阅读说明：本技术 猴耳环多肽的制备方法和猴耳环多肽脂质体的制备方法 (Preparation method of pithecellobium clypearia polypeptide and preparation method of pithecellobium clypearia polypeptide liposome ) 是由 陈东明 孙葵英 龙孝军 于 2020-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种猴耳环多肽的制备方法,包括以下步骤：S1、取猴耳环,灭菌后移至发酵罐；S2、往发酵罐中加入酵母菌粉、乳酸菌粉和适量水后,密封发酵；S3、将纤维素酶、果胶酶分别加入4～5倍猴耳环重量的水中,真空抽取酶液至发酵罐中,使发酵罐中的混合液在40～50℃保温18～36h；S4、往发酵罐中加入酸液调节混合液的pH为3～5,过滤得到滤液；S5、将滤液进行浓缩、干燥,得到猴耳环多肽干粉。通过酶解法破坏猴耳环的细胞壁,避免细胞壁吸附猴耳环多肽和多酚从而影响得率,利用表面活性剂吐温80,解决了脂质体难成膜且容易溶散的问题,且得到的猴耳环多肽脂质体包封率高。(The invention discloses a preparation method of pithecellobium clypearia polypeptide, which comprises the following steps: s1, taking the pithecellobium clypearia, sterilizing and transferring to a fermentation tank; s2, adding yeast powder, lactic acid bacteria powder and a proper amount of water into the fermentation tank, and sealing and fermenting; s3, adding cellulase and pectinase into water with the weight 4-5 times that of the pithecellobium clypearia, and vacuumizing enzyme liquid into a fermentation tank to keep the temperature of mixed liquid in the fermentation tank at 40-50 ℃ for 18-36 hours; s4, adding acid liquor into the fermentation tank to adjust the pH of the mixed liquor to 3-5, and filtering to obtain filtrate; and S5, concentrating and drying the filtrate to obtain the pithecellobium clypearia polypeptide dry powder. The cell wall of the pithecellobium clypearia is damaged by an enzymolysis method, the problem that the pithecellobium clypearia polypeptide and polyphenol are adsorbed by the cell wall to influence the yield is avoided, the problem that the liposome is difficult to form a film and easy to dissolve is solved by using the surfactant Tween 80, and the encapsulation rate of the obtained pithecellobium clypearia polypeptide liposome is high.)

猴耳环多肽的制备方法和猴耳环多肽脂质体的制备方法

技术领域

本发明涉及中药制药领域，尤其涉及一种猴耳环多肽的制备方法和猴耳环多肽脂质体的制备方法。

背景技术

耳环，学名名围涎树，民间又叫婆劈树、鸡心树、三不正、尿桶公、洗头树、落地金钱等，是多年生乔本植物，1984年7月由华南植物研究所分类室鉴别原植物为含羞草科，后由国际卫生组织将其归到豆科、猴耳环属，学名为Pithecellobium clypearia(属多年生乔木围廷树)。猴耳环性味苦涩寒，功效清热解毒、收湿敛疮，是治疗多种热毒症候独特的南方药材。

目前对猴耳环的提取多为有机物提取法，例如申请号为2013103140324的中国发明专利，公开猴耳环提取物的制备方法，通过用水或乙醇或乙醇水溶液进行提取得到浸膏，然而这种制备方法猴耳环多肽的得率低。另外就是定向合成或者通过特定的蛋白水解，定向合成与蛋白水解需要特定药学中间体以及特定的蛋白质，对原料要求极高。因此，亟需一种得率高、对原料要求低的猴耳环多肽的制备方法。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供一种猴耳环多肽的制备方法。

一种猴耳环多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、取猴耳环，灭菌后移至发酵罐；

S2、往发酵罐中加入酵母菌粉、乳酸菌粉和适量水后，密封发酵72～108h；酵母菌粉重量为猴耳环重量的0.1％～1％，乳酸菌粉重量为猴耳环重量的0.1％～0.5％；

S3、将纤维素酶、果胶酶分别加入4～5倍猴耳环重量的水中，真空抽取酶液至发酵罐中，使发酵罐中的混合液在40～50℃保温18～36h；

S4、往发酵罐中加入酸液调节混合液的pH为3～5，过滤得到滤液；

S5、将滤液进行浓缩、干燥，得到猴耳环多肽干粉。

在本发明的其中一种

具体实施方式

中，步骤S5中先将滤液浓缩至密度为1.15～1.35g/cm³，再喷雾干燥至干粉。将滤液浓缩至对应的密度，能保证步骤S5的喷雾干燥顺畅进行，避免喷头堵塞。

在本发明的其中一种具体实施方式中，步骤S3中纤维素酶和果胶酶的加入量均为猴耳环重量的0.01％～0.02％。

在本发明的其中一种具体实施方式中，步骤S4中的酸液为酒石酸或柠檬酸。采用酒石酸或柠檬酸调节pH除可以调节pH外，残留的酒石酸或柠檬酸可以不用除去直接制药。

在本发明的其中一种具体实施方式中，步骤S4调节pH之前，先使发酵罐中的混合液冷却至室温。避免过滤的过程中由于温度的降低导致猴耳环多肽的析出。

在本发明的其中一种具体实施方式中，步骤S2中酵母菌粉和乳酸菌粉预先溶解于水中。将酵母菌粉和乳酸菌粉预先溶解于水中，有助于酵母菌粉和乳酸菌粉的分散，保证发酵罐中发酵程度的一致性。

基于本发明的猴耳环多肽制备方法，本发明进一步提出一种猴耳环多肽脂质体的制备方法，在步骤S1～S5的基础上，还包括以下步骤：

S6、将猴耳环多肽干粉粉碎至500～800目，得到猴耳环多肽细粉，将猴耳环多肽细粉加入含有吐温80的丙二醇中溶解，吐温80的重量为猴耳环多肽细粉重量的0.01％～0.08％；

S7、用***溶解大豆磷脂和液态胆固醇；大豆磷脂的重量为猴耳环多肽细粉重量的1％～5％；液态胆固醇的重量为猴耳环多肽细粉重量的1％～5％；

S8、将步骤S6的丙二醇溶液与***溶液混合均匀，加入羟丙甲基纤维素后混合均匀，喷雾干燥后得到猴耳环多肽脂质体；羟丙甲基纤维素的重量为为猴耳环多肽细粉重量的0.1％～1％。

在本发明的其中一种具体实施方式中，步骤S8中将丙二醇溶液和***溶液搅拌混合均匀，至无***味，再加入羟丙甲基纤维素。保证***无大量残留，防止由于***与羟丙甲基纤维素不互溶而影响猴耳环多肽脂质体的成型。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过酶解法破坏猴耳环的细胞壁，避免细胞壁吸附猴耳环多肽和多酚从而影响得率，且在过滤之前调节pH，提高猴耳环多肽在发酵液中的溶解度，避免过多的猴耳环多肽随着猴耳环残渣被滤去。利用表面活性剂吐温80，解决了脂质体难成膜且容易溶散的问题，且得到的猴耳环多肽脂质体包封率高。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1

一种猴耳环多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、取猴耳环，灭菌后移至发酵罐；

S2、往发酵罐中加入酵母菌粉、乳酸菌粉和适量水后，酵母菌粉、乳酸菌粉提前溶解在水中，密封发酵72h；酵母菌粉重量为猴耳环重量的0.3％，乳酸菌粉重量为猴耳环重量的0.1％；

S3、将纤维素酶、果胶酶分别加入5倍猴耳环重量的水中，真空抽取酶液至发酵罐中，使发酵罐中的混合液在40℃保温18h，纤维素酶和果胶酶的加入量均为猴耳环重量的0.012％，冷却至室温；

S4、往发酵罐中加入酒石酸调节混合液的pH为5，过滤得到滤液；

S5、将滤液进行浓缩、干燥，得到猴耳环多肽干粉。

步骤S5中先将滤液浓缩至密度为1.15g/cm³，再喷雾干燥至干粉。

基于本实施例的猴耳环多肽制备方法，进一步提出一种猴耳环多肽脂质体的制备方法，在步骤S1～S5的基础上，还包括以下步骤：

S6、将猴耳环多肽干粉粉碎至500目，得到猴耳环多肽细粉，将猴耳环多肽细粉加入含有吐温80的丙二醇中溶解，吐温80的重量为猴耳环多肽细粉重量的0.02％；

S7、用***溶解大豆磷脂和液态胆固醇；大豆磷脂的重量为猴耳环多肽细粉重量的2％；液态胆固醇的重量为猴耳环多肽细粉重量的2％；

S8、将步骤S6的丙二醇溶液与***溶液混合均匀，至无***味，加入羟丙甲基纤维素后混合均匀，喷雾干燥后得到猴耳环多肽脂质体；羟丙甲基纤维素的重量为为猴耳环多肽细粉重量的0.5％。

本实施例得到的猴耳环多肽脂质体呈多孔状均一的囊材，囊材可塑性高。

实施例2

一种猴耳环多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、取猴耳环，灭菌后移至发酵罐；

S2、往发酵罐中加入酵母菌粉、乳酸菌粉和适量水后，酵母菌粉、乳酸菌粉提前溶解在水中，密封发酵108h；酵母菌粉重量为猴耳环重量的0.1％，乳酸菌粉重量为猴耳环重量的0.1％；

S3、将纤维素酶、果胶酶分别加入4倍猴耳环重量的水中，真空抽取酶液至发酵罐中，使发酵罐中的混合液在50℃保温36h，纤维素酶和果胶酶的加入量均为猴耳环重量的0.012％，冷却至室温；

S4、往发酵罐中加入酒石酸调节混合液的pH为3，过滤得到滤液；

S5、将滤液进行浓缩、干燥，得到猴耳环多肽干粉。

步骤S5中先将滤液浓缩至密度为1.35g/cm³，再喷雾干燥至干粉。

基于本实施例的猴耳环多肽制备方法，进一步提出一种猴耳环多肽脂质体的制备方法，在步骤S1～S5的基础上，还包括以下步骤：

S6、将猴耳环多肽干粉粉碎至800目，得到猴耳环多肽细粉，将猴耳环多肽细粉加入含有吐温80的丙二醇中溶解，吐温80的重量为猴耳环多肽细粉重量的0.05％；

S7、用***溶解大豆磷脂和液态胆固醇；大豆磷脂的重量为猴耳环多肽细粉重量的2％；液态胆固醇的重量为猴耳环多肽细粉重量的2％；

S8、将步骤S6的丙二醇溶液与***溶液混合均匀，至无***味，加入羟丙甲基纤维素后混合均匀，喷雾干燥后得到猴耳环多肽脂质体；羟丙甲基纤维素的重量为为猴耳环多肽细粉重量的0.5％。

本实施例得到的猴耳环多肽脂质体呈多孔状均一的囊材，囊材可塑性高。

实施例3

一种猴耳环多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、取猴耳环，灭菌后移至发酵罐；

S2、往发酵罐中加入酵母菌粉、乳酸菌粉和适量水后，酵母菌粉、乳酸菌粉提前溶解在水中，密封发酵72h；酵母菌粉重量为猴耳环重量的0.1％，乳酸菌粉重量为猴耳环重量的0.1％；

S3、将纤维素酶、果胶酶分别加入5倍猴耳环重量的水中，真空抽取酶液至发酵罐中，使发酵罐中的混合液在40℃保温18h，纤维素酶和果胶酶的加入量均为猴耳环重量的0.01％，冷却至室温；

S4、往发酵罐中加入酒石酸调节混合液的pH为5，过滤得到滤液；

S5、将滤液进行浓缩、干燥，得到猴耳环多肽干粉。

步骤S5中先将滤液浓缩至密度为1.15g/cm³，再喷雾干燥至干粉。

基于本实施例的猴耳环多肽制备方法，进一步提出一种猴耳环多肽脂质体的制备方法，在步骤S1～S5的基础上，还包括以下步骤：

S6、将猴耳环多肽干粉粉碎至500目，得到猴耳环多肽细粉，将猴耳环多肽细粉加入含有吐温80的丙二醇中溶解，吐温80的重量为猴耳环多肽细粉重量的0.01％；

S7、用***溶解大豆磷脂和液态胆固醇；大豆磷脂的重量为猴耳环多肽细粉重量的1％；液态胆固醇的重量为猴耳环多肽细粉重量的1％；

S8、将步骤S6的丙二醇溶液与***溶液混合均匀，至无***味，加入羟丙甲基纤维素后混合均匀，喷雾干燥后得到猴耳环多肽脂质体；羟丙甲基纤维素的重量为为猴耳环多肽细粉重量的0.1％。

本实施例得到的猴耳环多肽脂质体呈多孔状均一的囊材，囊材可塑性高。

实施例4

一种猴耳环多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、取猴耳环，灭菌后移至发酵罐；

S2、往发酵罐中加入酵母菌粉、乳酸菌粉和适量水后，酵母菌粉、乳酸菌粉提前溶解在水中，密封发酵108h；酵母菌粉重量为猴耳环重量的1％，乳酸菌粉重量为猴耳环重量的0.5％；

S3、将纤维素酶、果胶酶分别加入5倍猴耳环重量的水中，真空抽取酶液至发酵罐中，使发酵罐中的混合液在50℃保温36h，纤维素酶和果胶酶的加入量均为猴耳环重量的0.08％，冷却至室温；

S4、往发酵罐中加入酒石酸调节混合液的pH为5，过滤得到滤液；

S5、将滤液进行浓缩、干燥，得到猴耳环多肽干粉。

步骤S5中先将滤液浓缩至密度为1.35g/cm³，再喷雾干燥至干粉。

基于本实施例的猴耳环多肽制备方法，进一步提出一种猴耳环多肽脂质体的制备方法，在步骤S1～S5的基础上，还包括以下步骤：

S6、将猴耳环多肽干粉粉碎至500目，得到猴耳环多肽细粉，将猴耳环多肽细粉加入含有吐温80的丙二醇中溶解，吐温80的重量为猴耳环多肽细粉重量的0.02％；

S7、用***溶解大豆磷脂和液态胆固醇；大豆磷脂的重量为猴耳环多肽细粉重量的5％；液态胆固醇的重量为猴耳环多肽细粉重量的5％；

S8、将步骤S6的丙二醇溶液与***溶液混合均匀，至无***味，加入羟丙甲基纤维素后混合均匀，喷雾干燥后得到猴耳环多肽脂质体；羟丙甲基纤维素的重量为为猴耳环多肽细粉重量的0.1％。

本实施例得到的猴耳环多肽脂质体呈多孔状均一的囊材，囊材可塑性高。

对比例1

称取猴耳环叶片粉末20mg，加入100mg的60％乙醇，提取144h，过滤得到滤液。

对比例2

一种猴耳环多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、取猴耳环，灭菌后移至发酵罐；

S2、往发酵罐中加入酵母菌粉、乳酸菌粉和适量水后，酵母菌粉、乳酸菌粉提前溶解在水中，密封发酵72h；酵母菌粉重量为猴耳环重量的0.3％，乳酸菌粉重量为猴耳环重量的0.1％；

S3、将纤维素酶、果胶酶分别加入5倍猴耳环重量的水中，真空抽取酶液至发酵罐中，使发酵罐中的混合液在40℃保温18h，纤维素酶和果胶酶的加入量均为猴耳环重量的0.012％，冷却至室温；

S4、往发酵罐中加入酒石酸调节混合液的pH为5，过滤得到滤液；

S5、将滤液进行浓缩、干燥，得到猴耳环多肽干粉。

步骤S5中先将滤液浓缩至密度为1.15g/cm³，再喷雾干燥至干粉。

基于本对比例的猴耳环多肽制备方法，进一步提出一种猴耳环多肽脂质体的制备方法，在步骤S1～S5的基础上，还包括以下步骤：

S6、将猴耳环多肽干粉粉碎至500目，得到猴耳环多肽细粉，将猴耳环多肽细粉加入丙二醇中溶解；

S7、用***溶解大豆磷脂和液态胆固醇；大豆磷脂的重量为猴耳环多肽细粉重量的2％；液态胆固醇的重量为猴耳环多肽细粉重量的2％；

S8、将步骤S6的丙二醇溶液与***溶液混合均匀，至无***味，加入羟丙甲基纤维素后混合均匀，喷雾干燥后得到猴耳环多肽脂质体；羟丙甲基纤维素的重量为为猴耳环多肽细粉重量的0.5％。

本对比例的脂质体难以成球，且容易溶散，脂质体可塑性差。

对比例3

一种猴耳环多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、取猴耳环，灭菌后移至发酵罐；

S2、往发酵罐中加入酵母菌粉、乳酸菌粉和适量水后，酵母菌粉、乳酸菌粉提前溶解在水中，密封发酵108h；酵母菌粉重量为猴耳环重量的0.1％，乳酸菌粉重量为猴耳环重量的0.1％；

S3、将纤维素酶、果胶酶分别加入4倍猴耳环重量的水中，真空抽取酶液至发酵罐中，使发酵罐中的混合液在50℃保温36h，纤维素酶和果胶酶的加入量均为猴耳环重量的0.012％，冷却至室温；

S4、往发酵罐中加入酒石酸调节混合液的pH为3，过滤得到滤液；

S5、将滤液进行浓缩、干燥，得到猴耳环多肽干粉。

步骤S5中先将滤液浓缩至密度为1.35g/cm³，再喷雾干燥至干粉。

基于本实施例的猴耳环多肽制备方法，进一步提出一种猴耳环多肽脂质体的制备方法，在步骤S1～S5的基础上，还包括以下步骤：

S6、将猴耳环多肽干粉粉碎至800目，得到猴耳环多肽细粉，将猴耳环多肽细粉加入含有司盘80的丙二醇中溶解，司盘80的重量为猴耳环多肽细粉重量的0.05％；

S7、用***溶解大豆磷脂和液态胆固醇；大豆磷脂的重量为猴耳环多肽细粉重量的2％；液态胆固醇的重量为猴耳环多肽细粉重量的2％；

S8、将步骤S6的丙二醇溶液与***溶液混合均匀，至无***味，加入羟丙甲基纤维素后混合均匀，喷雾干燥后得到猴耳环多肽脂质体；羟丙甲基纤维素的重量为为猴耳环多肽细粉重量的0.5％。

多酚的测试

对照品溶液的制备：取没食子酸对照品适量，精密称定，加60％甲醇溶解制成每1ml含没食子酸0.5mg的对照品储备液。

标准曲线的制备：精密移取没食子酸对照品贮备溶液3.0、1.0、2.0、1.0、3.0mL，分别置于250、20、25、10、20mL量瓶中，加水定容置刻度，取稀释处理后对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，依次加入蒸馏水1ml、Folin～Ciocalteu试液0.5ml，摇匀后于0.5～8min之间加入20％Na₂CO₃溶液1ml，最后用水定容，摇匀，室温下反应2h，以60％甲醇代替供试品溶液作为空白，在760nm下测定其吸光度A(空白)。以没食子酸浓度(μg/mL)为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)进行线性回归，绘制标准曲线。

取实施例1-4和对比例1的滤液，稀释后，取1ml。照标准曲线制备项下的方法，自“加入蒸馏水1ml”起，依照以上方法测定吸光度值，从标准曲线上读出滤液样品中多酚量，计算含量。结果如表1所示。

多肽的测试

标准曲线的制作：取十个10ml的容量瓶，用5％的TCA依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，然后分别取6.0ml标准溶液，加入4.0ml双缩脲试剂，混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值(以第一管做空白对照)。以肽的浓度为横坐标X(mg/ml)，OD值为纵坐标Y，制作标准曲线。

多肽含量的测定程序：分别取2.5ml实施例1-4和对比例1的滤液，加入2.5ml 10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r/min下离心15min，将上清液全部转移到50ml容量瓶中，并用5％的TCA定容至刻度，摇匀。然后取6.0ml上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0ml(样液:双缩脲试剂＝3:2，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/ml)，从而得到对应滤液中多肽含量，结果如表1所示。

表1猴耳环多酚和猴耳环多肽含量测试

编号	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	对比例1
						多酚含量	62％	60％	58％	58％	35％
多肽含量	55％	52％	50％	49％	28％

通过表1可知，实施例1-4采用酶解法相对于对比例1的有机溶剂提取法，猴耳环多酚和多肽的得率更高。

将实施例1-4和对比例2-3得到的猴耳环脂质体进行包封率测定，具体步骤如下：

称取5mg猴耳环脂质体置于10mL容量瓶中，加入适量的10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液超声破乳后，再用10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液定容至容量瓶刻度，混匀后过滤膜后得到滤液，然后取6.0ml上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0ml(样液:双缩脲试剂＝3:2，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值，对照多肽含量测定的标准曲线求得样品破乳后溶液中的多肽浓度C，进而得到5mg猴耳环脂质体的总质量C_总；称取5mg猴耳环脂质体于离心管中，加入适量的10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液后15000r/min离心，将离心管中的所有物质转移到10mL的容量瓶中，再用10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液定容至容量瓶刻度，混匀后过滤膜后得到滤液，然后取6.0ml上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0ml(样液:双缩脲试剂＝3:2，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值，对照多肽含量测定的标准曲线求得样品离心后溶液中的多肽浓度C，进而得到5mg猴耳环脂质体的游离质量C_游离，包封率＝(C_总-C_游离)/C_总×100％，计算结果如表2所示。

表2猴耳环多肽包封率测定

项目	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	对比例2	对比例3
							包封率(％)	92.3	94.1	91.9	91.7	69.8	70.1

由表2数据可知：实施例1-4通过加入表面活性剂吐温80，相对于不加表面活性剂的实施例2，猴耳环多肽脂质体的包封率均高于90％，大大提高了猴耳环多肽脂质体的包封率；对比例3加入司盘80，包封率并没有太明显的提高。

本发明制备的猴耳环多肽脂质体可用于上呼吸道感染动物的治疗，例如家禽咳嗽。

以上为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。