阅读说明：本技术 一种丙二醛乙醛加合物（maa）的合成方法 (Method for synthesizing Malonaldehyde Acetaldehyde Adduct (MAA) ) 是由 兰萍 胡治勇 习月 冉凯凯 于 2019-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种丙二醛乙醛加合物(MAA)的合成方法,包括以下步骤：步骤一、密闭容器中加入5克Malonildialdehyde-bis-dimethylacetal(Sigma)、5mL的去离子水和25mL的HCl,在室温下低速振摇反应1hr。本发明中,在步骤一中加入6NNaOH中和,再加入加冰丙酮100mL,提取沉淀物并溶于1.5去离子水中,加入与步骤四中去离子水等体积的冰丙酮,密封密闭容器并在在零下20摄氏度环境中放置1.5hr,抽滤反应物,收集沉淀,将产物真空干燥2-6hr或一整夜,将1.4 mmol的丙二醛、0.7 mmol的乙醛、30 mg的人血白蛋白和30 mL的PBS液体混匀,使用氮气密封,并置于37摄氏度的水浴中孵浴3天,然后取出并在4摄氏度的环境下过夜,除去未反应的丙二醛和乙醛,生成丙二醛乙醛(MAA)人血白蛋白加合物溶液。(The invention discloses a method for synthesizing Malonaldehyde Acetaldehyde Adduct (MAA), which comprises the following steps: step one, 5 g of Malonildehyde-bis-dimethyl acetal (Sigma), 5mL of deionized water and 25mL of HCl are added into a closed container, and the mixture is shaken at low speed at room temperature for reaction for 1 hr. In the invention, 6N NaOH is added in the first step for neutralization, 100mL of glacial acetone is added, the precipitate is extracted and dissolved in 1.5 deionized water, the glacial acetone with the same volume as that of the deionized water in the fourth step is added, the sealed container is sealed and placed in an environment at minus 20 ℃ for 1.5hr, the reactant is filtered by suction, the precipitate is collected, the product is dried in vacuum for 2-6hr or overnight, 1.4 mmol of malonaldehyde, 0.7 mmol of acetaldehyde, 30 mg of human albumin and 30 mL of PBS liquid are mixed uniformly, nitrogen is used for sealing, the mixture is placed in a water bath at 37 ℃ for 3 days, and then the mixture is taken out and placed overnight in an environment at 4 ℃ to remove unreacted malonaldehyde and acetaldehyde, so that Malonaldehyde (MAA) human albumin adduct solution is generated.)

一种丙二醛乙醛加合物（MAA）的合成方法

技术领域

本发明涉及丙二醛乙醛加合物合成技术领域，尤其涉及一种丙二醛乙醛加合物（MAA）的合成方法。

背景技术

丙二醛，英文名称Malondialdehyde 或 malonic dialdehyde，简称MDA。化工产业中，可由乙醛和甲酸乙酯在碱作用下缩合而得,主要用于医药中间体、感光色素的原料。 在生物体内，MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤,可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，丙二醛在3类致癌物清单中。

乙醛，又名醋醛，英文名称acetaldehyde，简称AA。化工产业中，可由乙烯，乙醇等氧化制备，是一种无色易流动液体，有刺激性气味。乙醛广泛存在于生物体内。在人体内，乙醛主要是摄入乙醇（酒精）后，代谢产生的。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，与酒精饮料摄入有关的乙醛在一类致癌物清单中、乙醛在2类致癌物清单中。

乙醛和丙二醛，都属于比较活泼的化学物质，在体内生成后，会与蛋白质发生复杂作用，形成相对稳定的丙二醛-乙醛加合物（MAA）。

体内的MAA加合物来源主要有两个途径：

乙醇代谢产生乙醛。长期酒精摄入可使肝脏线粒体功能紊乱， 氧化乙醛的能力大大下降，导致肝内乙醛含量增加，并进一步生成丙二醛。它们与蛋白质发生复杂的反应产生新的加合物， 即为丙二醛-乙醛（MAA）蛋白加合物。

多不饱和脂肪酸过氧化反应产生丙二醛，丙二醛在体内可降解为乙醛，并进一步与蛋白质发生复杂的反应，形成丙二醛-乙醛（MAA）蛋白加合物。

体内生产的丙二醛-乙醛（MAA）蛋白加合物，对免疫系统来说，是一种异源物质，会使机体产生相应的抗体，已有研究表明，MAA抗体水平和冠心病进程的严重程度呈正比。

因此，本发明提出一种新的MAA加合物制备方法。

发明内容

本发明的目的在于：为了解决用于预测冠心病进程的严重程度的丙二醛乙醛加合物通常在人体内生成，并难以提取的问题，而提出的一种丙二醛乙醛加合物（MAA）的合成方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种丙二醛乙醛加合物（MAA）的合成方法，包括以下步骤：

步骤一、密闭容器中加入5克Malonildialdehyde-bis-dimethylacetal（Sigma）、5mL的去离子水和25mL的HCl，在室温下低速振摇反应1hr；

步骤二、反应产物置于冰上冷却15min，逐滴加入6NNaOH中和至中性；

步骤三、逐滴加冰丙酮100mL，置于冰上反应1hr；

步骤四、抽滤步骤三中的反应产物，收集沉淀，并溶于1-1.5ml去离子水中；

步骤五、再次逐滴加入与步骤四中去离子水等体积的冰丙酮；

步骤六、密封密闭容器并在在零下20摄氏度环境中放置1.5hr；

步骤七、再次抽滤反应物，收集沉淀，将产物真空干燥2-6hr或一整夜；

步骤八、转至室温密闭玻璃容器中，避光保存；

步骤九、将1.2-1.6 mmol的丙二醛、0.4-0.8 mmol的乙醛、30 mg的人血白蛋白、30 mL的 PBS 液体混匀；

步骤十、使用氮气密封，并置于37摄氏度的水浴中孵浴3天;

步骤十一、然后取出并在4摄氏度的环境下过夜，然后用透析袋除去未反应的丙二醛和乙醛；

步骤十二、对步骤十一提取的MAA加合物采用SDS-PAGE验证和质谱MAIDI-TOF-MS验证。

作为上述技术方案的进一步描述：

步骤四中，去离子水选取1.5mm。

作为上述技术方案的进一步描述：

步骤四和步骤七中均选取布氏漏斗加1#滤纸对反应物进行抽滤。

作为上述技术方案的进一步描述：

步骤七中将产物真空干燥一整夜。

作为上述技术方案的进一步描述：

选取1.4 mmol丙二醛和0.7 mmol乙醛。

作为上述技术方案的进一步描述：

选取武汉戴安生物有限公司自行制备的30 mg的人血白蛋白。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明中，通过在密闭容器中加入Malonildialdehyde-bis-dimethylacetal（Sigma）、5mL的去离子水和25mL的HCl，然后加入加入6NNaOH中和，再加入加冰丙酮100mL，提取沉淀物并溶于1.5去离子水中，再次逐滴加入与步骤四中去离子水等体积的冰丙酮，密封密闭容器并在在零下20摄氏度环境中放置1.5hr，再次抽滤反应物，收集沉淀，将产物真空干燥2-6hr或一整夜，生成100mg丙二醛，将1.2-1.6 mmol的丙二醛、0.4-0.8 mmol的乙醛、30 mg的人血白蛋白和30 mL的 PBS 液体混匀，使用氮气密封，并置于37摄氏度的水浴中孵浴3天，然后取出并在4摄氏度的环境下过夜，然后用透析袋除去未反应的丙二醛和乙醛，此时生成溶于0.1 M的磷酸盐缓冲液中的1 mg/ml 的丙二醛乙醛（MAA）人血白蛋白加合物溶液，通过此种合成方式，相比在人体内提取所需要的条件更加简单。

附图说明

图1为本发明提出的一种丙二醛乙醛加合物（MAA）的合成方法的SDS-PAGE验证的示意图；

图2为本发明提出的一种丙二醛乙醛加合物（MAA）的合成方法的加合物的质谱验证的示意图；

图3为本发明提出的一种丙二醛乙醛加合物（MAA）的合成方法的乙醛化、丙二醛化和丙二醛-乙醛化蛋白质示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

请参阅图1-3，一种丙二醛乙醛加合物（MAA）的合成方法，包括以下步骤：

步骤一、密闭容器中加入5克Malonildialdehyde-bis-dimethylacetal（Sigma）、5mL的去离子水和25mL的HCl，在室温下低速振摇反应1hr；

步骤二、反应产物置于冰上冷却15min，逐滴加入6NNaOH中和至中性；

步骤三、逐滴加冰丙酮100mL，置于冰上反应1hr；

步骤四、抽滤步骤三中的反应产物，收集沉淀，并溶于1-1.5ml去离子水中；

步骤五、再次逐滴加入与步骤四中去离子水等体积的冰丙酮，溶液会变得浑浊；

步骤六、密封密闭容器并在在零下20摄氏度环境中放置1.5hr，看见针状白色结晶析出；

步骤七、再次抽滤反应物，收集沉淀，将产物真空干燥2-6hr或一整夜，由此得到NaMDA；

步骤八、将上述产物转至室温密闭玻璃容器中，避光保存，当见到明显白色针状结晶析出时，丙二醛生成；

步骤九、将1.2-1.6 mmol的丙二醛、0.4-0.8 mmol的乙醛、30 mg的人血白蛋白和30 mL的 PBS 液体混匀；

步骤十、使用氮气密封，并置于37摄氏度的水浴中孵浴3天;

步骤十一、然后取出并在4摄氏度的环境下过夜，然后用透析袋除去未反应的丙二醛和乙醛，所得产物即为“溶于0.1 M的磷酸盐缓冲液中的1 mg/ml 的丙二醛乙醛（MAA）人血白蛋白加合物溶液”；

步骤十二、对步骤十一提取的MAA加合物采用SDS-PAGE验证和质谱MAIDI-TOF-MS验证，加合反应后，通过SDS-PAGE验证，HAS分子量由67kDa增加至100kDa左右，证明加合物制备成功，通过质谱MAIDI-TOF-MS验证，质荷比为36600，电荷量为3，实际分子量为102.8kDa。远高于BSA的正常分子量65kda，说明加合物合成成功。

实施例2

请参阅图1-3，一种丙二醛乙醛加合物（MAA）的合成方法，包括以下步骤：

步骤一、密闭容器中加入5克Malonildialdehyde-bis-dimethylacetal（Sigma）、5mL的去离子水和25mL的HCl，在室温下低速振摇反应1hr；

步骤二、反应产物置于冰上冷却15min，逐滴加入6NNaOH中和至中性；

步骤三、逐滴加冰丙酮100mL，置于冰上反应1hr；

步骤四、采用布氏漏斗加1#滤纸抽滤步骤三中的反应产物，收集沉淀，并溶于1.5ml去离子水中，布氏漏斗加1#滤纸方便提取结晶，在布氏漏斗内加1#滤纸，方便冰丙酮冲洗沉淀；

步骤五、再次逐滴加入与步骤四中去离子水等体积的冰丙酮，溶液会变得浑浊；

步骤六、密封密闭容器并在在零下20摄氏度环境中放置1.5hr，看见针状白色结晶析出；

步骤七、采用布氏漏斗加1#滤纸抽滤反应物，收集沉淀，将产物真空干燥2-6hr或一整夜，由此得到NaMDA，布氏漏斗加1#滤纸方便提取结晶；

步骤八、将上述产物转至室温密闭玻璃容器中，避光保存，当见到明显白色针状结晶析出时，丙二醛生成；

步骤九、步骤九、将1.2-1.6 mmol的丙二醛、0.4-0.8 mmol的乙醛、30 mg的人血白蛋白和30 mL的 PBS 液体混匀；

步骤十、使用氮气密封，并置于37摄氏度的水浴中孵浴3天;

步骤十一、然后取出并在4摄氏度的环境下过夜，然后用透析袋除去未反应的丙二醛和乙醛，所得产物即为“溶于0.1 M的磷酸盐缓冲液中的1 mg/ml 的丙二醛乙醛（MAA）人血白蛋白加合物溶液”；

步骤十二、对步骤十一提取的MAA加合物采用SDS-PAGE验证和质谱MAIDI-TOF-MS验证，加合反应后，通过SDS-PAGE验证，HAS分子量由67kDa增加至100kDa左右，证明加合物制备成功，通过质谱MAIDI-TOF-MS验证，质荷比为36600，电荷量为3，实际分子量为102.8kDa。远高于BSA的正常分子量65kda，说明加合物合成成功。

实施例3

请参阅图1-3，一种丙二醛乙醛加合物（MAA）的合成方法，包括以下步骤：

步骤一、密闭容器中加入5克Malonildialdehyde-bis-dimethylacetal（Sigma）、5mL的去离子水和25mL的HCl，在室温下低速振摇反应1hr；

步骤二、反应产物置于冰上冷却15min，逐滴加入6NNaOH中和至中性；

步骤三、逐滴加冰丙酮100mL，置于冰上反应1hr；

步骤四、采用布氏漏斗加1#滤纸抽滤步骤三中的反应产物，收集沉淀，并溶于1.5ml去离子水中，布氏漏斗加1#滤纸方便提取结晶，在布氏漏斗内加1#滤纸，方便冰丙酮冲洗沉淀；

步骤五、再次逐滴加入与步骤四中去离子水等体积的冰丙酮，溶液会变得浑浊；

步骤六、密封密闭容器并在在零下20摄氏度环境中放置1.5hr，看见针状白色结晶析出；

步骤七、采用布氏漏斗加1#滤纸抽滤反应物，收集沉淀，将产物真空干燥2-6hr或一整夜，由此得到NaMDA，布氏漏斗加1#滤纸方便提取结晶；

步骤八、将上述产物转至室温密闭玻璃容器中，避光保存，当见到明显白色针状结晶析出时，丙二醛生成；

步骤九、将1.4 mmol的丙二醛、0.7 mmol的乙醛、武汉戴安生物有限公司自行制备的30mg的人血白蛋白和30 mL的 PBS 液体混匀，选取将1.4 mmol的丙二醛、0.7 mmol的乙醛，后续生成的加合物检验时，通过质谱MAIDI-TOF-MS验证，提高实际的分子量；

步骤十、使用氮气密封，并置于37摄氏度的水浴中孵浴3天;

步骤十一、然后取出并在4摄氏度的环境下过夜，然后用透析袋除去未反应的丙二醛和乙醛，所得产物即为“溶于0.1 M的磷酸盐缓冲液中的1 mg/ml 的丙二醛乙醛（MAA）人血白蛋白加合物溶液”；

步骤十二、对步骤十一提取的MAA加合物采用SDS-PAGE验证和质谱MAIDI-TOF-MS验证，加合反应后，通过SDS-PAGE验证，HAS分子量由67kDa增加至100kDa左右，证明加合物制备成功，通过质谱MAIDI-TOF-MS验证，质荷比为36600，电荷量为3，实际分子量为109.8kDa。远高于BSA的正常分子量65kda，说明加合物合成成功。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。