玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10在改变植物抗逆性中的应用
阅读说明：本技术 玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10在改变植物抗逆性中的应用 (Application of corn 10kDa heat shock protein gene ZmHsp10 in changing stress resistance of plants ) 是由 张举仁 李鹏 李朝霞 于 2020-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10在改变植物抗逆性中的应用,是从玉米中克隆基因ZmHsp10,以正义或反义形式将该基因重组到植物表达载体中,利用转基因技术将融合基因导入植物,通过对转基因植株进行抗旱性或耐热性测定,筛选出抗性明显提高或降低的转基因植株及其后代,创造出具有应用价值的植物新种质。其中所述玉米基因ZmHsp10的cDNA序列如SEQ ID No.1所示,其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述植物是指农作物或草坪草。本发明的应用对提高在干旱和热胁迫下作物产量有重要意义。(The invention discloses an application of a corn 10kDa heat shock protein gene ZmHsp10 in changing plant stress resistance, which is to clone a gene ZmHsp10 from corn, recombine the gene into a plant expression vector in a sense or antisense form, introduce a fusion gene into a plant by using a transgenic technology, and screen out a transgenic plant and progeny thereof with obviously improved or reduced resistance by carrying out drought resistance or heat resistance determination on the transgenic plant, thereby creating a new plant germplasm with application value. Wherein the cDNA sequence of the corn gene ZmHsp10 is shown in SEQ ID No.1, and the coded amino acid sequence is shown in SEQ ID No. 2; the plant is a crop or a turf grass. The application of the invention is of great significance to the improvement of crop yield under drought and heat stress.)
技术领域
本发明属植物生物工程育种领域，具体说，涉及一种玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10在改变植物抗旱性和耐热性中的应用。
背景技术
近年来，伴随着全球气温的升高干旱和热胁迫对主要农作物产量的影响越来越重。在我国淮河以南地区和黄淮海地区的7-9月间气温通常高于玉米的适宜生长温度，高温会引起玉米严重减产。我国约二分之一国土面积处干旱、半干旱区。即使在非干旱地区的主要农业区，也不时受到旱灾侵袭，水资源短缺是限制我国农业及国民经济发展的最重要因素之一。玉米植株高大，耗水量较多，生长发育期易受到高温干旱的侵袭，高温干旱是影响我国玉米产量的主要环境因素。玉米抽穗期的严重高温或干旱造成玉米大幅度减产或绝产。采用基因操作技术培育耐热耐旱玉米具有重要的战略意义，是应对全球气温不断升高和提高我国玉米产量、保障粮食安全及农业可持续发展的重要选择。
早在上世纪70-80年代初期，人们已发现细胞在遭受热胁迫时会合成一类应激蛋白，它们具有不同大小的分子量，作用机理也有明显差别。植物热激蛋白根据分子量大小可以分为HSP60、HSP70、HSP90、HSP100和小分子HSP家族(small Heat Shock Proteins,sHSPs)。小分子热激蛋白分子量一般为12-34KD，它的分布极为广泛，普遍存在于所有生物体内。小分子热激蛋白具有多种功能，包括赋予细胞以耐热性以抵抗高温，作为分子伴侣(molecular chaperones)以防止蛋白聚集，对抗正常的细胞死亡，从而调节细胞的生存和死亡的平衡。小分子热激蛋白是一种重要的分子伴侣，能与很多蛋白质分子结合，发挥多种生理功能：帮助氨基酸链折叠成三维正确的结构、清除受损而无法正确折叠的氨基酸链、防止蛋白聚集、护送蛋白分子寻找目标分子以免受到其它分子的干扰等。
分子伴侣是指具有介导其它蛋白质的正确装配但自己不成为最后功能结构中的蛋白，它们由许多不相关的蛋白质组成。1987年Lasky首先提出了分子伴侣的概念，将细胞核内能与组蛋白结合并能介导核小体有序组装的核质素(nucleoplasmin)称为分子伴侣。根据Ellis的定义，这一概念延伸为"一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份"。在蛋白合成过程中，伴侣分子能识别与稳定多肽链的部分折叠的构象，从而参与新生肽链的折叠与装配。热休克蛋白就是一大类分子伴侣。
不同植物中的热激蛋白的数目差异较大，例如，在拟南芥中有13个HSP20、8个HSP70、7个HSP90、8个HSP100和21个热激蛋白转录因子(Hsfs)。在植物中，小分子热激蛋白(sHSPs)是含量最丰富、分布最为广泛的热激蛋白分子量一般为12～43kD，且大部分蛋白的C端都包含1个80～100个氨基酸序列的α－晶体蛋白结构域(ACD)。sHSPs在植株正常生长条件下通常是含量很低，但逆境条件能激活其表达，一般情况下生物胁迫和非生物胁迫均可以诱导小分子热激蛋白的表达，其中高温胁迫是最主要的诱导因素。且在高温胁迫时，sHSPs含量短时间内急剧增加，种类也比其它热激蛋白多。不同植物中，小分子热激蛋白的种类和数目各异，这可能与植物的种类及生活习性有关。植物smHSP基因都是核基因编码的，具有丰富的功能和遗传多样性,参与细胞生命活动的多个重要进程，根据其亚细胞定位和氨基酸序列的同源性被分为不同的种类。通常将植物的sHSPs分为5大亚家族：①定位在细胞质或细胞核的CI、CII、CIII、CIV、CV、CVI和CVII亚家族；②定位于线粒体的MI和MII亚家族；③定位于质体的P亚家族；④定位于内质网的ER亚家族；⑤定位于过氧化物酶体的Po亚家族。如在拟南芥中有19个sHSPs基因，其产物定位在细胞质/细胞核中的有sHSPs13个，定位在内质网中和过氧化物酶体中的sHSP各1个，定位在线粒体和叶绿体中的sHSPs各2个。在水稻中鉴定出了23个sHSPs基因，分布在不同细胞器中的sHSPs个数也不尽相同。
sHSPs在生物体应对生物或非生物胁迫中，能够维持天然蛋白的稳定性，并在保护膜结构等方面发挥重要的作用。任何蛋白的功能都是由其构造和三维结构的折叠方式所决定的，sHSPs能调控蛋白质的折叠、积累及其定位和降解。sHSPs形成的聚合体能够与体内受胁迫后产生的损伤蛋白相结合以防止它们聚集；在ATP存在的条件下可与HSP100或HSP70相互作用，帮助受损蛋白重新折叠，恢复其生物功能。sHSPs在植物面临胁迫时发挥着重要的作用，且抗胁迫能力具有多样性。研究表明，热诱导后小分子热激蛋白sHSP17.4大量表达，提高了拟南芥的抗旱性，而干旱敏感突变株的sHSP17.4表达量很低，sHSP17.4在干旱胁迫下可以通过保护细胞组分使植物维持生长发育。在拟南芥中过表达CII类AtHSP17.6A可以增强植株的耐盐和抗旱能力，AtHSP17.6A的表达受热、渗透胁迫以及种子发育过程的诱导。对花生实施热激处理(生长室温度高于环境温度10℃以上)，发现热激蛋白被快速(0.5小时)诱导，尤其是小热激蛋白(HSP 17、HSP 40)在耐热基因型中被迅速诱导，而且持续时间长时间(2h)，很可能是植株应对高温胁迫的生理适应机制。过表达AtHSP22.0基因后，拟南芥种子耐受衣霉素胁迫的能力明显提高，种子萌发率明显高于野生型。细胞质CI型sHSP在种子的胚胎形成以及成熟过程中表达量均会升高。也有研究表明，在拟南芥中异位过表达百合的小分子热激蛋白基因LimHSP16.45，可通过阻止不可逆的蛋白聚集和清除细胞内的活性氧等途径，提高转基因植株对逆境胁迫的抵抗能力。在水稻中过表达小分子热激蛋白基因sHSP17.7可以增强转基因植物的耐热性和对B类紫外线的抗性，该基因在水稻的抗旱中也起到重要作用。水稻OsHSP18.6可由干旱、盐和寒冷等不同的胁迫引起，特别是在高温下。该基因在根、茎、叶、节间和小穗中均有表达，过表达OsHSP18.6的转基因植物的耐热性和抵抗其他非生物胁迫的能力明显提高。在高温和干旱条件下，过表达植株丙二醛(MDA)水平较低，过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性较高，不育率下降，但其他农艺性状无显著变化。RNAi干扰水稻OsHSP18.0降低了植株对细菌的抗性，以及耐热性和耐盐性。紫花苜蓿MsHSP17.7在高温、高盐、氧化胁迫以及干旱环境中均可被诱导表达，过表达MsHSP17.7转基因植物显著提高了植株对高盐胁迫的抗性能力，表明该基因在植物抵抗盐渍化胁迫方面具有重要的作用。
在高温胁迫下，植物光合效率下降，生长变慢或停止。叶绿体的小分子热激蛋白(CP-sHSP)作为质体中含量最丰富的热激蛋白，在植物遇到热胁迫时对光合作用的细胞器行使保护功能。CP-sHSP保护叶绿体膜、与膜结合的蛋白，并稳定细胞的膜结构。CP-sHSP的生成可以减轻光系统II(PS II)的光抑制，且在同一种植物的不同基因型中，耐热性的强弱与CP-sHSP的表达水平相关。另外，转基因试验证明CP-sHSPs在植物应对热胁迫中发挥重要的保护作用。在烟草中过量表达CP-sHSPs可以增加光系统Ⅱ在高温胁迫下的稳定性。番茄中，CP-sHSP只有在高温胁迫下(47℃)才会对PSII起到保护作用，在常温下(25℃)没有此功能。
过表达线粒体的热激蛋白基因可以明显抑制植物的细胞程序性死亡，小分子热激蛋白形成的复合体在其中具有重要作用。小分子热激蛋白之间相互作用，从而形成复合体参与植物的耐热反应，如水稻HSP17.7可以与HSP16.9A互作。线粒体sHSPs在植物耐热性方面发挥了重要的作用，可以减轻线粒体中蛋白质复合物的损伤，保证细胞正常的电子传递、ATP合成，促使植物在高温胁迫条件下能维持正常生长。将辣椒的小热激蛋白基因CaHSP24进行了分子克隆和逆境表达分析，发现该基因在非生物胁迫下的表达量明显上升，说明该基因参与了植物的逆境响应。若将辣椒的CaHSP26基因在拟南芥中异位过表达，则增强转基因植株的耐热能力。为了阐明线粒体小热休克蛋白(MT-sHSP)在热休克反应中的作用，将35S启动子控制的番茄MT-sHSP22基因导入烟草，检测转化植株的耐热性。无论该基因正义或反义，转基因植株在营养生长阶段表现出正常的形态和生长速度。4周龄幼苗在突然热胁迫下，过表达MT-sHSP22的植株表现出耐热性，sHSP22蛋白的积累可以提高其细胞的抗氧化胁迫能力和适应性；而表达被抑制的反义植株表现出敏感性。
内质网小分子热激蛋白ER-sHSP在高温下的表达量会显著升高，例如番茄的LeHSP21.3和拟南芥的AtHSP22.0对高温有一定的抵御作用。花生小热激蛋白基因(sHSP)的诱导表达可以增强植株在高温下的生理性适应能力。有研究者结合高温胁迫下的牡丹的转录组测序，确定了小热激蛋白参与牡丹对高温的抵抗能力。另外，内质网小热激蛋白基因过表达，转基因植物的抗衣霉素能力较对照显著增强，说明该基因在一定程度上能减轻外界给内质网带来的胁迫压力。
不同的非生物胁迫因素严重影响了植物的生长与发育，选育优良的抗逆品种是提高作物抗胁迫性的主要途径。植物对高温、干旱以及其他逆境胁迫响应是多基因控制的复杂的生物过程。虽然小热激蛋白能够在植物面临生物胁迫、热胁迫等逆境胁迫时被激活表达，参与植物抗逆性提高，但主要工作集中在细胞质定位的sHSPs上，CP-sHSP、MT-sHSP和ER-sHSP基因表达量变化对植株抗逆性影响的工作集中在耐热性变化上，有关MT-sHSP表达量变化对植物抗旱性影响的工作未见报道，有关sHSPs能否被用来改变玉米抗逆性的工作也未见报道，植物热激10kD蛋白(sHsp10)在玉米等作物中功能研究也缺乏报道。
热激10kD蛋白(Hsp10)又称伴侣蛋白10(Cpn10，chaperonin 10)，大肠杆菌中的同源物是GroES。Cpn10是热休克蛋白家族的成员，已从细菌、质体或线粒体中分离纯化出来。在大肠杆菌中，GroEL有时被称为分子伴侣，而GroES被称为辅分子伴侣(Co-chaperonin)，因为GroEL在指导折叠的过程中起到了重要的作用，而GroES辅助它的活性功能。整个GroEL/GroES的分子量为～106道尔顿，与核糖体小亚基相近。Cpn家族是具有独特的双层7-9元环状结构的寡聚蛋白，它们以依赖ATP的方式促进体内蛋白质折叠。Cpns可分为两组:Hsp60(GroEL)家族和TriC家族。Hsp60型的Cpns存在于真细菌、线粒体和叶绿体中，由双层圆环组成，每层有7个同型亚基，每个亚基分子量约为60Kd。它们在体内与一种辅助因子，即Hsp10亚基构成的7聚体相结合，如E.coli中与GroES相结合，协同帮助蛋白折叠。除了叶绿体中的类似物外，这些蛋白是胁迫诱导的。有报道指出Cpn60和Cpn10在ATP存在下形成稳定的二元配合物。这一现象被用作鉴定马铃薯线粒体中Cpn10同源物的基础。当GroES与GroEL结合后，它诱导近端GroEL的一个构型变化，增加中心空洞的体积，改变了底物所处的环境。ATP在GroEL行使功能中起重要作用。每个GroEL的亚基都含有一个ATP分子。近端环上亚基上的ATP对于底物的折叠是必要的，GroES和底物的释放需要远端环的ATP水解。在植物中Hsp10功能的研究很少，只知道在冷处理的根中和缺氧植株叶片中cpn10被发现上调，似乎是一种钙调素结合蛋白(Yang and Poovaiah,2000)，可能参与了冷信号传导。未见到Hsp10或cpn10在植物抗逆性中作用的报道。
玉米ZmHsp10基因(GRMZM2G035063)编码一个10Kd的热激蛋白(GRMZM2G035063_P01(GenBank accession:DAA41590)；UniProt accession(s):GRMZM2G035063-B6SLX1)，长度2254bp，位于玉米2号染色体214323983..214329237处，含有2个内含子和3个外显子。在GenBank中注册为ZEAMMB73_172782或ZEAMMB73_100400，在NCBI Gene(Entrez Gene)为103647892。经典转录本为GRMZM2G035063_T01，cDNA长度779bp，编码蛋白98氨基酸。依据序列相似性推测，ZmHsp10在高粱中的同源基因为Sb02g040870，水稻中的同源基因为LOC_Os07g44740，在拟南芥中为AT1G23100.1，后者编码一个GroES-like family protein。ZmHsp10是一个表达丰度较高的基因，最高转录本水平出现在玉米胚乳中，其次为胚和根的分生区及伸长区，苗期植株的初生根和幼叶、未成熟雄穗的表达水平也较高，而在成熟叶片和节间中表达水平很低。ZmHsp10在玉米中有同源基因GRMZM2G013652(GenBank:ZEAMMB73_881784,ZEAMMB73_298840；NCBI Gene(Entrez Gene):100193174)，后者存在于7号染色体上(Chr7:169306985..169311988)，经典长度2003bp。在高粱中的同源基因为Sb02g040870，水稻中的同源基因为LOC_Os07g44740，推测编码chaperonin蛋白，而在拟南芥中的同源基因仍为AT1G23100.1。GRMZM2G013652编码GroES-like family protein，有3个不同转录本，经典转录本为GRMZM2G013652_T01，cDNA长866bp，包括3个外显子和2个内含子，经典蛋白为GRMZM2G013652_P01(GenBank accession:DAA63865；UniProt accession(s):GRMZM2G013652-B4FE30)，有98个氨基酸。第2种转录本GRMZM2G013652_T02(TranscriptID:DAA63867)长1217bp，包括2个外显子和2个内含子，编码的多肽为83个氨基酸长度。第3种转录本为GRMZM2G013652_T03(Transcript ID:DAA63866)，长度712bp，包括3个外显子和2个内含子，编码多肽为98个氨基酸，与GRMZM2G013652_P01序列完全一致。GRMZM2G013652是一个遍在性的表达水平较高的基因，在玉米胚乳及幼胚、根的分生区和延长区、V7-V9期节间及叶基部、茎端及分生组织、未成熟雄穗和果穗中转录本高丰度表达，在胚及胚乳、果穗原基、萌发籽粒和营养生长期的分生组织中蛋白质强度高，即在迅速分裂和生长的器官中大量合成。在拟南芥中，与ZmHsp10相似的基因还有AT1G14980.1，后者可能编码线粒体定位的分子伴侣10，能互补大肠杆菌的groES突变，其mRNA丰度受热胁迫而上调，在不同器官中均表达。
经检索有关ZmHsp10基因及其编码的10Kd热激蛋白的功能及在植物抗逆中的作用未见报道。
发明内容
针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10在改变植物抗旱性和耐热性中的应用。
本发明所述的玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10在改变植物抗逆性中的应用；其中：所述玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述的抗逆性是指耐旱性和耐热性。
上述的应用中：所述植物是指农作物或草坪草。
其中：所述农作物优选是玉米或高粱，所述草坪草优选是早熟禾或黑麦草。
申请人通过筛选不同基因型玉米在干旱处理前后的cDNA扣除文库中发现，ZmHsp10基因转录本在玉米植株遭受干旱胁迫后显著上调表达，且在抗旱自交系中表达丰度上调幅度大。经测序鉴定，cDNA全长779bp，编码98氨基酸，序列检索得出该基因转录本编码一个10Kd的热激蛋白(ZmHsp10)。本发明所述的玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10在氨基酸水平上与其他植物的10kD的热激蛋白有相似性，在氨基酸水平上与野生水稻(Oryzabrachyantha)的XP_006658032.1的同一性最高，为91％；与水稻XP_015647372.1的同一性为90％。将该cDNA重组到植物表达载体pCUA中，用玉米Ubquitin1启动子或诱导型启动子RD29A/B启动转录，以nos终止子终止转录，构建出表达插盒及植物转化载体。
本发明所述的玉米ZmHsp10基因除有cDNA形式外，还可以基因组基因形式重组入植物转化载体；其编码序列可以正义形式或反义形式或基因编辑结构形式构建融合基因，后者用于植物转基因。
本发明提供了利用玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10通过转基因过表达技术培育在遭受干旱胁迫后产量显著高于对照组的玉米耐旱新品系的应用。
本发明提供了利用玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10通过转基因过表达技术培育在遭受热胁迫后植株成活率和叶色明显优于野生型的早熟禾耐热新品系的应用。
基本方法是：从玉米中克隆ZmHsp10基因，用于构建植物转化的表达载体，然后利用转基因技术生产转基因过表达或表达降低的植株，或采用基因编辑技术增加或敲除ZmHsp10基因的表达。通过对转基因植株进行抗旱性测定，筛选出抗旱明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出具有应用价值的植物新种质。具体是：
玉米ZmHsp10基因克隆和分析
首先，从玉米基因组DNA或cDNA中克隆出ZmHsp10基因，后者表达后产生一个98氨基酸的小蛋白。如采用PCR方法从玉米齐319的cDNA文库中克隆出完整的cDNA序列，测序鉴定得的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，即确定为ZmHsp10基因的cDNA形式。利用获得的cDNA序列设计引物，采用PCR方法从玉米自交系齐319基因组中扩增出ZmHsp10基因的基因组序列。将ZmHsp10基因cDNA的5’端序列在NCBI中进行BLAST，获得了一系列不同长度的序列，用于分析该基因的转录调控元件，然后通过定点插入增强子以促进基因表达来代替转基因过表达操作。
玉米ZmHsp10基因植物表达载体的构建
在植物中高效表达ZmHsp10需要将ZmHsp10重组到植物表达载体中并应用于植物转基因，产生工程植株。首先通过常规的基因重组技术将玉米ZmHsp10基因插入植物转化载体的目标基因(转基因)的插盒中形成融合基因，然后将产生的质粒转入受体细胞，经选择、鉴定，获得工程菌株。本发明所说的融合基因是由ZmHsp10基因编码框与启动子和转录终止区连接形成的基因表达结构，ZmHsp10编码框可正向或反向位于启动子3′端、转录终止区5′端。启动子可具有不同的启动特性，如胁迫诱导型启动子RD29A/B启动子、组成型启动子Ubiquitin 1启动子。重组质粒的受体细胞有大肠杆菌和根瘤农杆菌细胞。
玉米ZmHsp10基因转化植物
本发明中，用含有玉米ZmHsp10基因的植物表达载体转化植物。根据转基因受体材料的特点选用不同的转基因方法以批量获得转基因植株。以下以玉米为例简述转基因植物获得及筛选过程。
常用的玉米转化方法有：1)直接转化法，即提取重组质粒DNA，采用基因枪轰击法、电融合法等将质粒DNA导入细胞。2)农杆菌介导的遗传化方法。此外，还有将不同类方法组合使用的转化程序，如将基因枪轰击法和农杆菌结合使用以提高转化效率。以下以玉米自交系胚性愈伤组织为材料采用基因枪轰击法进行遗传转化为例予以说明。
玉米自交系植株在自交授粉后9-15天，取果穗剥去苞叶后于70％酒精中浸泡5min，无菌条件下挑取约1.0-1.5mm大小的幼胚接种于诱导培养基上，培养4-6周得到松脆、淡黄色的II型愈伤组织，然后继代培养。每10-15天继代培养一次。所得到的II型愈伤组织作为遗传转化的受体材料。
本发明中，可选用基因枪轰击法进行遗传转化。首先从含有玉米ZmHsp10重组质粒的受体细胞提取高质量质粒DNA，受体细胞为E.coli，重组质粒一般约4-5kb。采用常规方法培养工程菌和提取、纯化质粒。然后制备微弹，即称取1.0μm大小的金粉，经70％乙醇洗涤后静置15分钟，离心去除上清液；再用无菌水清洗3次，然后50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹)贮存备用。使用时涡旋5分钟以打破金粉凝集，依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl12.5M CaCl2、20μl 0.1M亚精胺，边加样边旋涡。然后，继续旋涡2～3分钟，静置1分钟。离心弃去上清液，再加70％乙醇静置，离心弃去上清液，再用无水乙醇重悬，取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹丸0.5mg。
在本发明中，取直径9cm的培养皿中倒入0.3cm厚的无菌培养基，然后将愈伤组织高密度放入培养皿中，每皿轰击一次。轰击参数取：可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6--9cm。其它参数按使用说明书取值。轰击后材料在暗中恢复培养3天，然后将材料转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的目标基因充分表达。再将材料转入加有选择剂(如0.09％除草剂草丁膦)的培养基上进行筛选。连续筛选2代，每代15天，然后抗性愈伤组织转入不加筛选剂的培养基上在光照16小时/天下恢复培养1代，再转入分化培养基上分化小苗。愈伤组织产生的小苗在生根培养基中生根，壮苗后移入花盆，长至约10cm高时栽到大田或温室，自交结实。转基因植株通过数代分子检测和自交结实产生纯系，然后通过抗性鉴定和田间选择获得转基因优异材料。
本发明中转基因植株的鉴定采用PCR检测法筛选，Southern blotting验证。即提取除草剂抗性小苗叶片DNA用于PCR检测。根据筛选标记基因和目的基因ZmHsp10的cDNA序列设计引物，分别进行PCR检测。从转基因植株中扩增出转基因的目的条带，而未转基因的对照植株则不出现相同大小的目的条带，初步推断这些PCR阳性植株是转基因植株。再取阳性植株叶片提取DNA用于Southern blotting验证，选取转基因植株自交繁殖。
玉米转ZmHsp10基因植株的选择及利用
本发明中，为了了解转基因与植株抗逆性的关系，选取PCR阳性的遗传稳定的T2代转基因植株、基因编辑植株，以未转基因对照为材料，提取叶片RNA，通过Real time RT-PCR检测目标基因的表达强度。在玉米转基因材料检测中，以玉米Ubiquitin1基因为内标基因。在玉米转ZmHsp10基因过表达株系中，ZmHsp10的mRNA丰度是对照植株的2.4-6.83倍；在转ZmHsp10反义结构的株系中，ZmHsp10基因的mRNA丰度为对照植株的0.41-0.75倍。在基因编辑植株中检测不出ZmHsp10转录本，这表明在这些转基因株系中转基因得到了有效的表达。在本发明中，转基因植株后代选择和抗旱性测定分阶段进行。
在正常生长条件下，3叶期转基因植株、基因编辑植株和受体自交系(未转基因对照)植株在表型上差异不显著。测定正常生长条件下3叶期植株的生物量，得出ZmHsp10过表达植株生长较快。当植株长到11-14叶期时，转基因植株和受体自交系植株在表型上的差异不明显。对3叶期的T2代转基因玉米和受体自交系小苗进行干旱致死实验。大部分玉米小苗经过7天的干旱胁迫处理后，叶片已接近干枯，茎基部变软，挑出因干旱胁迫频临死亡的小苗恢复浇水，观察不同株系小苗的恢复情况。不同株系抗干旱胁迫能力的差异明显，经受相同程度的干旱胁迫后再恢复浇水2天，转基因过表达株系大部分植株恢复正常生长，而对照和反义株系的植株大部分干枯死亡，ZmHsp10基因编辑植株已全部死亡。
在玉米植株长至10叶期时开始控制土壤含水量，相对含水量维持在50％-55％之间，胁迫处理8天，然后恢复正常浇水，植株一周后开始抽雄。同时，设置正常浇水条件下的对照区。在干旱胁迫过程中观察转基因玉米植株和受体自交系植株的表型变化，并于胁迫处理的0、2、4、6、8天和恢复浇水后一周分别取材测定各项生理指标。在正常生长条件下转ZmHsp10基因株系的形态特征和生长发育速率与WT相比差别不大。经受5天的干旱胁迫后，受体自交系植株、转ZmHsp10反义结构的植株和基因编辑植株的叶片严重卷曲、变黄，而转ZmHsp10基因过表达植株叶片萎蔫程度较轻，叶色较为翠绿。分别测定了不同条件和取样时间的玉米叶片细胞膜离子渗漏率和丙二醛含量，得出在正常生长条件下转基因株系和受体自交系植株、基因编辑植株的丙二醛含量和细胞膜离子渗漏无显著差别。随着干旱胁迫时间的延长，丙二醛含量和细胞膜离子渗漏率明显升高，其中转ZmHsp10基因过表达株系的升高幅度均较小。胁迫8天后，受体自交系的丙二醛含量和细胞膜离子渗漏率为21.18nmol/gFW和39.6％，转ZmHsp10基因过表达株系的丙二醛含量和离子渗漏率显著低于受体自交系的，转ZmHsp10反义结构株系和基因编辑株系的丙二醛含量和离子渗漏率则显著高于受体自交系的。即在干旱胁迫过程中，过表达株系的细胞膜损伤较轻，膜脂氧化程度较低，具有较强的抗旱能力。为了解干旱胁迫条件下叶片水分的丧失程度，测定了不同玉米株系叶片中的相对含水量。在干旱胁迫前，各株系间相对含水量RWC没有显著差异，在干旱胁迫后，所有株系叶片相对含水量均降低，但在胁迫3天后，不同株系叶片中RWC下降幅度有所不同。同转ZmHsp10基因过表达株系相比，受体自交系、转反义结构株系、基因编辑株系的的叶片水分流失都较多。在干旱胁迫的第8天，ZmHsp10基因过表达株系的叶片RWC显著高于受体自交系的，转ZmHsp10反义结构株系和基因编辑株系的显著低于受体自交系的。恢复正常浇水后，ZmHsp10基因过表达株系的RWC仍然高于受体自交系的，但是其反义株系和基因编辑株系的叶片含水量也较快回复。在干旱胁迫处理之前，玉米叶片可溶性总糖含量在转基因株系和受体自交系之间的差异不明显。干旱胁迫处理引起所有株系叶片中可溶性糖含量上升，但上升幅度不同。干旱胁迫条件下，转ZmHsp10基因过表达株系叶片中积累了比受体自交系更多的可溶性糖含量；同受体自交系相比，转ZmHsp10反义结构株系和基因编辑株系具有更少的可溶性糖。这些结果表明ZmHsp10基因过表达株系叶片在干旱胁迫条件下具有更好的保水能力，较好保持正常的细胞膨压，有利于植株的生长。
在防雨大棚中对开花前玉米植株进行连续6周的干旱胁迫，然后恢复正常浇水。在此期间观察了转基因植株与受体自交系植株在干旱胁迫下的表型变化：转ZmHsp10基因过表达株系植株的叶片较为伸展，表现出比受体自交系明显较好的抗旱性。干旱胁迫下转ZmHsp10反义结构株系和基因编辑株系的表现出了与WT类似的症状，叶片卷曲严重，叶色变浅。干旱胁迫后转ZmHsp10基因过表达株系的平均果穗长度显著大于受体自交系的，而反义株系和基因编辑株系的平均果穗长度显著小于受体自交系的。从单穗粒重来看，转ZmHsp10基因过表达正义株系的单穗粒重明显高于受体自交系的，而反义株系和基因编辑株系的单穗粒重明显少于受体自交系的，差异达到显著或极显著程度(P<0.05或P<0.01(n＝10))。从百粒重来看，各转基因株系与受体自交系之间虽有差异，但达不到差异显著程度。这些结果表明，转ZmHsp10基因过表达植株对开花前遇到的干旱胁迫具有明显提高的抗性，生殖器官发育受影响较小，使籽粒产量显著高于受体自交系的。
基于上述结果，综合干旱胁迫条件下玉米不同株系植株的生理指标和产量上的差异可得出：转ZmHsp10基因过表达株系在遇到干旱胁迫时细胞可溶性物质增加幅度较大，减少了细胞水分的流失，能够更好的保持细胞的含水量，细胞膜损伤小，光合能力较强，植株的生长发育受影响较小，因此籽粒产量高，表现出明显改善的抗旱性，比起受体自交系植株能够更好地适应干旱胁迫环境；相反，转ZmHsp10反义结构的株系或基因编辑株系在遇到干旱胁迫时，细胞溶质增加幅度较小，细胞水分流失多，细胞膜损伤大，光合能力减弱，植株减产，导致植株抗旱性变差。这表明通过在玉米中过表达ZmHsp10基因可明显改变玉米的抗旱性，为植物抗逆育种提供了实例，对提高作物在易干旱环境中的产量具有重要意义。
实验还证实转基因植株表现出明显提高的耐热性和耐冷性。
将在28℃(照光,13h/d)/22℃(暗,11h/d)下生长的转基因纯合的玉米植株移入36℃(照光)下生长2h,再在39℃下连续热处理4天(照光13h/d，暗11h/d)，然后在28℃下恢复生长。对照自交系植株几乎全部死亡，而转基因过表达株系中绝大多数的耐热性显著优于对照，其中部分转基因株受害不明显。
将玉米播种在温室中，在正常生长条件下生长到9-11叶期时给予连续5天高温处理，然后恢复到正常生长条件下生长发育到果穗成熟，同一株系内植株开放授粉结籽。在高温处理期间，每天22时到次日6时之间温度20-24℃,6-8时温度从20-24℃上升到37℃左右，在9-17时之间温度维持在38-39℃，而在17-19时温度保持在36-37℃，19-22时温度下降到22-24℃。自然光照，光照时间14h/d。转基因过表达株系和未转基因对照分区种植。在高温处理期间，转基因过表达植株受害不明显，未转基因对照的叶片在11-17时间轻微萎蔫，处理3天后叶片开始发黄，新叶生长缓慢。高温处理之后的未转基因对照植株的株高明显低于转基因过表达植株的，雄穗发育差，约半数花粉不育。比较单株籽粒产量，与3个转基因过表达株系相比，未转基因对照降低了31％-19％。即转基因过表达株系表现出明显提高的耐热性。
这些结果表明，提高玉米ZmHsp10(10kDa热激蛋白)基因的表达水平显著提高了玉米植株的耐热性，使玉米在高温环境中具有更强的耐受性。
综上，本发明公开了玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10在改变植物抗逆性中的应用，是从玉米中克隆基因ZmHsp10，以正义或反义形式将该基因重组到植物表达载体中，利用转基因技术将融合基因导入植物，通过对转基因植株进行抗旱性或耐热性测定，筛选出抗性明显提高或降低的转基因植株及其后代，创造出具有应用价值的植物新种质。本发明的应用对提高在干旱和热胁迫下作物产量有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
实施例1：过表达玉米ZmHsp10基因创造玉米耐旱自交系
1)受体系统的建立以我国农业生产上所用的骨干自交系为材料，如郑58、昌7-2、6WC等。种子用70％乙醇浸泡8分钟，再用0.1％氯化汞浸泡8-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌种子在无菌三角瓶内于黑暗条件(25-28℃)下萌发1-2天,待种子萌动后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽鞘伸长止3-4厘米时，及时剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，裸露出茎尖生长锥。
2)玉米茎尖转化和植株再生构建携带玉米ZmHsp10 cDNA序列的融合基因(正义形式)，转基因ZmHsp10用胁迫诱导型启动子RD29A/B或玉米Ubiquitin1启动子启动。再将融合基因重组到T-DNA区带有植物除草剂抗性基因bar的根瘤农杆菌应Mini-Ti质粒中，获得遗传转化载体。将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有选择剂抗性基因和ZmHsp10基因)的根瘤农杆菌(如LBA4404等)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0，热压灭菌)中28℃下震荡培养，震荡速率为110rpm(转/分)，使细菌浓度OD6000.45～0.6。然后在3000rpm下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone,As)100μmol/l的1/2改良MS液体培养基悬浮，稀释5～20倍用于转化。转化时将菌液倒在培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0.5×105Pa大气压下处理8-12分钟。再将浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在改良MS固体培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24℃。然后将无菌苗放在散射光下培养2-3天,再将其移栽到铺有上层蛭石、下层壤土的花盆中，并用蛭石覆盖植株顶部。让移栽的植株在自然光照下生长，日温22-28℃，夜温15-21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。转化植株长出3片叶后，喷洒0.125％除草剂草丁膦水溶液，以植株掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后4天后停止生长，9天后开始死亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株长到5叶时，将其定植到田间，套袋自交结籽。取移栽成活植株的叶片进行PCR检测筛选转基因植株。
3)转基因植株的抗性检测和选择利用将候选的转基因植株(T0)套袋自交结实。将来自不同T0植株的T1种子播在温室或具有防护设施的田间，喷洒0.18％除草剂草丁膦水溶液，观测植株抗性。T1代筛选出的抗除草剂植株继续套袋自交，对其子代继续进行分子生物学鉴定和抗性检测。通过数代自交纯合和抗性检测及选择，最终获得转基因玉米纯合系。在抗旱性鉴定及选择中，转基因株系分别种植于花盆、温室和大田，在3叶期、拔节期及开花前期、抽雄及散粉期、灌浆期分别进行干旱胁迫处理，测定生理参数的变化和籽粒产量，筛选出抗旱性强、籽粒产量比未转基因对照材料显著增加、且在适宜栽培条件下与受体自交系的籽粒产量略有提高的株系。该株系可用于配制玉米抗旱抗除草剂杂交种。
实施例2：转ZmHsp10基因创造早熟禾耐热新品系
草地早熟禾(Poa pratensis L.)是温带地区最重要的草坪草草种之一。由于它具有色美、抗寒能力强、耐荫、耐修剪等优点，在我国北方地区和南方部分冷凉地区被广泛用作建坪草种。草地早熟禾也有其自身的缺点，如耐高温能力差、抗旱力不强、易受病虫危害等，在盛夏季节生长停止，甚至部分死亡。这些缺点极大地制约了草地早熟禾在夏季炎热地区的广泛利用。由于草地早熟禾具有孤雌生殖的特性，采用常规育种技术改良这些不利性状难度大，成功率低，因此采用基因工程手段培育草地早熟禾新品种的工作受到重视。本发明通过转ZmHsp10基因创造草地早熟禾耐旱种质。
1)转化载体的构建：遗传转化所用质粒的构建同实例1所示，选择标记基因也可为除草剂抗性基因als(抗除草剂氯磺隆)、bar(抗除草剂草丁膦)等。
2)草地早熟禾转化受体的建立:草地早熟禾种子经70％酒精2分钟、0.2％氯化汞14min灭菌，无菌水冲洗3～5遍，在无菌湿滤纸上于黑暗下萌发。10～15d后转入诱导培养基(MS培养基+3mg/L 6-BA+0.5mg/L 2,4-D+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂)上诱导小苗基部膨大，培养18d后将小苗转入丛生芽发生培养基(MS培养基+2mg/L 6-BA+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂)上诱导形成丛生芽。丛生芽块转入继代培养基上继代培养，温度24±2℃，光强500～1000Lx，光照14h/d。为了使丛生芽块能长期继代培养，多数品种以MS培养基+3mg/L 6-BA+0.07mg/L 2,4-D+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂为适宜继代培养基。当2,4-D浓度较高时，丛生芽块基部产生愈伤化组织，分化小芽能力低。当2,4-D浓度较低时，小苗容易老化，不易产生新芽。即使在适宜继代培养基上，继代5次后的丛生芽块小苗老化，增生能力降低。要保持草地早熟禾丛生芽处于幼嫩状态，可在继代4～5次后将丛生芽分成单芽或者2～3mm小块接种在诱导培养基上诱导膨大，然后再转入丛生芽发生培养基上产生丛生芽块。取在继代培养基上暗培养5d左右的丛生芽块作为转化受体。
3)草地早熟禾丛生芽块遗传转化
挑取农杆菌(携带转化用质粒)单克隆培养物，接种到含有利福平25mg/L、卡那霉素50mg/L的液体LB液体培养基中28℃下振荡(180r/min)培养至对数生长期。菌液4000r/min离心,倒掉上清液,菌体用液体培养基(改良MS培养基+2mg/L 6-BA+200mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖)重悬，稀释浓度至OD600＝0.6备用。在浸染前向此细菌悬液加入0.2％(终浓度)的乙酰丁香酮(AS)。将草地早熟禾丛生芽块切去叶片，剥除叶鞘，然后切成1mm左右的小芽块，并尽量暴露出芽尖分生组织，放入培养皿中，倒入农杆菌菌液，在0.05MP负压处理下浸染4-6min。倒出菌液后，用无菌滤纸吸干残留菌液，再将小芽块转入丛生芽发生培养基上在24±2℃暗培养3天。将共培养后的芽块转到加有100mg/L头孢霉素的丛生芽发生培养基上抑制农杆菌生长，10d后再将丛生芽块分成单芽置于含有0.1-0.2％除草剂草丁膦(浓度因基因型不同而有较大差异)的丛生芽发生培养基上筛选抗性小芽，连续筛选3代，每代筛选15d。筛选3代后获得的抗性小苗转入丛生芽发生培养基上进行恢复和增殖培养。然后转入生根培养基中，约8～15d后长出根。当根生长到2～5cm长时，放在自然光下培养1～2d，去掉封口膜炼苗1～2d后移栽入花盆。花盆下部为土壤，上部为6～8cm厚的蛭石，每5d浇一次1/2MS营养液，隔天浇水一次。移栽成活率为95％～99％。成活2月后取叶片进行PCR检测。
4)转化植株的分子检测
用CTAB法提取草地早熟禾再生植株叶片DNA为模板，进行PCR反应检测转基因。对转基因植株进行分株繁殖或姊妹交结籽。无性克隆苗或子代小苗继续喷洒除草剂草丁膦(0.15％浓度)进行筛选，抗性植株采用PCR检测转基因、RT-PCR测定转基因表达水平，选出转基因表达水平高的植株进行分株繁殖。后者用于抗性检测实验。
5)转基因株系的耐热性检测及利用
将稳定的转基因株系和受体品种的植株进行克隆，选取大小相近的小苗分别移栽到大小一致的小花盆中，在适宜条件下生长。当植株产生3-4个分蘖时，将它们分成2组，每株系每组8盆左右，以受体品种的小苗为对照材料。将在18℃(照光,13h/d)/12℃(暗,11h/d)下生长的转基因纯合植株移入30℃(照光)下生长2h,再在35℃下连续热处理3天(照光13h/d，暗11h/d)，然后在20℃(照光,13h/d)/15℃(暗,11h/d)下恢复生长。在热处理后，未转基因对照(wt)几乎全部死亡，而转基因株系中只有个别株系与未转基因对照差距不大，而部分株系的耐热性显著优于对照的，部分叶片仍为绿色，放入正常生长条件下逐渐恢复生长，5天后受害症状已不再明显，即为初步入选的转基因耐热株系。入选的转基因株系繁殖种子，播种于田间进行性状观测，选育优良耐热早熟禾新品系。后者在经历炎热夏天后植株成活率和叶色明显优于野生型对照，也表现出明显改进的耐冷性。
序列表
<110>山东大学
<120>玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10及其在改变植物抗逆性中的应用
<141>2020-10-15
<160>2
<210>1
<211>779
<212>cDNA
<213>玉米（Zea mays L.）
<221>玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10的核苷酸序列
<222>（1）…（779）
<400> 1
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<210> 2
<211> 98
<212> PRT
<213>人工序列
<221>玉米10kDa热激蛋白基因ZmHsp10编码的氨基酸序列
<222>（1）…（98）
<400> 2
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