阅读说明：本技术 Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺与应用 (Peptibody multi-epitope vaccine fermentation production process and application ) 是由 邓宁 张利刚 于 2019-04-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺与应用。所述的Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺采用了M<Sub>9</Sub>培养基作为发酵培养基,通过IPTG或乳糖诱导发酵,各个环节有机配合实现了Peptibody多表位疫苗的规模生产。其中,所述的乳糖诱导发酵生产工艺能够实现高效稳定的诱导表达,进一步提高湿重和目的蛋白的产量；并可将接种量从2％提高至8％,有效缩短整个发酵时间。本发明成功实现了Peptibody工程菌的高密度发酵和Peptibody多表位疫苗的高效表达,简单稳定、易于放大,100L罐单次发酵生产目的蛋白的产量可达105.64g,具有良好的应用前景和工业生产价值。(The invention provides a Peptibody multi-epitope vaccine fermentation production process and application. The Peptibody multi-epitope vaccine fermentation production process adopts M 9 The culture medium is used as a fermentation medium, and IPTG or lactose is used for inducing fermentation, and all links are organically matched to realize the large-scale production of the Peptibody multi-epitope vaccine. The lactose induced fermentation production process can realize high-efficiency and stable induced expression, and further improves the wet weight and the yield of target protein; and the inoculation amount can be improved from 2% to 8%, and the whole fermentation time is effectively shortened. The invention successfully realizes the high-density fermentation of the Peptibody engineering bacteria and the high-efficiency expression of the Peptibody multi-epitope vaccine, is simple, stable and easy to amplify, has the yield of target protein produced by single fermentation in a 100L tank up to 105.64g, and has good application prospect and industrial production value.)

Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺与应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，特别涉及Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺与应用。

背景技术

肿瘤组织的发展与正常组织一样需要血管提供氧气和营养物质，而肿瘤血管需要在bFGF和VEGF等细胞因子的共同作用下才能生成，因此，bFGF和VEGF已经成为有效抑制肿瘤血管新生和肿瘤细胞发展的分子靶点。发明人团队利用生物信息学和噬菌体展示等技术筛选得到三个bFGF和三个VEGF抗原表位，为提高药物学特性与人的IgG1Fc片段基因融合，构建pET28a重组质粒，通过大肠杆菌BL21表达目的蛋白，即Peptibody多表位疫苗。

在前期研究中，申请人也对重组菌株进行了诱导表达，但要实现Peptibody多表位疫苗从研究到生产的进一步突破，目前至少还需创新解决如下问题：

(1)在实验室研究阶段中的生产规模是在1L以内的容器进行目的蛋白的表达，Peptibody工程菌的湿重和目的蛋白的产量与实际生产仍有较大差距。

(2)IPTG是一种十分高效的乳糖操纵子诱导剂，少量的IPTG即可产生持久的诱导作用。但是IPTG价格昂贵，诱导成本过高会限制工业的规模化生产；同时，过高浓度的IPTG会抑制菌体生长，对人体具有潜在的毒性，生产过程中难以去除，部分国家已经禁止在生产人用重组蛋白时使用IPTG作为诱导剂。而且，IPTG诱导时目的蛋白累积过快，不能正确折叠导致包涵体的生成增多；IPTG在对数生长中期加入即可对菌体产生有效快速的诱导，但是诱导时机难以把握，稍有偏差便会使目的蛋白的产量受到较大影响。

(3)乳糖无毒且价格低廉，现有技术中将其作为IPTG的替代物对乳糖操纵子进行诱导。相比于IPTG通过扩散或者借助乳糖透过酶进入胞内，少量即可快速稳定诱导目的蛋白的表达，对菌体产生有效快速的诱导；乳糖则需要乳糖透过酶的转运才能进入胞内，经β-半乳糖苷酶转化为异乳糖才能起诱导作用，乳糖透过酶对乳糖的亲和力和转运速率都不如IPTG，且主动运输和转化过程会占用菌体能量，造成菌体生长减缓和目的蛋白表达滞后。利用乳糖作为诱导剂的诱导过程较IPTG更为复杂，乳糖诱导存在糖介导的诱导物排除作用，在培养基存在葡萄糖和甘油等碳源的情况下，乳糖诱导滞后，需要在碳源耗尽后才能启动乳糖操纵子；同时乳糖诱导较IPTG温和，但是菌体其他代谢能量充足，细胞壁合成完整，过硬的细胞壁不利于菌体的破碎和目的蛋白的释放。因此，如何实现Peptibody多表位疫苗的价廉、质优及高产的经济规模大生产还需对工艺条件等进行进一步的改进研究。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术生产Peptibody多表位疫苗的缺点与不足，提供一种Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺，对Peptibody多表位疫苗的生产方法进行了进一步的创新研究与完善，对生产工艺进行了放大和改进，通过将M₉培养基和乳糖诱导技术进行创新融合，实现了规模生产抑制肿瘤血管新生的Peptibody多表位疫苗。

本发明的另一目的在于提供所述的Peptibody多表位疫苗发酵生产方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺，包括如下步骤：

(1)接种：将Peptibody工程菌接种至M₉基础培养基，在有氧条件下增殖；

(2)补料：待菌体进入对数生长期后，加入M₉补料培养基；此时菌体进入对数生长期，菌体快速生长，营养消耗快；

(3)诱导：在溶氧量低于步骤(1)的条件下，

当菌体进入对数生长中期时加入IPTG进行诱导，

或者，

当菌体进入对数生长平台期时加入乳糖进行诱导；

(4)下罐：

当诱导剂为IPTG时，诱导1～6h后下罐；

当诱导剂为乳糖时，诱导2～12h后下罐。

本发明所述的Peptibody多表位疫苗为申请人设计的新型疫苗，已在中国专利申请CN201711202680.5中记载，该疫苗是由具有免疫原性的三个bFGF表位肽和三个VEGF表位肽，通过柔性Linker(GGGS)串联成多表位肽，并与IgG1的Fc片段偶连，其氨基酸序列如中国专利申请CN201711202680.5中的SEQID NO.1所示。

步骤(1)中所述的M₉基础培养基的配方优选为：15.12g/L Na₂HPO₄·12H₂O，3g/LKH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，20g/L蛋白胨，0.2g/L MgCl₂，0.01％(v/v)甘油和10g/L酵母提取物；所述的M₉基础培养基增加了无机盐和碳源等营养成分，能够显著提高Peptibody工程菌的湿重和目的蛋白的产量。

步骤(1)中所述的Peptibody工程菌优选为Peptibody工程菌的种子液，所述的种子液优选在LB培养基中培养得到；更优选通过如下步骤得到：

①将所述的Peptibody工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中过夜培养，得到一级种子；

②将所述的一级种子接种至LB培养基中培养得到二级种子。

步骤①中所述的过夜培养优选在37℃、220rpm的条件下进行培养。

步骤②中所述的培养条件优选在37℃、220rpm下培养4h。

步骤(1)中所述的Peptibody工程菌的种子液的接种量优选为2％(v/v)～8％(v/v)；本发明的接种量可提高至8％(v/v)，更快到达平台期和启动乳糖诱导，从而缩短发酵时间。

步骤(1)中的有氧条件优选为溶氧量大于40％的条件下，溶氧过低不利于菌体快速增殖。

步骤(1)中所述的增殖的条件优选为37℃、pH＝7±0.1。

步骤(1)中所述的Peptibody工程菌优选用体积分数为50％的甘油等体积混合后-80℃保存，如此保存12月Peptibody工程菌目的蛋白的表达量可保持达到20％以上，目的蛋白的抗原特异性无明显差异。

步骤(2)和/或步骤(3)中所述的加入优选为流加。

步骤(2)中所述的M₉补料培养基的配方优选为：80g/L蛋白胨，40g/L酵母提取物，0.2％(v/v)甘油和5g/L MgCl₂。

步骤(2)中所述的M₉补料培养基的添加量优选按M₉基础培养基体积的1/3～3/10进行添加。

步骤(2)中所述的补料速度优选为10～100mL/min，补料过慢不利于菌体快速增殖，补料过快会造成乙酸累积，抑制重组蛋白的表达；所述的补料优选在接种后第2～5h内一次性流加；进一步优选为接种后第2h。

步骤(3)中所述的乳糖的终浓度优选为5～30g/L；进一步优选为15～25g/L；最优选为20g/L。

步骤(3)中所述的溶氧量优选为大于30％；进一步优选为30％～80％；溶氧与增殖阶段持平不利于菌体由增殖阶段转变为表达重组蛋白。

步骤(3)中所述的IPTG的终浓度优选为0.1mM；目的蛋白的表达量最高，继续增加IPTG的量不会使目的蛋白的表达升高，甚至抑制目的蛋白的表达。

步骤(3)中所述的诱导的温度优选为20～40℃；进一步优选为28～30℃，最优选为28℃。

步骤(3)中所述的加入IPTG进行诱导优选在接种后第6±0.5h加入IPTG，目的蛋白的表达量最高。菌液OD600_nm优选为0.6～0.8(可根据情况进行稀释)，OD600_nm的值在A600曲线中段，斜率最大，菌体快速生长，菌体处于对数生长中期。

步骤(3)中所述的加入乳糖进行诱导优选在接种后第7h～9h加入乳糖，此时目的蛋白的表达量最高，菌液OD600_nm约为1.0～1.2(可根据情况进行稀释)，OD600_nm的值在A600曲线后段，菌体生长缓慢，曲线呈波动变化，菌体处于对数生长后期(平台期)；乳糖诱导的菌体处于平台期，时间范围宽广，更容易控制诱导剂加入时间，工业上更易于操作。

当诱导剂为IPTG时，步骤(4)中所述的诱导时间优选为4h，此时目的蛋白的表达量最高。

当诱导剂为乳糖时，步骤(4)中所述的诱导时间优选为12h，此时目的蛋白的表达量最高。

所述的生产工艺在下罐后还可以包括收集和/或洗涤菌体的步骤。

所述的收集优选通过离心进行收集，所述的离心的条件优选为4500～8000rpm、10～30min。

所述的洗涤菌体优选采用磷酸缓冲液进行洗涤，洗涤的次数优选为至少3次。

当所述的Peptibody多表位疫苗发酵在摇瓶中进行时，步骤(1)中增殖的转速和时间优选为220rpm和4h，过低的转速和过短的时间会造成菌体生长缓慢，过高的转速和过多的时间会导致菌体生长太快，副产物乙酸累积，抑制目的蛋白的表达；步骤(3)的诱导的温度和转速优选为28℃和180rpm，此条件下目的蛋白呈可溶表达，温度过高使目的蛋白呈包涵体表达，目的蛋白失活，转速继续维持220rpm会抑制菌体从增殖阶段转变为重组蛋白的表达阶段，而温度过低使降温成本升高且仪器条件难以实现。

所述的Peptibody多表位疫苗发酵生产工艺在生产Peptibody多表位疫苗中的应用。

本发明创新地设计了发酵工艺构思，在小量表达的基础上，进一步使用10L发酵罐和再使用100L发酵罐大量生产Peptibody多表位疫苗；并采用了乳糖作为诱导剂替换IPTG诱导Peptibody多表位疫苗的表达。本发明首先构建目的蛋白稳定表达的Peptibody基因工程菌菌种库，筛选出表达特性稳定的菌株；然后对Peptibody工程菌的表达条件进行优化，筛选出M₉培养基作为发酵培养基，对于乳糖诱导发酵，进一步优选了8％接种量和不低于40％的溶氧量作为增殖条件，更优选了接种后第7h的诱导时间、20g/L乳糖诱导终浓度、28℃诱导温度、12h诱导时间和不低于30％的溶氧量作为表达条件；进一步在10L罐中对Peptibody工程菌的发酵工艺进行小试，再在100L发酵罐中放大生产，获得Peptibody工程菌菌体终产物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提出了乳糖作为诱导剂的发酵生产方案，能够高效稳定地诱导Peptibody多表位疫苗的表达，与IPTG相比，能够降低诱导成本和潜在毒性；同时，由于乳糖本身也能作为碳源供细菌代谢利用，从而进一步提高湿重和目的蛋白的产量。

(2)乳糖诱导时，本发明的接种量可从2％提高至8％，能够缩短菌体到达平台期的时间，从而有效缩短整个发酵时间。

(3)本发明的Peptibody多表位疫苗通过乳糖诱导，条件温和，并能够促进目的蛋白正确折叠和可溶表达；在工程菌对数生长后期加入诱导剂，容易掌控加入时机，有利于控制工业上规模化生产重组蛋白的产量和质量。

(4)本发明的发酵生产工艺各个环节有机配合，实现了Peptibody工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高效表达，可实现在100L发酵罐中的放大生产，并优选了100L罐发酵工艺的最优工作参数，包括增殖温度(37℃)、诱导温度(28℃)、发酵pH(7.0)、增殖溶氧量(＞40％)、诱导溶氧量(＞30％)、补料速率(100mL/min)、诱导时机(第7h)和诱导时间(12h)等环节。

(5)本发明提供了一种简单稳定、易于放大，可以规模生产Peptibody多表位疫苗的发酵工艺，该工艺实现了Peptibody工程菌的高密度发酵和Peptibody多表位疫苗的高效表达，100L罐单次发酵生产目的蛋白的产量可达105.64g。

附图说明

图1是本发明Peptibody多表位疫苗发酵工艺的流程图。

图2是SDS-PAGE和Western Blot分析Peptibody工程菌保藏稳定性的结果图；其中，图A是目的蛋白表达图，泳道M为非预染蛋白分子量标准，泳道1～5分别为保藏1、3、6、9和12个月；图B是目的蛋白抗原特异性的结果图，泳道1～5分别为保藏1、3、6、9和12个月。

图3是Peptibody工程菌摇瓶培养条件优化的SDS-PAGE分析结果图；其中，图A是培养基筛选图，泳道1为M₉培养基，泳道2为LB培养基，泳道3为M₉培养基未加诱导剂，泳道4为空白BL21菌株(不含Peptibody质粒)，泳道M为预染蛋白分子量标准；图B是目的蛋白分布图，泳道M为非预染蛋白分子量标准，泳道1为IPTG诱导的破碎上清，泳道2为IPTG诱导的破碎沉淀，泳道3为乳糖诱导的破碎沉淀，泳道4为乳糖诱导的破碎上清。

图4是IPTG作为诱导剂的摇瓶条件优化的SDS-PAGE分析结果图，其中，NC-1为未诱导的Peptibody工程菌，NC-2为空白BL21菌株(不含Peptibody质粒)，诱导温度为20～36℃，诱导浓度为0.1～0.6mM，诱导时间为1～6h，接种量为1～8％(v/v)，溶氧量为30～70％，诱导时机为第2～8h。

图5是乳糖作为诱导剂的摇瓶条件优化的SDS-PAGE分析结果图，其中NC-1为未诱导的Peptibody工程菌，NC-2为空白BL21菌株(不含Peptibody质粒)，诱导温度为24～40℃，诱导浓度为5～30g/L，诱导时间为2～12h，接种量为2～8％(v/v)，溶氧量为30～80％，诱导时机为第1～13h。

图6是Peptibody工程菌10L罐发酵的结果分析图；其中图A和C是菌体生长曲线图；图B和D是SDS-PAGE分析目的蛋白随时间表达情况，泳道M为非预染蛋白分子量标准，B图泳道1～6为IPTG诱导0～5h，D图泳道1～8为乳糖诱导0～7h，泳道9为乳糖诱导12h。

图7是Peptibody工程菌在IPTG诱导下的100L罐发酵工艺的结果图；其中，图A是发酵罐参数曲线图，蓝色为温度(℃)，黑色为溶氧(％)，红色为pH，紫色为转速(rpm)；图B是菌体生长和目的蛋白表达曲线图，红色为湿重(g/L)，黑色为A600(即在600nm的吸光度，OD600_nm的值)，蓝色为表达量(g/L)；图C是SDS-PAGE分析目的蛋白随时间表达情况，泳道M为预染蛋白分子量标准，泳道1～5为IPTG诱导0～4h。

图8是Peptibody工程菌在乳糖诱导下的100L罐发酵工艺的结果图。其中图A是发酵罐参数曲线图，蓝色为温度(℃)，黑色为溶氧(％)，红色为pH，紫色为转速(rpm)；图B是菌体生长和目的蛋白表达曲线图，红色为湿重(g/L)，黑色为A600(OD600_nm的值)，蓝色为表达量(g/L)；图C是SDS-PAGE分析目的蛋白随时间表达情况，泳道M为预染蛋白分子量标准，泳道1～12为乳糖诱导1～12h。

图9是实施例4所用100L发酵罐照片图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1.Peptibody工程菌表达目的蛋白的稳定性

参照中国专利申请CN201711202680.5实施例1的方法构建得到质粒pET28a-VEGF/bFGF-Fc转入BL21大肠杆菌表达菌株，获得Peptibody工程菌，将所得到的Peptibody工程菌与50％甘油等体积混合，-80℃保藏，每隔三个月取样进行IPTG(终浓度为0.1mM)诱导表达，SDS-PAGE分析第1、3、6、9和12个月目的蛋白的表达情况。

2.Western Blot分析

(1)转膜：两层海绵垫、两个3层滤纸、甲醇激活的PVDF膜和SDS-PAGE胶分别叠入转膜装置，去除各层气泡，冰浴条件下进行转膜(100V、70min)；

(2)封闭：PBS-T洗膜，每次5min，重复三次，加入PBS-T配制的5％脱脂奶粉封闭过夜(4℃)；

(3)一抗：PBS-T洗膜三次，加入兔抗VEGF-A单抗(公司：Abcam，货号：ab52917，1:1000)孵育1h(37℃)；

(4)二抗：PBS-T洗膜三次，加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体(公司：CST，货号：#7074，1:2000)孵育45min(37℃)；

(5)曝光：PBS-T洗膜五次，均匀滴加ECL化学发光液，凝胶成像仪曝光。

结果显示，冷冻保藏第1～12个月内，Peptibody工程菌目的蛋白的表达量相近，均达到20％以上，各保藏时长下的Peptibody工程菌目的蛋白的抗原特异性无明显差异(图2A和B)。结果表明，所述的Peptibody工程菌长时间保藏后表达特性能够保持稳定。

实施例2摇瓶培养条件研究

1.培养基的筛选

(1)一级种子：5μL Peptibody工程菌(1:1000)(1:1000表示5μL Peptibody工程菌与5mL LB培养基的配比)+5μL 100mg/mL卡那霉素溶液(1:1000)(1:1000表示5μL 100mg/mL卡那霉素溶液与5mL LB培养基的比值，终浓度为100μg/mL)+5mL LB培养基，过夜培养(37℃、220rpm)；

(2)二级种子：2mL一级种子(1:100)+200mL LB培养基或200mL M₉培养基，培养4h(37℃、220rpm)；

所述的LB培养基(200mL)的配方为：2g蛋白胨，2g NaCl和1g酵母提取物；

所述的M₉培养基(200mL)的配方为：3.02g Na₂HPO₄·12H₂O，0.6g KH₂PO₄，0.1gNaCl，0.2g NH₄Cl，4mL体积分数为50％甘油，0.04g MgCl₂，4g蛋白胨，和2g酵母提取物；50％甘油和MgCl₂分开灭菌，其余物料一起灭菌(121℃、20min)，接种前补全培养基。

(3)诱导：分别加入工作浓度为0.1mM IPTG进行4h诱导(28℃、180rpm)；

(4)收集菌体：SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。

结果显示，LB培养基的菌体湿重为5.75g/L，M₉培养基的菌体湿重为8.5g/L，M₉培养基能够获得与LB培养基相近的诱导效果，目的蛋白的表达量均能达到20％以上(图3A)。结果表明，选用M₉培养基作为Peptibody工程菌的发酵培养基，能够提高菌体湿重和获得目的蛋白的高效表达。

2.IPTG诱导的摇瓶条件的优化(培养基选用M₉培养基)

对诱导温度、诱导浓度、诱导时间、接种量、溶氧量、IPTG加入时间等因素进行摇瓶条件的考察研究。

表1

3.乳糖诱导的摇瓶条件的优化(培养基选用M₉培养基)

对诱导温度、诱导浓度、诱导时间、接种量、溶氧量、乳糖加入时间等因素进行摇瓶条件的考察研究。

表2

温度、诱导剂浓度、诱导时间、接种量、溶氧量和诱导时机等因素对于原核表达都有重要的影响，其中温度的影响是最大的，温度过高时，菌体增长过快，蛋白表达速度过快，主要以包涵体的形式存在，对本发明获得可溶性目的蛋白的影响很大，因此本实施例就温度、诱导剂浓度、诱导时间、接种量、溶氧量和诱导时机等因素进行探索，以获得最佳的目的蛋白表达。

结果显示，IPTG诱导时(图4)，目的蛋白表达量最高的诱导温度为28℃，诱导浓度为0.1mM，诱导时间为4h，接种量为2％，溶氧量大于30％，诱导时机为接种后第6h；乳糖诱导时(图5)，目的蛋白表达量最高的最佳的诱导温度为28℃，诱导浓度为20g/L，诱导时间为12h，接种量为8％，溶氧量大于30％，诱导时机为接种后第7h。

结果表明，乳糖替换IPTG诱导Peptibody工程菌目的蛋白的表达是可行的，以此最佳的摇瓶条件进行10L罐和100L罐的发酵探索。

4.目的蛋白的分布

以所述的目的蛋白表达量最高的条件分别制备得到由IPTG或乳糖诱导得到的菌体。

(1)超声破碎：分别称取由IPTG或乳糖诱导得到的菌体1.14g，40mL 20mM PB缓冲液(磷酸缓冲液)重悬，冰浴条件下进行超声破碎(1/8破头、频率60Hz、工作5s、停5s、运行20min)；

(2)收集上清和沉淀：称量空管重量，离心10min(4000rpm、4℃)，称量管重，离心30min(8000rpm、4℃)，称量管重，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析；

结果显示，IPTG诱导菌体的破碎率为97.37％，乳糖诱导菌体的破碎率为91.23％，两者诱导的目的蛋白绝大部分为可溶表达(图3B)。结果表明，与IPTG相比，本发明中乳糖诱导的菌体同样能够充分破碎，目的蛋白可溶表达。

实施例3Peptibody工程菌10L罐发酵工艺研究

本实施例的10L发酵罐选用上海保兴生物设备工程有限公司的罐体，型号为10JSA-4。

(1)培养基配方：

5L M₉基础培养基的配方如表3所示。

表3

Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O	75.6g
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	15g
NaCl	2.5g
		NH<sub>4</sub>Cl	5g
50％甘油	100mL
		MgCl<sub>2</sub>	1g
蛋白胨	100g
		酵母提取物	50g

1.7L M₉补料培养基的配方如表4所示。

表4

蛋白胨	136g
		酵母提取物	68g
50％甘油	680mL
		MgCl<sub>2</sub>	8.5g

50％甘油和MgCl₂分开灭菌，其余物料一起灭菌(121℃、20min)，接种前补全培养基。

(2)一级种子：10μL Peptibody工程菌(1:1000)+10μL卡那霉素溶液(1:1000)+10mL LB培养基，过夜培养(37℃、220rpm)；

(3)二级种子：4mL一级种子(1:100)+400mL LB培养基，培养4h(37℃、220rpm)；

(4)接种：将活化的二级种子分别以2％(v/v)(即100mL)或8％(v/v)(即400mL)的接种量分别加入到M₉基础培养基中，控制温度为37℃，溶氧量与转速串联大于40％，pH为7.0；

(5)补料：接种后第2h，一次性恒流加入1.7L M₉补料培养基(补料速度＝10mL/min)；

(6)诱导：

IPTG诱导(接种量2％(v/v))：在第6h降低温度至28℃，控制溶氧量大于30％，加入终浓度0.1mM IPTG进行诱导；

乳糖诱导(接种量8％(v/v))：在第7h降低温度至28℃，控制溶氧量大于30％，加入终浓度20g/L乳糖进行诱导；

(7)取样：每隔1h取样，紫外分光光度计检测菌液OD₆₀₀值，SDS-PAGE分析诱导后目的蛋白随时间表达量；

(8)下罐：IPTG连续诱导5h结束下罐，乳糖连续诱导12h结束下罐；下罐后8000rpm、10min离心收集菌体，PB缓冲液洗涤菌体3次。

IPTG诱导时，菌体在接种后第0～2h缓慢生长(延滞期)；第2～5h恒流补料，补料速率为10mL/min，菌体在第2～9h迅速生长(对数生长期)；第6h降温降溶氧，加入0.1mM IPTG进行诱导，菌体在第9～11h波动生长(平台期)；下罐时菌体湿重为92.75g/L，诱导4h目的蛋白的表达量最高，此后开始下降(图6A和图6B)。结果表明，IPTG作为诱导剂时，10L罐Peptibody工程菌发酵工艺的菌体增长和目的蛋白表达情况与摇瓶相符，诱导时间最优为4h，目的蛋白的表达量占总蛋白的20％以上。

乳糖诱导时，接种后第0～2h处于延滞期，接种后菌体生长缓慢；第2～7h处于对数生长期，菌体快速生长；第7～19h处于平台期，菌体生长停滞；在第7h加入20g/L乳糖进行诱导，菌体密度缓慢波动增加，SDS-PAGE检测显示目的蛋白的表达量随时间增长缓慢累积，诱导第12h时目的蛋白的表达量占总蛋白的20％以上，下罐的湿重为99.46g/L(图6C和图6D)。用IPTG诱导时，2％接种量到达平台期的时间为接种后第9h；用乳糖诱导时，8％接种量到达平台期的时间为接种后第7h，接种量由2％提高到8％，到达平台期的时间缩短了2h。结果表明，乳糖诱导不但可以获得与IPTG相近的诱导效果，而且还能提高菌体湿重和目的蛋白的产量；提高接种量能够缩短菌体到达平台期的时间，从而缩短整个发酵时间，诱导时间优选为12h。

实施例4 Peptibody工程菌100L罐发酵工艺

本实施例的100L发酵罐选用德国Sartorious的罐体，型号为VP-100(图9)。

(1)培养基配方

50L M₉基础培养基如表5所示。

表5

17L M₉补料培养基如表6所示。

表6

蛋白胨	1360g
		酵母提取物	680g
50％甘油	6.8L
		MgCl<sub>2</sub>	85g

(2)一级种子：50mL LB培养基+50μL卡那霉素溶液(1:1000)+50μL Peptibody工程菌(1:1000)，37℃、220rpm过夜培养；

(3)二级种子：500mL LB培养基+5mL一级种子(1:100)，37℃、220rpm培养4h；

(4)接种：接种管分别泵入1L(即2％(v/v))或4L(即8％(v/v))二级种子，设置罐压为20mbar、温度为37℃、pH为7.0、溶氧(串联纯氧和转速)大于40％；

(5)补料：接种后第2h开始流加17L补料培养基，补料速率为100mL/min；

(6)诱导：

IPTG诱导(接种量2％(v/v))：在第6h设置温度为28℃、溶氧(串联纯氧和转速)大于30％，快速流加终浓度0.1mM IPTG；

乳糖诱导(接种量8％(v/v))：在第7h设置温度为28℃、溶氧(串联纯氧和转速)大于30％，快速流加终浓度20g/L乳糖；

(7)下罐：IPTG连续诱导4h结束下罐，乳糖连续诱导12h结束下罐，4500rpm、30min离心(离心杯装量2L/瓶)收集菌体，PB缓冲液洗涤3次；

(8)取样：间隔1h取样，检测样品OD_600nm和湿重的值，SDS-PAGE和软件分析目的蛋白的表达量。

IPTG诱导的接种量为2％(v/v)，菌体在接种后第0～2h缓慢生长(适应期)；第2～5h一次性恒流补料，补料速率为100mL/min，菌体在第2～9h迅速生长(对数生长期)；第6h降温降溶氧，加入0.1mM IPTG进行诱导，菌体在第9～10h波动生长(平台期)；诱导后，目的蛋白随时间缓慢累积，下罐时菌体湿重为126g/L，目的蛋白的表达量为1.41g/L，产量约为95.88g(图7A、B和C)。结果表明，IPTG作为诱导剂时，100L罐Peptibody工程菌发酵工艺的菌体增长和目的蛋白表达情况与10L罐相符。

乳糖诱导的接种量为8％(v/v)，在接种后第0～2h菌体缓慢生长(适应期)；第2～5h一次性进行补料，补料速率为100mL/min，在第2～7h菌体迅速生长(对数生长期)；第7h降低温度和溶氧，加入20g/L乳糖进行诱导，在第7～19h菌体波动生长(平台期)；诱导后，目的蛋白随时间缓慢累积，下罐时菌体湿重为137g/L，目的蛋白的表达量为1.39g/L，产量约为105.64g(图8A、B和C)。结果表明，乳糖作为诱导剂时，100L罐Peptibody工程菌发酵工艺的菌体增长和目的蛋白表达情况与10L罐相符，乳糖诱导能够实现Peptibody工程菌稳定的高密度发酵和Peptibody多表位疫苗的大量生产，100L罐单次发酵菌体湿重和目的蛋白产量均高于IPTG诱导。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。