％～10％。若小于0.005％，则无法发挥上述效果，若超过10％，则乳酸菌对Porphyromonas gulae的效果可能会减弱。

与此不同，壳聚糖通过对由蟹或虾等甲壳类的外骨骼得到的壳多糖进行强碱等的煮沸处理等而得到。由于其为多糖类，因此有时也被用作粘结剂，但也具有抗菌剂的效果及显示牙齿表面的涂层作用的效果。此外，能够使上述乳酸菌或木瓜蛋白酶更长时间地保留在牙齿表面上。由此，可进一步发挥使Porphyromonas gulae灭活的效果。该木瓜提取物的掺合量没有特别限定，但相对于本发明的口腔用组合物的总量，最好为0.005％～10％。若小于0.005％，则无法发挥上述效果，若超过10％，则乳酸菌对Porphyromonas gulae的效果可能会减弱。

进一步，也可同时掺合壳聚糖及木瓜提取物。由此，壳聚糖能够延长木瓜蛋白酶与乳酸菌滞留在牙齿表面或牙与牙龈之间的时间，结合壳聚糖所带来的杀菌效果，可进一步发挥使Porphyromonas gulae灭活的效果。此时的掺合量也没有特别限定，最好壳聚糖及木瓜提取物分别为0.005％～10％。若小于0.005％，则无法发挥上述效果，若超过10％，则乳酸菌对Porphyromonas gulae的效果可能会减弱。

作为研磨剂，可列举出硅胶、沉淀二氧化硅、加成性二氧化硅、水合硅酸、二氧化硅、沸石、铝硅酸盐、锆硅酸盐等二氧化硅类研磨剂、结晶纤维素、二水磷酸氢钙、无水磷酸氢钙、焦磷酸钙、磷酸镁、磷酸钙、氢氧化铝、氧化铝、轻质碳酸钙、重质碳酸钙、碳酸镁、硅酸锆、合成树脂研磨剂等。能够使用其中的一种或同时使用两种以上。这些研磨剂的掺合量相对于本发明的口腔用组合物总量通常为0～60％。

作为润湿剂，可列举出甘油、浓甘油、双甘油、山梨糖醇、麦芽糖醇、二丙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、木糖醇、聚乙二醇等多元醇，能够使用其中的一种或两种以上。另外，这些润湿剂也可用作溶解乳香树脂的溶剂。

作为粘结剂(增粘剂)，可列举出卡拉胶类、海藻酸、海藻酸钠、海藻酸丙二醇酯、含钙海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、海藻酸铵等海藻酸及其衍生物、黄原胶、瓜尔胶、明胶、琼脂、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙烯酸钠、普多兰等，能够使用其中的一种或同时使用两种以上。另外，增粘剂也兼作为胶凝(gel)剂。

作为发泡剂，可列举出月桂基硫酸钠、月桂酰肌氨酸钠、琥珀酸烷基酯磺酸钠、椰子油脂肪酸单甘油磺酸钠、α-烯烃磺酸钠、N-酰基谷氨酸盐等N-酰基氨基酸盐、2-烷基-N-羧甲基-N-羟乙基咪唑啉甜菜碱、麦芽糖醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、脂肪酸二乙醇酰胺、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯等，可使用其中的一种或同时使用两种以上。

作为pH(氢离子浓度)调节剂，可列举出柠檬酸、柠檬酸(一或二)钠、苹果酸、苹果酸(一或二)钠、葡糖酸、葡糖酸(一或二)钠、琥珀酸、琥珀酸钠、乳酸、乳酸(一或二)钠、碳酸钾、碳酸氢钠等，可使用其中的一种或同时使用两种以上。

作为用于使本发明的动物用的口腔用组合物的有效成分滞留(保持)的滞留剂，能够使用液体石蜡、作为液体石蜡与聚乙烯的混合物的凝胶化烃、植物油、蜂蜡等，可使用其中的一种或同时使用两种以上。另外，所述凝胶化烃也兼作为胶凝剂。

作为甜味剂，有糖精钠、阿斯巴甜、海藻糖、甜菊糖苷、甜叶菊提取物、对甲氧基肉桂醛、新橙皮苷二氢查尔酮(neohesperidin dihydrochalcone)、紫苏糖、木糖醇等。

作为防腐剂，有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等对羟基苯甲酸酯类、苯甲酸钠、苯氧乙醇、盐酸烷基二氨基乙基甘氨酸等。

作为香料成分，能够使用L-薄荷醇、茴香脑、薄荷酮、桉树脑、柠檬烯、香芹酮、水杨酸甲酯、丁酸乙酯、丁子香酚、百里酚、肉桂醛、反式-2-己烯醛等中的一种或同时使用两种以上。这些成分可以单品掺合，也可使用含有这些成分的精油等。

并且，上述的润湿剂、粘结剂、发泡剂、滞留剂、甜味剂、防腐剂、香料成分等各成分的掺合量没有特别限定，相对于动物用的口腔用组合物的总量，通常为0.001～20％的范围。

此外，除上述香料成分以外，也可在不阻碍本发明的效果的范围内掺合脂肪族醇及其酯、萜类烃或萜类醇、酚醚、醛、酮、内酯等的香料成分、精油。相对于本发明的动物用的口腔用组合物的总量，上述香料的掺合量通常为0.001～20％的范围。

除上述以外，本发明的动物用的口腔用组合物中也可进一步掺合有效成分。作为这种有效成分，可列举出氯化溶菌酶、氟化钠、氟化钾、单氟磷酸钠、硝酸钾、聚磷酸钠、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、桧木醇(hinokitiol)、抗坏血酸(维生素C)、抗坏血酸盐类、氯己定盐类、氯化十六烷吡啶、苯扎氯铵、苄索氯铵、红没药醇、三氯生、3-甲基-4-异丙基苯酚、生育酚、生育酚乙酸酯、ε-氨基己酸、氨甲环酸、羟基尿囊素铝、乳酸铝、二氢胆固醇、甘草次酸、甘草酸盐类、叶绿素铜盐、氯化钠、愈创木薁磺酸盐、葡聚糖酶、吡哆醇盐酸盐、药用羟基磷灰石等，能够掺合其中的一种或两种以上。相对于本发明的口腔用组合物的总量，该有效成分通常为0.001～20％的范围。

并且，相对于本发明的动物用的口腔用组合物的总量，以上述数值范围混合上述乳香树脂(其中，制成乳香树脂液)、乳香精油、乳酸菌、添加物等时，可将其剩余部分设定为溶剂(例如溶解乳香树脂的溶剂等)或胶凝剂等。此外，关于添加剂，通过与本发明的动物用的口腔用组合物相同的掺合，也可适用于动物用的牙周病预防剂或口臭预防剂。

本发明的动物用的口腔用组合物能够根据常规方法而制备，其制备方法没有特别限定。

此外，针对本发明的动物用的口腔用组合物，已经对以Porphyromonas gulae为对象时的各种方式进行了说明，但是认为本发明的动物用的口腔用组合物对存在于除人以外的哺乳动物的牙周病细菌，例如唾液卟啉单胞菌(Porphyromonas salivosa)、Odoribacterdenticanis、巴斯德菌类等也显示效果。

此外，关于本发明的动物用的口腔用组合物，对以除人以外的动物、即狗或猫为对象的实施方式进行了说明，但也可将其使用于其他的作为宠物而玩赏的兔子、仓鼠、豚鼠等。

以上，叙述了本发明的动物用的口腔用组合物的实施方式，但本发明并不限于上述方式，只要在不脱离权利要求书及本说明书的记载事项的范围内，当然也可采用各种方式。

实施例

为了支持本发明的口腔用组合物的上述实施方式，进一步对实施例进行说明。此处所述的实施例中，研究作为本发明的动物用的口腔用组合物的构成要素的乳香树脂、乳香精油、及粒度分布的众数为1.0μm以下的乳酸菌(以下，在本实施例中记作“纳米型乳酸菌”)对牙周病细菌(本实施例中为Porphyromonas gulae；以下，本实施例中有时称作“P.gulae”)的作用效果。

[制备例1]乳香树脂液及乳香精油的制备

首先，从产自希腊希俄斯岛的漆树科黄连木属乳香黄连木(Pistacia lentiscus)采集树汁(以下记作“乳香树汁”)，使其自然干燥1天。干燥后，通过水蒸气蒸馏分离挥发性成分与树脂状物质，将其中的树脂状物质作为本申请实施例中使用的“乳香树脂”。另一方面，对于所述挥发性成分，通过水蒸气蒸馏进行分离后，进一步进行精油化而制成本实施例中使用的“乳香精油”。另外，精油化遵照常规方法进行。

接着，对于乳香树脂，以三(辛酸/癸酸)甘油酯为溶剂，制成30％浓度的溶液。将所得到的溶液作为本实施例中使用的“乳香树脂液”。

[制备例2]纳米型乳酸菌的制备

根据国际专利公开第2009/157073号，制备本实施例中使用的纳米型乳酸菌。

首先，作为所述乳酸菌，使用作为植物性乳酸菌的短乳杆菌(菌株FERM BP-4693；以下，有时仅记作“短杆菌”)，使用添加了5％葡萄糖的公知的营养培养基，并使用20％氢氧化钠水溶液边将培养时的pH(氢离子浓度)调节成6.5，边于36.5℃培养所述短杆菌，在将葡糖(葡萄糖)完全消耗完的时间点终止培养。

终止培养后，将该培养液于80℃加热处理10分钟，用PBS(磷酸缓冲液)洗涤菌体，添加相对于菌体以重量换算计为4倍量的糊精作为赋形剂，用混合器分散后进行冻结干燥从而制备试样，以使菌体浓度为10mg/mL的方式将其再次混悬于PBS中。另外，将加工工序时的pH保持在6.5的短杆菌作为本实施例中使用的纳米型乳酸菌(短杆菌)。进一步对纳米型乳酸菌进行加热处理而制成死菌。

并且，测定所制备的纳米型乳酸菌的粒径，其结果，所有菌体的粒径为0.7～1.0μm以下，粒度分布的众数为1.0μm以下。另外，粒径测定遵照常规方法进行。

[制备例3]乳香树脂液、乳香精油及纳米型乳酸菌各自的稀释液的制备

进一步，针对本实施例中使用的乳香树脂液、乳香精油及纳米型乳酸菌，以三(辛酸/癸酸)甘油酯为溶剂而分别进行稀释。具体而言，将乳香树脂液稀释成10倍，将乳香精油及纳米型乳酸菌分别稀释成1000倍。以下，本实施例中分别记作“乳香树脂稀释液”、“乳香精油稀释液”、“纳米型乳酸菌稀释液”。另外，用于稀释的试管等使用已灭菌的试管等。此外，各稀释液在临用前制备。

[制备例4]用于抗牙周病细菌效果试验的试验液的制备

作为本实施例的用于抗牙周病细菌效果试验的试验液(有时仅记作“试验液”)的典型例，以后述的实施例8的试验液为例进行说明。实施例8中，设为“乳香树脂液3.00％、乳香精油0.03％、纳米型乳酸菌0.01％”(参考表2)，此时，向已灭菌的1根试管中添加制备例3中分别制备的乳香树脂稀释液2.7mL、乳香精油稀释液2.7mL及纳米型乳酸菌稀释液1.0mL以及三(辛酸/癸酸)甘油酯2.6mL，将总量设为9mL。并且，混合顺序没有特别要求。

并且，在后述的各实施例(参考表1～4)中，只要遵守总量为9mL这一点，则各稀释液及三(辛酸/癸酸)甘油酯的量可根据乳香树脂液、乳香精油及纳米型乳酸菌的各浓度而适当变更。

此外，对照试验(比较例；参考表1～4)中的试验液仅为三(辛酸/癸酸)甘油酯，并未混合乳香树脂液、乳香精油及纳米型乳酸菌。另外，详细内容在后文中进行说明。

另外，各实施例及比较例的试验液也在临用前制备。

[制备例5]牙周病(P.gulae)菌液的制备

作为后述的试验例1中使用的牙周病细菌，选择作为狗的牙周病病原菌的P.gulae，作为其菌株，使用JCM13865^T。

并且，用血液琼脂培养基将该菌株于37℃厌氧培养5天。培养后，用铂金接种环取适量的生长的菌落，混悬于已灭菌的生理盐水及麦氏浊度标准溶液(编号NO.1)中。将该混悬液作为本实施例中使用的“牙周病(P.gulae)菌液”。另外，该牙周病(P.gulae)菌液中的细菌数量约为1～3×10⁸CFU/mL。并且，牙周病(P.gulae)菌液在临用前制备。

[试验例1]抗牙周病细菌效果试验之一

使用制备例3中制备的各实施例及各比较例的用于抗牙周病细菌效果试验的试验液与制备例5中制备的牙周病(P.gulae)菌液而进行试验。

首先，对各实施例的试验液进行说明。“实施例1～4”中，将乳香树脂液固定为10.0％，并分别改变乳香精油(浓度固定为0.03％)及纳米型乳酸菌(浓度固定为0.01％)的变种(variation)。“实施例5～8”中，将乳香树脂液固定为3.0％，并分别改变乳香精油(浓度固定为0.03％)及纳米型乳酸菌(浓度固定为0.01％)的变种。“实施例9～12”中，将乳香树脂液固定为1.0％，并分别改变乳香精油(浓度固定为0.03％)及纳米型乳酸菌(浓度固定为0.01％)的变种。“实施例13～16”中，将乳香树脂液固定为0.5％，并分别改变乳香精油(浓度固定为0.03％)及纳米型乳酸菌(浓度固定为0.01％)的变种。另外，关于各实施例的试验液的制备，通过上述制备例3所示的方法在临用前制备。

接着，对各比较例进行说明。将“比较例1”作为实施例1及2的对照实验、“比较例2”作为实施例3及4的对照实验、“比较例3”作为实施例5及6的对照实验、“比较例4”作为实施例7的对照实验、“比较例5”作为实施例8的对照实验、“比较例6”作为实施例9的对照实验、“比较例7”作为实施例10的对照实验、“比较例8”作为实施例11及12的对照实验、“比较例9”作为实施例13及14的对照实验、“比较例10”作为实施例15及16的对照实验而分别进行试验。

接着，对抗牙周病细菌效果试验进行说明。简而言之，将向各实施例的9mL试验液中添加1mL牙周病(P.gulae)菌液的时间点记作作用时间为0分钟，随时间变化而对P.gulae的细菌数量进行计数。下面进行具体说明。

首先，向实施例1～16的9mL试验液中分别添加1mL牙周病(P.gulae)菌液，并在该时间点(记作作用时间为0分钟)用移液枪吸取1mL混合溶液。针对吸取的混合溶液，向其添加9mL已灭菌的生理盐水并进行搅拌，重复该操作，由此进行10倍梯度稀释。分别吸取0.1mL认为处于适当的稀释梯度的溶液，分别涂抹于2块血液琼脂培养基。在该涂抹后，以37℃、5天的条件对各培养基进行厌氧培养，之后对各培养基的菌落数进行计数，并对各实施例的作用时间为0分钟时的P.gulae的细菌数量进行计数。

分别对在相同的条件下，使实施例1～16的试验液与牙周病(P.gulae)菌液作用5分钟后、10分钟后、15分钟后及30分钟后的P.gulae的细菌数量进行计数。其中，由于某些原因，未对实施例7的作用时间为5分钟后、实施例9的作用5分钟后、实施例11的作用30分钟后(参考后述的表2及3)进行测定。

在上述细菌数量计数后，关于实施例5～8，再次分别对在相同的条件下，使试验液与牙周病(P.gulae)菌液作用0分钟、5分钟后、10分钟后、15分钟后及30分钟后的P.gulae的细菌数量(第二次)进行计数。并且，上述细菌数量计数后，对于实施例1～4，分别对在相同的条件下，使试验液与牙周病(P.gulae)菌液作用0分钟、1分钟后、3分钟后、5分钟后的P.gulae的细菌数量进行第二次的计数。另外，关于实施例9～16，未对P.gulae的细菌数量进行再次计数(参考后述的表3及4)。

接着，关于比较例1～10，未混合乳香树脂液、乳香精油及纳米型乳酸菌，仅向9mL三(辛酸/癸酸)甘油酯中添加1mL牙周病(P.gulae)菌液，并将该时间点记作作用时间为0分钟，以与各实施例相同的稀释条件、培养基条件、作用时间，对P.gulae的细菌数量进行计数。

并且，接着将实施例1～16及比较例1～10的P.gulae的细菌数量的变化示于表1～表4。

[表1]

表1乳香树脂液(10％)及乳香精油和/或纳米型乳酸菌试验液

对P.gulae的杀菌效果

％为重量百分比

首先，对表1进行说明。表1为实施例1～4，即将乳香树脂液固定为10％、并分别改变乳香精油及纳米型乳酸菌的变种时的P.gulae的细菌数量的计数结果。另外，对于细菌数量，为了明确细菌数量的位数，转换为常用对数。

比较例1中，随着时间的流逝，细菌数量减少了一位数或几乎恒定，即几乎没有观察到数量的变化，与之相比，仅为10％乳香树脂液的实施例1及使用了10％乳香树脂液及0.03％乳香精油的实施例2中，在作用的瞬间，位数减少了4位左右(在试验液及牙周病(P.gulae)菌液进行作用前为log[CFU/mL]＝8左右)，5分钟后达到了计数范围极限(log[CFU/mL]＜3.5)以下。并且，实施例1及2中再次测定细菌数量，其结果可知，在作用时间为3分钟时成为计数范围极限(参考表1的“第二次”)。

接着，与比较例1相同，比较例2中的细菌数量也减少了一位数或几乎恒定，即几乎没有观察到数量的变化，与之相比，使用了10％乳香树脂液及0.01％纳米型乳酸菌的实施例3以及使用了10％乳香树脂液、0.03％乳香精油及0.01％纳米型乳酸菌的实施例4中，在初次测定中，在作用时间为5～10分钟时成为计数范围极限(log[CFU/mL]＜3.5)以下。并且，实施例3及4中再次测定了细菌数量，其结果可知，与实施例1及2的情况不同，在作用时间为5分钟时细菌数量逐渐减少(参考表1的“第二次”)。

由此可知，实施例1～4、即将乳香树脂液设为10％时，无论是其自身单独，还是与乳香精油和/或纳米型乳酸菌混合时，P.gulae的细菌数量均有减少的倾向，30分钟后确实地成为了计数范围极限(log[CFU/mL]＜3.5)以下。

[表2]

表2乳香树脂液(3.0％)及乳香精油和/或纳米型乳酸菌试验液

对P.gulae的杀菌效果

％为重量百分比

N.M.＝未测定

接着对表2进行说明。表2为实施例5～8，即将乳香树脂液固定为3.0％、并分别改变乳香精油及纳米型乳酸菌的变种时的P.gulae的细菌数量的计数结果。另外，对于细菌数量，与表1相同，为了明确细菌数量的位数，转换为常用对数。

比较例3中，随着时间的流逝，细菌数量减少了一位数或几乎恒定，即几乎没有观察到数量的变化，与之相比，仅为3.0％乳香树脂液的实施例5以及使用了3.0％乳香树脂液及0.03％乳香精油的实施例6中，在作用的瞬间，位数减少了2.5位左右(在试验液及牙周病(P.gulae)菌液进行作用前为log[CFU/mL]＝8左右)，10分钟后成为计数范围极限(log[CFU/mL]＜3.5)以下。并且，实施例3及4中再次测定(第二次的)细菌数量，其结果可知，在作用时间为15分钟时几乎成为计数范围极限以下，30分钟后实施例3及4均成为计数范围极限以下(参考表2的“第二次”)。

接着，与其他的比较例相同，比较例3及4中的细菌数量也减少了一位数或几乎恒定，即几乎没有观察到数量的变化，与之相比，使用了3.0％乳香树脂液及0.01％纳米型乳酸菌的实施例7以及使用了3.0％乳香树脂液、0.03％乳香精油及0.01％纳米型乳酸菌的实施例8中，在初次测定中，在作用时间为30分钟时几乎成为计数范围极限(log[CFU/mL]＜3.5)以下。然而，与实施例5及6的情况不同，根据实施例7及8再次测定细菌数量的结果可知，在作用时间为10分钟后逐渐成为计数范围极限(log[CFU/mL]＜3.5)以下(参考表2的“第二次”)。

由此可知，实施例5～8、即将乳香树脂液设为3.0％时，无论是其自身单独，还是与乳香精油和/或纳米型乳酸菌混合时，P.gulae的细菌数量均有减少的倾向，其中，如实施例8所示，与实施例5～7相比，为乳香树脂溶液、乳香精油及纳米型乳酸菌时，在10分钟后确实地成为了计数范围极限(log[CFU/mL]＜3.5)以下。

[表3]

表3乳香树脂液(1.0％)及乳香精油和/或纳米型乳酸菌试验液

对P.gulae的杀菌效果

％为重量百分比

N.M.＝未测定

接着对表3进行说明。表3为实施例9～12，即将乳香树脂液固定为1.0％、并分别改变乳香精油及纳米型乳酸菌的变种时的P.gulae的细菌数量的计数结果。另外，对于细菌数量，与表1及表2相同，为了明确细菌数量的位数，转换为常用对数。

比较例6及7中，随着时间的流逝，细菌数量减少了一位数或几乎恒定，即几乎没有观察到数量的变化，与之相比，仅为1.0％乳香树脂液的实施例9以及使用了1.0％乳香树脂液及0.03％乳香精油的实施例10中，细菌数量也几乎恒定，或者即使减少也为log[CFU/mL]＞5.5。

接着，与其他比较例相同，比较例8中的细菌数量也减少了一位数或几乎恒定，即几乎没有观察到数量的变化，与之相比，使用了1.0％乳香树脂液及0.01％纳米型乳酸菌的实施例11以及使用了1.0％乳香树脂液、0.03％乳香精油及0.01％纳米型乳酸菌的实施例12与实施例9及10相比，细菌数量稍稍减少。

由此可知，实施例9～12、即将乳香树脂液设为1.0％时，与仅为乳香树脂液及乳香精油的情况相比，进一步添加了纳米型乳酸菌时的P.gulae的细菌数量有少许减少的倾向。但是可知，与乳香树脂液的浓度比较浓的实施例1～8不同，该细菌数量的减少缓慢或几乎恒定。

[表4]

表4乳香树脂液(0.5％)及乳香精油和/或纳米型乳酸菌试验液

对P.gulae的杀菌效果

％为重量百分比

接着对表4进行说明。表4为实施例13～16，即将乳香树脂液固定为0.5％、并分别改变乳香精油及纳米型乳酸菌的变种时的P.gulae的细菌数量的计数结果。另外，对于细菌数量，与表1、表2及表3相同，为了明确细菌数量的位数，转换为常用对数。

比较例9及10中，随着时间的流逝，细菌数量减少了一位数或几乎恒定，即几乎没有观察到数量的变化，与之相比，仅为0.5％乳香树脂液的实施例13以及使用了0.5％乳香树脂液及0.03％乳香精油的实施例14也与比较例9及10相同，仅观察到了P.gulae的细菌数量的少许减少。此外，使用了0.5％乳香树脂液及0.01％纳米型乳酸菌的实施例15以及使用了0.5％乳香树脂液、0.03％乳香精油及0.01％纳米型乳酸菌的实施例16的结果也与实施例13及实施例14几乎相同。

由此可知，实施例13～16、即将乳香树脂液设为0.5％时，与仅为乳香树脂液及乳香精油的情况相比，进一步添加了纳米型乳酸菌时的P.gulae的细菌数量有减少少许的倾向。但是可知，与乳香树脂液的浓度比较浓的实施例1～8不同，该细菌数量的减少缓慢或几乎恒定。

综上所述，本试验例1仅以P.gulae为对象，关于是否对其他的狗或猫所特有的牙周病细菌(例如唾液卟啉单胞菌(Porphyromonas salivosa)、猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)等)显示抗菌(杀菌)性尚有研究的余地，且关于详细的条件(例如以体内规模进行等)也尚有研究的余地，但申请人认为至少在试管(体外)规模中，作为本发明的动物用的口腔用组合物的构成要素的乳香树脂、乳香精油和/或纳米型乳酸菌对P.gulae充分地显示抗菌作用及效果。

[制备例6]猫的牙周病(P.gulae(猫)、P.Circumdentaria)及传染病(Pas.multocida)菌液的制备

作为后述的试验例2中使用的牙周病细菌，选择作为猫的牙周病病原菌的Porphyromonas Gulae(以下记作“P.gulae(猫)”；菌株C26Db5)、齿周卟啉单胞菌(以下，记作“P.Circumdentaria”；菌株YC34b)及作为传染病的病原菌的多杀巴斯德菌(以下记作“Pas.multocida”；菌株12K)这三种。

接着，使用CDC(Center for Disease Control and prevention:美国疾病控制与预防中心)厌氧菌用羊血琼脂培养基(Oxioid；日本BD公司制造)于37℃对P.gulae(猫)进行5天厌氧培养。使用添加了10.0ml/L氯化血红素及10.0ml/L甲萘醌的血液琼脂培养基(mhTS)，于37℃对P.Circumdentaria进行5天厌氧培养。使用大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA、Difco)于37℃对Pas.multocida进行1天需氧培养。

并且，对于分别培养的P.gulae(猫)、P.Circumdentaria及Pas.multocida的各个细菌，用铂金接种环取适量的各菌的生长的菌落，混悬于灭菌生理盐水(麦氏浊度标准溶液No.1浓度)而制成菌液。以下，对于各个细菌的菌液，对应于种类而分别制成牙周病(P.gulae(猫))菌液、牙周病(P.Circumdentaria)菌液及传染病(Pas.multocida)菌液。此外，各个细菌的菌液的细菌数量约为1～3×10⁸CFU/mL。

[试验例2]抗牙周病细菌效果试验之二

使用上述制备例6中制备的牙周病(P.gulae(猫))菌液、牙周病(P.Circumdentaria)菌液及传染病(Pas.multocida)菌液以及用于抗牙周病细菌效果试验的试验液(试验液)而进行抗牙周病细菌效果试验。另外，对于本试验例2中使用的用于抗牙周病细菌效果试验的试验液(试验液)，按照上述制备例4，以使乳香树脂液为5.0％且乳香精油为0.03％的方式进行制备。此外，与上述制备例4相同，对照试验(对照区)的试验液(记作“对照用试验液”)也仅为三(辛酸/癸酸)甘油酯，并未混合乳香树脂液、乳香精油。

首先，向9mL试验液中添加1mL各菌液(牙周病(P.gulae(猫))菌液、牙周病(P.Circumdentaria)菌液及传染病(Pas.multocida)菌液)，随时间变化而对细菌数量进行计数。

对于细菌数量的计数，向试验液中分别添加各菌液并进行搅拌后(将此设为作用时间为0分钟)，立即用移液枪吸取1mL该搅拌后的试验液及各菌液的混合液，进一步添加9mL灭菌生理盐水并进行搅拌，此外，重复进一步向1mL稀释溶液中添加9mL灭菌生理盐水并进行搅拌的操作，对各菌液进行10倍梯度稀释。稀释后，分别将0.1mL各菌液涂抹于2块血液琼脂培养基。另外，使用该培养基，对牙周病(P.gulae(猫))菌液及牙周病(P.Circumdentaria)菌液，于37℃进行5天厌氧培养，对传染病(Pas.multocida)菌液，于37℃进行1天需氧培养。对于各个菌液，在培养后，根据各培养基的菌落数求出试验液(混有各菌液)中的细菌数量。另外，细菌数量的测定极限值为3.5(log[cfu/mL])，将测定极限值以下的细菌数量记作＜3.5(log[cfu/mL])。

并且，对于向试验液中分别添加各菌液并进行搅拌后1分钟、3分钟、5分钟、10分钟或5分钟、10分钟、15分钟、30分钟的试验液，通过与作用时间为0分钟的情况相同的方法，向各试验液中添加灭菌食盐水并通过10倍梯度稀释而进行稀释，计数培养后细菌数量。作为对照，向对照用试验液中添加菌液，同样地求出随时间变化的细菌数量。

将基于各菌液(牙周病(P.gulae(猫))菌液、牙周病(P.Circumdentaria)菌液及传染病(Pas.multocida)菌液)与试验液的混合搅拌的抗牙周病细菌效果试验的结果分别示于表5～表7。表5～7中的“试验区”是指向试验液中添加了各菌液的溶液。

[表5]

表5.对牙周病(P.gulae(猫))菌液的杀菌效果

[表6]

表6.对牙周病(P.Circumdentaria)菌液

[表7]

表7.对传染病(Pas.multocida)菌液的杀菌效果

表5示出牙周病(P.gulae(猫))菌液与试验液的抗牙周病细菌效果试验的结果。向试验液中添加7.7(log[cfu/mL])的该菌液，其结果，在添加(搅拌)后5分钟，细菌数量成为4.6(log[cfu/mL])，在添加后10分钟成为测定极限以下。与之相比，对照(对照区)中，细菌数量在搅拌后0～30分钟内几乎恒定，约为7.0±0.5(log[cfu/mL])。此外，向试验液中添加5.2(log[cfu/mL])的该菌液时，结果为在添加后1分钟成为测定极限以下。

表6示出牙周病(P.Circumdentaria)菌液与试验液的抗牙周病细菌效果试验的结果。向试验液中添加该菌液，其结果，在添加(搅拌)后1分钟或3分钟成为测定极限以下。与之相比，对照(对照区)中，细菌数量在搅拌后0～30分钟内为5.9～7.0(log[cfu/mL])。

表7示出传染病(Pas.multocida)菌液与试验液的抗牙周病细菌效果试验的结果。向试验液中添加该菌液，其结果，在添加后1分钟成为1％以下(约4.0(log[cfu/mL]))，在添加后3分钟成为测定极限以下。与之相比，对照(对照区)中，细菌数量在搅拌后0～30分钟内为6.3～8.1(log[cfu/mL])。

以上的本试验例中，尽管各牙周病细菌或传染病菌的细菌数量在需氧或厌氧条件等反应条件下具有偏差，但在使本发明的动物用口腔组合物以乳香树脂液和/或乳香精油为有效成分而进行研究时发现，本发明的动物用口腔组合物不仅对来自狗及猫的Porphyromonas gulae显示杀菌作用，并且对其他的为卟啉单胞菌属的齿周卟啉单胞菌或不同属的多杀巴斯德菌也显示杀菌作用。

[制备例]本发明的动物用的口腔用组合物的制备

基于上述试验例的见解，制备本发明的动物用的口腔用组合物(凝胶膏状)。另外，关于该组合物的制备方法，通过常规方法进行。另外，各成分的组成比(重量％)如以下所示的表8所示。此外，将口腔用组合物的总量设为25kg。

[表8]

表8本发明的口腔用组合物的处方

※：乳香树脂的30％三(辛酸/癸酸)甘油酯溶液

※：羧甲基纤维素

※：液体石蜡与聚乙烯的混合物

另外，对于本制备例中制备的凝胶膏状的动物用的口腔用组合物，采取浸渍于牙刷或棉棒并涂布于动物(狗、猫)的牙或牙龈上的形式。

此外，上述制备例(添加量)为一个例子，只要遵守乳香树脂(树脂液)及乳香精油和/或纳米型乳酸菌的构成，则其他成分可适当变更。

[试验例3]动物用的口腔用组合物的临床试验

针对上述制备例中制备的、凝胶膏状的动物用的口腔用组合物(以下，记作“乳香凝胶”)，对通常的家养的狗(狗的品种不限；以下有时简称为“狗”)进行临床试验。

首先，关于通常的家养的狗，将10只所有的牙龈指数的评分为0.5以上，接受刮牙(scaling)(去除牙结石)处理，并且体重小于25kg且为3岁以上，性别不限的狗作为对象。并且，将10只狗分组为对照组(不涂布乳香凝胶；但实施除涂布乳香凝胶以外的通常的牙齿护理)5只与试验药物组(涂布乳香凝胶)5只。另外，关于对照组及试验药物组的狗，将试验对象的牙中的左右上下颚的犬齿及第4前臼齿作为观察对象。此处，将牙龈指数的评分的计算方法示于表9。

[表9]

表9.牙龈指数的评分的计算方法

接着，对试验药物组的狗给药(涂布及涂擦)乳香凝胶的方法为：让该狗的各个饲养者分别用手指将约0.5g乳香凝胶涂布于狗的左上颚、左下颚、右上颚及右下颚的牙龈。并且，在睡觉前，1天进行1次乳香凝胶的涂布及涂擦，在4周内每天都进行。另外，注意在给药乳香凝胶时避免同时使用牙齿护理目的的补剂，且在给药凝胶后的30分钟内避免饮食及饮水。

接着，进行临床的效果试验。该效果试验进行以下四种：1)牙龈指数的评分的计算、2)牙周病原细菌及菌毛类型的分析、3)口腔内细菌数量的计数及4)口臭测定。以下，依次对各试验进行说明。

[试验例3-1]牙龈指数的评分的计算

首先，关于牙龈指数的评分的计算，以表9所示的基准，通过肉眼观察并判断对照组及试验药物组中所有的狗在刮牙处理前(以下记作“术前”)及刮牙处理1个月后(以下记作“1个月后”)的牙龈指数的评分。另外，此时，将牙龈指数的评分与术前相比没有变差或者得到了改善的情况记作有效。将本试验例3-1的牙龈指数的评分的变化示于图1。

图1中，对照组及试验药物组分别在刮牙处理前(术前)与刮牙处理1个月后(1个月后)观察到了牙龈指数的评分的值的差异。进一步，比较对照组与试验药物组的刮牙处理1个月后(1个月后)时，观察到试验药物组(使用了乳香凝胶的狗)的评分降低、即观察到了牙龈炎的改善。由此可知，尽管在统计学或详细内容上尚有研究的余地，但至少结果暗示本发明的口腔用组合物显示作为牙龈炎乃至牙周病的预防剂的效果。

[试验例3-2]牙周病原细菌及菌毛类型的分析

接着，对牙周病原细菌的检测及菌毛类型的分析进行说明。

首先，牙周病原细菌的检测使用PCR(聚合酶链式反应)分析方法而进行。牙周病原细菌的采集中，使用3根棉拭子(swab)(seed swab(注册商标)γ2号；Eiken Chemical Co.,Ltd.制造)采集对照组及试验药物组的各只狗的左右及上颚的第4前臼齿侧的牙龈边缘附近。并且，针对3根棉拭子，从采集的棉拭子样品中提取细菌(牙周病菌)DNA并进行PCR分析，通过琼脂糖凝胶电泳法检测细菌。另外，检测的细菌及Porphyromonas gulae的fimA型如下所示：福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythensis)、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、牙龈卟啉单胞菌、Porphyromonas gulae、Porphyromonas gulae fimA的A～C型。并且，与PCR分析同时进行fimA检测(参考国际专利公开第2013/089166号)。另外，PCR分析中，进行t检验、曼-惠特尼U检验、威尔科克森符号秩检验及费舍尔精确检验法，将P值＜0.05的情况记作在统计学上具有显著性差异。

将基于PCR分析及Porphyromonas gulae fimA检测的牙周病原细菌的检测结果示于表10。

[表10]

表10.基于PCR分析与fimA检测的牙周病原细菌的分析结果

*：与术前具有显著性差异(P<0.05)

Pgu：Porphyromonas gulae、Pgi：牙龈卟啉单胞菌

type A：Pgu fimA的A型、type B：Pgu fimA的B型、type C：Pgu fimA的C型

Cr:直肠弯曲菌、Tf:福赛斯坦纳菌

※：例如“Pgu”的“术前”中，“4/5”是指5只中4只。

关于PCR分析，对照组及试验药物组中均观察到了：刮牙后检测到的所分析的牙周病病原性细菌的个体数量减少，1个月后检测到的个体数量再次增加的倾向(参考表10)。

关于fimA检测，在刮牙术前，两组中均有2例携带有Porphyromonas gulae fimA的A型，但在术后，所有的狗中的该fimA的A型消失，在1个月后也没有检测到。关于C型，对照组与试验药物组之间没有显著差异，关于B型，由于试验药物组在术前的检查中没有狗携带有B型，因此试验药物的效果不明。

[试验例3-3]口腔内细菌数量的计数

关于口腔内细菌数量，用白色灭菌棉棒擦拭对照组与试验药物组的狗的左上颚第4臼齿的脸颊侧三次，使用细菌自动计数仪(DU-AA01NP-H；松下健康医疗公司制造)对附着于棉棒的细菌进行计数。另外，与上述试验例3-2的PCR计数相同，进行t检验、曼-惠特尼U检验、威尔科克森符号秩检验及费舍尔精确检验法，将P值＜0.05的情况记作在统计学上具有显著性差异。

将表示口腔内细菌数量的变化的图示于图2。另外，图2中的“术前”是指刮牙处理前，“术后”是指刚完成刮牙处理后，“1个月后”是指刮牙处理1个月后。该图2中，对照组与试验药物组的口腔内细菌数量均因刮牙而显著减少(P＜0.05)。关于1个月后的口腔内细菌数量，与对照组相比，试验药物组的口腔内细菌数量显著减少，此外，与术前相比，显示显著低的值。

[试验例3-4]口臭测定

接着，使用OraStrip(DS PHARMA ANIMAL HEALTH CO.,LTD制造)对对照组及试验药物组的狗进行口臭测定。将其结果示于图3。另外，与图2相同，图3中的“术前”是指刮牙处理前，“术后”是指刚完成刮牙处理后，“1个月后”是指刮牙处理1个月后。试验药物组及对照组中，刮牙术前与术后的OraStrip分数显示较低的值。进一步，在1个月后，与术前相比，两组均显示较低的值。此外，对照组及试验药物组中，试验药物组的OraStrip分数一直为比对照组低的值。

以上的试验例3(3-1～3-4)中，通过使用了本发明的口腔用组合物的临床试验发现，尽管还有各种研究的余地，但至少乳香成分具有作为狗或猫的牙周病(牙龈炎)的预防剂或口臭预防剂的用途。

以上，关于本发明的动物用的口腔用组合物，记载了各种实施例，但本发明并不限定于此，只要不脱离权利要求书、上述实施方式中记载的范围，则可实施各种实施例。

工业实用性

在上述的实施方式及实施例中以牙膏为例对本发明所涉及的本发明的动物用的口腔用组合物进行了说明，但是由于本发明的动物用的口腔用组合物中使用了乳香树脂和/或精油，因此可用作动物用的抗菌剂或传染病预防药(例如针对消化系统寄生细菌)。