阅读说明：本技术 高分子化合物及使用了该高分子化合物的细胞内化合物导入促进剂 (Polymer compound and intracellular compound introduction promoter using same ) 是由 佐久间信至 鹈川真实 高日俊辅 福岛一范 武藤美音 宫田康平 田崎晃子 松本萤 于 2019-07-11 设计创作，主要内容包括：本发明的目的在于提供一种通用性高、安全性更高的药物的膜穿透促进技术。所述技术问题能够通过本发明的高分子化合物解决,所述高分子化合物的分子量为1000以上,且其侧链的末端具有一个精氨酸或者具有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽,并且含有0.5～20mmol/g来自于精氨酸的胍基。(The purpose of the present invention is to provide a membrane penetration promoting technique for a drug which has high versatility and higher safety. The polymer compound has a molecular weight of 1000 or more, has one arginine or a basic peptide having 2 to 6 chain lengths and containing one or more arginines at the end of a side chain, and contains 0.5 to 20mmol/g of a guanidine group derived from arginine.)

高分子化合物及使用了该高分子化合物的细胞内化合物导入 促进剂

技术领域

本发明涉及高分子化合物及使用了该高分子化合物的细胞内化合物导入促进剂。根据本发明，能够将药物等化合物有效地导入细胞内。

背景技术

肽、蛋白质、抗体及核酸等生物药品，对导致疾病的靶分子的特异性极高，被认为对疾病的治疗有效。2015年上市的新药中约一半为生物药品，并认为今后会进一步增多。作为所述生物药品的药物动力学特性，可例举出低膜穿透性。由于起因于高水溶性及高分子量的所述特性，大多的生物药品被开发为侵入性高的注射剂。因此，不仅会给患者带来痛苦，还存在医生给药管理及高生产成本等问题，生物药品的注射剂化成为医疗费用高涨的一个原因。

然而，促进局部给药部位处药物的膜穿透、使其在全身血液中移行并有效到达目标部位的促进吸收的技术开发，是DDS研究中的一个主要领域。作为典型的技术，可列举出改进脂溶性、或基于转运蛋白识别等的前药，但其以低分子有机化合物为主，在生物药品中并无成功案例。作为经典的吸收促进剂，有将癸酸钠用作氨苄西林栓剂的添加剂的例子，但极其有限。正在谋求开发一种可改善生物药品的吸收性、可进行经口给药或经鼻给药等患者自身给药管理、并可控制医疗费用的DDS技术。

对于HIV病毒感染机构的研究，正在研究寻找一种具有高细胞膜穿透性的蛋白质、并使用该蛋白质的膜穿透促进技术。具体而言，作为DDS载体，正在积极研究开发一种以所述HIV病毒蛋白质的一级结构为基础的穿膜肽。穿膜肽是富含精氨酸及赖氨酸等碱性氨基酸的10个残基左右的侧链低聚肽，作为代表性的穿膜肽，已知有低聚精氨酸或Penetratin等。

本发明的发明人公开了一种高分子化合物及多糖衍生物，其应用于穿膜肽技术并能够将核酸或蛋白质等水溶性高分子物质、或者药物简便且高效地导入细胞内或粘膜内(专利文献1及2)。通过使用这些高分子化合物及多糖衍生物，无需进行繁杂的前处理即可将低膜穿透性化合物高效地导入细胞内或粘膜内。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2016/136707号公报

专利文献2：国际公开第2016/136708号公报

发明内容

本发明要解决的技术问题

所述专利文献1及2中记载的高分子化合物及多糖衍生物所使用的以8个氨基酸链长为中心的穿膜肽或更长链的穿膜肽的价格高，除非实现降低成本，否则很难将其开发成药品添加剂。

此外，由于其依然具有少许毒性，因此期望开发一种对细胞更安全的药物的膜穿透促进技术。

本发明的目的在于提供一种通用性高、安全性更高的药物的膜穿透促进技术。

解决技术问题的技术手段

本发明的发明人对安全性高的药物的膜穿透促进技术进行了认真研究，结果惊人地发现，通过侧链末端含有6个以下氨基酸链长的碱性肽的高分子化合物，能够解决上述技术问题。

本发明是基于该见解而完成的。

即，本发明涉及：

[1]一种高分子化合物，其分子量为1000以上，且其侧链的末端具有一个精氨酸或者具有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽，并且含有0.5～20mmol/g来自于精氨酸的胍基；

[2]根据[1]所述的高分子化合物，其中，所述高分子化合物的主链为选自由亲水性高分子、阴离子型高分子及多糖衍生物组成的组中的一种或两种以上的组合；

[3]根据[1]或[2]所述的高分子化合物，其中，所述一个精氨酸或碱性肽的末端为-CONH₂基；

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的高分子化合物，其中，所述碱性肽由精氨酸及甘氨酸构成；

[5]一种针对细胞的化合物导入促进剂，其含有[1]～[3]中任一项所述的高分子化合物；以及

[6]一种药物组合物，其含有[1]～[3]中任一项所述的高分子化合物及药物。

本说明书公开了：

[7]一种药物的给药方法，其包括将[1]～[4]中任一项所述的高分子化合物及药物(特别是低膜穿透性药物)混合的工序、以及以药物的有效量对治疗对象给药的工序；

[8][1]～[4]中任一项所述的高分子化合物在药物(特别是低膜穿透性药物)给药中的应用；

[9][1]～[4]中任一项所述的高分子化合物在制备药物组合物中的应用。

发明效果

根据本发明的高分子化合物，即使侧链的碱性肽为6个以下氨基酸链长、例如为1个氨基酸，也能得到本发明的效果，因此与以往的八氨基酸等长链的穿膜肽相比，能够以低成本制备化合物导入促进剂。此外，根据本发明的高分子化合物，能够将药物等化合物有效导入细胞内，且细胞毒性低，因此能够安全地导入。

具体实施方式

[1]高分子

本发明的高分子化合物的分子量为1000以上，且其侧链的末端具有一个精氨酸或具有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽，并且含有0.5～20mmol/g来自于精氨酸的胍基。

<<分子量>>

对于高分子化合物的分子量，只要能获得本发明的效果，则没有特殊限定，作为下限，例如为1000以上，优选为5000以上，更优选为1万以上，进一步优选为5万以上，更进一步优选为10万以上，更进一步优选为20万以上，更进一步优选为30万以上。作为分子量的上限，例如为5000万以下，优选为4000万以下，更优选为3000万以下，进一步优选为2000万以下，更进一步优选为1000万以下。可以在对所述分子量的上限值与下限值进行任意组合的范围内进行实施。当高分子化合物的分子量过小时或高分子化合物的分子量过大时，有时会无法充分获得本发明的效果。

在本说明书中，分子量为重均分子量。重均分子量是指使用水性溶剂进行GPC分析时的重均分子量，其是普鲁兰、聚乙二醇(PEG)、或聚环氧乙烷(PEO)换算的重均分子量。

<<一个精氨酸或碱性肽>>

本发明的高分子化合物在侧链的末端具有一个精氨酸，或在侧链的末端具有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽。通过具有一个精氨酸或碱性肽，本发明的高分子化合物能够将药物等化合物有效导入细胞内。

所述链长为2～6的碱性肽至少含有一个精氨酸，精氨酸个数的下限优选为2个以上，更优选为3个以上。上限为6个以下，优选为5个以下，更优选为4个以下。碱性肽所含的2个以上的精氨酸可连续地、也不连续地包含于碱性肽中。只要能获得本发明的效果，则可以在对所述碱性肽所含的精氨酸的上限值与下限值进行任意组合的范围内进行实施。

所述链长为2～6的碱性肽的链长，只要为2～6的链长，则没有特殊限定，在某实施方式中链长为2～6，在某实施方式中链长为2～5，在某实施方式中链长为2～4，在某实施方式中链长为2～3，在某实施方式中链长为3～6，在某实施方式中链长为3～5，在某实施方式中链长为3～4，在某实施方式中链长为4～6，在某实施方式中链长为4～5。在这些碱性肽中，可以全部的氨基酸均为精氨酸，也可以含有一个以上除精氨酸之外的氨基酸(例如甘氨酸)。

碱性肽只要总体为碱性肽即可，也可以含有除精氨酸之外的氨基酸。作为除精氨酸之外的氨基酸，可列举出碱性氨基酸(例如鸟氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸或组氨酸)、中性氨基酸(例如丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)，但优选碱性氨基酸或中性氨基酸，更优选碱性氨基酸。除精氨酸之外的氨基酸的个数优选为5个以下，更优选为4个以下，进一步优选为3个以下，更进一步优选为2个以下，更进一步优选为1个以下，最优选为0个。

碱性肽所含的氨基酸可以为L型或D型中的任一种，可以根据细胞及预导入的水溶性高分子量物质进行适当选择。另外，在本说明书中记载为氨基酸时，只要无特殊说明，则均表示α-氨基酸。

例如，作为链长为2～6的碱性肽，可列举出RR(R表示精氨酸。以下同样)、RRR、RRRR、RRRRR、或RRRRRR的肽、或1个精氨酸与1个甘氨酸的组合的链长为2的碱性肽、2个精氨酸与1个甘氨酸的链长为3的碱性肽、3个精氨酸与1个甘氨酸的链长为4的碱性肽、2个精氨酸与2个甘氨酸的链长为4的碱性肽、4个精氨酸与1个甘氨酸的链长为5的碱性肽、3个精氨酸与2个甘氨酸的链长为5的碱性肽、5个精氨酸与1个甘氨酸的链长为6的碱性肽、4个精氨酸与2个甘氨酸的链长为6的碱性肽、或者3个精氨酸与3个甘氨酸的链长为6的肽。甘氨酸与精氨酸的排列没有特殊限定，但优选精氨酸位于侧链的末端。

碱性肽可由下述通式(1)或下述通式(2)表示：

[化学式1]

其中，X¹表示从精氨酸、碱性氨基酸、中性氨基酸、或酸性氨基酸中去除末端氨基和末端羧基而成的残基，且X¹中的至少一个为精氨酸残基，a为2～6的整数；

[化学式2]

其中，X¹表示从精氨酸、碱性氨基酸、中性氨基酸、或酸性氨基酸中去除末端氨基和末端羧基而成的残基，且X¹中的至少一个为精氨酸残基，a为2～6的整数。

上述式(1)所表示的碱性肽的末端为-CONH₂基。碱性肽的末端也可以为-COOH(羧基)，但通过使末端为-CONH₂基(或NH₂基)，所得到的细胞内化合物导入促进剂或药物组合物的分散性得以提升。

<<主链>>

本说明书中的高分子化合物的主链是指，除了含有一个精氨酸的侧链之外的部分，或者除了含有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽的侧链之外的部分。具体而言，主链可以是一条链的主链，也可以是接枝聚合而成的主链。主链通常是指化合物内最长的碳链，其可以部分被杂原子取代。主链也可以具有环结构，其以最长的线路为主链。

本发明的高分子化合物例如能够通过在一条链的高分子化合物或接枝聚合物(以下有时统称为主链高分子)上，键合在末端含有一个精氨酸的侧链或在末端含有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽的侧链而制备。

所述主链高分子没有特殊限定，可列举出亲水性高分子、阴离子型高分子或多糖衍生物，但优选亲水性高分子或多糖衍生物。在本说明书中，亲水性高分子是指水溶性高分子或在水中溶胀的高分子。水溶性高分子是指在常压下以0.1质量％以上的量均匀溶解于25℃的水中的高分子。

作为亲水性高分子，没有特殊限定，例如可列举出瓜尔胶、琼脂糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖、聚葡萄糖、木质素、甲壳质、壳聚糖、卡拉胶、普鲁兰、硫酸软骨素、纤维素、半纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、阳离子淀粉、糊精等多糖类或多糖类的改性物；白蛋白、酪蛋白、明胶、聚谷氨酸(聚γ-谷氨酸或聚α-谷氨酸)、聚赖氨酸等水溶性蛋白质或水溶性多肽；聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚(丙烯酸羟乙酯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚N-乙烯基乙酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(丙烯酸2-氨基乙酯)、聚(甲基丙烯酸2-氨基乙酯)、丙烯酸/丙烯酰胺共聚物、甲基丙烯酸/丙烯酰胺共聚物、丙烯酸/N-异丙基丙烯酰胺共聚物、甲基丙烯酸/N-异丙基丙烯酰胺共聚物、丙烯酸/N-乙烯基乙酰胺共聚物、甲基丙烯酸/N-乙烯基乙酰胺共聚物、丙烯酸/马来酸共聚物、甲基丙烯酸/马来酸共聚物、丙烯酸/富马酸共聚物、甲基丙烯酸/富马酸共聚物、乙烯/马来酸共聚物、异丁烯/马来酸共聚物、苯乙烯/马来酸共聚物、烷基乙烯基醚/马来酸共聚物、烷基乙烯基醚/富马酸共聚物等乙烯基类亲水性高分子；水溶性聚氨酯等。

作为多糖衍生物，没有特殊限定，例如可列举出羧甲基化淀粉、羧甲基化纤维素、羧甲基化β-葡萄糖等羧甲基化多糖衍生物、果胶、果胶酸、透明质酸或海藻酸。

阴离子型高分子为侧链具有阴离子基团的高分子。阴离子型高分子中的“阴离子基团”可以从上述关于两性高分子的阴离子基团中适当选择。

作为阴离子基团的一种形式，包括羧基、羧基、磷酸基团、磺酸基团、硝酸基团、硼酸基团。作为阴离子型高分子的具体例，没有特殊限定，例如可列举出聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚谷氨酸、羧甲基化聚组氨酸、透明质酸、海藻酸或聚天门冬氨酸等。

主链高分子可以适宜使用所述亲水性高分子、阴离子型高分子及多糖衍生物中一种或两种以上的组合。

为了使精氨酸或碱性肽(或含精氨酸的侧链、或含碱性肽的侧链)易于键合，所述主链高分子优选具有羧基或氨基的主链高分子。通过具有羧基，能够易于与精氨酸等氨基酸的氨基键合。此外，通过具有氨基，能够易于与精氨酸等氨基酸的羧基键合。

所述主链高分子没有特殊限定，但优选不具有膜穿透性的高分子，并优选不具有胍基的高分子。认为通过使主链高分子不具有胍基或不具有膜穿透性，能够使本发明的高分子化合物自身不易进入细胞内，而仅使以非共价键松弛共存的药物等化合物易于进入细胞内。

<<侧链>>

对于本发明的高分子化合物的侧链，只要末端侧含有一个精氨酸或含有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽，则没有特殊限定。即，在本说明书中，侧链是指末端侧含有一个精氨酸的链、或含有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽的链。此外，侧链的末端是指从主链分支出来且未再与主链键合的支链的末端部分。

对于末端侧含有一个精氨酸的侧链、以及末端侧含有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽的侧链，在其精氨酸或碱性肽的主链侧可以含有任意的链。任意的链没有特殊限定，例如可列举出连接肽(linker peptide)。

作为构成连接肽的氨基酸，可列举出中性氨基酸或ω-氨基链烷酸。作为中性氨基酸，例如可列举出丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及羟脯氨酸等，作为ω-氨基链烷酸，可列举出3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸及11-氨基十一烷酸等，也可以为这些的任意组合。从提高被导入细胞的化合物的导入效率的角度出发，优选甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸，更优选甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸，最优选甘氨酸。

只要能获得本发明的效果，则连接肽的链长没有特殊限定，例如为1～30，优选为1～20，更优选为1～10，进一步优选为1～5。

<<胍基>>

本发明的高分子化合物含有0.5～20.0mmol/g、优选含有1.0～10.0mmol/g、更优选含有1.0～8.0mmol/g、进一步优选含有1.5～8.0mmol/g来自于精氨酸的下述式(3)所表示的胍基。若小于0.5mmol/g，则无法得到本发明的效果，若大于20.0mmol/g，则会根据导入对象而增强毒性。通过使胍基的含量在上述范围内，能够将药物等化合物有效地导入细胞内。

[化学式3]

对于本发明的高分子化合物的胍基的含量，例如通过测定高分子化合物的¹H-NMR，并测定高分子的来自于主链的氢原子及来自于精氨酸的氢原子，从而计算来自于精氨酸的基团的含量，但并不仅限于此。由该结果，能够计算出每个高分子化合物的胍基的密度。具体的测定方法，如实施例所示。

<<高分子化合物的制备方法>>

本发明的高分子化合物的制备方法没有特殊限定，例如可以通过将具有含一个精氨酸的侧链的聚合性单体、或具有含有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽的侧链的聚合性单体进行聚合而制备。此外，也可以通过在所述主链高分子上导入所述含一个精氨酸的侧链(例如一个精氨酸)或含有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽的侧链(例如含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽)而制备。然而，从易于制备的角度出发，优选通过在所述主链高分子上导入所述含一个精氨酸的侧链(例如一个精氨酸)或含有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽的侧链(例如含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽)而进行制备。

当主链高分子具有羧基时，通过使精氨酸或碱性肽的氨基与羧基进行成肽反应，能够制备高分子化合物。对于羧基与氨基之间的反应，使用公知的方法即可，例如可列举出通过N-羟基琥珀酰亚胺使羧基琥珀酰亚胺酯化后，使其与氨基反应的方法等。

另一方面，当主链高分子具有氨基时，能够通过使精氨酸或碱性肽的羧基与氨基进行成肽反应而得到。含有精氨酸的侧链或含有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽的侧链的固定方法，并不仅限于本方法，可以利用通常所知的化学反应进行固定化。

此外，当所述主链高分子为具有在末端具有羧基或氨基的侧链的主链高分子时，通过使这些羧基或氨基与一个精氨酸或含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽键合，也能够制备本发明的高分子化合物。

本发明的高分子化合物能够用于制备后述的化合物导入促进剂或药物组合物。因此，本发明的应用为用于制备化合物导入促进剂、或疾病的治疗或预防用药物的应用。

[2]化合物导入促进剂

本发明的化合物导入促进剂含有本发明的高分子化合物。通过含有所述高分子化合物，能够将药物等化合物有效地导入细胞内。

<<导入细胞内的化合物>>

通过本发明的化合物导入促进剂而被导入细胞内的化合物，没有特殊限定，可列举出蛋白质(肽)、DNA、RNA、脂质、糖或低分子化合物。特别是可用于将向细胞内的导入率低的低膜穿透性化合物导入细胞内。

作为低膜穿透性化合物，例如可列举出胰岛素及胰岛素分泌促进剂(例如Exendin-4、GLP-1)等肽/蛋白质类药品、类固醇激素、非类固醇类镇痛消炎剂、精神稳定剂、抗高血压药、缺血性心脏病治疗药、抗组胺药、抗哮喘药、抗帕金森药、改善脑循环药、止吐剂、抗抑郁药、抗心律不齐药、抗凝血药、抗痛风药、抗真菌药、抗痴呆药、舍格伦综合征治疗药、麻醉性镇痛药、β受体阻断药、β1受体激动剂、β2受体激动剂、副交感神经激动剂、抗肿瘤药、利尿药、抗血栓药、组胺H1受体拮抗剂、组胺H2受体拮抗剂、抗过敏剂、戒烟辅助药、维生素等药品；脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及它们的类似物或衍生物(例如肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA等)等的核酸化合物；酶、抗体、糖蛋白、转录因子等肽化合物；普鲁兰、支链淀粉、直链淀粉、糖原、环糊精、葡聚糖、羟乙基葡聚糖、甘露聚糖、纤维素、淀粉、海藻酸、甲壳质、壳聚糖、透明质酸等的多糖衍生物及它们的衍生物等。

本发明的化合物导入促进剂所适用的细胞为动物、植物或细菌等细胞均可，但从低膜穿透性化合物的导入效率角度出发，优选齿乳动物(例如人、猴子、狗、猫、雪貂、牛、马、山羊、绵羊、豚鼠、仓鼠、沙鼠、小鼠或大鼠)的细胞。可以通过in vivo(体内)向细胞导入化合物，也可以通过in vitro(体外)向细胞导入化合物。

本发明的化合物导入促进剂，除了所述高分子化合物之外还可以含有稀释剂或添加剂等。作为稀释剂，可列举出纯化水、醇类(例如乙醇)、注射用蒸馏水、生理盐水、丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、聚山梨醇酯80。此外，作为除稀释剂之外的添加剂，可以含有润湿剂、悬浮剂、甜味剂、芳香剂、或防腐剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、增溶剂或增溶助剂等。

本发明的化合物导入促进剂能够用于向细胞内导入化合物(特别是低膜穿透性化合物)。即，本发明的应用为化合物导入促进剂的用于向细胞内导入化合物(特别是低膜穿透性化合物)的应用。

[药物组合物]

本发明的药物组合物含有药物及本发明的高分子化合物。通过含有所述高分子化合物，能够将药物有效地导入细胞内。

<<药物>>

本发明的药物组合物中所含的药物，没有特殊限定，例如可列举出胰岛素及胰岛素分泌促进剂(例如Exendin 4、GLP-1)等肽/蛋白质类药物、类固醇激素、非类固醇类镇痛消炎剂、精神稳定剂、抗高血压药、缺血性心脏病治疗药、抗组胺药、抗哮喘药、抗帕金森药、改善脑循环药、止吐剂、抗抑郁药、抗心律不齐药、抗凝血药、抗痛风药、抗真菌药、抗痴呆药、舍格伦综合征治疗药、麻醉性镇痛药、β受体阻断药、β1受体激动剂、β2受体激动剂、副交感神经激动剂、抗肿瘤药、利尿药、抗血栓药、组胺H1受体拮抗剂、组胺H2受体拮抗剂、抗过敏剂、戒烟辅助药、维生素等药品；抗体药等。

本发明的药物组合物除了药物及高分子化合物之外，可以含有稀释剂或添加剂等。作为稀释剂，可列举出纯化水、醇类(例如乙醇)、注射用蒸馏水、生理盐水、丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、聚山梨醇酯80。此外，作为除稀释剂之外的添加剂，可以含有润湿剂、悬浮剂、甜味剂、芳香剂、或防腐剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、增溶剂或增溶助剂等。

对于本发明的药物组合物的给药量，可以考虑有效成分的活性强度、症状、给药对象的年龄或性别等而适当决定。例如，经口给药时，对于成人(以体重60kg计)而言，给药量通常为每天约0.1～100mg，优选为0.1～50mg。非经口给药时，注射剂的情况下为每天0.01～50mg，优选为0.01～10mg。

<<药物的给药方法>>

本发明的药物的给药方法包括：将所述高分子化合物及药物(特别是低膜穿透性药物)混合的工序、以及以药物的有效量对治疗对象给药的工序。对于本发明的药物的给药方法，可以不受限地使用所述高分子化合物，所给药的药物也没有特殊限定。进一步，根据本发明的药物的给药方法，能够将药物有效地导入细胞内。

<<药物给药用高分子化合物>>

本发明的高分子化合物为在药物(特别是低膜穿透性药物)给药中进行使用的高分子化合物。即，本发明的高分子化合物为药物给药用高分子化合物，能够不受限地使用所述高分子化合物及药物。本发明的高分子化合物能够将药物有效地给药给细胞。

<<在制备药物组合物中的应用>>

本发明的应用是所述高分子化合物在制备药物组合物中的应用。在药物组合物的制备中，制备含有高分子化合物及药物的药物组合物。在药物组合物的制备中，除使用本发明的高分子化合物之外，可以根据公知的药物组合物的制备方法来制备药物组合物。

<<作用>>

对于本发明的高分子化合物能够将药物等化合物有效地导入细胞内的机理，其具体细节尚不明确。但是，可以做出如下推断。然而，本发明并不受限于以下推断。

本发明的高分子化合物具有含一个精氨酸的侧链，或者具有含有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽的侧链。该侧链所含的精氨酸具有胍基，本发明的高分子化合物含有0.5～20mmol/g胍基。认为由于具有所述范围内的胍基，因此当高分子化合物靠近细胞膜时，会诱发细胞的巨胞饮(macropinocytosis)。细胞会通过巨胞饮来导入含有精氨酸等的高分子化合物，而不易导入作为巨大分子的高分子化合物。另一方面，由于与高分子化合物相比，在高分子化合物上共存的药物等化合物的分子量较小，因此被导入细胞内。即，推定本发明的高分子化合物由于含有0.5～20mmol/g胍基，因而可诱发细胞的巨胞饮，由此，共存的药物等化合物被导入细胞内。另一方面，推定若高分子化合物的主链高分子能够键合含有一个精氨酸的侧链或含有含一个以上精氨酸且链长为2～6的碱性肽的侧链，则能够诱发巨胞饮，进而能够发挥本发明的效果。因此，在本发明的高分子化合物中，所述主链高分子并不限定于特定的主链高分子。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但这些实施例并不限定本发明的保护范围。另外，只要没有特殊限定，则实施例中的“份”或“％”均为基于质量标准的单位。

<<实施例1>>

在本实施例中，使用丙烯酸/N-乙烯基乙酰胺共聚物作为主链高分子，制备侧链上具有一个精氨酸的高分子化合物。

(丙烯酸/N-乙烯基乙酰胺共聚物的琥珀酰亚胺体的合成)

参考日本特开平08-081428的实施例14，以30.0g的丙烯酸钠及70.0g的N-乙烯基乙酰胺为原料，按照常规方法合成共聚物(NVA-AANa聚合物)。

接着，在色谱柱管中填充阳离子交换树脂(IR120B，ORGANO CORPORATION制造)，将130.0g的5.0wt％NVA-AANa聚合物水溶液以2.6mL/min进行通液，由此得到NVA-AANa聚合物水溶液。将所得到的NVA-AANa聚合物水溶液冷冻干燥，得到5.7g的NVA-AANa聚合物。

向300mL的五口烧瓶中加入NVA-AANa聚合物(5.0g)及DMF(142.0g)，利用冰水浴冷却至10℃以下。以2.0mL/min向该溶液中滴入58.2g(0.2g/mL)N-羟基琥珀酰亚胺的DMF溶液。进一步以1.0mL/min滴入66.2g(0.4g/mL)N,N’-二环己基碳二亚胺的DMF溶液。在冰水浴下搅拌1小时后，升温至室温并搅拌24小时。对反应液进行抽滤并回收滤液，利用2L乙腈进行再沉淀。然后利用2L丙酮洗涤沉淀并通过抽滤回收固体。通过对所得到的固体进行减压干燥，从而得到5.4g的经琥珀酰亚胺酯化的NVA-AA聚合物(NVA-AA聚合物OSu体)。

(碱性肽的导入)

将10.0mg的NVA-AA聚合物OSu体溶解于1.0mL的DMF溶液中。在该溶液中，混合0.2mL的单-L-精氨酸(NH₂-R1/L Merck制造)的DMF溶液(77.5mg/mL)和0.02mL的三乙胺(TCI制造)，于50℃搅拌24小时。然后利用1.0mL离子交换水进行稀释，加入纤维素透析管(无缝纤维素管、SPECTRUM Inc.制造)中，扎起管的两端，然后使用离子交换水透析5天。纯化后将管内液体冷冻干燥，得到11.5mg的导入有单-L-精氨酸的高分子化合物(以下有时称为NVA-AA-R1/L)。通过GPC测得的分子量为375000(PEG/PEO换算)。

(胍基的测定)

对于所得到的高分子化合物，通过测定¹H-NMR，求出来自于精氨酸的基团的含量，由该结果计算出每个高分子化合物的胍基的密度。

¹H-NMR(400MHz，D₂O)：δ＝4.16-3.75(br，1H)，3.50-3.31(br，0.67H)

具体而言，按照下述顺序进行。首先，通过测定导入精氨酸前的NVA-AA聚合物的¹H-NMR，计算出下述结构式(4)的“重复单元”的x/(y+z)的比。

接着，由下述式(4)的(*1)的一个氢原子和(*2)的两个氢原子的积分值计算出x/z。由这些结果得到x/y/z的比(实施例1中为14/1.32/4.68)。

另外，这里的“重复单元”是指，基于构成高分子化合物主链的单体单元(实施例1中为来自于N-乙烯基乙酰胺的部分、来自于丙烯酸的部分及来自于肽链键合的丙烯酸的部分)的结构比的重复结构。主链为无规共聚物时，为了方便，将重复有基于结构比的嵌段状的排列的结构视为“重复单元”。

对于一个重复单元(在实施例1中由x/y/z＝14/1.32/4.68构成)中所含的胍基的摩尔数，可通过使碱性肽所含的精氨酸的重复个数与z相乘，从而计算出单元结构式中所含的胍基的摩尔数(另外，在本实施例中，由于精氨酸为1个，因此精氨酸的重复个数为1)。

通过以所得到的“胍基的摩尔数”除以具有上述x/y/z的单元结构式的分子量(方便起见为重量)，计算出高分子化合物的胍基的密度。将结果示于表1。

[化学式4]

<<实施例2>>

在本实施例中，使用丙烯酸/N-乙烯基乙酰胺共聚物作为主链高分子，制备侧链上具有2个精氨酸的高分子化合物。

除了使用由2个L-精氨酸构成的碱性肽(NH₂-R2/L)代替单-L-精氨酸之外，重复实施例1的操作，得到16.5mg导入有2个精氨酸的高分子化合物(以下有时称为NVA-AA-R2/L)。通过GPC测得的分子量为482000(PEG/PEO换算)。以与实施例1相同的方式计算出胍基的密度。将结果示于表1。

<<实施例3>>

在本实施例中，使用丙烯酸/N-乙烯基乙酰胺共聚物作为主链高分子，制备侧链上具有4个精氨酸的高分子化合物。

除了使用由4个L-精氨酸构成的碱性肽(NH₂-R4/L)代替单-L-精氨酸之外，重复实施例1的操作，得到20.3mg导入有4个精氨酸的高分子化合物(以下有时称为NVA-AA-R4/L)。通过GPC测得的分子量为531000(PEG/PEO换算)。以与实施例1相同的方式计算出胍基的密度。将结果示于表1。

<<比较例1>>

在本比较例中，使用丙烯酸/N-乙烯基乙酰胺共聚物作为主链高分子，制备侧链上具有8个精氨酸的高分子化合物。

除了使用由8个L-精氨酸构成的碱性肽(NH₂-R8/L)代替单-L-精氨酸之外，重复实施例1的操作，得到17.8mg导入有8个L-精氨酸的高分子化合物(以下有时称为NVA-AA-R8/L)。通过GPC测得的分子量为671000(PEG/PEO换算)。以与实施例1相同的方式计算出胍基的密度。将结果示于表1。

<<比较例2>>

在本比较例中，使用丙烯酸/N-乙烯基乙酰胺共聚物作为主链高分子，制备侧链上具有8个精氨酸的高分子化合物。

除了使用由8个D-精氨酸构成的碱性肽代替单-L-精氨酸之外，重复实施例1的操作，得到17.8mg导入有8个D-精氨酸的高分子化合物(以下有时称为NVA-AA-R8/D)。通过GPC测得的分子量为611000(PEG/PEO换算)。以与实施例1相同的方式算出胍基的密度。将结果示于表1。

<<导入细胞内的评价>>

使用所述实施例1～3及比较例1～2中得到的高分子化合物，测定FITC-OVA向细胞内的导入。

向24孔板的各孔中播种500μL来自于中国仓鼠卵巢的细胞(CHO细胞)的Ham’s F12培养基悬浮液(2×10⁵个细胞/mL)，在二氧化碳培养箱(37℃、5％CO₂)中预培养24小时。去除上清液并用500μL磷酸缓冲生理盐水洗涤两次后，添加250μL荧光素标记-卵清白蛋白(FITC-OVA；Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)的Ham’s F12培养基溶液(最终浓度5μg/mL)。接着，添加250μL将实施例1～3及比较例1～2中得到的高分子化合物溶解于Ham’s F12培养基溶液中而成的溶液(最终浓度1μg/mL)，在二氧化碳培养箱中培养2小时。去除上清的培养基溶液并用500μL磷酸缓冲生理盐水洗涤两次后，添加100μL胰蛋白酶EDTA溶液(LifeTechnologies公司制造)，将培养的CHO细胞从板上剥离、分散。接着，添加400μL台盼蓝(Trypan Blue)使细胞悬浮，回收至微型管中。使回收的细胞悬浮液通过细胞过滤器，并通过流式细胞仪测定MFI(平均荧光强度)。作为对照，实施仅添加丙烯酸/N-乙烯基乙酰胺共聚物的例子(主链高分子)、仅添加由4个精氨酸构成的碱性肽的例子(R4/L)、仅添加FITC-OVA的例子(FITC-OVA)、仅添加细胞的例子(细胞)。将结果示于表1。

细胞外的FITC-OVA通过台盼蓝消光而不发出荧光，仅有被导入细胞内的FITC-OVA发出荧光。MFI表示每个细胞的荧光强度的平均值，因此MFI值越大，则表示作为水溶性高分子化合物的FITC-OVA已被导入细胞内。

此外，通过流式细胞仪解析计算出FITC-OVA的“导入率”。“导入率”是指，以测定仅含细胞时的自身荧光强度的最大值为基准，并测定细胞内导入FITC-OVA时大于基准值的细胞数的比例而得到的值。

将结果示于表1中。

<<细胞毒性评价>>

使用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST(同仁化学)，测定细胞毒性。

向96孔板的各孔中播种100μL CHO细胞的Ham’s F12培养基悬浮液(2×10⁵个细胞/mL)，在二氧化碳培养箱(37℃、5％CO₂)中预培养24小时。添加220μL将实施例1～3及比较例1～2中得到的高分子化合物溶解于Ham’s F12培养基溶液中而成的溶液(最终浓度5μg/mL)，将Ham’s F12培养基向低对照孔中添加220μL，向高对照孔添加200μL，向背景空白孔(无细胞的孔)添加220μL，并在二氧化碳培养箱中培养1.5小时。然后向高对照孔中加入20μL Lysis Buffer(裂解缓冲液)，在二氧化碳培养箱中进一步培养30分钟。从各孔中取出100μL上清液，转移至测定用96孔微板中。向所有的孔中加入100μL Working Solution(工作液)，并在遮光下于室温进行30分钟显色反应，然后向所有的孔中加入50μL Stop Solution(终止液)。使用读板器测定490nm的吸光度，计算出细胞毒性(％)。将结果示于表1中。

[表1]

※导入的蛋白质：FITC-OVA(1μg/mL)

※测定时添加实施例1～3、比较例1～2的高分子化合物、主链高分子、R4/L时的浓度：5μg/mL

使用实施例1～3中得到的高分子化合物时，与对照的4.04～4.36的MFI相比，表现出30.13～166.7的高MFI。此外，关于向细胞内的导入率，实施例2及3的高分子化合物表现出与比较例1几乎同等的导入率，实施例1的高分子化合物也被导入76％的细胞。另一方面，关于细胞毒性，与比较例1-1及1-2的8.7％及8.9％相比，实施例1～3的高分子化合物表现出1.5％～6.9％的低细胞毒性。

<<实施例4>>

在本实施例中，使用透明质酸(分子量30,000)作为主链高分子，制备侧链上具有2个甘氨酸及2个精氨酸的高分子化合物。

于60℃下，通过搅拌，将20.0mg透明质酸(TCI制造，平均分子量：30,000)溶解在0.8mL二甲基亚砜(DMSO)中。向该溶液中，添加溶解在0.15mL DMSO中的18mg N-羟基琥珀酰亚胺，进一步添加溶解在0.15mL DMSO中的34.0mg的二环己基碳二亚胺(DCC)，于室温下搅拌24小时。通过过滤滤出析出的固体，得到经琥珀酰亚胺酯化的透明质酸的DMSO溶液。向该经琥珀酰亚胺酯化的透明质酸的DMSO溶液中，混合0.40mL(116mg/mL)由2个甘氨酸及2个L-精氨酸构成的碱性肽(NH₂-G2R2/L、SIGMA制造)的DMSO溶液和0.04mL三乙胺(TCI制造)，于室温下搅拌24小时。反应后，利用1mL离子交换水稀释反应液，加入纤维素透析管(无缝纤维素管，SPECTRUM Inc.制造)中，扎起管的两端，然后使用离子交换水透析5天。然后将管内液体冷冻干燥，得到14.0mg导入有2个精氨酸的高分子化合物(以下有时称为HA(30k)-G2R2/L)。

(胍基的测定)

对于所得到的高分子化合物(HA-G2R2/L)，通过测定¹H-NMR求出来自于精氨酸的基团的含量，由该结果计算出每个高分子化合物的胍基的密度。

¹H-NMR(400MHz，D₂O)：δ＝3.45-3.34(br，1.64H)，2.26-2.12(br，3H)

具体而言，按照下述顺序进行。

首先，由下述式(5)的(*3)的3个氢原子和(*4)的2个氢原子的积分值算出1/m比。(实施例4中为0.41/0.59)。

对于一个重复单元(在实施例4中由1/m＝0.41/0.59构成)中所含的胍基的摩尔数，通过使碱性肽所含的精氨酸的重复个数与1相乘，能够计算出单元结构式中所含的胍基的摩尔数(另外，在实施例4中，由于精氨酸为2个，因此精氨酸的重复个数为2)。

通过以所得到的“胍基的摩尔数”除以具有下述1/m比的单元结构式的分子量(方便起见为重量)，从而计算出高分子化合物的胍基的密度。将结果示于表2。

[化学式5]

<<实施例5>>

在本实施例中，使用分子量为22万的透明质酸作为主链高分子，制备侧链上具有2个甘氨酸及2个精氨酸的高分子化合物。

除了使用分子量为22万的透明质酸代替分子量为3万的透明质酸之外，重复实施例4的操作，得到21.0mg导入有2个甘氨酸及2个L-精氨酸的高分子化合物(以下有时称为HA(220k)-G2R2)。

在本实施例中，得到胍基浓度不同的两种HA(220k)-G2R2/L。在表2中，分别记载为实施例5-1和实施例5-2。以与实施例4相同的方式计算出胍基的密度。将结果示于表2中。

<<向细胞内的导入的评价>>

使用所述实施例4～5中得到的高分子化合物，测定FITC-BSA向细胞内的导入。除了使用荧光素标记-牛血清白蛋白(FITC-BSA，Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)代替FITC-OVA、并改变添加实施例4～5中得到的高分子化合物、主链高分子、G2R2时的浓度、及FITC-BSA的浓度之外，重复上述实施例1～3及比较例1～2的向细胞内的导入的评价的操作。将结果示于表2。

[表2]

※导入的蛋白质：FITC-BSA(10μg/mL)

※测定时添加实施例4～5的高分子化合物、主链高分子、G2R2时的浓度：5μg/mL

使用实施例4～5中得到的高分子化合物时，与对照的4.26～5.05的MFI相比，表现出42.71～1761.48的高MFI。

<<实施例6>>

在本实施例中，使用γ-聚谷氨酸(以下简记为γ-PGA)作为主链高分子，制备侧链上具有1个精氨酸的高分子化合物。

(γ-PGA的琥珀酰亚胺体的合成)

加入10mgγ-PGA(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造，平均分子量为200,000～500,000)及1.0mL DMSO，于70℃下搅拌溶解后，冷却至室温。向该溶液中混合248.8mg(0.12g/mL)N,N’-二环己基碳二亚胺的DMSO溶液及236.3mg(0.067g/mL)N-羟基琥珀酰亚胺的DMSO溶液，于室温下搅拌24小时。接着，通过对反应液进行抽滤回收滤液，得到经琥珀酰亚胺化的γ-PGA(γ-PGA-OSu体)的DMSO溶液。

(碱性肽的导入)

向γ-PGA-OSu体的DMSO溶液中混合428.9mg单-L-精氨酸(NH₂-R1/L，Merck制造)的DMSO溶液(72.3mg/mL)和0.02mL三乙胺(TCI制造)，于室温下搅拌24小时。然后，用2.0mL离子交换水进行稀释，加入纤维素透析管(无缝纤维素管，SPECTRUM Inc.制造)中，扎起管的两端，然后使用离子交换水透析5天。纯化后将管内液体冷冻干燥，得到8.8mg导入有二-L-精氨酸的高分子化合物(以下有时称为γ-PGA-R2/L)。通过GPC测得的分子量为7,180(PEG/PEO换算)。

(胍基的测定)

对于所得到的高分子化合物(γ-PGA-R1/L)，通过测定¹H-NMR求出来自于精氨酸的基团的含量，由该结果计算出每个高分子化合物的胍基的密度。

¹H-NMR(400MHz，D₂O)：δ＝3.20-3.05(br，0.67H)，2.49-2.19(br，1H)

具体而言，按照下述顺序进行。

首先，由下述式(6)的(*5)的2个氢原子和(*6)的2个氢原子的积分值计算出p/q比(实施例6中为0.33/0.67)。

对于一个重复单元(在实施例6中由p/q＝0.33/0.67构成)中所含的胍基的摩尔数，通过使碱性肽所含的精氨酸的重复个数与q相乘，从而能够计算出单元结构式中所含的胍基的摩尔数(另外，在实施例6中，由于精氨酸为1个，因此精氨酸的重复个数为1)。

通过以所得到的“胍基的摩尔数”除以具有下述p/q比的单元结构式的分子量(方便起见为重量)，从而计算出高分子化合物的胍基的密度。将结果示于表3。

[化学式6]

<<实施例7>>

在本实施例中，使用γ-PGA作为主链高分子，制备侧链上具有2个精氨酸的高分子化合物。

除了使用由2个L-精氨酸构成的碱性肽(NH₂-R2/L)代替单-L-精氨酸之外，重复实施例6的操作，得到20.2mg导入有2个精氨酸的高分子化合物(以下有时称为γ-PGA-R2/L)。通过GPC测得的分子量为13,900(PEG/PEO换算)。以与实施例6相同的方式计算出胍基的密度。将结果示于表3。

<<实施例8>>

在本实施例中，使用γ-PGA作为主链高分子，制备侧链上具有4个精氨酸的高分子化合物。

除了使用由4个L-精氨酸构成的碱性肽(NH₂-R4/L)代替单-L-精氨酸之外，重复实施例6的操作，得到21.1mg导入有4个精氨酸的高分子化合物(以下有时称为γ-PGA-R4/L)。通过GPC测得的分子量为7,630(PEG/PEO换算)。以与实施例6相同的方式计算出胍基的密度。将结果示于表3。

<<实施例9>>

在本实施例中，使用γ-PGA作为主链高分子，制备侧链上具有1个甘氨酸及2个精氨酸的高分子化合物。

除了使用由1个甘氨酸及2个L-精氨酸构成的碱性肽(NH₂-G1R2/L)代替单-L-精氨酸之外，重复实施例6的操作，得到29.3mg导入有1个甘氨酸及2个精氨酸的高分子化合物(以下有时称为γ-PGA-G1R2/L)。通过GPC测得的分子量为14,000(PEG/PEO换算)。以与实施例6相同的方式计算出胍基的密度。将结果示于表3。

<<向细胞内的导入的评价>>

使用所述实施例6～10中得到的高分子化合物，测定FITC-OVA向细胞内的导入。

向24孔板的各孔中播种500μL来自于中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)的Ham’s F12培养基悬浮液(2×10⁵个细胞/mL)，在二氧化碳培养箱(37℃、5％CO₂)中预培养24小时。去除上清液并用500μL磷酸缓冲生理盐水洗涤两次后，添加250μL荧光素标记-卵清白蛋白(FITC-OVA；Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)的Ham’s F12培养基溶液(最终浓度1μg/mL)。接着，添加250μL将实施例6～10中得到的高分子化合物溶解于Ham’s F12培养基溶液中而成的溶液(最终浓度5μg/mL)，在二氧化碳培养箱中培养2小时。去除上清的培养基溶液，并用500μL磷酸缓冲生理盐水洗涤两次后，添加100μL胰蛋白酶EDTA溶液(Life Technologies公司制造)，将培养的CHO细胞从板上剥离、分散。接着，添加400μL台盼蓝，使细胞悬浮，回收至微型管中。使回收的细胞悬浮液通过细胞过滤器，并通过流式细胞仪测定MFI(平均荧光强度)。作为对照，实施仅添加γ-PGA的例子(主链高分子)、仅添加由4个精氨酸构成的碱性肽的例子(R4/L)、仅添加FITC-OVA的例子(FITC-OVA)、仅添加细胞的例子(细胞)。将结果示于表3。

细胞外的FITC-OVA通过台盼蓝消光而不发出荧光，仅有被导入细胞内的FITC-OVA发出荧光。MFI表示每个细胞的荧光强度的平均值，因此MFI值越大，则表示作为水溶性高分子化合物的FITC-OVA已被导入细胞内。

此外，通过流式细胞仪解析计算出FITC-OVA的“导入率”。“导入率”是指以测定仅含细胞时的自身荧光强度的最大值为基准，并测定FITC-OVA被导入细胞内时大于基准值的细胞数的比例而得到的值。

将结果示于表3中。

<<细胞毒性评价>>

使用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST(同仁化学)，测定细胞毒性。

向96孔板的各孔中播种100μL CHO细胞的Ham’s F12培养基悬浮液(2×10⁵个细胞/mL)，在二氧化碳培养箱(37℃、5％CO₂)中预培养24小时。添加220μL将实施例6～10中得到的高分子化合物溶解于Ham’s F12培养基溶液中而成的溶液(最终浓度5μg/mL)，将Ham’sF12培养基向低对照孔中添加220μL，向高对照孔添加200μL，向背景空白孔(无细胞的孔)添加220μL，并在二氧化碳培养箱中培养1.5小时。然后向高对照孔中加入20μL LysisBuffer，在二氧化碳培养箱中进一步培养30分钟。从各孔中取出100μL上清液，转移至测定用96孔微板中。向所有的孔中加入100μL Working Solution，并在遮光下于室温进行30分钟显色反应，然后向所有的孔中加入50μL Stop Solution。使用读板器测定490nm的吸光度，计算出细胞毒性(％)。将结果示于表3中。

[表3]

※导入的蛋白质：FITC-OVA(1μg/mL)

※由于γ-PGA不溶于水，因此无法进行向细胞内的导入的评价及细胞毒性的评价

※测定时添加实施例6～9的高分子化合物、主链高分子、R4/L时的浓度：5μg/mL

与对照的3.2～4.4的MFI相比，使用实施例6～9中得到的高分子化合物时，表现出13～36的高MFI。

工业实用性

本发明的高分子化合物能够用于将低膜穿透性的药物等导入细胞内。