抗炎植物提取物
阅读说明：本技术 抗炎植物提取物 (Anti-inflammatory plant extracts ) 是由 贾廷德·拉纳 凯莉·米切尔 于 2019-07-12 设计创作，主要内容包括：一种表现出抗炎活性的植物提取物,其中所述植物提取物至少是来自于腰果属(Anacardium)的提取物。(A plant extract exhibiting anti-inflammatory activity, wherein the plant extract is at least an extract from cashew (Anacardium).)
与相关申请的交叉引用
本申请要求2018年8月31日提交的美国专利申请号62/725,461的利益，所述申请的公开内容整体通过引用并入本文。
技术领域
本发明总的来说涉及表现出抗炎活性的植物提取物和包含这种提取物的组合物。
背景技术
花生四烯酸及其代谢物是炎症的重要介导物。花生四烯酸(“AA”)是膜磷脂的组分，其中在它的代谢物形成中的限速步骤取决于通过磷脂酶的活化介导的它从细胞膜磷脂库的释放。随后，它可以通过两种途径之一代谢——通过环氧合酶(“COX”)代谢以产生类花生酸例如前列腺素(“PGE2”)、前列环素和凝血烷，或者它可以被5-脂氧合酶(“5-LOX”)代谢，导致白三烯和脂氧素的产生。这些类花生酸充当细胞内信使，并在疼痛和炎性反应中的信号转导的调控中发挥重要作用。花生四烯酸代谢途径的说明提供在图1中。
环氧合酶-一种前列腺素类合酶，也被称为前列腺素-内过氧化物合酶(PTGS，EC1.14.99.1)-是一种负责被称为前列腺素类的包括前列腺素、前列环素和凝血烷在内的重要生物介导物的形成的酶。COX是从花生四烯酸到前列腺素类的生物合成途径中的关键酶。存在两种已知的同工酶-COX-1和COX-2。COX-1代表负责前列腺素产生的组成性同工型，所述前列腺素参与生理功能例如胃粘膜的保护和肾灌注的维持。COX-2在大多数细胞中在正常条件下不表达，但在炎症期间发现其水平升高。COX-2是发炎组织中的主要同工酶，在那里它的诱导可以通过几种促炎性细胞因子来促进，包括白介素-1(“IL-1”)和肿瘤坏死因子(“TNF-α”)。COX被非甾类消炎药(NSAID)的药理学抑制可以提供炎症和疼痛症状的缓解。
因此，为了防止不想要的副作用，出于镇痛和抗炎作用而不影响由通过COX-1形成的前列腺素所控制的重要生理过程的目的，选择性抑制COX-2似乎是实用的。此外，仍有报道将作为组成性同工酶的COX-2的协同效应与维持肾血流量和肾小球滤过率相关联，表明其选择性抑制可能导致某些副作用。在临床试验中，对象经历了这些作用，其中选择性COX-2抑制剂(例如塞来昔布和罗非考昔)在骨关节炎和类风湿性关节炎疼痛中的疗效与传统NSAID相近，具有更好的胃耐受性，并在肾副作用方面与NSAID相当。因此，与完全选择性地抑制任一种酶相反，可以合理地假设并获得一种强得足以引起这些同工酶的抑制，但又适度得足以避免不必要的不利后果的化合物。
还已发现，COX-2的表达以及因此其产物PGE2的合成的提高与MMP-9的诱导密切相关，所述MMP-9是癌症、心血管疾病和炎症中的关键因素。因此，COX-2酶的抑制可能导致MMP-9表达和活性的调控，这可能调节癌细胞的侵袭和迁移，阻止或延迟动脉粥样硬化的进展并稳定斑块，调控巨噬细胞蛋白酶表达，预防慢性牙周炎和牙龈炎，并控制肝脏疾病的重塑等。
花生四烯酸(“AA”)代谢途径的另一部分是通过5-脂氧合酶(“5-LOX”)途径，其中源自于LTA4的白三烯(LTB4、LTC4、LTD4和LTE4)是最终的生物活性代谢产物。LTC4及其产物LTD4和LTE4作用于支气管和血管的平滑肌细胞，其中它们的生物学效应表明它们在过敏反应和炎症过程中起作用。例如，在哮喘中，它们引起支气管收缩、血管收缩和血管通透性提高；因此，它们以前被称为过敏反应的慢反应物质。这个途径的另一种组分LTB4是嗜中性粒细胞的一种强力趋化因子。尽管5-LOX酶的特异性抑制剂齐留通(Zileuton)在抗炎和抗支气管痉挛作用共同起作用的情况下有效地干预了哮喘发作，但5-LOX调节剂的单一治疗方式似乎是不够的。
优选地，抗炎产品涵盖花生四烯酸(“AA”)代谢的两个主要代谢途径的抑制，具有广泛的抗炎活性，同时也具有更好的安全性。
作为细胞因子起作用并由免疫细胞分泌的另一种炎症介导物是高迁移率族蛋白1(“HMGB1”)，也被称为高迁移率蛋白1(“HMG-1”)和amphoterin。HMGB1是人类中由HMGB1基因编码的蛋白质。像组蛋白一样，HMGB1是最重要的染色质蛋白之一。HMGB1是一种30kDa的核和胞质蛋白，并且是一种自体产生的免疫激活剂，在免疫和炎症的调控中具有多种功能。
在炎症和受伤时，HMGB1可以由先天性免疫细胞例如巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞主动释放。例如，巨噬细胞和单核细胞对外源细菌内毒素(例如脂多糖或LPS)或内源促炎性细胞因子例如肿瘤坏死因子(“TNF-α”)、白介素-1β(“IL-1β”)和干扰素γ(“IFN-γ”)做出响应，以时间和剂量依赖性方式主动释放HMGB1。
HMGB1也可被坏死或受损细胞被动释放，并能够通过将损伤与邻近的免疫细胞进行沟通来诱导炎症反应，从而使先天免疫细胞既能对损伤做出响应，又能进一步诱导炎症。HMGB1蛋白通过高级糖基化终产物(“RAGE”)的受体和/或“Toll样”受体(TLR-2/4)触发细胞内信号传导，进而激活介导炎症的各种信号传导途径如有丝分裂原活化蛋白激酶(“MARK”)途径和随后的活化B细胞的核因子κ-轻链增强物(“NF-κB”)，导致各种不同白细胞粘附分子、促炎性细胞因子和趋化因子的表达。
HMGB 1在炎性活性中发挥重要作用，并参与多种免疫应答。HMGB1诱导树突状细胞(“DC”)的成熟和迁移，并激活这些细胞和单核细胞，以产生促炎性细胞因子例如TNF-α、1L-1β、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白1(“MIP-1”)。HMGB1还充当单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和DC的趋化因子，以维持炎症并引发先天性免疫应答。
HMGB1被认为是源自于受损的自身而不是入侵的病原体的危险信号的主要实例。HMGB1介导先天受体的活化，通过细胞因子的释放导致炎症反应放大，进而诱导额外HMGB1的释放，进一步促进了这些介导物的诱导。尽管已知促炎性细胞因子例如TNF-α、IL-1β和IFN-γ介导炎症的早期阶段，但在脓毒症和组织损伤中HMGB1被认为是晚期决定因子。
靶向HMGB1可能是用于炎性疾病的治疗性干预的一种务实方法，因为它已被鉴定为是包括脓毒症、关节炎、癌症和糖尿病在内的许多疾病的发病机制中的关键介导物。例如，已发现在(1)类风湿性关节炎患者的滑膜液，(2)与存活者相比未存活的脓毒症患者，(3)实体肿瘤的侵袭和转移，以及(4)糖尿病及其并发症中，HMGB1的水平升高。
因此，已研究了许多药理学药剂抑制HMGB1释放或HMGB1活性的潜力(参见图2)。这些药剂包括传统草药例如dong guai或当归(“女性人参”-Angelica sinensis)、绿茶(Camellia sisensis)和丹参(“丹参”或“石见穿”，Saliva miltorrhiza)的水性提取物，它们已被发现抑制内毒素诱导的HMGB1释放，并保护动物免受实验性脓毒症的侵害。
因此，植物药在大多数这些疾病的控制中发挥重要作用，而植物是天然抗氧化剂的潜在来源。研究显示，食用在茶、药草、水果和蔬菜中发现的多酚类化合物与这些疾病的低风险相关。因此，对表现出抗炎活性的植物和作为潜在治疗剂的促进健康的植物成分的研究兴趣日益增长。药用植物可为在长期暴露后可能有毒的化学抗氧化剂提供一种安全、成本效益高的生态替代品。
腰果树(Anacardium occidentale Linn)最初来自于亚马逊地区，后来被移植到印度、东非和其他国家进行种植。这种树产生采取膨胀果梗形式的非常奇特的果或果实。在这种果梗末端的外部，腰果坚果生长在其自身的灰色肾形硬壳中。这种壳具有柔软的革质外皮和围绕果仁的被称为果壳或种皮的薄且坚硬的内皮。在这两层皮之间是一个含有腰果壳液的蜂窝状结构。这种液体包含腰果酸、腰果酚和腰果二酚以及其他成分。腰果酸是一种水杨酸，而腰果酚和腰果二酚是取代的酚。
已研究了所述果实的各个部分的用途。除了作为可食用食物之外，来自于腰果果实的汁被用于饮料中，而果实提取物在体重管理方面显示出益处。已提取了腰果壳液用于各种不同的工业和农业应用，包括摩擦衬片、涂料、层压树脂、橡胶混配树脂、腰果水泥、基于聚氨酯的聚合物、表面活性剂、环氧树脂、铸造化学品、化学中间体、杀虫剂和杀真菌剂。腰果种皮已被用于鞣料中。
正如上文提到的，对于具有抗炎活性的有效、无毒的天然化合物存在着需求。本发明提供了一种这样的解决方案。
发明内容
本文提供了一种包含儿茶素类的植物提取物组合物，其中所述提取物已被标准化至以所述提取物的总重量计约15.0重量/重量％或更高的儿茶素含量。所述植物提取物组合物表现出抗炎活性，并至少包含来自于腰果属(Anacardium)的提取物。优选地，所述植物提取物至少是来自于腰果(Anacardium occidentale L.)的提取物。更优选地，所述植物提取物至少来自于腰果(Anacardium occidentale L.)果实的种皮。
在一个实施方式中，本发明涉及一种腰果(Anacardium occidentale L.)果实种皮的提取物，以包含以所述提取物的总重量计约15.0重量％或更高的儿茶素类。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种包含腰果(Anacardium occidentaleL.)种皮的植物提取物的组合物，其中所述植物提取物表现出抗炎活性。所述植物提取物可以以约4μg/mL或更高的量存在于所述组合物中。优选地，所述植物提取物以约4μg/mL至约2000μg/mL的量存在于所述组合物中。更优选地，所述植物提取物以约15μg/mL至约250μg/mL的量存在于所述组合物中。
关于所述组合物的植物提取物的抗炎活性，一方面，含有所述腰果(Anacardiumoccidentale L.)种皮的植物提取物的组合物抑制COX-1活性。优选地，对于此类抑制COX-1活性的组合物来说，所述植物提取物以约15μg/mL至约250μg/mL的量存在于所述组合物中。
另一方面，含有所述腰果(Anacardium occidentale L.)种皮的植物提取物的组合物抑制COX-2活性。优选地，对于此类抑制COX-2活性的组合物来说，所述植物提取物以约30μg/mL至约250μg/mL的量存在于所述组合物中。
甚至另一方面，含有所述腰果(Anacardium occidentale L.)种皮的植物提取物的组合物抑制5-LOX活性。优选地，对于此类抑制5-LOX活性的组合物来说，所述植物提取物以约32μg/mL至约250μg/mL的量存在于所述组合物中。
另一方面，含有所述腰果(Anacardium occidentale L.)种皮的植物提取物的组合物抑制HMGB1活性。在一个实施方式中，对于此类抑制HMGB1活性的组合物来说，所述植物提取物以约50μg/mL的量存在于所述组合物中。
另一方面，含有所述腰果(Anacardium occidentale L.)种皮的植物提取物的组合物抑制COX-1活性、COX-2活性、5-LOX活性和HMGB1活性。
含有所述腰果(Anacardium occidentale L.)种皮的植物提取物的组合物还可以包含可药用载体。此类组合物的非限制性实例包括膳食补充剂和局部用组合物。
附图说明
图1是花生四烯酸代谢途径的总体说明。
图2是在各个不同部位处HMGB1介导的促炎性反应的总体说明。
图3是腰果种皮提取物在0分钟(开始)至20分钟的保留时间内在275nm波长下的HPLC色谱图。
图4是腰果种皮提取物的LC/MS和LC/PDA(波长为280和350nm)色谱图。
图5是示出了使用各种不同浓度的腰果种皮提取物获得的COX-1抑制百分率的图。
图6是示出了使用各种不同浓度的腰果种皮提取物获得的COX-2抑制百分率的图。
图7是示出了使用各种不同浓度的腰果种皮提取物获得的5-LOX抑制百分率的图。
图8是条形图，示出了在环境大气(21％O2)(“RA”)、不使用腰果种皮提取物的95％O2(“O2”)、DMSO(“介质”)、阳性对照水杨酸钠(“SS 2μM”)和使用腰果种皮提取物的95％O2(“CT”)下，巨噬细胞培养上清液中HMGB1(释放的％)的检测。
发明详述
本发明是基于下述令人吃惊的发现，即腰果(Anacardium occidentale Linn)的种皮含有明显高的某些类黄酮。具体来说，已发现腰果种皮的提取物包含儿茶素和表儿茶素作为主要组分以及原花青素类。本文中提到的数据证实了腰果种皮提取物可能具有抗炎应用。
对于本申请来说，术语“组合物”是指治疗、改善、促进、提高、管理、控制、维持、优化、修改、减轻、抑制或阻止与天然状态、生物过程或疾病或障碍相关的特定状况的产品。例如，组合物在对象中改善氧化的抑制和/或减轻炎症等。术语组合物包括但不限于包含有效量的提取物、其至少一种组分或其混合物的药品(即药物)、非处方药(OTC)、化妆品、食品、食品成分或膳食补充剂组合物。示例性的组合物包括霜剂、化妆用洗剂、面膜或粉剂，或作为乳液、洗剂、搽剂泡沫、片剂、膏药、颗粒剂或软膏。组合物还可以包括饮料，例如加入有效量的提取物的饮料或含有有效量的提取物的茶包。含有有效量的提取物的食品组合物的非限制性实例包括烘焙食品、蛋白粉、肉制品、乳制品和糖食。
当在本文中使用时，术语“提取物”或“植物提取物”是指包含至少腰果属植物(例如Anacardium humile、Anacardium othonianum、Anacardium giganteum、Anacardiumnanum、Anacardium negrense和/或腰果(Anacardium occidentale))、优选为腰果(Anacardium occidentale L.)的物质的一种或多种活性成分的固体、半流体或液体物质或制剂。优选地，所述活性成分源自于腰果种皮的提取物。所述提取物使用溶剂例如水、1至4个碳原子的短链醇类(例如甲醇、乙醇、丁醇等)、乙烯、丙酮、己烷、醚、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(“DMF”)、二甲基亚砜(“DMSO”)、1,3-丁二醇、丙二醇及其组合来制备，但是也可以使用所述粗提取物在此类溶剂中的级分制备。可以使用任何提取方法，只要它确保所述活性成分的提取和保护即可。
当在本文中使用时，术语纯化合物、组合物、提取物、提取物混合物、提取物组分和/或活性药剂或成分或其组合的“有效量”或“治疗有效量”，是指在剂量和时间长度上足以有效实现所需结果的量。例如，所述“有效量”或“治疗有效量”是指本发明的纯化合物、组合物、提取物、植物提取物、提取物混合物、植物提取物混合物、提取物组分和/或活性药剂或成分或其组合的在给药到对象(例如哺乳动物例如人类)时，足以在对象中实现治疗例如改善氧化的抑制和/或减轻炎症等的量。本公开的组合物、提取物、植物提取物、提取物混合物、植物提取物混合物、提取物组分和/或活性药剂或成分的构成“有效量”或“治疗有效量”的量，将随着所述活性药剂或化合物、待治疗的病症及其严重程度、给药方式、给药持续时间或待治疗对象的年龄而变，但可以由本领域普通技术人员根据自己的知识和本公开内容常规地确定。
术语“可药用”意味着那些药物、医药、提取物或惰性成分适合于与人类和较低等动物相接触使用而没有过度毒性、不相容性、不稳定性、刺激性等，并与合理的利益/风险比相称。
术语“给药”被定义为通过本领域中已知的途径，包括但不限于静脉内、动脉内、口服、肠胃外、颊、局部、透皮、直肠、肌肉内、皮下、骨内、透粘膜或腹膜内给药途径将组合物提供给对象。在优选实施方式中，给药组合物的口服途径是适合的。
当在本文中使用时，术语“对象”或“个体”包括可能向其给药组合物的哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人类、非人类灵长动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、啮齿动物(包括转基因和非转基因小鼠)等。在某些实施方式中，所述对象是非人类哺乳动物，并且在某些实施方式中，所述对象是人。
当在本文中使用时，术语“载体”是指有助于将一种或多种植物提取物在适合于给药的形式中维持在可溶且均匀状态下的组合物，其无毒并且不以有害方式与其他组分相互作用。
除非另有指明，否则整个本公开中叙述的所有比例和百分率均以重量计。
本发明提供了一种表现出抗炎活性的植物提取物。更具体来说，本发明针对来自于腰果属的腰果种皮的植物提取物。已发现此类植物提取物表现出抗炎活性。
正如上文陈述的，根据本发明的有用抗炎植物提取物包括来自于腰果属的植物提取物。更具体来说，所述提取物是选自Anacardium humile、Anacardium othonianum、Anacardium giganteum、Anacardium nanum、Anacardium negrense和/或腰果(Anacardiumoccidentale)的一个或多个物种的植物提取物。优选地，所述植物提取物来自于腰果(Anacardium occidentale L.)物种。在一个实施方式中，所述植物提取物来自于腰果(Anacardium occidentale L.)物种的种皮。
根据本发明的抗炎组合物可以包括能够作为活性成分起作用的一种或多种化合物。所述化合物可能是所述植物提取物的组分。例如，所述化合物可以是获得所述植物提取物的植物中存在的植物化学成分。所述化合物可能至少部分负责表现出抗炎活性。所述化合物可以是能够抑制炎症的任何化合物。在一个实施方式中，所述化合物选自植物化学成分儿茶素类、表儿茶素类和/或原花青素(例如A、B、三聚体、四聚体)。
通常，植物的一个或多个部位可用于生产植物提取物，包括但不限于根、茎、叶、花、果实、种子和种子的种皮。在本发明中，单独地或与其他植物部位一起至少使用种子的种皮来生产所述植物提取物。来自于腰果属植物的种皮可以从各种不同来源商购。所述腰果种皮的提取物可以使用任何适合的提取技术获得。
就此而言，可以收集并粉碎所述植物的一个或多个部位，特别是所述植物的种皮。然后可以使用适合的溶剂提取所述粉碎的材料。所述溶剂可以在浓缩步骤中除去。例如，可以将所述提取过的材料过筛或过滤，以产生上清液和滤饼。所述滤饼可以被压榨以除去显著部分的液体，所述液体可以添加到所述上清液中。然后可以将所述滤饼脱水并用作纤维来源。所述上清液可以被蒸馏以除去所述溶剂或其一部分，以形成植物提取物液体浓缩物。所述被除去的溶剂可以循环利用。所述浓缩物可以被干燥(例如通过喷雾干燥)，以提供干燥的植物提取物。这种干燥的植物提取物可以如本文中所述进行化验和/或标准化。优选地，所述干燥的植物提取物源自于腰果(Anacardium occidentale)，特别是腰果(Anacardium occidentale L.)植物的种皮。
适合用于提取过程的溶剂包括水、醇或其混合物。示例性的醇性溶剂包括但不限于C1-C7醇类(例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇)、水-醇类或醇与水的混合物(例如水性乙醇)、多元醇(例如丙二醇和丁二醇)和脂肪醇。任何这些醇性溶剂可以以混合物的形式使用。在一个实施方式中，所述植物提取物使用乙醇、水或其组合(例如约70％乙醇与约30％水的混合物)来提取。在另一个实施方式中，所述植物提取物仅使用水来提取。
在一个实施方式中，所述植物提取物可以使用有机溶剂提取技术来获得。在另一个实施方式中，可以使用溶剂顺序分离技术来获得所述植物提取物。全水-乙醇提取技术也可用于获得所述植物提取物。通常，这被称为一次性提取。
也可以使用全乙醇提取。这种技术使用乙醇作为溶剂。这种提取技术可以产生除了水溶性化合物之外还具有脂溶性和/或亲脂性化合物的植物提取物。
可用于获得所述植物提取物的提取技术的另一个实例是超临界流体二氧化碳提取(“SFE”)。在这种提取过程中，待提取的材料可以不被暴露于任何有机溶剂。相反，可以使用含有或不含改性剂的处于超临界条件(>31.3℃和>73.8巴)下的二氧化碳作为提取溶剂。本领域技术人员将会认识到，可以改变温度和压力条件以获得提取物的最佳得率。这种技术与全己烷和乙酸乙酯提取技术相似，可以产生脂溶性和/或亲脂性化合物的提取物。
在所述过程中产生的植物提取物可以包括在所述被提取的材料中存在的广泛种类的植物化学成分。所述植物化学成分可以是脂溶性或水溶性的。在收集所述提取物溶液后，可以将溶剂蒸发，得到所述提取物。所述植物提取物可以被标准化至规定量的特定化合物。例如，所述植物提取物可以被标准化至规定量的活性成分或植物化学成分。在一个实施方式中，所述植物提取物被标准化至以所述提取物的总重量计约15.0重量％或更高的儿茶素含量。
在所述抑制炎症的组合物中存在的植物提取物的量可以取决于几种因素，包括所需的炎症抑制水平、特定植物提取物或其组分的炎症抑制水平和其他因素。优选地，所述植物提取物以所述组合物的总重量计约0.005重量％或更高、例如约0.005重量％至约50.00重量％的量存在。
所述抗炎组合物可以包括一种或多种可接受的载体。所述载体可以帮助将所述植物提取物并入到具有适合于给药到对象的形式的抗炎组合物中。大量可接受的载体在本领域中是已知的，并且所述载体可以是任何适合的载体。所述载体优选地适合于给药到动物包括人类，并且能够作为载体起作用而不显著影响所述植物提取物和/或任何活性成分的所需活性。所述载体可以在所需的给药途径和所述组合物的剂型的基础上选择。
适合的剂型包括液体和固体形式。在一个实施方式中，所述组合物采取凝胶、糖浆、浆液或悬液的形式。在另一个实施方式中，所述组合物采取液体剂型，例如口服液(drink shot)或液体浓缩物。在另一个实施方式中，所述组合物以固体剂型存在，例如片剂、丸剂、胶囊、糖衣丸剂或粉剂。当采取液体或固体剂型时，所述组合物可以采取适合于掺入到食品中以备递送的食品递送形式。适合用于固体形式(特别是片剂和胶囊形式)中的载体的实例包括但不限于有机和无机惰性载体材料例如明胶、淀粉、硬脂酸镁、滑石、树胶、二氧化硅、硬脂酸、纤维素等。所述载体可以是基本上惰性的。
作为实例，硅化微晶纤维素可用作载体或粘合剂。硅化微晶纤维素是微晶纤维素和胶体二氧化硅的物理混合物。一种此类适合形式的硅化微晶纤维素是可以从PenwestPharmaceutical Co.,Patterson,N.J获得的ProSolv90。二氧化硅除了由所述硅化微晶纤维素提供的之外，也可以作为加工助剂添加到所述组合物。例如，可以包括二氧化硅作为助流剂，以在固体剂量单元例如片剂的制造中在压片期间改善粉末的流动性。
在另一个实施方式中，所述载体至少是功能性载体例如荞麦或斯佩耳特小麦。通过在所述组合物中添加功能性载体，可以提供额外的益处，例如与例如上文提到的标准载体相比更低的血糖生成指数。此外，功能性载体可以是无过敏原的(例如荞麦)，并且通过将它们添加到生产过程中，本发明的植物提取物可能从这些功能性载体的类黄酮例如芸香苷和槲皮苷获益。此外，这些功能性载体的高纤维含量也可以促进并调节肠道通过。最后，斯佩耳特小麦中存在的硒的附加的矿物质益处可能有助于代谢。
所述抗炎组合物可以包含其他惰性成分例如润滑剂和/或助流剂。润滑剂有助于制造过程中例如从模具弹出的过程中片剂的操控。助流剂在压片期间改善粉末流动性。硬脂酸是可接受的润滑剂/助流剂的实例。
所述抗炎组合物可以被制造成固体剂型例如片剂和胶囊。这种形式提供了可以由个体容易地运输到进餐场所例如餐厅，并在进食食物之前、期间或之后服用的产品。所述组合物可以被配制成含有适量所述植物提取物和/或活性成分的剂量单元，允许个体根据适合的参数例如体重、食物量或碳水化合物(例如糖)含量来确定服用的单元的适合数量。
在一个实施方式中，所述植物提取物以治疗有效量存在于所述组合物中，例如约4.0μg/mL或更高、优选地约4.0μg/mL至约2000.0μg/mL、更优选地约20.0μg/mL至约1000.0μg/m、甚至更优选地约25.0μg/mL至约750.0μg/mL的量。所述组合物可以以例如每天约4.0μg/mL至约2000.0μg/mL的所述植物提取物的剂量给药。所述组合物可以作为单剂或在多剂中给药。在一个实例中，所述化合物每天给药至多三剂。例如，所述化合物可以在餐前、餐中或餐后给药。在一个实施方式中，所述组合物是具有抗炎性质的膳食补充剂，含有治疗有效量的腰果种皮提取物。
所述剂量可以被选择成在单个单元中提供可能对某些个体和/或某些食品有效的抑制作用水平，同时也允许相对简单的剂量增加，以提供可能对其他个体和/或其他食品有效的其他抑制作用水平。
所述抑制性组合物可以采取适合于口服摄取的形式。这种形式可以被配置成旨在提供规定剂量的所述植物提取物的单一剂型。例如，所述单一剂型可以是粉剂、丸剂、片剂、胶囊或口服液。所述单一剂型可以包含例如约4.0μg/mL至约2000.0μg/mL的所述植物提取物。
实施例
实施例-材料和化学物质剖测
实施例1-来自于腰果种皮的70％乙醇提取物的制备
将干燥的腰果(Anacardium occidentale L.)种皮粉末(60g)装入3个100ml不锈钢试管中，并使用Thermo ScientificTMDionexTMASE 350加速溶剂提取器在80℃的温度和1500psi的压力下用DI水中的70％乙醇溶剂提取两次。过滤并收集所述提取物溶液。将合并的乙醇提取物溶液用旋转蒸发仪在真空下蒸发，以给出粗品腰果种皮提取物。
提取结果提供在下述表1中。
表1-腰果种皮的提取
实施例2-腰果种皮提取物的儿茶素定量
与带有光电二极管阵列检测器的日立高效液相色谱(“HPLC/PDA”)一起使用C18反相柱(5μm C18(2)LC柱250x4.6mm，可以从Torrance,California,US获得)，来确定所述腰果种皮提取物中存在的游离儿茶素类。对于流动相A来说，溶剂是水中的0.10％磷酸(“H3PO4”)，并且对于流动相B来说，溶剂B是乙腈(“ACN”)，其被用于以1.0ml/min的流速洗脱，并使用275nm处的UV吸收和35℃的柱温。使用的儿茶素参比标准品来自于Sigma-Aldrich Co。将所述参比标准品溶解在甲醇(“MeOH”)：0.1％H3PO4(1:1比例)中，其中儿茶素(C1251)浓度为0.5mg/ml，并且表儿茶素(E1753)浓度为0.1mg/ml。测试样品在容量瓶中以2mg/ml的浓度制备在含有50％MeOH的0.1％H3PO4中，超声处理直至溶解(大约10分钟)，然后冷却至室温，充分混合，并通过0.45μm尼龙注射式滤器过滤。通过将20μl样品注射到所述HPLC中进行HPLC分析。下面的表2提供了HPLC分析方法的梯度表。
表2-HPLC分析方法的梯度表
时间(min)
流动相A
流动相B
0.0
85.0
15.0
7.0
85.0
15.0
12.0
10.0
90.0
16.5
10.0
90.0
16.6
85.0
15.0
24.0
85.0
15.0
腰果种皮提取物中HPLC儿茶素的定量结果提供了以所述提取物的总重量计，儿茶素含量为9.40重量％并且表儿茶素含量为6.12重量％，总儿茶素含量为15.52重量％。因此，所述腰果种皮提取物可以被标准化至以所述提取物的总重量计总儿茶素含量为约15.00重量％或更高。腰果种皮提取物在275nm波长处的HPLC色谱图提供在图3中。
实施例3-腰果种皮提取物的化学剖测
使用超高压液相色谱(“HPLC”)和质谱(UPLC I类和GS-XT-QTof系统，两者均可以从Water Corporation,Milford,Massachusetts USA获得)，确定了所述腰果种皮提取物中存在的类黄酮化合物。使用的柱是UPLC HSS T32.1x100mm，1.8μm，柱温为40℃，样品温度为15℃。对于流动相来说，溶剂A是含有10％乙腈(“ACN”)的水(含有0.1％甲酸)，溶剂B是ACN。采集范围是100-1500道尔顿(“Da”)，采集模式是电喷雾电离(“ESI”)(-)。下面的表3提供了HPLC条件。
表3-用于分析腰果种皮提取物的HPLC条件
运行时间(min)
进样体积(μL)
浓度
20.00
2.00
1mg/mL
峰的鉴定仅仅基于准确质量。鉴定到二没食子酰基儿茶素、儿茶素和表儿茶素是腰果种皮提取物的主要组分。在所述提取物中也检测到原花青素类，包括A和B型原花青素、原花青素四聚体和原花青素三聚体，其中B型原花青素是所述原花青素类的主要组分。除了那些刚刚提到的化合物之外，鉴定到的化合物还包括二没食子酰基儿茶素、vaccihein A、6"-对香豆酰基洋李苷和dunalianoside B等。从所述分析获得的腰果种皮提取物的LC/MS和LC/PDA色谱图示出在图4中。
实施例-生物测定法
使用食品级乙醇制备腰果种皮的提取物，然后如上所述过滤和干燥。对于测定法准备的其余部分，使用研究级试剂。将提取物溶解在二甲基亚砜(“DMSO”)中至终浓度为50mg/mL，然后在适合于每种生物测定法的缓冲液中稀释到工作浓度。
实施例4-COX-1和COX-2抑制
使用来自于BioVision(Milpitas,California,US)的环氧合酶-1(“COX-1”)抑制剂筛选试剂盒(目录号K548)测试了腰果种皮提取物的COX-1抑制。这种筛选试剂盒测量由COX酶产生的产物有机过氧化物前列腺素G2的随时间过程的生产。将提取物在DMSO和COX测定缓冲液中溶解到工作浓度，DMSO的终浓度为5％。使用SC-560COX-1抑制剂作为阳性对照。COX-1酶在无菌水中重构并储存在-80℃。COX辅因子和花生四烯酸溶液在即将使用前稀释。将COX探针、COX辅因子和COX-1酶溶液添加到测试样品和对照。然后快速添加花生四烯酸溶液以起始反应。在下述波长处每分钟测量荧光共10分钟：激发-535nm，发射590nm。推衍曲线的线性部分的斜率(图5)，并计算未被抑制的对照的抑制百分数。参考图5，取决于腰果种皮提取物的浓度，观察到各种不同程度的COX-1抑制。在约4μg/mL至至少约2000μg/mL、更特别地约15μg/mL至约250μg/mL下观察到腰果种皮提取物的COX-1抑制，并且IC50为32μg/mL。
使用来自于BioVision(Milpitas,California,US)的环氧合酶-2(“COX-2”)抑制剂筛选试剂盒(目录号K547)测试了腰果种皮提取物的COX-2抑制。这种筛选试剂盒测量由COX酶产生的产物有机过氧化物前列腺素G2的随时间过程的生产。将提取物在DMSO和COX测定缓冲液中溶解到工作浓度，DMSO的终浓度为10％。使用塞来昔布非甾类消炎药(“NSAID”)作为阳性对照。COX-2酶在无菌水中重构并储存在-80℃。COX辅因子和花生四烯酸溶液在即将使用前稀释。将COX探针、COX辅因子和COX-2酶溶液添加到测试样品和对照。然后快速添加花生四烯酸溶液以起始反应。在下述波长处每分钟测量荧光共10分钟：激发-535nm，发射590nm。推衍曲线的线性部分的斜率(图6)，并计算未被抑制的对照的抑制百分数。参考图6，取决于腰果种皮提取物的浓度，观察到各种不同程度的COX-2抑制。在约4μg/mL至至少约2000μg/mL、更特别地约30μg/mL至约250μg/mL下观察到腰果种皮提取物的COX-2抑制，并且IC50为86μg/mL。因此，基于本文中呈现的结果，腰果种皮提取物可能在减少COX-1和COX-2的活性或释放中具有合理的活性，建议了它在由COX-1和COX-2介导的炎性疾病中的使用。
实施例5-5-LOX抑制
使用脂氧合酶抑制剂筛选测定试剂盒(可以从Cayman Chemical,Ann Arbor,Michigan,US获得)和马铃薯5-脂氧合酶(可以从Cayman Chemical获得)测试了腰果种皮提取物的5-LOX抑制。这种试剂盒测量在脂氧合反应中产生的氢过氧化物。
将提取物溶解在甲醇中至最终工作浓度。5-LOX酶、发色体和亚油酸溶液在即将使用前制备。去甲二氢愈创木酸(“NDGA”)被用作阳性对照。将5-LOX酶添加到测试样品和对照，并在室温温育5分钟以允许酶/抑制剂相互作用。将亚油酸底物添加到板以启动反应，然后将板在室温振摇10分钟。添加发色体以使反应期间形成的氢过氧化物可视化，并将板在室温振摇另外5分钟。然后在492nm处读取吸光度。与未抑制的对照孔相比较计算所述提取物浓度的抑制百分数。
测试了10种不同浓度(0.7、1.5、3.0、6.0、1 1.9、15.6、31.2、62.5、125.0和250.0μg/mL)的腰果种皮提取物的5-LOX抑制活性。使用100mM NDGA作为具有100％5-LOX酶抑制的阳性对照。参考图7，在约32μg/mL至至少约250μg/mL、更特别地约32μg/mL至约125μg/mL下观察到腰果种皮提取物的5-LOX抑制，并且对所述腰果种皮提取物观察到IC50为55μg/mL。因此，基于本文中呈现的结果，腰果种皮提取物可能在减少5-LOX的活性或释放中具有合理的活性，建议了它在由5-LOX介导的炎性疾病中的使用。
实施例6-HMGB1抑制
HMGB1实验程序
细胞培养物.鼠类巨噬细胞样细胞(可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,Virginia,US)作为RAW 264.7(TIB-71TM)获得)被培养在增补有10％胎牛血清(来自于Atlanta Biologicals,Lawrenceville,Georgia,US)的Dulbecco改良的Eagle培养基(“DMEM”)((DMEM)(30-2002TM)，从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,Virginia,US)获得)中。所述细胞被维持在常氧条件(5％CO2/21％O2)下，允许其生长至70-80％合生，并且每两(2)天传代培养。
提取物/药物制备.腰果种皮提取物以粉末形式储存在-20℃。再用提取物处理细胞之前，将所述提取物的储用溶液在二甲基亚砜(“DMSO”)(来自于AMRESCO,Inc.,Solon,Ohio,US)中调整到终浓度为50mg/mL，并储存在-20℃。将提取物在无血清Opti-MEMTMI培养基(来自于Gibco-BRL,Gaithersburg Maryland,US)中稀释到0.25mg/mL的终浓度，并通过0.2μm PES注射式滤器(来自于VWR,Radnor,Pennsylvania,US)过滤除菌。制备2-20μM的水杨酸钠(来自于AMRESCO,Inc.,Solon,Ohio,US)作为阳性对照，所述水杨酸钠可以减弱高氧诱导的HMGB1从巨噬细胞的释放。
高氧暴露.鼠类巨噬细胞RAW 264.7细胞在高氧中的暴露在用95％O2/5％CO2冲刷的密封加湿的Plexiglas仓室(来自于Billups-Rotheriberg,Del Mar,California,US)中，在37℃进行24小时实现。
HMGB1 ELISA.为了确定细胞外HMGB1的水平，将RAW 264.7细胞在6孔板中在无血清Opti-MEMTMI培养基(来自于Gibco-BRL,Gaithersburg,Maryland,US)中培养，并在含有或不含腰果种皮提取物的情况下在21％O2(环境空气)下或暴露于95％O2保持24小时。在高氧暴露后，通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)测量培养基中的HMGB1水平。收集细胞培养基并将其在4℃下以500g离心5分钟。然后使用Amicon Ultra-4离心装置(来自于EMDMillipore,Burlington,Massachusetts,US)将等体积的细胞培养上清液浓缩大约6倍。在浓缩后，立即将等体积的细胞培养上清液浓缩物装载在96孔板上，按照制造商的说明书(来自于Chondrex,Inc.,Redmond,Washington,US)通过ELISA确定HMGB1。通过在ThermoMultiscan Ex微孔板读板器(来自于Thermo Scientific,Waltham,Massachusetts,US)上在450nm处(使用630nm作为参比)读取光密度(“OD”)值来确定板的吸光度。通过与标准曲线进行比较来确定样品细胞培养上清液中的HMGB1水平，并使用浓缩倍数进一步校正。
统计分析.数据被呈现为1至3个独立实验的平均值±平均值的标准误差(SEM)。数据使用Fisher’s最小显著性差异(“LSD”)事后分析和GraphPad Prism第6版软件(来自于GraftPad Software,La Jolla,California,US)，通过单向方差分析(ANOVA)进行分析。<0.05的p-值被认为是统计显著的。
HMGB1实验结果
参考图8可以看出，与用21％O2(“RA”)处理的细胞相比，高氧(“O2”)引起HMGB1水平的显著提高。作为用腰果种皮提取物处理的结果(“CT”)，这些提高的HMGB1水平降低到更接近正常水平(暴露于环境空气(RA)的未处理的细胞)。对阳性对照水杨酸钠(“SS”)观察到相似的降低。两个处理组(SS和CT)的降低是统计显著的。因此，基于本文中呈现的结果，腰果种皮提取物可能在减少HMGB1的活性或释放中具有合理的活性，建议了它在由HMGB1介导的炎性疾病中的使用。
上述数据说明腰果(Anacardium occidentale L.)种皮的植物提取物具有一种或多种表现出抗炎活性的化合物。更具体来说，所述腰果种皮提取物可能在减少COX-1、COX-2、5-LOX和/或HMGB1的活性或释放中具有合理的活性。
上面的描述公开了本发明的几种方法和材料。本发明易于在材料和方法方面做出修改，并易于在制造方法和设备方面做出改变。对于本领域技术人员来说，考虑到本公开或本文公开的发明的实践，此类修改将变得显而易见。此外，除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。因此，本发明不打算限于本文公开的
具体实施方式
，而是打算覆盖落入随附的权利要求书中体现的本发明的真正范围和精神之内的所有修改和替换方案。
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