一种多糖sm-0.4m及其制备的抗肿瘤产品
阅读说明：本技术 一种多糖sm-0.4m及其制备的抗肿瘤产品 (Polysaccharide SM-0.4M and anti-tumor product prepared from same ) 是由 杨永晶 田文慧 尹星星 王学红 魏涛 于 2020-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多糖SM-0.4M,是从树莓多糖中分离得到,并鉴定出其具体的糖链结构,通过试验验证多糖SM-0.4M可促进巨噬细胞增殖,并可促进巨噬细胞释放NO、上调TNF-α和IL-6表达,进而增强巨噬细胞的吞噬作用,提高免疫力,还有利于巨噬细胞发挥抗肿瘤的作用,可用于制备相关产品,同时为进一步探明树莓多糖的构效关系及开发多糖类抗肿瘤药物和免疫佐剂提供参考。(The invention discloses a polysaccharide SM-0.4M, which is separated from raspberry polysaccharide, a specific sugar chain structure of the polysaccharide is identified, experiments verify that the polysaccharide SM-0.4M can promote macrophage proliferation, promote the macrophage to release NO, and up-regulate TNF-alpha and IL-6 expression, further enhance phagocytosis of the macrophage, improve immunity, and is beneficial to the macrophage to play an anti-tumor role, so that the polysaccharide SM-0.4M can be used for preparing related products, and simultaneously provides references for further exploring the structure-activity relationship of the raspberry polysaccharide and developing polysaccharide anti-tumor drugs and immune adjuvants.)
技术领域
本发明属于天然产物技术领域，特别是涉及树莓多糖中的多糖SM-0.4M及其制备方法和用途。
背景技术
植物多糖，又称植物多聚糖，是植物细胞代谢产生的聚合度超过10个的聚糖，是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，它是生物体内重要的生物大分子，是维持生命活动正常运转的基本物质之一。
同时，植物多糖是公认的具有多种生物活性的天然大分子，大部分植物多糖都具有显著的免疫调节活性和体内抗肿瘤活性。它们不仅能直接影响巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞等多种免疫细胞的功能，还能调节相关细胞因子、补体的产生，有效地增加了免疫细胞之间的联系，从多方面、多层次对免疫系统进行调节。加之其安全无毒的特性，植物多糖更是用于开发抗肿瘤免疫治疗药物或免疫佐剂的理想物质。
已有研究发现，来源于青藏高原引种红树莓果实的多糖具有显著的体内抗肿瘤免疫活性和化疗药物协同作用。在荷瘤小鼠模型中(恶性黑色素瘤)，树莓粗多糖抑瘤活性非常显著(400mg/kg树莓多糖的肿瘤抑制率高达59.95％，阳性对照多西他赛注射液抑瘤率66.49％)，且对荷瘤小鼠的体重无明显影响，对荷瘤小鼠的肝脏、肾脏亦无损伤。
然而，对树莓多糖中的具体成分并未做深入研究，若能明确树莓多糖中不同组分的糖链结构，必然对多糖的抗肿瘤药物、免疫佐剂的开发具有重要意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种多糖SM-0.4M，可提高免疫力。
本发明提供了一种多糖SM-0.4M，其糖链结构如下：
进一步地，多糖SM-0.4M的重均分子量Mw为86000～91000，优选88997；数均分子量Mn为57000～62000，优选59284。
进一步地，多糖SM-0.4M的峰位分子量Mp为67000～72000，优选70366。
本发明还提供了所述多糖SM-0.4M的制备方法：将树莓多糖用DEAE SepharoseFast Flow进行离子交换层析，用水洗脱出第一个组分后，用0.15mol/L～0.25mol/L的NaCl水溶液洗脱出第二个组分，再用0.35mol/L～0.45mol/L的NaCl水溶液洗脱出第三个组分为多糖SM-0.4M。
进一步地，洗脱出第二个组分的洗脱剂为0.2mol/L的NaCl水溶液，洗脱出第三个组分的洗脱剂为0.4mol/L的NaCl水溶液。
进一步地，水的用量为4～6个柱体积，优选5个柱体积。
进一步地，0.15mol/L～0.25mol/L的NaCl水溶液用量为4～6个柱体积，优选5个柱体积。
进一步地，0.35mol/L～0.45mol/L的NaCl水溶液用量为4～6个柱体积，优选5个柱体积。
树莓多糖在本领域内已被广泛研究，在本领域内，不同方法制备得到的树莓多糖，均可应用于本发明中。
在本发明的一个
具体实施方式
中，所述树莓多糖的提取方法为：将树莓脱脂、除单糖及色素后，将所得固形物水提醇沉。
进一步地，水提时水的用量为固形物的5～30倍，提取后将水提液浓缩指原体积0.1～0.5倍，优选0.25倍；再与3～5倍体积的体积分数为85～95％的乙醇，优选体积分数为95％的乙醇。
更进一步地，所述水提的条件为超声提取。
进一步地，所述超声提取的功率为50～70W，温度为50～90℃。
更进一步地，所述超声提取的时间为60min～100min。
本发明还提供了所述多糖SM-0.4M在制备提高免疫力的产品中的用途。
进一步地，所述产品为免疫佐剂。
免疫佐剂简称佐剂，即非特异性免疫增生剂，指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。
非特异性免疫(英文：nonspecific immunity；innate immunity)又称先天免疫或固有免疫，指机体先天具有的正常的生理防御功能，非特异性免疫系统包括：组织屏障(皮肤和黏膜系统、血脑屏障、胎盘屏障等)；固有免疫细胞(吞噬细胞、杀伤细胞、树突状细胞等)；固有免疫分子(补体、细胞因子、酶类物质等)。非特异性免疫的组成可概括为三个方面：机体的正常生理屏障；吞噬细胞的吞噬作用；正常的体液因素。
本发明还提供了所述多糖SM-0.4M在制备促进巨噬细胞增殖或/和增强巨噬细胞吞噬作用的产品中的用途。
巨噬细胞(英语：Macrophages，缩写为)是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫)。
进一步地，所述产品为NO释放剂、TNF-α激动剂、IL-6激动剂中的一种或几种。
所述NO释放剂是指能够促进巨噬细胞释放NO的产品；所述TNF-α激动剂是指能够提高TNF-α的表达、提高巨噬细胞中TNF-α含量的产品；所述IL-6激动剂是指能够提高IL-6的表达、提高巨噬细胞中IL-6含量的产品。
进一步地，所述产品为预防和/或治疗肿瘤的产品。
在对多糖抗肿瘤活性的研究中发现，树莓粗多糖对肿瘤细胞无直接的细胞毒性作用，而是通过增强荷瘤小鼠的细胞免疫反应实现其抗肿瘤作用，具体包括：增加荷瘤小鼠的脾脏指数，刺激脾细胞增殖；增强荷瘤小鼠脾脏组织中免疫相关酶AKP、ACP、SOD和LDH的活性；提高荷瘤小鼠血清中免疫相关细胞因子TNF-α、IL-2和IFN-γ的浓度；增加肿瘤组织的免疫细胞浸润程度等。
本发明化合物可促进巨噬细胞的增殖，并可促进巨噬细胞释放NO、上调细胞因子TNF-α和IL-6表达，进而增强巨噬细胞的吞噬作用，有利于巨噬细胞发挥抗肿瘤的作用，即可用于预防和/或治疗肿瘤产品的制备。
本发明还提供了所述多糖SM-0.4M在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的用途。
本发明的有益效果是：
(1)本发明从树莓多糖中分离出多糖组分SM-0.4M，并鉴定出其具体的糖链结构，通过试验验证多糖SM-0.4M可促进巨噬细胞增殖，并可促进巨噬细胞释放NO、上调TNF-α和IL-6表达，进而增强巨噬细胞的吞噬作用，提高免疫力，还有利于巨噬细胞发挥抗肿瘤的作用，可用于制备相关产品。
(2)本发明明确了树莓多糖中不同组分的糖链结构，为进一步探明其构效关系及开发多糖类抗肿瘤药物和免疫佐剂提供参考。
附图说明
图1为SM-0.4M分子量检测结果；
图2为SM-0.4M单糖组成；
图3为SM-0.4M甲基化结果；
图4为SM-0.4M红外图谱；
图5为SM-0.4M氢谱；
图6为SM-0.4M碳谱；
图7为SM-0.4M Dept135图谱；
图8为SM-0.4M HHCOSY图谱；
图9为SM-0.4M HSQC图谱；
图10为SM-0.4M HMBC图谱；
图11为SM-0.4M NOESY图谱；
图12为多糖对RAW264.7细胞增值的影响；
图13为多糖对RAW264.7细胞NO含量的影响；
图14为多糖对RAW264.7细胞TNF-α和IL-6含量的影响。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、树莓粗多糖的提取
树莓冻果烘干，粉碎去籽后加1～10倍石油醚(沸程60～90℃)脱脂，除尽石油醚后加入85％乙醇于50～70℃回流除单糖及色素，将过滤后的滤渣加5～30倍纯净水超声提取(功率50～70W，温度：50～90℃，处理时间：60min～100min)，离心取上清，滤渣按原条件再提取两次，合并滤液，减压浓缩至原体积的1/4，加入3～5倍体积的95％的乙醇，于4摄氏度静置24h，过滤收集滤渣，冷冻干燥后即得树莓粗多糖。
二、树莓均一多糖组分的分离与纯化
采用DEAE Sepharose Fast Flow填料进行多糖极性分离，富集中性糖和酸性糖。填料预处理后装柱，用蒸馏水溶解1g树莓粗多糖后取上清液上样。调整流速后用分别用蒸馏水、0.2M NaCl、0.5M NaCl进行洗脱，每种洗脱剂的用量为5个柱体积。采用苯酚硫酸法进行追踪检测，将收集到的树莓多糖组分纯化、浓缩、透析、冷冻，最终蒸馏水、0.2M NaCl、0.5M NaCl三种洗脱剂中依次得到SM-W，SM-0.2M，SM-0.4M。
三、树莓多糖组分分子量测定
通过HPGPC测定多糖分子量和纯度。精密称取样品和标准品，样品配制成5mg/ml溶液，离心，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤后转置于进样小瓶中。色谱条件：色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；流动相：0.05M NaCl溶液；流速：0.6ml/min，柱温：40℃；进样量：20μl；检测器：示差检测器RI-502。
表1 SM-0.4M分子量检测结果
四、树莓多糖组分单糖组成测定
使用离子测谱仪(IC)测定单糖组成。将10种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)配成10mg/ml标准溶液。取各单糖标准溶液精密配置1、5、10、20、50、80、100mg/L梯度浓度标准品做标准曲线。取各样品4mg置于安瓿瓶中，加入2M TFA于120℃水解3h。准确吸取200μl酸水解溶液用氮气吹干，加入1ml水涡旋混匀、离心后取上清进IC分析。色谱柱条件：DionexCarbopacTMPA20(3*150)；流动相：A:H2O；B:250mMNaOH；C:50mMNaOH&500mM NaOAC；流速：0.3ml/min；进样量：5μL；柱温：30℃；检测器：电化学检测器。
表2 SM-0.4M单糖组成
五、多糖组分连接方式测定
多糖样品甲基化衍生后用GC-MS测定其连接方式。样品经甲基化、水解、乙酰化后，经GC-MS测定并与标准质谱图库进行比对。
GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30*0.25*0.25；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。
表3 SM-0.4M甲基化结果
六、多糖组分红外图谱分析
通过FT-IR分析多糖的官能团。精密称取样品2mg和溴化钾200mg，压制成片，空白对照采用溴化钾粉末压片而成。分别置于傅里叶变换红外光谱仪FT-IR650进行扫描记录。
SM-0.4M红外结果：
吸收带在3600-3200cm-1是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：3426cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2927cm-1有吸收峰，归属于C-H伸缩振动。在1741cm-1吸收峰，归属于C＝O伸缩振动。在1616cm-1处有一个吸收峰，归属于C＝O非对称伸缩振动。在1421cm-1有吸收峰，归属于C-O伸缩振动。在1103cm-1有吸收峰，归属于C-O伸缩振动。在1020cm-1有吸收峰，归属于O-H伸缩振动。在765cm-1有吸收峰，可能为吡喃环的伸缩振动。
七、多糖组分核磁图谱及糖链结构
称取多糖样品50mg，将其溶于0.5ml的重水中并冷冻干燥。重复此过程数次后，将样品溶于0.5ml的重水中，在室温25℃下置于以600MHz的核磁共振仪测定1H NMR谱、13CNMR谱、DEPT135一维图谱和二维图谱，见图5～11。
根据以上图谱，SM-0.4M的糖链结构如下：
八、三种树莓多糖组分的体外免疫活性测定
(1)树莓多糖组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖的影响
采用MTT法检测树莓多糖组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖的影响。RAW264.7细胞以1×104浓度铺96孔板。将三种树莓多糖组分用无血清培养基配制到不同浓度，加入孔板中，每个剂量设4个复孔。以LPS(10μg/ml)为阳性对照，不加药组为空白对照。孵育24小时后加入MTT检测。与空白对照相比，SM-0.4M能明显促进小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖，结果如图12。
(2)树莓多糖组分对RAW264.7细胞NO含量的影响
RAW264.7细胞以1×104浓度铺96孔板。将三种树莓多糖组分用无血清培养基配制到不同浓度，加入孔板中，每个剂量设5个复孔。以LPS(10μg/ml)为阳性对照，不加药组为空白对照。孵育24小时后，取细胞培养液，按照NO含量测定试剂盒说明测定培养液中的NO含量。与空白对照相比，SM-0.4M能极显著地提高RAW264.7细胞培养液中NO的含量，且呈现出明显的剂量依赖关系，结果如图13。
(3)树莓多糖组分对RAW264.7细胞因子含量的影响(TNF-α、IL-6)
采用ELiSA试剂盒定量检测RAW264.7细胞培养液中细胞因子TNF-α和IL-6的含量。具体方法如下：RAW264.7细胞以1×104浓度铺96孔板。将三种树莓多糖组分用无血清培养基配制到不同浓度，加入孔板中，每个剂量设5个复孔。以LPS(10μg/ml)为阳性对照，不加药组为空白对照。孵育24小时后，取细胞培养液，按照试剂盒说明书进行检测。与空白对照相比，SM-0.4M能极显著提高RAW264.7细胞培养液中两种细胞因子TNF-α和IL-6的含量，结果如图14。
根据上述试验结果可知，本发明多糖SM-0.4M可促进巨噬细胞大量释放活性因子NO，上调TNF-α和IL-6的表达，增强RAW264.7细胞的吞噬作用，有利于巨噬细胞发挥抗肿瘤的作用，为进一步研究树莓多糖通过巨噬细胞途径发挥抗肿瘤作用提供依据。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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