阅读说明：本技术 用于在tau蛋白病变治疗中使用的经修饰的寡核苷酸 (Modified oligonucleotides for use in the treatment of tauopathies ) 是由 A·埃布内特 C·范奥特利福迪德瓦勒 S·格里亚兹诺夫 S·马丁内兹蒙特罗 V·K·拉万什 于 2019-03-13 设计创作，主要内容包括：公开了在2’和/或3’位置包含修饰的寡核苷酸,以及制备和针对阿尔茨海默病和其他tau蛋白病变使用的方法。(Oligonucleotides comprising modifications at the 2' and/or 3' positions are disclosed, as well as methods of making and using against alzheimer's disease and other tauopathies.)

用于在tau蛋白病变治疗中使用的经修饰的寡核苷酸

背景技术

已经考虑将反义寡核苷酸疗法用于治疗或预防各种疾病和病症，例如病毒性疾病、神经疾病、神经退行性疾病、纤维化疾病和过度增生性疾病。

与人脑神经原纤维或胶质原纤维缠结中tau蛋白病理聚集相关的神经退行性疾病被称为tau蛋白病变。缠结由以不可溶形式聚集的高磷酸化微管相关蛋白tau构成。神经原纤维缠结(NFT)可能导致神经元死亡，并且因此是包括阿尔茨海默病在内的tau蛋白病变的主要致病因素。

阿尔茨海默病(AD)是一种慢性神经退行性脑障碍，占所有痴呆症病例的50％-70％。全世界约有4700万人患有痴呆症，预计到2050年这一数字将上升至1.31亿。仅对症治疗可用，说明必须找到可减缓或甚至阻止疾病进展的疾病修饰疗法。

病理上，AD的特征是细胞外淀粉样蛋白β斑块的异常积累和由高磷酸化tau蛋白组成的NFT的细胞内形成。tau是由MAPT基因编码的微管相关蛋白(MAP)。NFT积累的位置和强度与AD的认知能力下降密切相关，并且MAPT基因的突变导致帕金森病(FTD)情况下的额颞叶痴呆。这些事实支持基于tau疗法的发展。减少聚集、去除细胞内聚集物、停止扩散、增加细胞内清除率和改变翻译后修饰是旨在减少tau病理的一些治疗策略。

反义寡核苷酸(ASO)是小的单链核酸分子，通过经典的沃森-克里克碱基配对与RNA靶结合，形成ASO:RNA双链体。取决于磷酸糖主链的化学修饰，形成的ASO:RNA双链体可以募集RNA酶-H，所述酶将切割双链体的RNA链，而使ASO保持完整。然后，切割的RNA进一步降解，导致靶基因的mRNA和蛋白质表达水平降低。ASO主链的化学修饰也可以改变结合亲和力、对核酸酶活性的抵抗力以及与(血清)蛋白质的结合能力。

相应地，本领域需要发现和开发具有不同作用机制、效力增加、亲和力增加和/或副作用减少的新疗法。

发明内容

本公开涉及含有寡核苷酸的化合物和组合物，以及它们在预防或治疗疾病和病症，例如诸如阿尔茨海默病中的用途。

一些实施例包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是式(I)的核苷酸：

其中R是H或带正电荷的抗衡离子，B是核碱基，

R₁是-(CR’₂)₂OCR’₃，并且R’在每种情况下独立地是H或F。在一些实施例中，所述寡核苷酸的每个核苷酸是式(I)的核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包含2至40个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包含2-26个式(I)的核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包含5-10个式(I)的核苷酸。在一些实施例中，在至少一个式(I)的核苷酸中B是未修饰的核碱基。在一些实施例中，在至少一个式(I)的核苷酸中B是经修饰的核碱基。在一些实施例中，在每个式(I)的核苷酸中B是未修饰的核碱基。在一些实施例中，在每个式(I)的核苷酸中B是经修饰的核碱基。在一些实施例中，在至少一个式(I)的核苷酸中每个R’是H。在一些实施例中，在每个式(I)的核苷酸中每个R’是H。在一些实施例中，在至少一个式(I)的核苷酸中R₁是-(CH₂)₂OCH₃。在一些实施例中，在每个式(I)的核苷酸中R₁是-(CH₂)₂OCH₃。

在一些实施例中，寡核苷酸包含一个或多个式(II)的核苷酸：

其中Y是S或O，R是H或带正电荷的抗衡离子，B是核碱基，R₂是-CR’₃、-CR’₂OCR’₃、-(CR’₂)₃OCR’₃或-(CR’₂)_1-2CR’₃，或R₂是-(CR’₂)₂OCR’₃且Y是O，且R’在每种情况下独立是H或F。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式(II)的核苷酸，其中R₂是-CR’₃。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式(II)的核苷酸，其中R₂是-(CR’₂)_1-2OCR’₃。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式(II)的核苷酸，其中R₂是-(CR’₂)_1-2CR’₃。在一些实施例中，在至少一个式(II)的核苷酸中B是经修饰的核碱基。在一些实施例中，在至少一个式(II)的核苷酸中Y是S。在一些实施例中，在至少一个式(II)的核苷酸中Y是O。在一些实施例中，在每个式(II)的核苷酸中Y是S。在一些实施例中，在每个式(II)的核苷酸中Y是O。

在一些实施例中，寡核苷酸还包含一个或多个式(IIIa)或式(IIIb)的核苷酸：

其中Y是S或O，R是H或带正电荷的抗衡离子，并且B是核碱基。

在一些实施例中，寡核苷酸还包含一个或多个式(V’)的核苷酸：

其中Y是S或O，R是H或带正电荷的抗衡离子，B在每种情况下独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基，A是-(CR”R”)_1-2-并且R”在每种情况下独立地是H、F或Me。

在一些实施例中，寡核苷酸以式(VI)：5'X—Y—Z3'(VI)的构建体布置，其中X、Y和Z中的每一个是包含2-14个核苷酸的结构域，X和Z结构域中的至少一个包含至少一个式(I)的核苷酸，并且其中Y结构域的每个核苷酸是2’-脱氧核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包含18至22个核苷。在一些实施例中，X和Z结构域各自包含5-10个核苷酸。在一些实施例中，Y结构域包含5-10个核苷酸。在一些实施例中，X和Z结构域各自包含5-10个核苷酸，并且Y结构域包含5-10个核苷酸。在一些实施例中，X和Z结构域各自包含5个核苷酸，并且Y结构域包含10个核苷酸。在一些实施例中，X和Z结构域的每个核苷酸是式(I)的核苷酸。在一些实施例中，X结构域的至少一个核苷酸和Z结构域的至少一个核苷酸各自独立地选自由以下组成的组：式(II)的核苷酸、式(IIIa)的核苷酸和式(IIIb)的核苷酸。在一些实施例中，X和Z结构域的至少一个核苷酸的每一个是相同的核苷酸。在一些实施例中，Y结构域的每个核苷酸通过硫代磷酸酯亚基间键联连接。在一些实施例中，寡核苷酸是单链的。在一些实施例中，寡核苷酸是反义寡核苷酸。

在实施例中，寡核苷酸与人MAPT基因的外显子5的至少一部分互补。

其他实施例包括嵌合寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是式(VI)的核苷酸：

5'-X—Y—Z-3' (VI)，

其中X—Y—Z是包含具有18至22个核苷的序列的嵌合寡核苷酸，并且任选地在5'和/或3'末端缀合至配体靶向基团；X是包含经修饰的核苷的序列的结构域，所述经修饰的核苷的序列的长度是3-10个核苷；Z是包含经修饰的核苷的序列的结构域，所述经修饰的核苷的序列的长度是3-10个核苷；并且Y是包含通过硫代磷酸酯亚基间键联连接的2至14个2’-脱氧核苷的序列的结构域。在一些实施例中，Y结构域的长度是6至10个核苷。在一些实施例中，X和/或Z结构域包含通过N3’→P5’氨基磷酸酯或N3’→P5’硫代氨基磷酸酯亚基间键联连接的经修饰的核苷的序列。在一些实施例中，Y结构域包含至少一个磷酸二酯亚基间键。在一些实施例中，Y结构域由通过硫代磷酸酯亚基间键和任选地一个或两个磷酸二酯亚基间键联连接的2’-脱氧核苷组成。在一些实施例中，X结构域包含经修饰的核苷，其中所述修饰独立地选自由以下组成的组：2’-F、2’-F-N3’→P5’、2’-OMe、2’-OMe-N3’→P5’、2’-O-甲氧基乙氧基、2’-O-甲氧基乙氧基-N3’→P5’、构象受限的核苷、2’-OH-N3′→P5′硫代氨基磷酸酯和2’-OH-N3′→P5′氨基磷酸酯。在一些实施例中，Z的功能结构域包含经修饰的核苷，其中所述修饰选自由以下组成的组：2’-F、2’-F-N3’→P5’、2’-OMe、2’-OMe-N3’→P5’、2’-O-甲氧基乙氧基、2’-O-甲氧基乙氧基-N3’→P5’、构象受限的核苷、2’-OH-N3’→P5’硫代氨基磷酸酯和2’-OH-N3’→P5’氨基磷酸酯。在一些实施例中，X和/或Z结构域包含通过N3’→P5’氨基磷酸酯亚基间键联连接的一个或多个2’-脱氧核苷。在一些实施例中，X和Z结构域包含一个或多个2’-***糖基-F和/或2’-核糖基-F修饰的核苷，其中每个所述核苷通过N3′→P5′氨基磷酸酯或N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚基间键联中的至少一个独立地连接。在一些实施例中，X和Z结构域包含一个或多个2’-OMe修饰的核苷，其中每个所述核苷通过N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯或硫代磷酸酯亚基间键联中的至少一个独立地连接。在一些实施例中，X和Z结构域的每一个中的经修饰的核苷是通过硫代磷酸酯亚基间键联连接的2’-OMe修饰的核苷，并且其中所述经修饰的核苷包括5-甲基胞嘧啶核碱基，但任选地不包括胞嘧啶。在一些实施例中，经修饰的核苷包括2,6-二氨基嘌呤核碱基，但任选地不包括腺嘌呤。在一些实施例中，经修饰的核苷包括5-甲基尿嘧啶核碱基，但任选地不包括尿嘧啶。在一些实施例中，经修饰的核苷包括2,6-二氨基嘌呤核碱基，但不包括腺嘌呤和5-甲基尿嘧啶核碱基，但任选地不包括尿嘧啶。在一些实施例中，Y结构域包含6-8个2’-脱氧核苷。在一些实施例中，X和Z结构域的每一个中的经修饰的核苷包含任选地通过硫代磷酸酯亚基间键联连接的2’-OMe修饰的核苷和构象受限的核苷，并且其中2’-OMe修饰的核苷包括5-甲基胞嘧啶核碱基，但任选地不包括胞嘧啶。在一些实施例中，X和Z结构域的每一个中的经修饰核苷包含2’-OMe和构象受限的核苷。在一些实施例中，X和Z结构域的每一个中的经修饰的核苷包含构象受限的核苷，并且其中至少一个经修饰的核苷包括N3’→P5’氨基磷酸酯或N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚基间键联。在一些实施例中，Y结构域包含7-8个2’-脱氧核苷。在一些实施例中，2’-OMe修饰的核苷包括5-甲基尿嘧啶核碱基，但任选地不包括尿嘧啶。在一些实施例中，Y结构域包含9-10个2’-脱氧核苷。

在一些实施例中，X和Z结构域包含由式(A1)表示的核苷酸：

其中A在每种情况下独立地是NH或O；B在每种情况下独立地是未修饰的或经修饰的核碱基；W在每种情况下独立地是OR或SR，其中R是H或带正电荷的抗衡离子；R’和R”在每种情况下各自独立地选自由以下组成的组：H、F、Cl、OH、OMe、Me和O-甲氧基乙氧基；R”’是H，或R’和R”’一起形成-O-CH₂-或-O-(CH₂)₂-，并且a是3至9的整数，其中当R’、R”和R”’各自是H时，则A是NH，并且任选地，当A是O时，则W是SR。

在一些实施例中，配体靶向基团选自由以下组成的组：生育酚、棕榈酸和硫辛酸及其组合。

在一些实施例中，X和/或Z结构域包含一个或多个寡核苷酸，其中修饰是2’-O-甲氧基乙氧基-N3’→P5’。在一些实施例中，X结构域包含一个或多个寡核苷酸，其中修饰是2’-O-甲氧基乙氧基-N3’→P5’。在一些实施例中，Z结构域包含一个或多个寡核苷酸，其中修饰是2’-O-甲氧基乙氧基-N3’→P5’。在一些实施例中，所述寡核苷酸的构建体对应于表B的构建体。

其他实施例包括嵌合寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是式(VII)的核苷酸：

5'-X’—Y’—Z’-3' (VII)，

其中X’—Y’—Z’是包含具有16至22个核苷的序列的嵌合寡核苷酸，并且任选地在5'和/或3'末端缀合；X’是包含经修饰的核苷的序列的结构域，所述经修饰的核苷的序列的长度是3-10个核苷；Z’是包含经修饰的核苷的序列的结构域，所述经修饰的核苷的序列的长度是3-10个核苷；并且Y’是包含通过亚基间键联连接的2至4个2’-脱氧核苷的序列的结构域，其中所述X’和/或Z’结构域包含通过N3′→P5′氨基磷酸酯或N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚基间键联连接的经修饰的核苷的序列。在一些实施例中，Y’结构域由通过硫代磷酸酯亚基间键和任选地一个磷酸二酯亚基间键联连接的2’-脱氧核苷组成。在一些实施例中，X’结构域的长度是9或10个核苷。在一些实施例中，X’结构域包含经修饰的核苷，其中所述修饰选自由以下组成的组：2’-F、2’-F-N3’→P5’、2’-OMe、2’-OMe-N3’→P5’、2’-O-甲氧基乙氧基、2’-O-甲氧基乙氧基-N3’→P5’和构象受限的核苷。在一些实施例中，Z’结构域包含经修饰的核苷，其中所述修饰选自由以下组成的组：2’-F、2’-F-N3’→P5’、2’-OH、2’-OMe、2’-OMe-N3’→P5’、2’-O-甲氧基乙氧基、2’-O-甲氧基乙氧基-N3’→P5’和构象受限的核苷。在一些实施例中，X’和/或Z’结构域包含一个或多个2’-***糖基-F和/或2’-核糖基-F修饰的核苷。在一些实施例中，X’和/或Z’结构域中的经修饰的核苷包含2’-OMe和构象受限的核苷。在一些实施例中，X’和/或Z’结构域中的经修饰的核苷包含构象受限的核苷和N3’→P5’修饰。在一些实施例中，所述序列选自表B中具有2-4个核苷酸Y结构域的那些序列。

其他实施例包括嵌合寡核苷酸，所述嵌合寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的核碱基序列对应于表D中列出的序列。

其他实施例包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是下式(VIII)的核苷酸：

其中X_A是NH或O，Y是OR或SR，其中R是H或带正电荷的抗衡离子，B_A在每种情况下独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基，R_A’和R_A”在每种情况下独立地选自H、F、OH、OMe、Me、O-甲氧基乙氧基，并且R_A”’是H或R_A’和R_A”’一起形成-O-CH₂-或-O-(CH₂)₂-。在一些实施例中，R_A’和R_A”’是H；并且R_A”是F。在一些实施例中，R_A’和R_A”是H；并且R_A”’是F、OH、H或OMe。在一些实施例中，X_A是NH；B_A是未修饰或经修饰的核碱基；R_A’和R_A”’一起形成构象受限的核苷(例如，-O-CH₂-或-O-(CH₂)₂-)；并且R_A”是H。在一些实施例中，R_A’和R_A”中的至少一个是H。在一些实施例中，当B_A是嘌呤核碱基时，R_A’和R_A”中的至少一个是OH或F，和/或当B_A是嘧啶核碱基时，R_A’和R_A”中的至少一个是OMe、OH或F。在一些实施例中，经修饰的核碱基选自5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、5-甲基尿嘧啶和g-夹钳。

其他实施例包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的十个或更多个核苷酸是下式(IX)的核苷酸：

其中R是H或带正电荷的抗衡离子，B_B在每种情况下独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基，R_B’和R_B”在每种情况下各自独立地选自H、F、OMe、Me、O-甲氧基乙氧基，并且R_B”’是H或R_B’和R_B”’一起形成-O-CH₂-或-O-(CH₂)₂-。在一些实施例中，R_B’和R_B”’是H；并且R_B”是F。在一些实施例中，R_B’和R_B”是H；并且R_B”’是F、OH、H或OMe。在一些实施例中，B_B是未修饰或经修饰的核碱基；R_B’和R_B”’一起形成构象受限的核苷(例如-O-CH₂-或-O-(CH₂)₂-)；并且R_B”是H。在一些实施例中，R_B’和R_B”中的至少一个是H。在一些实施例中，当B_B是嘌呤核碱基时，R_B’和R_B”中的至少一个是OH或F，和/或当B_B是嘧啶核碱基时，R_B’和R_B”中的至少一个是OMe、OH或F。在一些实施例中，经修饰的核碱基选自5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、5-甲基尿嘧啶和g-夹钳。

在一些实施例中，式(B)的核苷酸包括表A中的那些，其中X_A是NH。在一些实施例中，式(B)的核苷酸根据表B中列出的构建体进行布置和修饰。在一些实施例中，式(B)的构建体包括与选自表D中的序列有1、2、3、4或5个核碱基不同的序列。在一些实施例中，每个寡核苷酸是式(B)的核苷酸。

在实施例中，寡核苷酸的核碱基序列对应于SEQ ID NO:1。在实施例中，根据所公开的修饰中的至少一个来修饰SEQ ID NO:1的序列。在实施例中，将具有对应于SEQ ID NO:1的核碱基序列的寡核苷酸的5’和3’末端的至少前两个核苷酸修饰为包括氨基磷酸酯键联，并进一步修饰为包括2’-甲氧基乙氧基(2’MOE)修饰。在实施例中，来自具有对应于SEQID NO:1的核碱基序列的寡核苷酸的5’和3’末端的至少前三个核苷酸被进一步修饰以包括2’MOE修饰。在实施例中，来自具有对应于SEQ ID NO:1的核碱基序列的寡核苷酸的5’和3’末端的至少前四个核苷酸被进一步修饰以包括2’MOE修饰。在实施例中，来自具有对应于SEQ ID NO:1的核碱基序列的寡核苷酸的5’和3’末端的至少前五个核苷酸被进一步修饰以包括2’MOE修饰。在实施例中，来自具有对应于SEQ ID NO:1的核碱基序列的寡核苷酸的5’和3’末端的至少前六个核苷酸被进一步修饰以包括2’MOE修饰。

其他实施例包括药物组合物，所述药物组合物包含前述实施例中任一项的寡核苷酸和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，所述组合物适合于鞘内或脑室内递送。其他实施例包括抑制中枢神经系统(CNS)细胞(例如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞)中MAPT基因表达的方法，所述方法包括使细胞与前述实施例中任一项的寡核苷酸或组合物接触。其他实施例包括抑制CNS细胞中MAPT的转录或翻译的方法，所述方法包括使所述细胞与前述实施例中任一项的寡核苷酸或组合物接触。其他实施例包括治疗患有tau蛋白病变(诸如阿尔茨海默病(AD))和/或任何tau蛋白病变相关障碍的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的前述实施例中任一项的寡核苷酸或组合物。其他实施例包括前述实施例中任一项的寡核苷酸，其中与MAPT基因序列的至少一部分复合的所述寡核苷酸具有>37℃的解链温度(Tm)。其他实施例包括治疗患有tau蛋白病变(诸如阿尔茨海默病(AD))和/或任何tau蛋白病变相关障碍的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的前述实施例中任一项的寡核苷酸或组合物。其他实施例包括抑制CNS细胞中靶RNA表达的方法，所述方法包括使细胞与前述实施例中任一项的寡核苷酸或包含所述寡核苷酸的组合物接触，其中所述嵌合寡核苷酸包含与靶RNA的一部分互补或杂交的核碱基序列。其他实施例包括抑制CNS细胞中MAPT基因转录或翻译的方法，所述方法包括使细胞与前述实施例中任一项的寡核苷酸或包含所述寡核苷酸的组合物接触，所述寡核苷酸包含与MAPT基因的至少一部分互补或杂交的核碱基序列。其他实施例包括治疗患有tau蛋白病变(诸如阿尔茨海默病(AD))和/或任何tau蛋白病变相关障碍的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的前述实施例中任一项的寡核苷酸或包含所述寡核苷酸的组合物，其中所述寡核苷酸包含与MAPT基因的至少一部分互补或杂交的核碱基序列。其他实施例包括通过使靶核酸与反义化合物接触来调节靶表达的方法，所述反义化合物包含前述实施例中任一项的寡核苷酸或包含所述寡核苷酸的组合物，其中所述寡核苷酸包含与靶核酸的一部分互补或杂交的核碱基序列。

具体实施方式

本公开涉及包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是经修饰的核苷酸，并且两个或多个核苷酸在核苷酸之间包含经修饰的键联。本公开还针对寡核苷酸的构建体，其包括在寡核苷酸内的具有共同特征的结构域、区域或部分以及与寡核苷酸缀合的其他组分，例如靶向部分。本公开进一步针对使用和制备寡核苷酸及其构建体的方法。

如本领域中已知的并且如本公开中所述，经修饰的核苷酸是不是脱氧核糖核苷酸的任何核苷酸。例如，脱氧核糖的2’碳可以被羟基(OH)以外的取代基取代；脱氧核糖的3’碳可以被氧原子(O)以外的取代基取代。如本领域中已知的并且如本公开中所述，两个核苷酸之间的经修饰的键联是在第一核苷酸的脱氧核糖的3’碳与第二核苷酸的脱氧核糖的5’碳之间的不是磷酸二酯键联的任何键联。

1. 2’,3’-修饰的核苷酸和相关寡核苷酸

本公开的化合物包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是具有特定的2’和3’修饰的经修饰的核苷酸。在实施例中，本公开的化合物包括在脱氧核糖的2’碳上羟基的替代或取代。另外，本公开的这些化合物包括两个核苷之间的键联的修饰，其包括在脱氧核糖的3’碳上的氧原子被氮原子(N)替代或取代。所述键联的修饰还包括在磷酸二酯键中替代或取代另一个氧原子。

这些经修饰的核苷酸可用于例如寡核苷酸，例如嵌合寡核苷酸中，比如允许通过RNA酶H或经修饰的反义寡核苷酸来酶促切割基因靶的嵌合寡核苷酸。

2’,3’-修饰的核苷酸

相应地，本公开的化合物包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是式(I)的核苷酸：

其中R是H或带正电荷的抗衡离子，B在每种情况下独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基，R₁是-(CR’₂)₂OCR’₃，并且R’在每种情况下独立地是H或F。

在式(I)的核苷酸中，R₁是-(CR’₂)₂OCR’₃。在一些实施例中，R’在每种情况下均是H。在其他实施例中，至少一个R’是F、例如1、2、3、4、5、6或7个R’是F。在一些实施例中，CR’₃包含1、2或3个F部分。例如，在实施例中，R₁选自由以下组成的组：-CH₂CH₂OCH₃(或MOE)、-CF₂CH₂OCH₃、-CH₂CF₂OCH₃、-CH₂CH₂OCF₃、-CF₂CF₂OCH₃、-CH₂CF₂OCF₃、-CF₂CH₂OCF₃、-CF₂CF₂OCF₃、-CHFCH₂OCH₃、-CHFCHFOCH₃、-CHFCH₂OCFH₂、-CHFCH₂OCHF₂和-CH₂CHFOCH₃。在实施例中，式I的核苷酸是：

在实施例中，本公开的化合物包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是式(II)的核苷酸：

其中Y是S或O，R是H或带正电荷的抗衡离子，B是核碱基，R₂是-CR’₃、-CR’₂OCR’₃、-(CR’₂)₃OCR’₃或-(CR’₂)_1-2CR’₃或R₂是-(CR’₂)₂OCR’₃且Y是O且R’在每种情况下独立地是H或F。

在式(II)的核苷酸中，R₂是-CR’₃、-(CR’₂)_1-3OCR’₃或-(CR’₂)_1-2CR’₃。在一些实施例中，R₂是-CR’₃或-CR’₂CR’₃。在一些实施例中，R’在每种情况下均是H。在其他实施例中，至少一个R’是F、例如1、2、3、4或5个R’是F。在一些实施例中，CR’₃包含1、2或3个F部分。例如，在实施例中，R₂选自由以下组成的组：-CH₃(或Me)、-CFH₂、-CHF₂、CF₃、-CH₂OCH₃、-CFH₂OCH₃、-CHF₂OCH₃、-CF₃OCH₃、-CH₂OCFH₂、-CH₂OCHF₂、-CH₂OCF₃、-CFH₂OCH₃、-CFH₂OCFH₂、-CFH₂OCHF₂、-CFH₂OCF₃、-CHF₂OCH₃、-CHF₂OCFH₂、-CHF₂OCHF₂、-CHF₂OCF₃、-(CR’₂)₃OCR’₃、-CH₂CH₃(或Et)、-CFH₂CH₃、-CHF₂CH₃、-CF₃CH₃、-CH₂CFH₂、-CH₂CHF₂、-CH₂CF₃、-CFH₂CH₃、-CFH₂CFH₂、-CFH₂CHF₂、-CFH₂CF₃、-CHF₂CH₃、-CHF₂CFH₂、-CHF₂CHF₂、-CHF₂CF₃、-CH₂CH₂CH₃、CF₂CH₂CH₃、CH₂CF₂CH₃、CH₂CH₂CF₃、CF₂CF₂CH₃、CH₂CF₂CF₃、CF₂CH₂CF₃、CF₂CF₂CF₃、CHFCH₂CH₃、CHFCHFOCH₃、CHFCH₂CFH₂、CHFCH₂CHF₂和CH₂CHFCH₃。在实施例中，R₂是-CH₃(或Me)或-CH₂CH₃(或Et)。

在实施例中，式II的核苷酸选自由以下组成的组：

在式(I)或(II)的化合物中，Y可以是O或S。在一些实施例中，在至少一种情况中(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)Y是S。在其他实施例中，Y在至少一个实例中Y是S，并且在至少另一实例中是O。在其他实施例中，Y在每种情况下均是S。在一些实施例中，在至少一种情况中(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)Y是O。

公开的寡核苷酸包含至少一个式(I)的核苷酸。在实施例中，公开的寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个式(I)的核苷酸。在实施例中，公开的寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个式(II)的核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包含2至40个核苷酸，例如8至26个核苷酸或在其之间的整数。

在寡核苷酸中包含一个以上式(I)的核苷酸的实施例中，所述核苷酸可以相同或不同。在一些实施例中，一个或多个式(II)的核苷酸被包括并且可以相同或不同。例如，在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式(I)的核苷酸和至少一个式(II)的核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个式(I)的核苷酸(其中至少一个R₁是MOE)和至少一个式(II)的核苷酸，其中R₂是Me或Et。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少2个交替的式(I)和式(II)的核苷酸。例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个具有交替的2’修饰(例如Me-MOE-Me-MOE…或Et-MOE-Et-MOE-Et-MOE…)的核苷酸。

在一些实施例中，式(I)和/或式(II)的核苷酸由以下表示：

在一些实施例中，包含式(I)的核苷酸的寡核苷酸还包含式(IIIa)和/或(IIIb)的2’-氟核苷酸：

其中Y是S或O，R是H或带正电荷的抗衡离子，并且B是核碱基。

在一些实施例中，寡核苷酸包含至少4个交替的式(I)和(IIIa)的核苷酸。例如，寡核苷酸包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个交替核苷酸。

某些实施例包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含4-40个核苷酸并包含式(IV)：

其中Y是S或O，R是H或带正电荷的抗衡离子，B是核碱基，R₁是-(CR’₂)₂OCR’₃，R₂选自-OCR’₃、-OCR’₂OCR’₃、-O(CR’₂)₃OCR’₃或-O(CR’₂)_1-2CR’₃和F，R’在每种情况下独立地是H或F，a是1-10的整数并且b是1-10的整数，其中到20，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。

本公开的化合物包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是式(III’)的核苷酸：

其中Y是S或O，R是H或带正电荷的抗衡离子，并且B在每种情况下独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基；且任选地包含式(I)、(II)和/或(IV)中的一个或多个。

式(I)、(II)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)和(V)的核苷酸的核碱基B可以各自独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包括2,6-二氨基嘌呤核碱基，但任选地不包括腺嘌呤。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包括5-甲基尿嘧啶核碱基，但任选地不包括尿嘧啶。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包括2,6-二氨基嘌呤核碱基，但不包括腺嘌呤和5-甲基尿嘧啶核碱基，但任选地不包括尿嘧啶。

式(II)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)和(V)的每个核苷酸中的Y可以独立地是O或S。在一些实施例中，在至少一种情况中(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)Y是S。在其他实施例中，Y在至少一个实例中Y是S，并且在至少另一实例中是O。在其他实施例中，Y在每种情况下均是S。在一些实施例中，在至少一种情况中(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)Y是O。

在包括一个以上的式(I)、(II)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)和(V)中每个的核苷酸的实施例中，一个以上的这些式的核苷酸可以相同或相同。例如，在一些实施例中，除了至少一个式(I)的核苷酸外，核苷酸还包含至少一个式(II)、(III)、(IV)、(V)和/或(V’)的核苷酸。在一些实施例中，核苷酸包含至少2个交替的式(I)和/或式(II)和/或(III)和/或(IV)、(V)和/或(V’)的核苷酸。例如，公开的寡核苷酸可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个具有交替的2’修饰的核苷酸。

在实施例中，寡核苷酸的核苷酸选自由以下组成的组：

其中B可以是任何天然或经修饰的碱基。

本公开的化合物包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是式(V’)的核苷酸：

其中Y是S或O，R是H或带正电荷的抗衡离子，B在每种情况下独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基，A是-(CR”R”)_1-2-并且R”在每种情况下独立地是H、F或Me，并且任选地包含式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)中的一个或多个。

在包含式(V’)的化合物中，A是-(CR”R”)_1-2-。在一些实施例中，A是-(CR”R”)-。在其他实施例中，A是-(CR”R”)₂-。R’在每种情况下独立地是H或Me。在一些实施例中，一个R”是Me，并且其余是H。在其他实施例中，所有R”均为H。

在一些实施例中，当A是CH₂时，则Y是S。在其他实施例中，当A是CH₂CH₂时，则Y是O或S。在一些实施例中，A是CH₂CH(Me)或CH(Me)且Y是O或S。

在包含式(V’)的化合物中，Y是O或S。在一些实施例中，在至少一种情况中(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)Y是S。在其他实施例中，Y在至少一个实例中Y是S，并且在至少另一实例中是O。在其他实施例中，Y在每种情况下均是S。在一些实施例中，在至少一种情况中(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)Y是O。

式(V’)(和任选地式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和/或(V’)的化合物可以是寡核苷酸的一部分。在一些实施例中，包含式(IV)(和任选地式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和/或(V’))的化合物是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个式(V’)(以及式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和/或(V’))的核苷酸的寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包含2至40个核苷酸，例如8至26个核苷酸或在其之间的整数。

在包括一个以上式(V’)的核苷酸的实施例中，一个以上式(V’)的核苷酸可以相同或不同。在一些实施例中，一个或多个式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和/或(V’)的核苷酸被包括并且可以相同或不同。例如，在一些实施例中，核苷酸包含至少一个式(V’)的核苷酸和至少一个式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和/或(V’)的核苷酸。在一些实施例中，核苷酸包含至少2个交替的式(V’)和式(I)和/或(II)的核苷酸。例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个具有交替的2’修饰的核苷酸。

在一些实施例中，包含式(V’)(和任选地式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和/或(V’))的核苷酸的核苷酸还包含以下结构的2-氟核苷酸：

其中Y、R和B与式(I)相同。在一些实施例中，核苷酸包含至少4个交替的式(V’)的核苷酸和2-氟核苷酸。

本公开的化合物包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列，其中所述寡核苷酸的一个或多个核苷酸是式(V)的核苷酸：

其中Y是S或O，R是H或带正电荷的抗衡离子，并且B在每种情况下独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基；并任选地包含式(I)、(II)、(III)、(IV)和/或(V’)中的一个或多个。

嵌合寡核苷酸

本公开涉及包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列的寡核苷酸的构建体，所述构建体包括在寡核苷酸内的具有共同特征的结构域、区域或部分。具有这些结构域的寡核苷酸在本文中称为嵌合寡核苷酸。在一些实施例中，嵌合寡核苷酸由式(VI)表示：

5'-X—Y—Z-3' (VI)，

其中嵌合寡核苷酸包含具有14至22个核苷的序列，其中X是包含经修饰的核苷酸的序列的结构域，所述经修饰的核苷酸的序列的长度是3-10个核苷酸；Z是包含经修饰的核苷酸的序列的结构域，所述经修饰的核苷酸的序列的长度是3-10个核苷；并且Y是包含2-10个2’-脱氧核苷酸或未修饰的核苷酸的序列的结构域。每个结构域中的每个核苷通过亚基间键联连接。

在一些实施例中，包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列的嵌合寡核苷酸包括一个或多个式(VI’)的核苷酸：

5'-X—Y—Z-3' (VI’)，

其中嵌合寡核苷酸包含具有14至22个核苷的序列，其中X是包含经修饰的核苷酸的序列的结构域，所述经修饰的核苷酸的序列的长度是2-10个核苷酸；Z是包含经修饰的核苷酸的序列的结构域，所述经修饰的核苷酸的序列的长度是2-10个核苷；并且Y是包含6-14个2’-脱氧核苷酸或未修饰的核苷酸的序列的结构域。每个结构域中的每个核苷通过亚基间键联连接。

式(I)、(II)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)、(V)和/或(V’)的核苷酸可以存在于X和/或Z结构域中。嵌合寡核苷酸可在5'和/或3'末端缀合至配体靶向基团。

在一些实施例中，Y结构域包含通过硫代磷酸酯亚基间键联连接的2’脱氧核苷。在实施例中，Y结构域包含通过至少一个磷酸二酯亚基间键联连接的2’脱氧核苷。在实施例中，Y结构域包含通过两个磷酸二酯亚基间键联连接的2’脱氧核苷。在实施例中，Y结构域包含通过硫代磷酸酯亚基间键联和一个或两个磷酸二酯亚基间键联连接的2’脱氧核苷。在一些实施例中，Y结构域的长度是6至10个核苷酸。

在一些实施例中，X结构域包含式(I)、(II)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)、(V)和/或(V’)的核苷酸。在一些实施例中，X结构域包含经修饰的核苷酸，其中所述修饰独立地选自2’-OMe、2’-OEt、2’-O-甲氧基乙氧基和构象受限的核苷酸。在一些实施例中，X结构域的长度是9或10个核苷酸。

在一些实施例中，Z结构域包含式(I)、(II)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)、(V)和/或(V’)的核苷酸。在一些实施例中，Z结构域包含2’修饰的核苷酸，其中修饰是2’-OMe、2’-OEt或2’-MOE。在一些实施例中，Z结构域的长度是9或10个核苷酸。

在实施例中，嵌合寡核苷酸包含具有14至22个核苷酸的序列。例如，寡核苷酸可包含14、15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸。

在实施例中，X是由以下序列组成的结构域：所述序列包含一个或多个经修饰核苷酸，长度是3-10个核苷酸；Z是由以下序列组成的结构域：所述序列包含一个或多个经修饰核苷酸，长度是3-10个核苷酸；并且Y是由以下序列组成的结构域：具有2至10个通过硫代磷酸酯亚基间键联和任选地一个或两个磷酸二酯亚基间键联连接的2’-脱氧核苷的序列。在一些实施例中，X是5-9，Y是6-10且Z是5-9。在一些实施例中，X、Y和Z各自的核苷酸数目分别是：6/6/6、6/6/7、6/6/8、6/7/6、6/7/7、6/7/8、6/8/6、6/8/7、6/8/8、3/10/3、4/10/4、5/10/5、5/10/6、2/12/2、3/12/3、2/14/2、5/9/5、5/9/6、5/8/5、5/8/6、5/8/7、7/5/7、7/5/8、7/5/9、7/6/6、7/6/7、7/6/8、7/6/9、7/7/6、7/7/7、7/7/8、7/7/9、7/5/7、7/5/8、7/5/9、7/4/7、7/4/8、7/4/9、8/4/7、8/4/8、8/4/9、7/3/7、7/3/8、7/3/9、8/3/7、8/3/8、8/3/9、8/3/10、9/3/7、9/3/8、9/3/9、9/3/10、8/2/7、8/2/8、8/2/9、8/2/10、9/2/7、9/2/8、9/2/9、9/2/10、10/2/8、10/2/9、10/2/10。X结构域和Z结构域各自分别包含经修饰的核苷酸的序列，其中所述结构域的长度是4-10个核苷酸。例如，X结构域和/或Z结构域可包含具有4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的序列。这些核苷酸中的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)被修饰。例如，在一些实施例中，X结构域和/或Z结构域各自中的所有核苷酸均被修饰。

关于一个或多个，X和Z结构域的核苷酸可以根据式(I)、(II)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)、(V)和/或(V’)关于其核碱基中的一个或多个、核糖上的2’和/或3’位置以及它们的亚基间键联进行修饰。实施例包括其中2’位置用F(核糖或***糖)修饰并且3’位置是O或NH。实施例还包括其中2’位置用OMe修饰并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’位置用F(核糖或***糖)以及Me或OMe修饰，并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’位置用F(核糖或***糖)修饰并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’位置被O-甲氧基乙氧基修饰并且3’位置是O或NH。实施例还包括其中2’位置用F(核糖或***糖)修饰并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’和4’位置是经修饰的桥接基团(如本文中其他地方所述)以形成构象受限的核苷酸，并且3’位置是O或NH。这些实施例中的每一个可以包括硫代磷酸酯(或硫代氨基磷酸酯，取决于3’取代)和氨基磷酸酯亚基间键联。

实施例还包括其中至少一个核苷酸的2’位置是H且3’位置是NH的寡核苷酸。这些实施例的每一个可包括硫代氨基磷酸酯和/或氨基磷酸酯亚基间键联。

在一些实施例中，X结构域和Z结构域的经修饰的核苷酸各自分别包括独立地选自由以下组成的组的修饰：2’-F、2’-F-N3’→P5’、2’-OMe、2’-OMe-N3’→P5’、2’-O-甲氧基乙氧基、2’-O-甲氧基乙氧基-N3’→P5’、构象受限的核苷酸。

在一些实施例中，经修饰的核苷酸包含由下式(A)表示的核苷：

其中A在每种情况下独立地是NH或O，B在每种情况下独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基，并且R’和R”在每种情况下各自独立地选自H、F、OH、OMe、OEt、O-甲氧基乙氧基，并且R”’是H，或R’和R”’一起形成2-4个原子的桥以形成构象受限的核苷(例如-O-CH₂-、-O-CH(Me)-或-O-(CH₂)₂-)。

在一些实施例中，R’选自F、OH、-OMe、-OEt、O-甲氧基乙氧基；R”是H和F；而R”’是H、Me或-OMe。在其他实施例中，R”和R”’是H；并且R’选自F、OMe，OEt和O-甲氧基乙氧基。在一些实施例中，A在每种情况下均是NH。

一些实施例包括一个或多个由式(A)表示的经修饰的核苷，其中A是NH；B是G-夹钳；R’是F或OMe，并且R”是H；或R’是H并且R”是H或F；并且R”’是H。

一些实施例包括一个或多个由式(A)表示的经修饰的核苷，其中A是NH；B是未修饰的或经修饰的核碱基；R’和R”’一起形成构象受限的核苷(例如-O-CH₂-、-O-CH(Me)-或-O-(CH₂)₂-)；并且R”是H。在一些实施例中，B是选自由以下组成的组的未修饰或经修饰的核碱基：5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤和5-甲基尿嘧啶。

一些实施例包括一个或多个由式(A)表示的经修饰的核苷，其中A是NH；B是未修饰的或经修饰的核碱基；R’是F或OMe，R”是H，并且R”’是H。

一些实施例包括一个或多个由式(A)表示的经修饰的核苷，其中A是NH；B是未修饰的或经修饰的核碱基；R’是H，R”是F，并且R”’是H。

在一些实施例中，X和Z结构域由式(A1)表示：

其中W在每种情况下独立地是OR或SR，其中R是H或带正电荷的抗衡离子；R’、R”、R”’、A和B如对于式(A)所述。在其他实施例中，A是O且R’、R”独立地是H或OEt，其中R’、R”中的至少一个是OEt。

例如，除了在X和Z结构域的每一个中的至少一个核苷酸(其中A是NH，W是S且R’是MOE)之外，X和/或Z的核苷酸还可以包括如表A2中所述的一个或多个式A2的核苷酸或如表A3中所述的一个或多个式A3的核苷酸。

表A2

表A3：

核苷酸编号	C	A	W
				36	-O-CH<sub>2</sub>-	NH	S
37	-O-CH<sub>2</sub>-	NH	O
				38	-O-CH<sub>2</sub>-	O	S
39	-O-CH<sub>2</sub>-	O	O
				40	-O-(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>-	NH	S
41	-O-(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>-	NH	O
				42	-O-(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>-	O	S
43	-O-(CH<sub>2</sub>)<sub>2</sub>-	O	O
				44	-O-CH(Me)-	NH	S
45	-O-CH(Me)-	NH	O
				46	-O-CH(Me)-	O	S
47	-O-CH(Me)-	O	O

在一些实施例中，X结构域和Z结构域各自独立地包含两个、三个或更多个不同的核苷酸1-47。

X结构域的核苷通过亚基间键联连接，例如，N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸二酯亚基间键和或其组合。在一些实施例中，X结构域通过选自N3′→P5′氨基磷酸酯，N3′→P5′硫代氨基磷酸酯及其组合的亚基间键联连接。

嵌合寡核苷酸的X结构域可以包括经修饰的核苷酸的一定排列。例如，在一些实施例中，X结构域包含一个或多个构象受限的核苷酸。构象受限的核苷酸可包括BNA，例如LNA和ENA。(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个构象受限的核苷酸)。在一些实施例中，X结构域包含一个或多个2’-F和/或2’-OMe修饰的核苷酸。在一些实施例中，X结构域包含交替的构象受限的核苷酸，例如，每隔一个核苷酸是构象受限的核苷酸。在一些实施例中，X结构域包含一个或多个2’-F和/或2’-OMe修饰的核苷酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个2’-F和/或2’-OMe修饰的核苷酸)。在一些实施例中，X结构域包含交替的2’-F和2’-OMe修饰的核苷酸。在实施例中，X结构域例如在交替序列中包含2’-F或2’-OMe和构象受限的核苷酸。

Y结构域包含具有2至14个2’-脱氧核苷酸的序列。例如，Y结构域可以包含具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个2’-脱氧核苷酸的序列。2’-脱氧核苷中的一个或多个可以通过硫代磷酸酯亚基间键联(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个硫代磷酸酯亚基间键联)连接。在一些实施例中，每个2’-脱氧核苷通过硫代磷酸酯亚基间键联连接。在一些实施例中，Y结构域包含至少一个磷酸二酯亚基间键联(例如1、2或3个磷酸二酯亚基间键联)。在其他实施例中，Y结构域由通过硫代磷酸酯亚基间键联和任选地一个或两个磷酸二酯亚基间键联连接的2’-脱氧核苷组成。

在实施例中，Y结构域包含诱导RNA酶H切割的核苷酸。

在一些实施例中，式(A)的核苷酸包括表A中的那些，其中X_A是NH。在一些实施例中，式(A)的核苷酸根据表B中列出的构建体进行布置和修饰。在一些实施例中，式(A)的构建体包括与选自表D中的序列有1、2、3、4或5个核碱基不同的序列。在一些实施例中，寡核苷酸中的每个核苷酸是式(A)的核苷酸。

在一些实施例中，通过硫代磷酸酯亚基间键联连接的2’-脱氧核苷可以由下式(B)表示：

其中B在每种情况下独立地是未修饰的或经修饰的核碱基。在一些实施例中，B是选自由以下组成的组的未修饰或经修饰的核碱基：5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤和5-甲基尿嘧啶。

在其他实施例中，通过硫代磷酸酯亚基间键联连接的2’-脱氧核苷包含经修饰的2’-脱氧核苷，其可以以与X和Z结构域中相同的方式被修饰。例如，通过硫代磷酸酯亚基间键联连接的经修饰的2’-脱氧核苷可以由下式(C)表示：

其中B在每种情况下独立地是未修饰的或经修饰的核碱基，并且R”和R”’在每种情况下各自独立地选自H、F、Cl，OH、OMe、Me、O-甲氧基乙氧基或R’和R”’一起形成2-4个原子的桥以形成构象受限的核苷。在一些实施例中，B是选自由以下组成的组的未修饰或经修饰的核碱基：5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤和5-甲基尿嘧啶。Z结构域包含经修饰的核苷酸的序列，其中Z结构域的长度是4-10个核苷酸。例如，Z结构域可以包含具有4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的序列。这些核苷酸中的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个)被修饰。例如，在一些实施例中，Z结构域中的所有核苷酸被修饰。

Z结构域的经修饰的核苷酸包括例如独立地选自以下的修饰：2’-F、2’-F-N3’→P5’、2’-OMe、2’-OMe-N3’→P5’、2’-OEt-N3’→P5’、2’-O-甲氧基乙氧基、2’-O-甲氧基乙氧基-N3’→P5’、构象受限的核苷酸、2’-OH-N3′→P5′硫代氨基甲酸酯和2’-OH-N3′→P5′氨基磷酸酯中至少一个。

Z结构域的核苷酸可以通过亚基间键联连接，例如，N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或磷酸二酯亚基间键联。在一些实施例中，Z结构域通过N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯、亚基间键联及其组合连接。

嵌合寡核苷酸的Z结构域可以包括经修饰的核苷酸的一定排列。例如，在一些实施例中，Z结构域包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个)构象受限的核苷酸(例如BNA，例如，LNA、ENA，其每个都可以任选地被取代)。在一些实施例中，Z结构域包含交替的构象受限的核苷酸，例如，每隔一个核苷酸是构象受限的核苷酸(例如，BNA，例如LNA、ENA，其每个都可以任选地被取代)。在一些实施例中，Z结构域包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个)2’-F和/或2’-OMe修饰的核苷酸。例如，一些实施例包括其中Z结构域包含交替的2’-F和2’-OMe修饰的核苷酸，或Z结构域包含交替的2’-F或2’-OMe和构象受限的核苷酸。

在一些实施例中，经修饰的式(VI)或(VI’)的核苷酸包括5-甲基胞嘧啶核苷碱基，但不包括胞嘧啶核苷。在一些实施例中，经修饰的式(VI)或(VI’)的核苷酸包括2,6-二氨基嘌呤核碱基，但不包括腺嘌呤。在一些实施例中，经修饰的式(VI)或(VI’)的核苷酸包括5-甲基尿嘧啶核碱基，但不包括尿嘧啶。在一些实施例中，经修饰的式(VI)或(VI’)的核苷酸包括2’-OMe和构象受限的核苷酸，并通过硫代磷酸酯亚基间键联连接，并且经修饰的核苷酸包括5-甲基胞嘧啶核苷碱基，但不包括胞嘧啶。在一些实施例中，经修饰的式(VI)或(VI’)的核苷酸包括具有5-甲基尿嘧啶核碱基但不具有尿嘧啶的2’-OMe修饰的核苷酸。

在某些实施例中，根据表B的构建体中的至少一种来布置包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列的嵌合寡核苷酸中的式(VI)或(VI’)的核苷酸，其中X和Z结构域中的至少一个亚基间键联是NPS键联。

表B

在表B中，X和Z结构域的每个/5中的核苷酸可以是表A2和A3中编号的核苷酸中的一个或多个。在一些实施例中，表B的嵌合寡核苷酸包括表A中至少1、2、3、4、5、6、7、8或更多个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，X和/或Z的所有核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些实施例中，表B中的核苷酸选自表A中列出的某些经修饰的核苷酸，例如核苷酸编号1-4或5-8或9-12或13-16或17-20或21-24或25-28或29-30或31-32或33。在一些实施例中，表B中的核苷酸选自表A中列出的某些经修饰的核苷酸，例如核苷酸编号9-12和21-28，或9-12和21-24，或1-4和21-28，或1-4和21-24，或5-8和21-28，或5-8和21-24。在一些实施例中，表B中的核苷酸选自表A中列出的一个或两个或三个经修饰的核苷酸，例如核苷酸编号29-31或31-32或33。在一些实施例中，表B中的核苷酸选自表A中列出的某些经修饰的核苷酸，例如核苷酸编号29或31或33。表B的Y结构域中的核苷酸可以包括式B的核苷酸。

在一些实施例中，表B的寡核苷酸在5'和/或3'末端缀合至配体靶向基团和/或脂质部分。

在一些实施例中，本公开的寡核苷酸化合物包括表C中列出的以下核碱基序列。

表C

核碱基序列(5’-3’)
	5’-GCTTTTACTGACCATGCGAG-3’(SEQ ID NO:1)

在实施例中，寡核苷酸包括SEQ ID NO:1的序列。在实施例中，根据所公开的修饰中的至少一个来修饰SEQ ID NO:1的序列。在实施例中，对SEQ ID NO:1进行修饰，以在从寡核苷酸的5’和3’末端的至少前两个核苷酸中具有硫代氨基磷酸酯键联和2’-甲氧基乙氧基(2’MOE)修饰。在实施例中，对SEQ ID NO:1进行修饰，以在从寡核苷酸的5’和3’末端的至少前三个核苷酸中具有2’MOE修饰。在实施例中，对SEQ ID NO:1进行修饰，以在从寡核苷酸的5’和3’末端的至少前四个核苷酸中具有2’MOE修饰。在实施例中，对SEQ ID NO:1进行修饰，以在从寡核苷酸的5’和3’末端的至少前五个核苷酸中具有2’MOE修饰。在实施例中，对SEQID NO:1进行修饰，以在从寡核苷酸的5’和3’末端的至少前六个核苷酸中具有2’MOE修饰。

在一些实施例中，包含与MAPT基因序列的至少一部分互补的序列的寡核苷酸包含根据表D的经修饰的序列的经修饰的序列，其中X在每种情况下独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基。在一些实施例中，每个X独立地选自A、C、G、U、T、2,6-二氨基嘌呤、5-Me嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶)和g–夹钳。在实施例中，根据表D的经修饰序列对SEQ ID NO:1进行修饰，以使表D中的每个X对应于SEQ ID NO:1的每个核碱基。

表D

在实施例中，结构域的每个核苷酸被修饰。在实施例中，结构域的每个核苷酸具有相同的修饰。在实施例中，X和Z结构域的每个核苷酸被修饰。在实施例中，X和Z结构域的每个核苷酸具有相同的修饰。在实施例中，结构域的每个核苷酸用2’MOE修饰。在实施例中，X和Z结构域的每个核苷酸用2’MOE修饰。在实施例中，结构域的每个核苷酸都用2’OMe修饰。在实施例中，X和Z结构域的每个核苷酸用2’OMe修饰。在实施例中，结构域的每个核苷酸用2’OEt修饰。在实施例中，X和Z结构域的每个核苷酸用2’OEt修饰。在实施例中，X和Z结构域的每个核苷酸通过NPS键联连接。在实施例中，X和Z结构域具有相同数目的核苷酸。在实施例中，X和Z结构域各自具有4-8个核苷酸。在实施例中，X和Z结构域各自具有5-6个核苷酸。在实施例中，X和Z结构域各自具有5个核苷酸。在实施例中，Y结构域具有的核苷酸数目是X和Z结构域中每一个的至少两倍。在实施例中，Y结构域具有8-12个核苷酸。在实施例中，Y结构域具有10个核苷酸。在实施例中，Y结构域的每个核苷酸通过PS键联连接。在实施例中，寡核苷酸的至少一个核碱基被修饰。在实施例中，与寡核苷酸的3’末端相邻的至少一个核碱基被修饰。在实施例中，寡核苷酸的Z结构域中的至少一个核碱基被修饰。在实施例中，寡核苷酸的Y结构域中的至少一个核碱基被修饰。

本公开的寡核苷酸还包括以下寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与选自表C中列出的序列的核碱基序列至少90％相同的序列，而与表B和D中列出的序列的修饰无关。在一些实施例中，独立于表B和D中列出的序列的修饰，1、2、3、4、5个核碱基不同于表C中列出的序列。

在实施例中，与具有相同序列的未修饰的寡核苷酸相比，公开的寡核苷酸显示出对靶核酸序列的增加的亲和力。例如，在一些序列中，公开的寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列以比具有相同序列的未修饰的寡核苷酸更高的亲和力与靶核酸序列互补或杂交。在实施例中，与互补靶核酸序列复合的公开的寡核苷酸具有>37℃的解链温度(Tm)。所述复合物可以在生理条件或接近生理条件的条件下(例如在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)形成。在实施例中，复合物的Tm是>50℃。在实施例中，复合物的Tm是50℃-100℃。在实施例中，在生理条件或接近生理条件下与靶核酸序列双链化的公开的寡核苷酸的Tm是>50℃。

在某些实施例中，靶核酸序列可以选自已知DNA或RNA序列(例如MAPT基因)的核酸序列。MAPT基因可以是DNA或RNA序列，例如外显子5、外显子10或外显子12。

在实施例中，所公开的寡核苷酸显示出对MAPT基因的至少一部分或其RNA等价物(例如MAPT mRNA)的亲和力，和/或显示出与MAPT基因的至少一部分或其RNA等效物复合的稳定性。在实施例中，与互补的MAPT基因序列复合的寡核苷酸具有>37℃的解链温度(Tm)。MAPT基因可以包括RNA序列，例如外显子5、外显子10或外显子12。所述复合物可以在生理条件或接近生理条件的条件下(例如在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)形成。在实施例中，复合物的Tm是>50℃。在实施例中，复合物的Tm是50℃-100℃。在实施例中，在生理条件或接近生理条件下与MAPT基因双链化的公开的寡核苷酸的Tm是>50℃。

本公开的化合物包括具有与MAPT基因的至少一部分互补的核碱基序列的寡核苷酸构建体，所述构建体具有下式(VII)：

5'-X’—Y’—Z’-3' (VII)

其中X’—Y’—Z’是包含具有14至22个核苷的序列的嵌合寡核苷酸，并且任选地在5’和/或3’末端缀合至配体靶向基团，X’是包含长度为3-14个核苷的经修饰的核苷序列的结构域；Y’是包含具有通过亚基间键联连接的2至4个2’-脱氧核苷的序列的结构域；并且Z’是包含长度为3-14个核苷的经修饰的核苷序列的结构域，其中X’和/或Y’结构域包含一个或多个通过N3’→P5’氨基磷酸酯或N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚基间键联连接的经修饰的核苷。

由式(VII)的X’—Y’—Z’表示的嵌合寡核苷酸包含具有14至22个核苷酸(例如14、15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸)的序列。在一些实施例中，X’、Y’和Z’各自的核苷酸数目分别是：8/2/10、9/2/10、10/2/10、7/3/10、8/3/10、9/3/10、8/4/8、9/4/9、6/4/8。在一些实施例中，X’是6-10，Y’是2-4，并且Z’是8-10。

在一些实施例中，式(VII)的化合物由X’-Y’-Z’嵌合寡核苷酸组成(所述嵌合寡核苷酸由具有14至22个核苷酸的序列组成)，并且任选地在5'和/或3'末端(例如，5'末端，3'末端或5'和3'末端)缀合至配体靶向基团，其中X’是由长度为3-10个核苷酸的包含一个或多个经修饰的核苷酸的序列组成的结构域；Z’是由以下序列组成的结构域：所述序列包含一个或多个经修饰核苷酸，长度是3-10个核苷酸；并且Y’是由通过硫代磷酸酯亚基间键联和任选的一个磷酸二酯亚基间键联连接的2至4个2’-脱氧核苷酸的序列组成的结构域，其中X’和/或Y’结构域包含一个或多个通过N3′→P5′氨基磷酸酯或N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚基间键联连接的经修饰的核苷酸。

X’结构域包含经修饰的核苷酸的序列，其中X’结构域的长度是4-10个核苷酸。例如，X’结构域可以包含具有4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的序列。这些核苷酸中的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22)被修饰。例如，在一些实施例中，X’结构域中的所有核苷酸被修饰。

X’结构域的经修饰核苷酸可以与对于式(VI)或(VI’)中的X所公开的相同。例如，X’结构域的核苷酸可以关于它们的核碱基中的一个或多个、核糖上的2’和/或3’位置以及它们的亚基键联而被修饰。实施例包括其中2’位置用F(核糖或***糖)修饰并且3’位置是O或NH。实施例还包括其中2’位置用OMe修饰并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’位置用F(核糖或***糖)以及Me或OMe修饰，并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’位置用F(核糖或***糖)修饰并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’位置被O-甲氧基乙氧基修饰并且3’位置是O或NH。实施例还包括其中2’位置用F(核糖或***糖)修饰并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’和4’位置是经修饰的桥接基团(如本文中其他地方所述)以形成构象受限的核苷酸，并且3’位置是O或NH。这些实施例中的每一个可以包括硫代磷酸酯(或硫代氨基磷酸酯，取决于3’取代)和氨基磷酸酯亚基间键联。

实施例还包括其中2’位置是OH并且3’位置是NH的情况，或其中2’位置是H并且3’位置是NH的情况。这些实施例的每一个可包括硫代氨基磷酸酯和/或氨基磷酸酯亚基间键联。

X’结构域的核苷酸通过亚基间键联连接，例如，N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或磷酸二酯亚基间键联。在一些实施例中，X’结构域通过选自N3′→P5′氨基磷酸酯，N3′→P5′硫代氨基磷酸酯及其组合的亚基间键联连接。在一些实施例中，X’结构域包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自N3′→P5′氨基磷酸酯和/或N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚基间键联。

Y’结构域包含具有2至4个2’-脱氧核苷酸的序列。例如，Y’结构域可以包含具有2、3或4个2’-脱氧核苷酸的序列。2’-脱氧核苷酸中的一个或多个可通过硫代磷酸酯或磷酸二酯亚基间键联连接(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22)。在一些实施例中，每个2’-脱氧核苷酸通过硫代磷酸酯亚基间键联连接。在其他实施例中，每个2’-脱氧核苷酸通过磷酸二酯亚基间键联连接。在其他实施例中，Y’结构域由通过硫代磷酸酯亚基间键联和任选地一个磷酸二酯亚基间键联连接的2’-脱氧核苷酸组成。

Z’结构域包含经修饰的核苷酸的序列，其中Z’结构域的长度是4-10个核苷酸。例如，Z’结构域可以包含具有4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的序列。这些核苷酸中的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个)被修饰。例如，在一些实施例中，Z’结构域中的所有核苷酸被修饰。

Z’结构域的经修饰核苷酸可以与对于式(VI)或(VI’)中的Z所公开的相同。例如，Z’结构域的核苷酸可以关于它们的核碱基中的一个或多个、核糖上的2’和/或3’位置以及它们的亚基键联而被修饰。实施例包括其中2’位置用F(核糖或***糖)修饰并且3’位置是O或NH。实施例还包括其中2’位置用OMe修饰并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’位置用F(核糖或***糖)以及Me或OMe修饰，并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’位置用F(核糖或***糖)修饰并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’位置被O-甲氧基乙氧基修饰并且3’位置是O或NH。实施例还包括其中2’位置用F(核糖或***糖)修饰并且3’位置是O或NH。实施例包括其中2’和4’位置是经修饰的桥接基团(如本文中其他地方所述)以形成构象受限的核苷酸，并且3’位置是O或NH。这些实施例中的每一个可以包括硫代磷酸酯(或硫代氨基磷酸酯，取决于3’取代)和氨基磷酸酯亚基间键联。

实施例还包括包含核苷酸(其中2’位置是OH并且3’位置是NH，或2’位置是H并且3’位置是NH)的寡核苷酸。这些实施例的每一个可包括硫代氨基磷酸酯和/或氨基磷酸酯亚基间键联。

Z’结构域的核苷酸通过亚基间键联连接，例如，N3′→P5′氨基磷酸酯、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或磷酸二酯亚基间键联。在一些实施例中，Z’结构域通过选自N3′→P5′氨基磷酸酯，N3′→P5′硫代氨基磷酸酯及其组合的亚基间键联连接。在一些实施例中，Z’结构域包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自N3′→P5′氨基磷酸酯和/或N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亚基间键联。

其他实施例包括寡核苷酸，所述包含：

(A)一个或多个下式的核苷酸：

其中R是H或带正电荷的抗衡离子，B是核碱基，R₁是-(CH₂)₂OCH₃或-OCH₃，和

(B)包含具有通过硫代磷酸酯亚基间键联连接的2至10个2’-脱氧核苷的序列的结构域。在一些实施例中，寡核苷酸包含20个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸包括结构域，所述结构域包含具有通过硫代磷酸酯亚基间键联连接的10个2’-脱氧核苷的序列。

经修饰的反义寡核苷酸

其他化合物包括经修饰的反义寡核苷酸。在一些实施例中，ASO包括式(I)、(II)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)、(V)和/或(V’)的核苷酸。

本公开的其他化合物包括具有与MAPT基因的至少一部分互补的核碱基序列的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少一个具有下式(VIII)的核苷酸：

其中X_A是NH或O，Y是OR SR，其中R是H或带正电荷的抗衡离子，B_A在每种情况下独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基，R_A’和R_A”各自独立地选自H、F、OH、OMe、O-甲氧基乙氧基，并且R_A”’是H或R_A’和R_A”’一起形成-O-CH₂-、-O-CH(Me)-或-O-(CH₂)₂-。

在一些实施例中，R_A’和R_A”’是H；并且R_A”选自F、OH、OMe，Me，O-甲氧基乙氧基。在其他实施例中，R_A”和R_A”’是H；并且R_A’选自F、OMe、Me、O-甲氧基乙氧基。在一些实施例中，X_A在每种情况下均是NH。

一些实施例包括一个或多个由式(VIII)表示的经修饰的核苷酸，其中X_A是NH；B_A是G-夹钳；R_A’是F或OMe，并且R_A”是H；或R_A’是H且R_A”是H或F；并且R_A”’是H。

一些实施例包括一个或多个由式(VIII)表示的经修饰的核苷酸，其中X_A是NH；B_A是未修饰或经修饰的核碱基；R_A’和R_A”’一起形成构象受限的核苷酸(例如，-O-CH₂-或-O-(CH₂)₂-)；并且R_A”是H。在一些实施例中，B_A是选自由以下组成的组的未修饰或经修饰的核碱基：5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤和5-甲基尿嘧啶。

一些实施例包括一个或多个由式(VIII)表示的经修饰的核苷酸，其中X_A是NH；B是未修饰的或经修饰的核碱基；R_A’是F或OMe，R_A”是H，并且R_A”’是H。

一些实施例包括一个或多个由式(VIII)表示的经修饰的核苷酸，其中X_A是NH；B_A是未修饰或经修饰的核碱基；R_A’是H，R_A”是F，并且R_A”’是H。

在一些实施例中，X_A是NH。在其他实施例中，Y是O^-或S^-(具有带正电荷的抗衡离子)。在一些实施例中，R_A’或R_A”是H，并且另一个是F、OH、OMe，Me，O-甲氧基乙氧基(例如***糖基-F或核糖基-F或OMe)。

在一些实施例中，B_A选自A、C、G、U和T。在另外的实施例中，B_A选自A、C、G、U、T、2,6-二氨基嘌呤、5-Me嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶)。在一些实施例中，R_A’和R_A”中的至少一个是H。例如，在一些实施例中，R_A’是F、OH、OMe、Me、O-甲氧基乙氧基并且R_A”是H。在其他实施例中，R_A’是H且R_A”是F。

在一些实施例中，当B_A是嘌呤核碱基时，R_A’和R_A”中的至少一个是OH或F，和/或当B_A是嘧啶核碱基时，R_A’和R_A”中的至少一个是OMe、OH或F。

在其他实施例中，核苷酸包括表E或表F中的一个或多个核苷酸。

表E

表F

本公开的化合物还包括具有与MAPT基因的至少一部分互补的核碱基序列的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少十个具有下式(IX)的核苷酸：

其中R是H或带正电荷的抗衡离子，B_B在每种情况下独立地是天然或未修饰的核碱基或经修饰的核碱基，R_B’和R_B”在每种情况下各自独立地选自H、F、OMe、O-甲氧基乙氧基，并且R_B”’是H或R_B’和R_B”’一起形成-O-CH₂-、-O-CH(Me)-或-O-(CH₂)₂-。

在一些实施例中，每个寡核苷酸是式(IX)的核苷酸。

在一些实施例中，R_B’和R_B”’是H，且R_B”选自F、OH、OMe、Me、O-甲氧基乙氧基。在其他实施例中，R_B”和R_B”’是H；并且R_B’选自F、OMe、Me、O-甲氧基乙氧基。

一些实施例包括一个或多个由式(IX)表示的经修饰的核苷酸，其中B_A是G-夹钳；R_B’是F或OMe，并且R_B”是H；或R_B’是H且R_B”是H或F；并且R_B”’是H。

一些实施例包括一个或多个由式(IX)表示的经修饰的核苷酸，其中B_A是未修饰的或经修饰的核碱基；R_B’和R_B”’一起形成构象受限的核苷酸(例如-O-CH₂-或-O-(CH₂)₂-)；并且R_B”是H。在一些实施例中，B_A是选自由以下组成的组的未修饰或经修饰的核碱基：5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤和5-甲基尿嘧啶。

一些实施例包括一个或多个由式(IX)表示的经修饰的核苷酸，其中B是未修饰的或经修饰的核碱基；R_B’是F或OMe，R_B”是H，并且R_B”’是H。

一些实施例包括一个或多个由式(IX)表示的经修饰的核苷酸，其中B_A是未修饰的或经修饰的核碱基；R_B’是H，R_B”是F，并且R_B”’是H。

在其他实施例中，Y是S^-(具有带正电荷的抗衡离子)。在一些实施例中，R_B’或R_B”是H，并且另一个是F、OH、OMe，Me，O-甲氧基乙氧基(例如***糖基-F或核糖基-F或OMe)。

在一些实施例中，B_B选自A、C、G、U和T。在另外的实施例中，B_B选自A、C、G、U、T、2,6-二氨基嘌呤、5-Me嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)。在一些实施例中，R_B’和R_B”中的至少一个是H。例如，在一些实施例中，R_A’是F、OH、OMe、Me、O-甲氧基乙氧基并且R_B”是H。在其他实施例中，R_B’是H且R_B”是F。

在一些实施例中，当B_B是嘌呤核碱基时，R_B’和R_B”中的至少一个是OH或F，和/或当B_B是嘧啶核碱基时，R_B’和R_B”中的至少一个是OMe、OH或F。

在一些实施例中，式(VIII)或(IX)的寡核苷酸的核苷碱基序列包含选自表A中的那些的序列。在一些实施例中，式(VIII)或(IX)的寡核苷酸的核苷碱基序列包含与选自表D中的那些的序列有1、2、3、4或5个核碱基不同的序列。

在实施例中，公开的寡核苷酸对MAPT基因的至少一部分或其RNA等效物表现出亲和力和/或与MAPT基因的至少一部分或其RNA等效物的以下六个序列中的至少一个复合显示出稳定性。在实施例中，与互补的MAPT基因序列复合的寡核苷酸具有>37℃的解链温度(Tm)。MAPT基因可以是RNA序列，例如外显子5、外显子10或外显子12。所述复合物可以在生理条件或接近生理条件的条件下(例如在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)形成。在实施例中，复合物的Tm是>50℃。在实施例中，复合物的Tm是50℃-100℃。在实施例中，在生理条件或接近生理条件下与MAPT基因的至少一部分双链化的公开的寡核苷酸的Tm是>50℃。

在本公开的一些方面，式(VIII)或(IX)的寡核苷酸的核碱基序列包含具有12-22个核苷酸(例如14-20个核苷酸或16-19个核苷酸)的序列。在一些实施例中，式(VIII)或(IX)的寡核苷酸的核碱基序列的长度是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸。

在本公开的另一方面，本文描述的寡核苷酸在寡核苷酸的一个或多个末端被缀合或修饰。

例如，在一些实施例中，寡核苷酸的末端被所述末端上的至少一个经修饰的核苷酸保护以免水解切割。在一些实施例中，经修饰的核苷酸是包含经修饰的核苷酸的经修饰的核苷酸，所述经修饰的核苷酸包含3’-N修饰并且可以包括硫代氨基磷酸酯亚基键联。在一些实施例中，式(VIII)和(IX)的寡核苷酸在3’和/或5’末端还包含至少一个核苷酸(例如1或2个)，其包含硫代磷酸酯亚基间键联和胸腺嘧啶核苷。在一些实施例中，式(VIII)和(IX)的寡核苷酸在3’和/或5’末端还包含至少一个核苷酸(例如1或2个)，其包含2-OMe修饰的核苷酸和胸腺嘧啶核碱基。在一些实施例中，式(VIII)和(IX)的寡核苷酸在3’和/或5’末端还包含至少一个2’-OMe修饰的核苷酸，其包含硫代磷酸酯亚基间键联和尿嘧啶核碱基。在一些实施例中，可以在式(VIII)和(IX)的寡核苷酸的3’末端掺入反向dT，导致3’-3’键联，其可以抑制通过3’核酸外切酶的降解和/或通过DNA聚合酶的延伸。

缀合的寡核苷酸

本公开还涉及缀合至寡核苷酸的其他组分，例如靶向部分和在一个或多个末端修饰的寡核苷酸。

在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸任选地通过连接部分，例如HEG接头或C6或C7氨基接头，与一个或多个配体靶向基团缀合。在一些实施例中，本文所述的寡核苷酸还包含通过任选的接头在5'和/或3'末端缀合的配体靶向基团。在优选的实施例中，本文所述的寡核苷酸还包含通过任选的接头在5'和/或3'末端缀合的配体-靶向基团。在一些实施例中，缀合在本文描述的寡核苷酸的3’末端。

在一些实施例中，配体靶向基团增强特定类型的细胞例如CNS细胞中寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。

在一些实施例中，配体靶向基团可以是脂质部分，例如生育酚和脂肪酸，例如十六烷酸(棕榈酸)和辛酸，例如二硫辛酸(硫辛酸)，棕榈酰基部分。

在一些实施例中，寡核苷酸的末端被所述末端上的至少一个经修饰的核苷酸保护以免水解切割。在一些实施例中，经修饰的核苷酸是包含经修饰的核苷酸的经修饰的核苷酸，所述经修饰的核苷酸包含3’-N修饰并且可以包括硫代氨基磷酸酯亚基键联。在一些实施例中，寡核苷酸链在3’和/或5’末端还包含至少一个核苷酸(例如1或2个)，其包含硫代磷酸酯亚基间键联和胸腺嘧啶核苷。在一些实施例中，寡核苷酸链在3’和/或5’末端还包含至少一个核苷酸(例如1或2个)，其包含2’-F、2’-OMe、2’-OEt或2’-MOE修饰的核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸链在3’和/或5’末端还包含至少一个2’-OMe修饰的核苷酸，其包含硫代磷酸酯亚基间键联和尿嘧啶核碱基。在实施例中，ASO的3’末端通过np或po键联连接至进一步连接至靶向部分的C6氨基接头。

在一些实施例中，可将反向的dT掺入寡核苷酸链的3’末端，导致3’-3’键联，其可以抑制通过3’核酸外切酶的降解和/或通过DNA聚合酶的延伸。

2.组合物

本公开还涵盖包含本公开的寡核苷酸的药物组合物。一个实施例是药物组合物，其包含式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的寡核苷酸或本公开的其他寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂或载剂。

在一些实施例中，配制含有本公开的寡核苷酸的药物组合物以递送至中枢神经系统(CNS)，例如鞘内或脑室内递送。在其他实施例中，含有本公开的寡核苷酸的药物组合物被配制用于经由肠胃外递送的全身施用。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输液；同样，例如经由植入装置进行皮下施用。在一个优选的实施例中，含有本公开的寡核苷酸的药物组合物被配制用于鞘内或脑室内递送。用于CNS施用的配制品可以包括无菌水悬浮液，其还可以包含缓冲液、稀释剂和本领域技术人员理解的其他药学上可接受的添加剂。

包含本公开的寡核苷酸的药物组合物可用于治疗例如与AD基因的表达或活性相关的疾病或障碍。

3.使用方法

本技术的一个方面包括用于治疗被诊断患有、怀疑患有或具有患诸如阿尔茨海默病(AD)的tau蛋白病变和/或任何其他tau相关障碍的风险的受试者的方法。在治疗应用中，将包含本公开的寡核苷酸的组合物以一定量施用给怀疑患有或已经患有tau蛋白病变例如AD和/或任何tau蛋白病变相关障碍的受试者，所述量足以治愈或至少部分地抑制所述疾病的症状，包括其在tau蛋白病发展过程中的并发症和中间病理性表型。

在一些实施例中，本公开的寡核苷酸显示对包括外显子和/或内含子区域的taucDNA序列的亲和力。在一些实施例中，本公开的寡核苷酸显示对小神经胶质细胞靶如PLCG2、CD33、TREM2)或星形胶质细胞靶如ApoE以及其他神经元靶如APP具有亲和力。在一些实施例中，本公开的寡核苷酸显示对表G中MAPT基因的以下区域中的至少一个的亲和力。

表G

在一个实施例中，本公开的核苷酸显示出对Tau mRNA的外显子10或外显子12的亲和力。

在另一个总体方面，本公开涉及在有需要的受试者中治疗或减轻疾病、障碍或病症(例如tau蛋白病发)的症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的药物组合物。

在另一个总体方面，本公开涉及一种在有需要的受试者中减少病理性tau聚集或tau蛋白病变扩散的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的药物组合物。

根据本公开的实施例，药物组合物包含治疗有效量的本公开的寡核苷酸。如本文参考本公开的寡核苷酸所使用的，治疗有效量是指本公开的寡核苷酸的量，其导致疾病、障碍或病症的治疗；预防或减缓疾病、障碍或病症的发展；或减轻或完全缓解与免疫疾病、障碍或病症相关的症状。

根据特定的实施例，治疗有效量是指足以实现以下作用中的一种、两种、三种、四种或更多种的治疗量：(i)降低或改善待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的严重程度；(ii)减少待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的持续时间；(iii)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的进展；(iv)引起待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的消退；(v)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的发展或发作；(vi)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的复发；(vii)减少具有待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的受试者的住院；(viii)减少具有待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的受试者的住院长度；(ix)增加具有待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中的待治疗的疾病、障碍或病症或与其相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的一种或多种预防或治疗作用。

根据特定的实施例，要治疗的疾病、障碍或病症是tau蛋白病变。根据更具体的实施例，待治疗的疾病、障碍或病症包括但不限于家族性阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病、与17号染色体连锁的额颞痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮层下神经胶质增生、仅缠结痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、嗜银颗粒痴呆、肌萎缩性侧索硬化、帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合征、吉斯特曼-斯召斯列疾病(disease)、哈-斯二氏病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵体肌炎、克-雅二氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系统萎缩、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease typeC)、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、具有神经原纤维缠结的非Guamanian运动神经元疾病、脑炎后帕金森综合征、慢性创伤性脑病、或拳击手痴呆(拳击病)。

tau蛋白病变相关的行为表型包括但不限于认知损害、早期人格改变和去抑制、情感淡漠、意志缺失、缄默、失用症、持续言语、刻板动作/行为、口部过度活动(hyperorality)、无组织化、无法计划或组织连续任务、自私/冷漠、***性状、缺乏同情、迟疑不决、具有频繁错语错误但相对保守的理解的语法错乱言语、受损的理解和字词寻找缺陷、慢性进行性步态不稳、反步症(retropulsion)、冷淡、频繁跌倒、非左旋多巴响应轴向刚度、核上注视麻痹、方形急跳、缓慢垂直扫视、假延髓性麻痹、肢体失用、肌张力障碍、皮层感觉丧失以及震颤。

适于治疗的患者包括但不限于有AD或其他tau蛋白病变风险的无症状个体以及目前显示症状的患者。适于治疗的患者包括具有已知的AD遗传风险(如AD的家族史或基因组中存在遗传风险因子)的个体。示例性风险因子是淀粉样前体蛋白(APP)中、特别是在位置717以及位置670和671处的突变(分别为哈迪(Hardy)突变和瑞典(Swedish)突变)。其他危险因素是早老素基因PS1和PS2以及ApoE4的突变、高胆固醇血症或动脉粥样硬化的家族史。通过上述风险因子的存在，可以从特征性痴呆中识别目前患有AD的个体。此外，多种诊断测试可用于识别患有AD的个体。这些包括脑脊液tau和Aβ42水平的测量。升高的tau和降低的Aβ42水平表示AD的存在。还可以通过AD和相关疾病协会标准来诊断患有AD的个体。

本公开的寡核苷酸适合作为治疗剂和预防剂，用于治疗或预防涉及tau的病理性聚集的神经退行性疾病，例如AD或其他tau蛋白病变。在无症状患者中，治疗可以在任何年龄开始(例如，在约10、15、20、25、30岁)。然而，通常，直到患者达到约40、50、60或70岁之前无需开始治疗。在一段时间内治疗通常需要多个剂量。

在预防性应用中，向易患或原本有AD的风险的患者以足以消除或降低所述风险、减轻所述疾病(包括疾病、在所述疾病的发展期间存在的其并发症和中间病理性表型的生物化学的、组织学的和/或行为的症状)的严重程度或延迟其发作的量施用药物组合物或药物。在治疗性应用中，向怀疑患有或已经患有这种疾病的患者以足以减少、抑制或延缓任何所述疾病的症状(生物化学的、组织学的和/或行为的)的量施用组合物或药物。施用治疗剂可以减少或消除尚未患上特征性阿尔茨海默病变的患者的轻度认知损害。

治疗有效量或剂量可以根据各种因素而变化，例如要治疗的疾病、障碍或病症，施用方式，靶位点，受试者的生理状态(包括年龄、体重、健康)，受试者是人类还是动物，施用的其他用药、以及治疗是预防性的还是治疗性的。最佳滴定治疗剂量以优化安全性和功效。

本公开的寡核苷酸可以制备为药物组合物，所述药物组合物在药学上可接受的载剂中包含治疗有效量的本公开的寡核苷酸作为活性成分。载剂可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可以使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物质。它们可通过常规的公知灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。这些组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂以及着色剂等。本公开的寡核苷酸在这种药物配制品中的浓度可以广泛变化，即按重量计从小于约0.5％、通常为或至少约1％到多达15％或20％，并且将根据选择的具体施用方式主要基于所需的剂量、流体体积、粘性等进行选择。

用于治疗性使用本公开的寡核苷酸的施用方式可以是将药剂递送至宿主的任何合适的途径。例如，本文所述的组合物可以配制成适合肠胃外施用，例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或颅内施用，或者它们可以施用到脑或脊柱的脑脊液中。

在一些实施例中，根据本公开的可注射配制品可以直接施用至中枢神经系统(CNS)。如本文所定义，术语“中枢神经系统”被定义为神经系统的一部分，其在脊椎动物中由脑和脊髓组成，向其传递感觉冲动并且从其发出运动冲动，并且其协调整个神经系统的活动。

直接施用到CNS中的实例包括鞘内(IT)施用和直接施用到脑中，例如脑内(IC)、室内、脑室内(ICV)、颅内或硬膜下施用途径。这样的施用途径对于影响中枢神经系统的疾病可能特别有益。

因此，在本公开的某些方面和实施例中，非全身性施用选自由以下组成的组：鞘内、脑内、室内、脑室内、颅内和硬膜下施用。

在一些实施例中，本文定义的非全身性施用是鞘内施用。如本领域技术人员已知的，术语“鞘内施用”是指通过绕过血脑屏障注射到脊髓的蛛网膜下腔中来引入治疗物质。

在其他实施例中，本文定义的非全身性施用是脑室内施用。

如本领域中已知的，室系统是脑中的四个相互连接的腔(室)的集合，其中产生脑脊液(CSF)。在每个室中都有脉络丛区域，这是与CSF产生有关的室管膜细胞网络。室系统与脊髓中央管是连续的，允许CSF的血液循环。

尽管血脑屏障在保护大脑方面起屏护作用，但它限制了针对神经退行性障碍设计的潜在疗法进入中枢神经系统(CNS)的途径。神经退行性疾病，例如但不限于阿尔茨海默病可极大地受益于直接将治疗剂引入CNS。进入CNS的直接施用途径之一是通过脑室内施用直接注射入脑侧脑室，这导致物质通过脑脊液递送至施用。

因此，如本领域已知的和如本文所用，术语“脑室内施用”是指直接注射入脑侧脑室。

如本文所用，术语“注射”或“可注射的”是指弹丸式注射(施用离散量的药剂以提高其在体液中的浓度)，在几分钟内的缓慢弹丸式注射，或延长的输注或以间隔开的时间给予的几次连续注射/输注。

能以单剂量方案或作为多剂量方案给予治疗，其中治疗的主要过程可以有1-10个单独剂量，随后以维持和/或强化反应所需的后续时间间隔给予其他剂量，例如在1-4个月时给予第二剂量，并且若需要的话，在数月后给予一个或多个后续剂量。合适的治疗方案的实例包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或足以引起预期减轻疾病症状或减轻疾病严重程度的所希望的反应的其他方案。

根据特定的实施例，可将用于治疗tau蛋白病变的组合物与有效治疗相关神经退行性疾病的其他药剂组合使用。在AD的情况下，本公开的寡核苷酸可以与减少或防止淀粉样β(Aβ)沉积的药剂组合施用。PHF-tau和Aβ病理可能是协同的。因此，同时靶向清除PHF-tau和Aβ以及Aβ相关病理的联合疗法比各个单独靶向更有效。在帕金森病和相关的神经变性疾病的情况下，对α-突触核蛋白的清晰聚集形式的免疫调节也是一种新兴的疗法。同时靶向tau和α-突触核蛋白的清除的组合疗法可能比单独靶向任一种蛋白更有效。

在另一个总体方面，本公开涉及生产包含本公开的寡核苷酸的药物组合物的方法，所述方法包括将寡核苷酸与药学上可接受的载剂组合以获得药物组合物。

在一些实施例中，用本公开的寡核苷酸组合物治疗的受试者将显示出以下病症或症状中的一种或多种的改善或消除：家族性阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病、与17号染色体连锁的额颞痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮层下神经胶质增生、仅缠结痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、嗜银颗粒痴呆、肌萎缩性侧索硬化、帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合征、吉斯特曼-斯召斯列疾病(disease)、哈-斯二氏病(Hallervorden-Spatzdisease)、包涵体肌炎、克-雅二氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系统萎缩、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease typeC)、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、具有神经原纤维缠结的非Guamanian运动神经元疾病、脑炎后帕金森综合征、慢性创伤性脑病、和拳击手痴呆(拳击病)。

在一些实施例中，与患有tau蛋白病变例如AD和/或任何其他tau相关障碍的未治疗的受试者相比，用本公开的寡核苷酸组合物治疗的受试者将显示出选自tau蛋白和MAPTmRNA的一种或多种生物标志物的表达水平降低。

本公开提供了一种用于治疗被诊断患有或怀疑患有tau蛋白病变例如AD和/或任何其他tau相关障碍的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的寡核苷酸组合物。

本公开的寡核苷酸和组合物可用于反义疗法。例如，寡核苷酸可以包含与AD相关的已知DNA或RNA序列的靶核酸序列(例如MAPT基因的至少一部分)互补或杂交的核碱基序列。

一些实施例包括通过使靶核酸与包含本公开的寡核苷酸的反义化合物接触来调节靶表达的方法。在一些实施例中，靶核酸在细胞中，例如在动物如人中。

一些实施例包括抑制MAPT基因在动物中表达的方法，所述方法包括向所述动物施用包含本公开的寡核苷酸的反义化合物。寡核苷酸可以与MAPT基因的一部分互补或杂交。

一些实施例包括一种用于在患有AD的受试者中降低tau mRNA表达或tau蛋白水平的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的寡核苷酸或组合物，从而降低所述受试者中的tau mRNA表达或tau蛋白水平。寡核苷酸可以与参与tau mRNA例如MAPT mRNA的表达的靶RNA的一部分互补或杂交。

本公开的寡核苷酸和组合物可以用于例如抑制或降低tau或MAPT基因的表达或抑制tau或MAPT的转录或翻译，以治疗患有AD的受试者或用于降低患有或诊断患有AD的受试者中的tau或MAPT蛋白水平。在实施例中，所公开的嵌合寡核苷酸用于在靶基因例如MAPT基因上诱导RNA酶H活性。

本公开还涉及稳定寡核苷酸以递送至受试者的方法。寡核苷酸的稳定在本文中被表征为[量化]为增加寡核苷酸的熔点或温度T_m。

所公开的寡核苷酸构建体可以单独施用或与一种或多种针对靶向病痛的其他治疗组合施用。公开的寡核苷酸构建体可以单独施用或与一种或多种其他AD治疗组合施用。在组合疗法中，寡核苷酸构建体和一种或多种用于AD的其他治疗可以在相同或分开的组合物中同时施用，或分开地、同时地或顺序地施用。

在一些实施例中，所公开的寡核苷酸构建体与tau或MAPT转录或翻译抑制剂组合施用，或以将抗AD寡核苷酸剂与tau或MAPT转录或翻译抑制剂组合的方案施用。在实施例中，将所公开的寡核苷酸构建体与针对tau病变例如AD的标准护理疗法组合施用。针对tau蛋白病变诸如AD的标准护理治疗可以包括乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA受体调节剂、BACE抑制剂、蛋白质聚集抑制剂、抗tau抗体、抗Aβ抗体、tau疫苗接种、Aβ疫苗接种以及其他已知的针对tau蛋白病变的治疗。在实施例中，在同时(共同施用)或顺序给药之后，将所公开的寡核苷酸构建体与一个或多个寡核苷酸组合施用。寡核苷酸可以包括siRNA寡核苷酸、反义寡核苷酸(例如Tau^ASO-12(Devos等人,Sci Transl Med.[科学转化医学]2017年1月25日；9(374)))、miRNA模拟物或抑制剂、适体、空间阻断剂、saRNA、shRNA和/或免疫调节性寡核苷酸。

一些实施例包括抑制MAPT基因在细胞或受试者中的表达，所述抑制包括使细胞与本公开的寡核苷酸或组合物接触，或向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的寡核苷酸或组合物。

一些实施例包括治疗与MAPT基因的表达或活性相关的疾病或障碍，所述治疗包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的寡核苷酸或组合物。

一些实施例包括用于在患有tau蛋白病变的受试者中降低tau蛋白病变例如阿尔茨海默病(AD)的tau mRNA表达或tau蛋白水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的寡核苷酸或组合物，从而降低所述受试者中的tau mRNA表达或tau蛋白水平。

一些实施例包括用于在患有tau蛋白病变的受试者中降低tau蛋白病变例如阿尔茨海默病(AD)的MAPT mRNA表达或MAPT蛋白水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的寡核苷酸或组合物，从而降低所述受试者中的MAPT mRNA表达或MAPT蛋白水平。

在一个实施例中，将靶向MAPT的本公开的寡核苷酸或组合物施用给患有tau蛋白病变例如阿尔茨海默病和/或任何tau蛋白病变相关障碍的受试者，使得例如在受试者的细胞、组织、血液或其他组织或体液中的MAPT基因表达和/或tau蛋白水平在向所述受试者施用本发明的寡核苷酸或组合物后降低至少约25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、62％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或更多，或这些数字中的两个之间的值。在一些实施例中，tau蛋白水平降低了前述量。在一些实施例中，一种或多种基因(包括MAPT基因)的表达降低了前述量。

根据本公开的方法和用途施用本公开的寡核苷酸或组合物可导致患有tau蛋白病变(例如阿尔茨海默病)和/或任何tau蛋白病变相关障碍的患者的此类疾病或障碍的严重程度、体征、症状和/或标志物降低。在本文中，“降低”是指该水平的统计学上显著的减少。减少可以是例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大约100％，或这些数字的两个之间的值。

本公开的寡核苷酸或组合物的量可以由医学专业人员确定。产品的日剂量可以在每个成年人每天0.001至1,000mg的宽范围内变化，或其中的任何范围。对于IT或ICV施用，优选以包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250和500毫克活性成分的悬浮液形式提供组合物，用于对待治疗患者的剂量进行对症调整。有效量的药物通常以每天约0.01mg/kg体重至约100mg/kg体重或其中的任何范围的剂量水平供应。优选地，所述范围是每天约0.01至约50.0mg/kg体重，或其中的任何范围。更优选每天约0.01至约10.0mg/kg体重，或其中的任何范围。更优选每天约0.01至约1.0mg/kg体重，或其中的任何范围。寡核苷酸可以每天1-4次的方案施用。例如，本公开的寡核苷酸可以以约0.1mg/kg至约100mg/kg的一个或多个剂量施用。例如，公开的寡核苷酸可以约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100mg/kg的剂量施用。所列举的值中间的值和范围也意图成为本公开的一部分。这些值可能适用于鞘内或脑室内递送。本文所述的其他递送形式也可以这些剂量施用。剂量可以根据患者的需求、所治疗病症的严重程度以及所使用的寡核苷酸而变化。可采用每日施用亦或周期后给药(postperiodic dosing)。

本公开的寡核苷酸可以经一段时间，例如经5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或大约25分钟通过鞘内或脑室内注射施用。可以例如定期，每周一次，每双周一次(即，每两周一次)重复施用一个月、两个月、三个月、四个月或更长时间。在初始治疗方案之后，可以较低频率为基础施用治疗。例如，在每周或每两周一次施用三个月后，可以每月一次重复施用，持续六个月或一年或更长时间。

可以例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、认知评量、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标志物或适合于治疗或靶向预防的给定疾病的任何其他可测量参数的水平来评估治疗或预防疾病的功效。通过测量这样的参数中的任何一个或参数的任何组合来监视治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，可以通过定期监测MAPT基因的表达和/或tau蛋白水平来评估tau蛋白病变(例如AD)的治疗功效。随后的读数与初始读数的比较提供了该治疗是否有效的指示。

4.定义

应理解，本文所用术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不意图限制本发明的范围。除非另外指出，否则以下定义应适用。

如本文所用，如本文所用，关于多核苷酸(即，核苷酸序列，诸如寡核苷酸或靶核酸)的术语“互补”或“互补性”是指碱基配对规则。如本文所用，核酸序列的互补序列是指当与核酸序列比对以使得一个序列的5'末端与另一序列的3'末端配对时处于“反平行缔合”的寡核苷酸。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5”互补。在天然存在的核酸中不常见的某些碱基可以包括在本文所述的核酸中。这些包括例如肌苷，7-脱氮鸟嘌呤、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。互补性不一定是完全的；稳定的双链体可能包含不匹配的碱基对、变性或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以根据经验确定双链体稳定性，其中考虑多个变量，这些变量包括例如寡核苷酸的长度、碱基组成和寡核苷酸的序列、离子强度以及错配碱基对的发生率。互补序列也可以是与DNA序列或其互补序列互补的RNA序列，也可以是cDNA。

如本文所用，如本文所用，术语“杂交”是指以下过程，其中两个基本互补的核酸链(在至少14至25个核苷酸上至少约65％互补，至少约75％或至少约90％互补)在适当严格的条件下彼此退火，通过在互补碱基对之间形成氢键来形成双链体或异双链体。杂交通常且优选地用探针长度的核酸分子进行，所述探针长度的核酸分子的长度优选是15-100个核苷酸，更优选是18-50个核苷酸。核酸杂交技术是本领域众所周知的。参见例如Sambrook,等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版,Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验室出版社],平景镇(Plainview),纽约。杂交和杂交强度(即核酸之间的缔合强度)受以下因素影响：核酸之间的互补程度，所涉及条件的严格性和形成的杂交体的热解链点(T_m)。本领域技术人员理解如何估计和调节杂交条件的严格性，使得具有至少所需互补水平的序列将稳定地杂交，而具有较低互补性的序列则不会。对于杂交条件和参数的实例，参见例如，Sambrook,等人,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版,；Cold Spring Harbor Press,[冷泉港出版社],平景镇(Plainview),纽约；Ausubel,F.M.等人1994,Current Protocols inMolecular Biology[分子生物学最新方案],John Wiley&Sons[约翰·威利父子出版社],塞考克斯(Secaucus),新泽西州。在一些实施例中，特异性杂交在严格杂交条件下发生。对靶核酸特异的寡核苷酸或多核苷酸(例如，探针或引物)将在合适的条件下与靶核酸杂交。

如本文所用，如本文所用的术语“严格杂交条件”是指至少如下严格的杂交条件：在42℃下于50％甲酰胺、5x SSC、50mM NaH₂PO₄、pH6.8、0.5％SDS、0.1mg/mL超声处理的鲑鱼***DNA和5x Denharts溶液中杂交过夜；在45℃下用2x SSC、0.1％SDS洗涤；并在45℃下用0.2x SSC，0.1％SDS洗涤。在另一个实例中，严格的杂交条件不应允许以下两个核酸的杂交，这两个核酸在一段20个连续核苷酸之间的差异超过两个碱基。

如本文所用，如本文所用的术语“基本上互补”是指两个序列在严格杂交条件下杂交。本领域技术人员将理解，基本上互补的序列不需要沿其整个长度杂交。特别地，基本上互补的序列可以包含不与靶序列杂交的碱基的连续序列，其位于在严格杂交条件下与靶序列杂交的碱基的连续序列的3'或5'。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不是生物学上或其他方面不期望的材料，即，所述材料可以掺入施用于患者的药物组合物中而不会引起任何不希望的生物学作用或以有害方式与包含它的组合物中的任何其他组分相互作用。当术语“药学上可接受的”用于指代药物载剂或赋形剂时，意味着所述载剂或赋形剂已达到毒理学和生产测试的要求标准，或者所述载剂或赋形剂包含在美国药物管理局编写的Inactive Ingredient Guide[非活性成分指南]中。

如本文所用，寡核苷酸的术语“构建体(construct或constructs)”可以指本公开的寡核苷酸，例如，(1)缀合部分，例如本文所述的那些(例如靶向部分)或(2)具有经修饰/未修饰的核苷酸的结构域，例如在某些嵌合寡核苷酸中。

如本文所用，术语“嵌合寡核苷酸”是指具有一个以上结构域的寡核苷酸，例如由式(VI)和(VII)举例说明的。嵌合寡核苷酸可包括另外的组分，例如配体靶向基团或另外的核苷酸、接头等。

如本文所用，术语“经修饰的核苷”是指独立地具有经修饰的糖部分和/或经修饰的核碱基的核苷。可以理解的是，核苷可以通过亚基间键联连接，例如磷酸二酯亚基间键联、硫代磷酸酯亚基间键联、氨基磷酸酯亚基间键联和硫代氨基磷酸酯亚基间键联。“经修饰的核苷酸”可以指核苷和亚基间键联。

如本文所用，术语“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。“经修饰的核碱基”包括其他合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-C≡C-CH₃)尿嘧啶和嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的经修饰的核碱基包括三环嘧啶，例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶[5,4-b][l,4]苯并嗪-2(3H)-酮)，吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶[5,4-b][l,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-夹钳，例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-am-oe1hoxy)-H-嘧啶[5,4-b][l,4]苯并嗪2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶[4,5-b]吲哚-2-酮)，吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶[3,2,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的核碱基还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮替代的那些。

在一些实施例中，经修饰的核碱基选自由以下组成的组：5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、5-甲基尿嘧啶和g-夹钳。在一些实施例中，g-夹钳是

如本文所用，术语“配体靶向基团”或“靶向部分”是指以下部分，所述部分促进寡核苷酸向tau蛋白病变中涉及的细胞的递送，从而增强细胞摄取或改善药代动力学，包括寡核苷酸对其靶序列的生物利用度。这些基团包括靶向细胞表面受体的受体靶向配体。

如本文所用，术语“构象受限的核苷”是指具有桥联或双环糖结构的核苷，其中核苷的构象可以固定为特定构型。例如，构象受限的核苷包括具有固定C₃’-内糖折叠的核苷。示例性实施例包括桥接核酸(BNA)，例如2’,4’-BNA核苷，例如α-L-亚甲基氧基(4'-CH₂-O-2')LNA、β-D-亚甲基氧基(4'-CH₂-O-2')LNA、亚乙基氧基(4'-(CH₂)₂-O-2')ENA、2’,4’-BNA^NC[NH]、2’,4’-BNA^NC[NMe]、2’,4’-BNA^NC[NBn]、氨基氧基(4'-CH2—O—N(R)-2')BNA和氧基氨基(4'-CH₂—N(R)—O-2')BNA。其他示例性BNA结构包括但不限于在糖的4’和2’位置之间具有至少一个桥的寡核苷酸，其中每个桥独立地包含1个或2至4个独立地选自—[C(R₁)(R₂)]_n—、—C(R₁)═C(R₂)—、—C(R₁)═N—、—C(═NR₁)—、—C(═O)—、—C(═S)—、—O—、—Si(R₁)₂—、—S(═O)_x—和—N(R₁)—的连接基团；其中：x是0、1或2；n是1、2、3或4；每个R₁和R₂独立地是H、保护基、羟基、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、取代的C₅-C₂₀芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C₅-C₇脂环族基团、取代的C₅-C₇脂环族基团、卤素、OJ₁、NJ₁J₂、SJ₁、N₃、COOJ₁、酰基(C(═O)—H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(═O)₂-J₁)或巯基(S(═O)-J₁)；并且每个J₁和J₂独立地是H、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₅-C₂₀芳基、取代的C₅-C₂₀芳基、酰基(C(═O)—H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C₁-C₁₂氨基烷基、取代的C₁-C₁₂氨基烷基或保护基。某些BNA已制备并已在专利文献和科学文献中公开(参见例如：刊于美国专利号7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；6,525,191；7,696,345；7,569,575；7,314,923；7,217,805；和7,084,125，通过引用以其整体并入本文。“构象受限的核苷酸”是指通过亚基间键联连接的构象受限的核苷。

在一些实施例中，构象受限的核苷选自任选取代的LNA或任选取代的ENA。任选取代的LNA或ENA可以被烷基部分取代，例如-CH₂-部分之一上的甲基或乙基。

如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。所述术语包括基因转录成RNA。所述术语还涵盖RNA转录成一种或多种多肽，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。本公开的寡核苷酸可以在宿主细胞的细胞质内，进入细胞外环境(例如细胞培养物的生长培养基)或锚定至细胞膜。

如本文所用，术语“抑制表达”是指表达或活性的降低或阻断，并不一定表示完全消除表达或活性。

如本文所用，术语“降低蛋白质水平”是指降低或阻断mRNA的转录形成由mRNA编码的蛋白质，并且不一定表示完全消除mRNA或蛋白质的转录。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。在一些实施例中，受试者是人，例如成年人。

如本文所用，术语“tau”或“tau蛋白”是指具有多种同种型的丰富的中枢和周围神经系统蛋白。在人中枢神经系统(CNS)中，由于可变剪接，存在大小为长度从352至441个氨基酸不等的六种主要tau同种型(Hanger等人Trends Mol Med[分子医学趋势]15:112-9,2009)。所述同种型通过调节包含0-2个N末端***物和3或4个串联布置的微管结合重复序列而彼此不同，并且被称为0N3R、1N3R、2N3R、0N4R、1N4R和2N4R。如本文所用，术语“对照tau”是指没有磷酸化和其他翻译后修饰的tau同种型。如本文所用，术语“tau”包括含有突变的蛋白质，例如全长野生型tau的点突变、片段、***、缺失和剪接变体。术语“tau”还涵盖tau氨基酸序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于磷酸化。Tau结合微管并调节货物通过细胞的运输，这一过程可以经由tau磷酸化来调节。在AD和相关障碍中，普遍存在tau的异常磷酸化，并认为其在以下之前和/或触发以下：tau聚集成原纤维，称为成对螺旋丝(PHF)。PHF的主要成分是高磷酸化的tau。如本文所用，术语“成对螺旋丝-tau”或“PHF-tau”是指成对的螺旋丝中的tau聚集体。电子显微镜下可以看到PHF结构的两个主要区域，即模糊层和核丝；模糊层对蛋白水解敏感，位于丝的外部，丝的蛋白酶抗性核形成PHF的骨架(Wischik等人Proc Natl Acad Sci USA.[美国国家科学院院刊]85:4884-8,1988)。

如本文所用，“tau蛋白病变”包括涉及tau在脑内的病理性聚集的任何神经变性疾病。除了家族性和散发性AD之外，其他示例性tau蛋白病变是与17号染色体连锁的额颞痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮层下神经胶质增生、仅缠结痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、嗜银颗粒痴呆、肌萎缩性侧索硬化、帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合征、吉斯特曼-斯召斯列疾病(

disease)、哈-斯二氏病(Hallervorden-Spatzdisease)、包涵体肌炎、克-雅二氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系统萎缩、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease type C)、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、具有神经原纤维缠结的非Guamanian运动神经元疾病、脑炎后帕金森综合征以及慢性创伤性脑病(如拳击手痴呆(拳击病))(Morris等人,Neuron[神经元],70:410-26,2011)。

如本文所使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”均旨在指改善或逆转与tau蛋白病变有关的至少一个可测量的物理参数，所述tau蛋白病变在受试者中不一定可辨别，但是可以受试者中辨别。术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”还可以指引起消退、防止疾病进展，或至少减慢疾病、障碍或病症的进展。在一个特定的实施例中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指减轻、预防与tau蛋白病变有关的一种或多种症状的发展或发作或减少与tau蛋白病变有关的一种或多种症状的持续时间。在一个特定的实施例中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在一个特定的实施例中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活的增加。在一个特定的实施例中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指消除受试者的疾病、障碍或病症。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引发所希望的生物或药物应答的活性成分或组分的量。关于所阐述的目的，治疗有效量可以根据经验并且以常规方式来确定。例如，体外测定可以任选地用于帮助鉴定最佳剂量范围。基于几个因素的考虑，包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态以及熟练的技术人员已知的其他因素，本领域技术人员可以确定(例如，经由临床试验)特定有效剂量的选择。配制品中待采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病的严重程度，并且应当根据执业医师的判断和每名患者的情况来决定。可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推出有效剂量。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本公开的化合物的生理上和药学上可接受的盐，即，保留母体寡核苷酸/化合物的所希望生物活性并且不赋予其不希望的毒理作用的盐。

在本公开中使用以下缩写。2’-H(脱氧核糖)核苷由对应于核碱基的大写字母表示，例如A、C、G和T。2’-OH(核糖)核苷由小写r和对应于核碱基的大写字母表示，例如rA、rC、rG和rU。2’-O-Me核苷由小写字母m和对应于核碱基的大写字母表示，例如mA、mC、mG和mU。2’-MOE核苷由小写“moe”和对应于核碱基的大写字母表示，例如moeA、moeC、moeG和moeU。2’-核糖基-F核苷由小写字母“f”和对应于核碱基的大写字母表示，例如fA、fC、fG和fU。2’-***糖基-F核苷由小写字母“af”和对应于核碱基的大写字母表示，例如afA、afC、afG和afU。mA*是3’-氨基-2’-OMe-2,6-二氨基嘌呤。A*是3’-氨基-2’-脱氧-2,6-二氨基嘌呤。fA*是3’-氨基-2’-F-2,6-二氨基嘌呤。LNA核苷由“L”和对应于核碱基的大写字母表示，例如LA、LC、LG、LT。

对于核苷酸的骨架或亚基间键联，磷酸二酯亚基间键联被称为“PO”或通常不包括在序列细节中；硫代磷酸酯亚基间键联缩写为小写“ps”；氨基磷酸酯亚基间键联缩写为小写“np”；和硫代氨基磷酸酯亚基间键联缩写为小写“nps”。

N3’→P5’是指具有亚基间键联的经修饰核苷酸，其中3’部分包含N(例如NH)并通过P连接。例如，以下结构具有N3’→P5’键联：

注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述”包括复数指示物。还应注意，可以起草权利要求以排除任何任选要素。因此，此陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。

术语“约”将是本领域普通技术人员所理解的，并将在一定程度上根据其使用的上下文而变化。如果所述术语的使用在本领域普通技术人员使用的上下文中是不明确的，则“约”将意味着高达特定术语的正负10％。本文给出了某些范围，其中数值之前带有术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后的确切数字以及与所述术语后的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举数字可以是以下数字，所述数字在其出现的上下文中提供了具体列举的数字的基本等同物。

还应理解，本文描述的疾病或病症的各种治疗或预防方式旨在表示“实质性”，其包括总的或小于总的治疗或预防，并且其中一些生物学或医学上相关的结果被实现。所述治疗可以是针对慢性疾病的连续延长治疗，也可以是一次或几次施用以治疗急性病症。

在提供数值范围的情况下，应理解为，除非上下文另有明确规定，否则所述范围的上限和下限之间的每个中间值(到下限单位的十分之一)以及所述范围内的任何其他陈述值或中间值包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，遵守所述范围内任何明确排除性限制。当所述范围包括所述极限的一个或两个时，排除那些所包括的极限中的一个或两个的范围也包括在本发明中。

本公开不限于所描述的特定实施例，因为这样可以变化。还应理解，本文所用术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不打算具有限制性，因为本发明的范围将仅受随附权利要求书限制。

对于本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独的实施例具有离散的组分和特征，其可以在不会脱离本发明的范围或精神的情况下容易地与其他几个实施例中的任何一个的特征分离或组合。任何叙述的方法都可以以叙述的事件顺序或逻辑上可能的任何其他顺序执行。

本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文(就如同每个单独的出版物或专利均被具体地和单独地指出通过引用并入本文一样)，并且通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。任何出版物的引用都是出于其在申请日之前的公开，并且不应被解释为承认本发明由于在先发明而无权早于此出版物。此外，提供的公开日期可能与可能需要独立确认的实际公开日期不同。

5.实例

以下实例说明了本公开的某些实施例，以帮助技术人员实施本公开。相应地，这些实例决不被认为限制本公开的范围。

制备的方法

将所有单体在具有干燥剂(KOH和P₂O₅，RT 24h)的真空干燥器中干燥。附接在第一个5’残基上的合成固体支持物(CPG)是从商业渠道获得的。所有其他合成试剂和溶剂均购自商业来源，并直接使用。用于合成后工作流程的化学药品和溶剂购自商业来源，无需任何纯化或处理即可使用。在合成过程中，溶剂(乙腈)和溶液(酰胺和活化剂)被储存在分子筛上。

使用制造商编写的标准93步循环在ABI-394合成仪上合成反义寡核苷酸。固体支持物是受控孔玻璃，并且单体包含标准保护基。使用可商购的5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)DNA和或6-N-苯甲酰基腺苷(A^Bz)、4-N-乙酰基胞苷(C^Ac)、2-N-异丁酰基鸟苷(G^iBu)和胸苷(T)的2’-O-Me亚磷酰胺单体，根据标准固相寡核苷酸合成方案来分别合成每种寡核苷酸。亚磷酰胺购自商业来源。2’-O-Me-2,6,二氨基嘌呤亚磷酰胺购自商业来源。DDTT((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二硫杂唑啉-3-硫酮用作硫转移剂，用于合成寡核糖核苷酸硫代磷酸酯。在5-(乙硫基)-1H-四唑活化剂存在下，将亚磷酰胺在CH₃CN中的0.1M溶液与固体结合的寡核苷酸进行扩展偶联，然后进行标准的加帽、氧化和脱保护，从而获得经修饰的寡核苷酸。所有经修饰的亚磷酰胺的逐步偶联效率均超过98％。将带有寡核苷酸的固体支持物与氨水/乙醇(3:1)水溶液在55℃下加热8小时，以使碱基不稳定的保护基脱保护。

可以通过以下来获得生育酚缀合的寡核苷酸：在附接到TEG接头上的生育酚支持物上开始固相合成，并且最终将亚磷酰胺偶联到与支持物结合的寡核苷酸上。可以在内部自行填充的RPC-Source15反相柱上通过高效液相色谱(HPLC)纯化生育酚缀合的序列。缓冲液可以是在10％CH₃CN中的20mM NaOAc(缓冲液A)和在70％CH₃CN中的20mM NaOAc(缓冲液B)。分析性HPLC和ESLC-MS建立了寡核苷酸的完整性。

氨基磷酸酯(NP)和硫代氨基磷酸酯(NPS)修饰的寡核苷酸的合成

NP和NPS修饰的寡核苷酸是在ABI-394合成仪上合成的，使用具93步循环，其中对去封闭、偶联和等待步骤有修改。固体支持物是3’-NHTr-5’-LCAA-CPG。使用6-N-苯甲酰基腺苷(A^Bz)、4-N-乙酰基胞苷(C^Bz)、2-N-异丁酰基鸟苷(G^iBu)和胸苷(T)的3’-NH-Tr-5'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)DNA亚磷酰胺单体，根据标准固相亚磷酰胺化学方法，使用Nucleic Acids Research[核酸研究],1995,卷23,第14期2661-2668中描述的程序来分别合成每种寡核苷酸。

用于寡聚体合成的3’-NHTr-DNA构建块

2’-F3’-NH-MMTr-5'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)尿苷(U)和4-N-苯甲酰基胞苷(C^Bz)亚磷酰胺单体通过使用Nucleic Acids Research[核酸研究],1996,卷24,第15期,2966-2973中描述的程序来进行合成

2’-F3’-NH-MMTr-5'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)6-N-苯甲酰基腺苷(A^Bz)、2-N-异丁酰基鸟苷(G^iBu)按照以下步骤合成

PH-1的制备

在氮气惰性气氛下向(2R,3S,4S,5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)氧戊环-3,4-二醇(300g，1.123mol，1.00当量)在N,N-二甲基甲酰胺(7500mL)中的溶液中添加三苯基膦(735g，2.802mol，2.50当量)。将所得溶液在0℃搅拌15分钟。随后在搅拌下在60分钟中于0℃下滴加偶氮二甲酸二乙酯(449.4g，2.581mol，2.54当量)在N,N-二甲基甲酰胺(7500mL)中的溶液。将所得溶液在25℃下搅拌2小时。将所得混合物在减压下浓缩。通过添加醚使产物沉淀。通过过滤收集固体。通过从甲醇中重结晶来纯化粗产物。将固体在烘箱中减压干燥。得到186g(66％)呈白色固体的PH-1。1H-NMR(DMSO-d₆,400MHz):8.34-8.07(m,2H),7.44-7.26(m,2H),6.30-6.21(m,1H),5.07-4.95(m,1H),4.33-4.20(m,1H),4.15-4.03(m,2H),3.71-3.50(m,2H)。

PH-2的制备

在氮气惰性气氛下向PH-1(100g，401.2mmol，1.00当量)在吡啶(1000mL)中的溶液中在0℃搅拌下在30分钟中滴加苯甲酰氯(175g，1.245mol，3.10当量)。将所得溶液在25℃下搅拌3小时。将所得溶液用400mL乙酸乙酯稀释。将所得混合物分别用3x 300mL水和2x300mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤。将所得混合物用1x 300mL的饱和氯化钠溶液洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物用乙酸乙酯/石油醚(2/1)施加到硅胶柱上。得到157g(70％)呈白色固体的PH-2。

PH-3的制备

在氮气惰性气氛下向PH-2(30g，53.42mmol，1.00当量)在N,N-二甲基甲酰胺(300mL)中的溶液中依顺序添加氯化铵(5.7g，106.56mmol，2.00当量)和叠氮化钠(34.8g，535.30mmol，10.00当量)。将所得溶液在50℃下搅拌5小时。将所得溶液用2000mL二氯甲烷稀释。将所得混合物分别用3x 2000mL水、1x 2000mL饱和碳酸氢钠溶液和1x 2000mL饱和氯化钠溶液洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。得到24g(90％)呈白色固体的PH-3和PH-3S(5:1)。

PH-4的制备

在氮气惰性气氛下向PH-3和PH-3S(5:1)(10g，19.98mmol，1.00当量)在四氢呋喃(100mL)中的溶液中添加1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(10.69g，70.22mmol，3.50当量)。随后在搅拌下于0℃在10分钟中滴加全氟丁基磺酰氟(12.69g，2.10当量)。将所得溶液在0℃下搅拌1.5小时。将所得溶液用200mL二氯甲烷稀释。将所得混合物分别用3x 200mL水、1x 200mL饱和碳酸氢钠溶液和1x 200mL饱和氯化钠溶液洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将粗产物从乙酸乙酯/石油醚以1:1的比例重结晶。得到6g(60％)呈白色固体的PH-4和PH-4S(5:1)。MS m/z[M+H]+(ESI):503。

PH-5的制备

向PH-4和PH-4S(5:1)(10g，19.90mmol，1.00当量)在四氢呋喃(150mL)中的溶液中添加10％钯碳(3.0g)。将烧瓶抽空并用氮气冲洗三次，然后用氢气冲洗。将所得溶液在室温搅拌1小时。滤出固体。将所得混合物在减压下浓缩。通过快速制备型HPLC在以下条件(IntelFlash-1)下纯化粗产物(10g)：柱，C18；流动相，水和乙腈(30％的乙腈在30分钟中达到50％)；检测器，UV 254nm。得到7g(74％)的呈白色固体的PH-5和1.0g的呈白色固体的PH-5S。MS m/z[M+H]+(ESI):477。

PH-6的制备

在氮气惰性气氛下向PH-5(4g，8.40mmol，1.00当量)在吡啶(40mL)中的溶液中依顺序添加4-二甲基氨基吡啶(1.5g，12.28mmol，1.50当量)和4-甲氧基三苯甲基氯化物(10.3g，4.00当量)。将所得溶液在25℃下搅拌16小时。将所得溶液用300mL二氯甲烷稀释。将所得混合物用1x 300mL水和3x 300mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤。将所得混合物分别用1x300mL的饱和氯化钠溶液洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物用二氯甲烷/甲醇(100/1)施加到硅胶柱上。得到5.7g(91％)呈白色固体的PH-6。

PH-7的制备

在搅拌下在0℃在5分钟中向PH-6(5g，6.68mmol，1.00当量)在吡啶/甲醇/水(32.2/14.7/2.4mL)中的溶液中滴加氢氧化钠(2mol/L)(7.2mL，1.10当量)。将所得溶液在0℃下搅拌20分钟。然后通过添加200mL冰水淬灭反应。将所得溶液用400mL二氯甲烷萃取，并且合并有机层。将所得混合物用1x 300mL水和1x 300mL饱和氯化钠溶液洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物用甲醇/二氯甲烷(1:100)施加到硅胶柱上。得到4.3g(100％)呈白色固体的PH-7。MS m/z[M+H]+(ESI):645。

PH-8的制备

在氮气惰性气氛下向PH-7(19.4g，35.89mmol，1.00当量)在二氯甲烷(200mL)中的溶液中添加3-([双[双(丙-2-基)氨基]磷烷基]氧基)丙腈(11.79g，39.12mmol，1.30当量)。随后在0℃下添加4,5-二氰基咪唑(4.26g，1.20当量)。将所得溶液在室温搅拌30分钟。将所得溶液用1000mL二氯甲烷稀释。将所得混合物分别用3x 800mL饱和碳酸氢钠溶液和1x800mL氯化钠溶液洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。粗产物通过快速制备型HPLC在以下条件下纯化：柱，C18；流动相，水和乙腈(40％的乙腈在6分钟中达到80％)；检测器，UV 254nm。得到15.2g(50％)呈白色固体的PH-8。MS m/z[M+H]+(ESI):845。

PH-11的制备

在氮气惰性气氛下向2-氨基-9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)氧戊环-2-基]-6,9-二氢-1H-嘌呤-6-酮(700g，2.47mol，1.00当量)在N,N-二甲基甲酰胺(7L)中的溶液中添加咪唑(504g，7.41mol，3.00当量)。这之后在搅拌下在20℃滴加1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷(770g，2.44mol，1.00当量)。将所得溶液在20℃下搅拌16小时。然后将反应溶液倒入70L水/冰中。通过过滤收集固体。得到1200g(92％)呈白色固体的PH-11。MSm/z[M+H]+(ESI):526。

PH-12的制备

在氮气惰性气氛下向PH-11(530g，1.01mol，1.00当量)在二氯甲烷(5000mL)中的溶液中依顺序添加吡啶(725g，9.17mol，9.00当量)和4-二甲基氨基吡啶(147g，1.20mol，1.20当量)。然后在0℃在搅拌下滴加三氟甲磺酸酐(426g，1.51mol，1.20当量)。将所得溶液在0℃下搅拌15分钟。然后使所得溶液在搅拌下反应，在20℃下再反应2小时。将所得溶液用5000mL二氯甲烷稀释。将所得溶液分别用2x 3000mL饱和碳酸氢钠和1x 3000mL饱和氯化钠洗涤。将溶液经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。得到600g(90％)呈褐色固体的PH-12。

产物不经进一步纯化直接用于下一步。

PH-13的制备

在氩气惰性气氛下向PH-12(200g，304.04mmol，1.00当量)在N,N-二甲基甲酰胺(1000mL)中的溶液中添加亚硝酸钠(115g，1.67mol，5.00当量)。将所得混合物在25℃下搅拌16小时。将所得溶液倒入5000ml水/冰中。通过过滤收集固体。将粗产物从二氯甲烷/乙腈中(以1/4(50ml/g)的比例)重结晶。得到78g(经最后两个步骤49％)呈固体的PH-13。MS m/z[M+H]+(ESI):526。

PH-14的制备

在氮气惰性气氛下向PH-13(50g，95.10mmol，1.00当量)在四氢呋喃(500mL)中的溶液中添加四丁基铵氟化物(95mL，1.00当量，在四氢呋喃中1N)。将所得混合物在20℃下搅拌12小时。将所得混合物在减压下浓缩。粗品从甲醇/乙酸乙酯中(以1/5(20ml/g)的比例)重结晶三次。通过过滤收集固体，然后在以下条件下通过快速(Flash)纯化：柱，C18硅胶；流动相，水和乙腈(2％的乙腈在10分钟中达到10％)；检测器，UV 254nm。得到16g(59％)呈褐色固体的PH-14。1H-NMR(DMSO-d₆,400MHz):10.44(s,1H),6.49(s,2H),6.02(s,1H),5.55-5.65(m,2H),5.10(s,1H),4.08(m,2H),3.76(m,1H),3.64(m,1H)。

PH-15的制备

在氩气惰性气氛下向PH-14(220g，776.72mmol，1.00当量)在N,N-二甲基甲酰胺(2000mL)中的溶液中添加三苯基膦(509g，1.94mol，2.50当量)。将所得溶液在0℃下搅拌1.5小时。在0℃在搅拌下向其中滴加偶氮二甲酸二乙酯(338g，1.94mol，2.50当量)。将所得溶液在室温搅拌2小时。将所得混合物倒入20L冷***中。将固体通过过滤收集，然后从甲醇/乙酸乙酯中(以1/10(10ml/g)的比例)重结晶。得到100g(49％)呈棕色固体的PH-15。MSm/z[M+H]+(ESI):266。

PH-16的制备

在氮气惰性气氛下向PH-15(100g，377.0mmol，1.00当量)在N,N-二甲基甲酰胺(1000mL)中的溶液中添加咪唑(77g，1.131mol，3.00当量)。然后在0℃在搅拌下滴加叔丁基二甲基甲硅烷基氯(142g，942mmol，1.50当量)。将所得溶液在室温搅拌2小时。然后通过添加甲醇淬灭反应。将所得混合物在减压下浓缩。将残余物用二氯甲烷/甲醇(100:1至15:1)施加到硅胶柱上。得到80g(85％)呈固体的PH-16。MS m/z[M+H]+(ESI):380。

PH-17的制备

在氮气惰性气氛下向PH-16(73g，192.37mmol，1.00当量)在吡啶(730mL)中的溶液中添加4-二甲基氨基吡啶(23.5g，192.35mmol，0.50当量)。随后在搅拌下滴加异丁酸酐(213g，1.35mol，5.00当量)。将所得溶液在50℃下搅拌3小时。然后通过添加冰水淬灭反应。将所得溶液用3x 2000mL二氯甲烷萃取，并且合并有机层。将所得混合物分别用3x 2000mL饱和碳酸氢钠、3x 2000mL水和3x 2000mL饱和氯化钠洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。将残余物用二氯甲烷/甲醇(100:1至20:1)施加到硅胶柱上。得到52g(60％)呈黄色固体的PH-17。MS m/z[M+H]+(ESI):450。

PH-18的制备

在氮气惰性气氛下向PH-17(20g，44.4mmol，1.00当量)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液中添加叠氮化钠(18g，267mmol，6.00当量)。将所得溶液在80℃下搅拌2小时。将所得混合物用1000mL二氯甲烷稀释。将所得溶液分别用3x 1000mL饱和碳酸氢钠、3x1000mL水和3x 1000mL饱和氯化钠洗涤。将溶液用无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将残余物用二氯甲烷/甲醇(100/1至40/1)施加到硅胶柱上。得到11g(50％)呈黄色固体的PH-18/PH-18S(5.2:1)。MS m/z[M+H]+(ESI):493

PH-19的制备

向PH-18/PH-18S(5.2:1)(16g，37.87mmol，1.00当量)在二氯甲烷(160mL)中的溶液中添加吡啶(23g，290.77mmol，9.00当量)和二甲基氨基吡啶(4.35g，35.66mmol，1.20当量)。随后在0℃在搅拌下滴加1,3-双(三氟甲基磺酰基)三氧烷(11.9g，37.88mmol，1.20当量)。将所得溶液在20℃下搅拌2小时。通过添加水/冰淬灭反应。将所得混合物用2x 1000mL二氯甲烷萃取，并且合并有机层。将所得溶液用1x 1000mL的饱和氯化钠洗涤。将所得溶液在减压下浓缩。得到16g(68％)呈棕色固体的PH-19/PH-19S。产物不经进一步纯化直接用于下一步。

PH-20的制备

在氩气惰性气氛下向PH-19/PH-19S(16g，25.61mmol，1.00当量)在四氢呋喃(160mL)中的溶液中在搅拌下在0℃滴加四丁基铵氟化物(100mL，5.00当量)。将所得溶液在室温搅拌5小时。将所得溶液用1000mL二氯甲烷稀释。将所得溶液分别用1x 500mL水和1x500mL饱和氯化钠洗涤。将所得溶液在减压下浓缩。将残余物用二氯甲烷/甲醇(100/1至20/1)施加到硅胶柱上。得到8g(85％)呈黄色固体的PH-20/PH-20S(7:1)。MS m/z[M+H]+(ESI):381。

PH-21的制备

向PH-20/PH-20S(3.4g，8.94mmol，1.00当量)在甲醇(50mL)中的溶液中添加10％钯碳(1.7g)。将烧瓶抽空并用氮气冲洗三次，然后用氢气冲洗。将所得溶液在室温搅拌1小时。将所得溶液用100mL甲醇稀释。滤出固体。将所得溶液在减压下浓缩。粗产物通过快速制备型HPLC在以下条件下纯化：柱，C18硅胶；流动相，水和乙腈(5％的乙腈在35分钟中达到50％)；检测器，UV 254nm。得到1.7g(54％)呈白色固体的PH-21。1H-NMR(DMSO-d₆,400MHz):12.13(s,1H),11.91(s,1H),8.91(s,2H),8.23(s,2H),7.25(m,1H),5.78(m,1H),4.62-3.72(m,4H),2.92(m,1H),1.13(s,6H)。

PH-22的制备

在氩气惰性气氛下向PH-21(6.0g，16.95mmol，1.00当量)在吡啶/N,N-二异丙基乙胺(100/20mL)中的溶液中添加1-(氯二苯基甲基)-4-甲氧基苯(6.24g，20.34mmol，1.20当量)。将所得溶液在室温搅拌16小时。将所得溶液用1000ml二氯甲烷稀释。将所得溶液分别用1x 250mL饱和碳酸氢钠、1x 250ml水和1x 250mL饱和氯化钠洗涤。将残余物用二氯甲烷/甲醇(100/1至50/1)施加到硅胶柱上。得到13g(74％)呈白色固体的PH-22。1H-NMR(DMSO-d₆,400MHz):12.15(s,1H),11.70(s,1H),8.14(s,1H),7.49(m,4H),7.24(m,6H),7.15(m,2H),6.72(m,2H),5.82(m,1H),5.30(m,1H),4.04(m,3H),3.62(s,3H),3.45(m,1H),2.83-2.62(m,3H),1.10(m,6H)。

PH-23的制备

在氩气惰性气氛下向PH-22(7.8g，12.45mmol，1.00当量)在二氯甲烷(80mL)中的溶液中依顺序添加3-(双[双(丙-2-基)氨基]磷烷基氧基)丙腈(7.5g，24.92mmol，2.00当量)和4,5-二氰基咪唑(2.2g，18.63mmol，1.50当量)。将所得溶液在室温搅拌2小时。将所得混合物用1000mL二氯甲烷稀释。将所得溶液分别用3x 250mL饱和碳酸氢钠、3x 250mL水和3x 250mL饱和氯化钠洗涤。将所得溶液在减压下浓缩。粗产物通过快速制备型HPLC在以下条件下纯化：柱，C18硅胶；流动相，水和乙腈(40％的乙腈在35分钟中达到95％)；检测器，UV254nm。得到8.06g(78％)呈白色固体的PH-23。MS m/z[M+H]+(ESI):827。

用于寡聚体合成的2’-F-3’-NHTr构建块

如下所示的6-N-苯甲酰基腺苷(A^Bz)、4-N-苄基胞苷(C^Bz)、2-N-异丁酰基鸟苷(G^iBu)和尿苷(U)的2’-O-Me 3’-NH-MMTr-5’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)亚磷酰胺单体是使用WO 200118015 A1中描述的程序合成。

用于寡聚体合成的2’-O-Me-3’-NHTr构建块

示例性的氨基磷酸酯包括：

反向亚磷酰胺3’-O-DMT-脱氧腺苷(NH-Bz)、5’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺、3’-O-DMT-脱氧鸟苷(NH-ibu)、5’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺、3’-O-DMT-脱氧胞嘧啶(NH-Bz)、5’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺、3’-O-DMT-脱氧胸苷(NH-Bz)、5’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺和反向固体支持物购自商业来源(化基因公司(Chemgenes))。

用于寡聚体合成的反向DNA构建块

用于本公开的示例性反向亚磷酰胺包括：

用于制备具有以下修饰的寡聚体：2’-F-NPS-PS-2’-F-NPS；2’-F-NP-PS-2’-F-NP；2’-OMe-NP-PS-2’-OMe-NP；2’-OMe-NPS-DNA-PS-2’-OMe-NPS，在5’至3’方向上以1μM的规模进行合成，其中5’-亚磷酰胺单体在无水CH₃CN中稀释至0.1M的浓度，在5-(苄硫基)-1H-四唑活化剂的存在下与固体结合的寡核苷酸偶联(偶联时间为2.0-4.0分钟)，然后进行标准的加帽、氧化和脱保护，得到经修饰的寡核苷酸。所有经修饰的亚磷酰胺的逐步偶联效率均超过98％。DDTT(二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二硫杂唑啉-3-硫酮用作硫转移剂，用于合成寡核糖核苷酸硫代磷酸酯。将带有寡核苷酸的固体支持物在室温下与氨水/甲胺(1:1)溶液一起在振荡器中加热3小时，以从支持物上切割并脱保护碱基不稳定的保护基。

实例1-4

适当保护的2’-O-甲氧基乙基-3’-氨基核苷-5’-亚磷酰胺构建块(实例1-4)是在方案1-4中所示的化学转化后制备的。

首先对于合成基于尿嘧啶的3’-NH-MMTr-2’-O-甲氧基乙基亚磷酰胺实例5，如方案1所示，通过脱水中间体2以低产率获得了关键的3’-叠氮基-2’-甲氧基乙基中间体3。

由于低产率的烷基化，使3-1与BOMCl/DBU反应以得到N-3保护的中间体3-4，其通过使用2-溴乙基甲基醚/Ag₂O/NaI/DMF进行烷基化而得到2’-O-甲氧基乙基衍生物3-5，如下方案1所示。使用氢化条件(Pd/C/H₂)对N-3-BOM基团进行脱保护，得到10％-20％的所需3’-氨基中间体3-6a以及明显过度减少的副产物3-6b。

方案1

如方案2所示，以高产率获得2’-O-烷基化。为此，将3-1用PMBCl/DBU/DMF处理，得到N-3保护的中间体4-2，将其用2-溴乙基甲基醚/Ag₂O/NaI/DMF进行2’-O烷基化，得到2’-O-甲氧基乙基衍生物4-3。然后，4-3的5’-去三苯甲基化和使用苯甲酰氯的5’-羟基再保护得到4-5。

方案2

在温和条件下，中间体4-5的PMB基团脱保护得到4-6。将中间体4-6的3’-叠氮基还原为胺，然后将其立即保护，例如与4-单甲氧基三苯甲基氯化物反应，得到4-8。然后使用碱性溶液裂解5’-苄基酯，然后使用已知方法进行磷酸化，得到所需的2’-O-甲氧基乙氧基尿苷亚磷酰胺单体4-10。

(4-2)的制备：向3-1(45.30g，88.56mmol)在DMF(120.00mL)中溶液中添加PMBCl(20.80g，132.84mmol)和DBU(44.61g，177.12mmol)，将混合物在室温搅拌2小时。添加水，用EA萃取。浓缩有机层，并通过柱纯化，得到呈白色固体的4-2(52.00g，82.32mmol)。ESI-LCMS：m/z 632.3[M+H]⁺。

(4-3)的制备：向4-2(50.00g，79.15mmol)在DMF(120.00mL)中的溶液中添加2-溴乙基甲基醚(16.50g，118.73mmol)和Ag₂O(18.34g，79.15mmol，2.57mL)，然后添加NaI(5.93g，39.58mmol)。将反应混合物在室温搅拌12小时。LC-MS显示表现良好。过滤并添加水和EA，将有机层浓缩并通过柱纯化，得到呈无色油的4-3(52.00g，75.39mmol)。ESI-LCMS：m/z 690.4[M+H]⁺。

(4-4)的制备：向4-3(52.00g，75.39mmol)在DCM(200.00mL)中的溶液中添加TFA(150.00mL)。将混合物在室温搅拌1小时。将反应混合物缓慢添加到冷的NH₄OH中，用DCM萃取。将有机层浓缩并纯化，得到呈无色油的4-4(31.00g，69.28mmol)。ESI-LCMS：m/z 448.2[M+H]⁺。¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz):δppm8.02(d,J＝8.12Hz,1H),7.26-7.23(m,2H),6.87-6.84(m,2H),5.87-5.81(m,2H),5.38(t,J＝5.0Hz,1H),4.96-4.85(m,2H),4.36-4.34(m,1H),4.17-4.14(m,1H),4.00-3.97(m,1H),3.83-3.77(m,1H),3.75-3.72(m,1H),3.71(s,3H),3.70-3.68(m,1H),3.61-3.56(m,1H),3.45-3.43(m,2H),3.18(s,3H)。

(4-5)的制备：向4-4(31.00g，69.28mmol)在吡啶(200.00mL)中的溶液中添加BzCl(13.14g，93.87mmol)，将反应混合物在室温搅拌15分钟并浓缩并通过柱纯化，得到呈白色固体的4-5(35.10g，63.8mmol)。ESI-LCMS：m/z 552.2[M+H]⁺。

(4-6)的制备：向4-5(35.10g，63.8mmol)在乙腈(300.00mL)和水(100.00mL)中的溶液中添加硝酸铈铵(105g，191.40mmol)，将反应混合物在室温搅拌12小时并浓缩并用EA萃取。浓缩有机层，并通过柱纯化，得到呈黄色固体的4-6(27.5g，63.75mmol)。ESI-LCMS：m/z 432.2[M+H]⁺。

(4-7)的制备：向4-6(27.50g，63.75mmol)在THF(500.00mL)中的溶液中添加Pd/C(3.00g)，将反应混合物在室温搅拌12小时，过滤并浓缩，得到呈黄色固体的4-7(25.00g，61.67mmol)。ESI-LCMS：m/z 406.2[M+H]⁺。

(4-8)的制备：向4-7(25.00g，61.67mmol)在DCM(300.00mL)中的溶液中添加MMTrCl(28.49g，92.51mmol)和可力丁(14.95g，123.34mmol)，然后添加AgNO₃(15.7g，92.5mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，过滤，并将有机层用水洗涤，经Na₂SO₄干燥，并通过硅胶柱纯化，得到呈黄色固体的4-8(33.00g，48.69mmol)。

(4-9)的制备：向4-8(14.50g，21.39mmol)的溶液中添加1N NaOH在甲醇(200mL)(在水(20mL)中)中的溶液，将反应混合物在室温搅拌1小时并浓缩并用DCM萃取，将有机层浓缩并通过硅胶柱纯化，得到呈白色固体的4-9(11.50g，20.05mmol)。¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz):δppm11.26(s,1H),7.95(d,J＝8.4Hz,1H),7.47-7.44(m,4H),7.34-7.17(m,8H),6.82(d,J＝8.8Hz,2H),5.50-5.48(m,2H),5.13(t,J＝3.6Hz,1H),4.05-3.98(m,3H),3.78(s,3H),3.52-3.49(m,1H),3.34-3.32(m,2H),3.14(s,3H),3.08-3.04(m,1H),2.89-2.86(m,1H),2.70(d,J＝10.0Hz,1H),1.51(d,J＝4.4Hz,1H)。

(4-10)的制备：向4-9(11.50g，20.05mmol)在DCM(100.00mL)中的溶液中添加DMAP(489.85mg，4.01mmol)和DIPEA(10.36g，80.19mmol，14.01mL)。然后将CEPCl(5.70g，24.06mmol)加入溶液中。将混合物在室温搅拌30分钟。用饱和NaHCO₃淬灭反应。将有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，浓缩，得到粗产物。将粗产物通过快速制备型HPLC纯化。将产物溶于无水甲苯中并浓缩三次。然后将产物溶解于无水乙腈中并浓缩三次。得到13g呈白色固体的4-10。MS m/z[M-H]^-(ESI):772.3；¹H-NMR(CDCl₃,400MHz):9.01(s,1H),8.07-7.61(m,1H),7.53-7.41(m,6H),7.29-7.15(m,5H),6.79-6.76(m,2H),5.63-5.57(m,2H),4.27-4.15(m,2H),4.06-3.95(m,1H),3.85-3.77(m,1H),3.75(s,3H),3.69-3.35(m,7H),3.23(d,J＝4Hz,1H),2.26-2.91(m,3H),2.59(t,J＝6.4Hz,1H),1.75-1.39(m,1H),1.21-1.11(m,12H)。³¹PNMR(162MHz,CDCl₃):149.10,148.26。

实例5

2’-O-甲氧基乙氧基-NH-苯甲酰基-胞嘧啶亚磷酰胺化合物5-4是通过以下得到：将尿苷中间体4-8转化为3’-氨基胞嘧啶核苷类似物5-1，然后使用已知方法进行磷酸化以给出所需的2’-O-甲氧基乙氧基胞苷亚磷酰胺单体5-4，如下流程3所示。

方案3

(5-1)的制备：向4-8(18.50g，27.30mmol)在乙腈(250.00mL)中的溶液中添加TPSCl(16.49g，54.60mmol)和DMAP(6.67g，54.60mmol)，然后向溶液中添加TEA(5.52g，54.60mmol，7.56mL)。将反应混合物在室温下在N₂下搅拌5小时。将NH₄OH(50.00mL)添加到反应混合物中。将混合物在室温搅拌12小时。将溶液浓缩并用EA萃取。将有机层用盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。浓缩有机层，并通过硅胶柱纯化，得到呈黄色固体的5-1(16.00g，23.64mmol)。

(5-2)的制备：在0℃下，向5-1(16.00g，23.64mmol)在吡啶(100.00mL)中的溶液中添加BzCl(4.96g，35.46mmol)。将混合物在室温搅拌1小时。将溶液浓缩并通过硅胶柱纯化，得到呈白色固体的5-2(17.40g，22.28mmol)。

(5-3)的制备：在0℃下，将化合物5-2(17.40g，22.28mmol)添加至180mL的1N NaOH在吡啶/MeOH/H₂O(65/30/5)中的溶液中。将悬浮液在0℃下搅拌15分钟。通过添加饱和NH₄Cl溶液来淬灭反应混合物。用EA萃取溶液，并将合并的有机层用饱和NaHCO₃溶液、盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱纯化，得到呈白色固体的5-3(12.50g，18.47mmol)。1H-NMR(DMSO-d₆,400MHz):δppm12.25(s,1H),8.53(d,J＝7.6Hz,1H),8.01(d,J＝5.2Hz,2H),7.64-7.60(m,1H),7.52-7.42(m,6H),7.31(d,J＝8.8Hz,2H),7.26-7.14(m,7H),6.79(d,J＝8.8Hz,2H),5.55(s,1H),5.23(t,J＝3.6Hz,1H),4.09-3.97(m,3H),3.73(s,3H),3.70-3.66(m,1H),3.38-3.34(m,2H),3.17(s,3H),3.11-3.05(m,1H),2.96-2.91(m,1H),2.68(d,J＝10.8Hz,1H),1.49(d,J＝4Hz,1H)。

(5-4)的制备：向5-3(12.50g，18.47mmol)在DCM(100.00mL)中的溶液中添加DMAP(451.30mg，3.69mmol)和DIPEA(9.55g，73.88mmol，12.90mL)，然后添加CEPCl(5.25g，22.16mmol)。将混合物在室温搅拌30分钟。用饱和NaHCO₃淬灭反应。将有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，浓缩，得到粗产物。通过快速制备型HPLC分析粗产物。将产物溶于无水甲苯中并浓缩三次。然后将产物溶解于无水乙腈中并浓缩三次。得到13g呈白色固体的5-4。MS m/z[M-H]^-(ESI):875.4。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δppm8.64-8.20(m,2H),7.90-7.88(m,2H),7.62-7.58(m,1H),7.53-7.39(m,8H),7.25-7.15(m,6H),6.78-6.74(m,2H),5.69(d,J＝1.72Hz,1H),4.37-4.21(m,2H),4.10-4.03(m,1H),3.90-3.79(m,2H),3.75(d,J＝1.64Hz,3H),3.68-3.52(m,3H),3.46-3.42(m,2H),3.26(d,J＝1.2Hz,3H),3.17-2.97(m,2H),2.94-2.87(m,1H),2.67-2.48(m,2H),1.79-1.51(m,1H),1.26-1.18(m,12H)。³¹PNMR(162MHz,CDCl₃):148.93,148.03

实例6

如以下方案6中所示，完成了2’-O-甲氧基乙基腺苷类似物6-10的合成。在碱性条件(NH₃/MeOH)下的中间体6-2生成二醇6-3，然后使用TBDPSCl保护5’-羟基，得到6-4中间体6-4。然后，使用2-溴乙基甲基醚/NaH/DMF将6-4进行2’-O烷基化，得到2’-O-甲氧基乙基衍生物6-5(在没有保护6-4的C-6-环外胺的情况下)。以本发明的方式实现了中间体6-4的2’-OH基团的选择性烷基化。

方案4

中间体6-5的3’-叠氮基还原为胺6-7，然后立即对其进行保护，例如与4-单甲氧基三苯甲基氯反应，在使用TBAF/THF对5’-OTBDPS基团脱保护后得到前体6-8。使用已知方法进行6-9的磷酸化作用，得到所需的2’-O-甲氧基乙氧基腺嘌呤-NH-苯甲酰基亚磷酰胺单体6-10。

(6-2)的制备：向化合物1(79.50g，210.68mmol)在干ACN(1.20L)中的溶液中添加N-(5H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(100.80g，421.36mmol)和BSA(180.07g，884.86mmol)。将所得悬浮液在50℃下搅拌直至澄清。然后将混合物冷却至-20℃，并通过注射器添加TMSOTf(93.54g，421.36mmol)。然后将混合物在N₂下于70℃搅拌72小时，并用饱和NaHCO₃淬灭，并用DCM萃取。将有机层经Na₂SO₄干燥，然后蒸发溶剂，并将残余物在硅胶上纯化，得到呈黄色固体的化合物6-2(107.50g，192.26mmol，91.26％产率)。¹H-NMR(400MHz,DMSO):δ＝11.28(s,1H),8.64(d,J＝6.4Hz,2H),8.05(d,J＝8.0Hz,2H),7.84(d,J＝8.0Hz,2H),7.66(t,J＝7.6Hz,1H),7.56(t,J＝8.0Hz,2H),7.33(d,J＝8.0Hz,2H),6.37(d,J＝3.6Hz,1H),6.17(dd,J＝6.0Hz,1H),5.09(t,J＝6.8Hz,1H),4.69-4.56(m,2H),4.40-4.38(m,1H),2.39(s,3H),2.17(s,3H)。ESI-LCMS：m/z 557.2[M+H]⁺。

(6-3)的制备：向化合物6-2(107.50g，192.26mmol)溶于在乙醇(600.00mL)中的33wt％甲胺中的溶液中，然后将混合物在20℃搅拌16小时，然后蒸发溶剂，用在石油醚(1.5L)中的50％EtOAc洗涤，过滤，得到呈浅黄色固体的化合物6-3(52.50g，179.64mmol，93.44％产率)。ESI-LCMS：m/z 293.1[M+H]⁺。

(6-4)的制备：将化合物6-3(52.50g，179.64mmol)、咪唑(18.32g，269.46mmol)和TBDPS-Cl(54.34g，197.60mmol)在吡啶(500.00mL)中的溶液在20℃搅拌2小时，LC-MS显示6-3消耗。然后用MeOH(30mL)淬灭，浓缩，得到粗产物，将其在硅胶上纯化，得到呈白色固体的化合物6-4(72.60g，136.81mmol，76.16％产率)。

¹H-NMR(400MHz,DMSO):δ＝8.29(s,1H),8.10(s,1H),7.63-7.59(m,4H),7.48-7.33(m,8H),6.36(d,J＝5.6Hz,1H),5.97(d,J＝4.4Hz,1H),5.10-5.06(m,1H),4.47(t,J＝5.6Hz,1H),4.14-4.11(m,1H),3.94(dd,J＝11.2Hz,1H),3.83(dd,J＝11.6Hz,1H),0.99(s,9H)。ESI-LCMS：m/z 531.3[M+H]⁺。

(6-5)的制备：6-4(35.00g，65.96mmol)和1-溴-2-甲氧基乙烷(18.33g，131.91mmol)在干DMF(400.00mL)中的溶液中添加NaI(19.77g，131.91mmol)和Ag₂O(15.29g，65.96mmol)，将混合物在室温搅拌5小时。然后将反应倒入冰水中，用EA萃取，用盐水洗涤并经无水Na₂SO₄干燥。蒸发溶剂，并将残余物在硅胶上纯化，得到呈白色固体的6-5(23.70g，40.26mmol，61.04％产率)和呈白色固体的TBDPS的副产物损失5.20g，9.81mmol，14.87％产率)。

¹H-NMR(400MHz,DMSO):δ＝8.31(s,1H),8.11(s,1H),7.63-7.60(m,4H),7.47-7.44(m,2H),7.40-7.36(m,6H),6.10(d,J＝4.4Hz,1H),5.02(t,J＝4.8Hz,1H),4.69(t,J＝5.6Hz,1H),4.18-4.14(m,1H),3.95(dd,J＝11.6Hz,1H),3.84(dd,J＝11.6Hz,1H),3.78-3.75(m,2H),3.45(t,J＝4.8Hz,1H),3.16(s,3H),0.99(s,9H)。ESI-LCMS：m/z 589.5[M+H]⁺。

(6-6)的制备：在0℃下，向6-5(31.23g，53.04mmol)在吡啶(300.00mL)中的溶液中滴加BzCl(11.22g，79.56mmol)。将混合物在室温搅拌2小时。然后将溶液冷却至0℃，并且添加氢氧化铵(20mL，30％)，并且将混合物温热至室温，然后蒸发溶剂，添加300mL H₂O和600mL EA以分离溶液，将水相用EA萃取，将有机相合并，用盐水洗涤，经无水Na₂SO₄干燥，除去溶剂，并将残余物在硅胶上纯化，得到呈白色固体的6-6(28.70g，41.42mmol，78.09％产率)。ESI-LCMS：m/z 693.4[M+H]⁺。

(6-7)的制备：在H₂下，向6-6(28.70g，41.42mmol)在EA(150.00mL)中的溶液中添加Pd/C(3.00g)和MeOH(150.00mL)。将混合物在室温搅拌5小时。然后将反应过滤并将滤液浓缩以得到呈灰色固体的6-7(25.49g，38.22mmol，92.27％产率)。ESI-LCMS：m/z 667.3[M+H]⁺。

(6-8)的制备：向6-7(25.49g，38.22mmol)和AgNO₃(12.98g，76.44mmol)在DCM(300.00mL)中的溶液中添加可力丁(13.89g，114.66mmol)和MMTrCl(19.43g，57.33mmol)，将混合物在室温下搅拌2小时。然后将反应倒入冰水中，将有机层用DCM萃取，用盐水洗涤并经无水Na₂SO₄干燥，除去溶剂，并将残余物在硅胶上纯化，得到呈灰色固体的6-8(32.79g，34.92mmol，91.36％产率)。

(6-9)的制备：向6-8(32.79g，34.92mmol)在THF(300.00mL)中的溶液中添加TBAF(1M，35.00mL)，将混合物在室温搅拌15小时。然后除去溶剂，并将残余物在硅胶上用EA纯化，得到呈白色固体的6-9(22.22g，31.71mmol，90.82％产率)。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝8.68(s,1H),8.32(s,1H),8.04(d,J＝7.2Hz,2H),7.61-7.57(m,1H),7.53-7.48(m,6H),7.40(d,J＝8.8Hz,2H),7.21-7.12(m,6H),6.73(d,J＝8.8Hz,2H),6.09(d,J＝2.4Hz,2H),4.08-4.02(m,2H),3.93-3.87(m,1H),3.72(s,3H),3.58-3.53(m,1H),3.43-3.39(m,3H),3.24-3.19(m,4H),2.19(br,1H)。

(6-10)的制备：在Ar下向6-9(14.00g，19.98mmol)、DMAP(488.19mg，4.00mmol)和DIPEA(6.46g，49.95mmol，8.73mL)在干DCM(100.00mL)中的溶液中滴加CEPCl(5.68g，23.98mmol)。将混合物在室温搅拌1小时。然后将反应用10％NaHCO₃(水溶液)和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，除去溶剂，并将残余物用与PE/EA混合物通过c.c纯化，然后浓缩，得到粗产物。通过快速制备型HPLC纯化粗产物(10g，溶于10mL ACN中)，得到呈白色固体的6-10(12.60g，13.98mmol，69.99％产率)。然后将产物溶于无水甲苯(15mL)中并浓缩三次，并用干ACN浓缩三次。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝9.12(d,J＝46.8Hz,1H),δ＝8.71(d,J＝11.6Hz,1H),8.50(s,0.6H),8.22(s,0.4H),8.04(t,J＝7.2Hz,2H),7.63-7.59(m,1H),7.55-7.46(m,6H),7.40-7.37(m,2H),7.19-7.06(m,6H),6.69(dd,J＝8.8Hz,2H),6.03(d,J＝3.2Hz,1H),4.36-4.24(m,2H),3.92-3.78(m,2H),3.71(d,J＝11.6Hz,3H),3.67-3.33(m,7H),3.29(d,J＝11.2Hz,3H),3.17-3.10(m,1H),2.88(dd,J＝27.2Hz,1H),2.65-2.50(m,2H),2.38(d,J＝4.4Hz,0.4H),1.80(d,J＝4.0Hz,0.6H),1.23-1.15(m,12H)。³¹PNMR(400MHz,CDCl₃):148.86,148.22。ESI-LCMS：m/z 901.3[M+H]⁺。

实例7

在方案5中所示的化学转化之后，制备了适当保护的2’-O-乙基-3’-氨基-5’-亚磷酰胺(实施9、10、11、12)。

首先对于合成基于胸腺嘧啶的3’-NH-MMtr-2’-O-乙基亚磷酰胺实例9，在二甲基氨基吡啶的存在下，将中间体2进行保护(如丙酸乙酯)(方案8)，得到N-3保护的中间体8-4以在较高产率下促进2’-O-烷基化。8-4进一步脱乙酰基化，得到C-2’-羟基中间体8-5。

方案5

使用碘乙烷的进一步烷基化得到2’O-乙基核苷8-6。通过遵循之前方案4中所示的化合物4-10的类似化学方法，将中间体8-6转化为胸腺嘧啶碱基2’-O-乙基-3’-氨基-5’-亚磷酰胺8-11。

(8-4)的制备：向8-2(22.0g，49.62mmol)在MeCN(400mL)中的溶液中添加DMAP(1.2g，9.92mmol)。然后添加3(5.8g，419.5mmol)，将混合物在室温在N₂下搅拌2小时，TLC显示8-2消耗。浓缩并通过硅胶柱通过(PE:EA＝6:1)纯化，得到呈黄色油的8-4(22.0g，40.63mmol，81.9％产率)。ESI-LCMS：m/z 564[M+Na]⁺。

(8-5)的制备：在0℃下向8-4(28.0g，51.71mmol)在MeOH(400mL)中的溶液中添加浓NH₄OH水溶液(28mL)。将反应混合物在0℃下搅拌1.5小时，TLC显示8-4消耗。浓缩并通过硅胶柱通过(PE:EA＝10:1至2:1)纯化，得到呈黄色油的8-5(21.0g，42.04mmol，81.3％产率)。ESI-LCMS：m/z 522[M+Na]⁺。

(8-6)的制备：向8-5(20.0g，40.04mmol)在碘乙烷(100mL)中的溶液中添加Ag₂O(18.6g，80.08mmol)。在LC-MS显示已完全消耗8-5后，将反应混合物在50℃下搅拌5小时，并用硅藻土过滤并浓缩，得到呈黄色油的8-6(16.0，30.33mmol，75.7％产率)，其可直接使用在下一步中。ESI-LCMS：m/z 528[M+H]⁺。

(8-7)的制备：向8-6(16.0g，30.33mmol)在MeCN(400mL)中的溶液中添加吡咯烷(8.63g，121.32mol，12mL)，将反应混合物在室温搅拌过夜，TLC显示8-6完全消耗。浓缩并通过硅胶柱通过(DCM:MeOH＝100:1至50:1)纯化，得到呈黄色油的7(12.0g，27.94mmol，92.1％产率)。ESI-LCMS：m/z 430[M+H]⁺。

(8-8)的制备：向8-7(12.0g，27.94mmol)在THF(200mL)溶液中添加Pd/C(1.2g)，将混合物在室温在H₂下搅拌过夜。LC-MS显示7完全消耗。过滤并用DCM(100mL*3)洗涤，然后浓缩，得到呈灰色固体的8-8(11.0g，27.27mmol，97.6％产率)，其直接用于下一步。ESI-LCMS：m/z 404[M+H]⁺。

(8-9)的制备：向8-8(10.0g，24.79mmol)在DCM(80mL)中的溶液中添加MMTrCl(11.4g，37.18mmol)、2,4,6-可力丁(2.0g，16.61mmol，6.5mL)和AgNO₃(6.3g，37.18mmol)，将混合物在室温搅拌1.5小时。TLC显示8-8完全消耗。过滤，并且将有机层用水洗涤，经Na₂SO₄干燥，然后浓缩，并通过硅胶柱通过(PE:EA＝5:1至1:1)纯化，得到呈浅黄色固体的8-9(16.0g，23.68mmol，95.5％产率)。

(8-10)的制备：将8-9(4.0g，5.92mmol)添加到1.0N NaOH溶液的溶液(20mL，MeOH/H₂O＝9:1)中。将反应混合物在40℃搅拌2小时，TLC显示8-9消耗，浓缩并用DCM(20mL*2)萃取，将有机层经Na₂SO₄干燥并浓缩，将残余物通过硅胶通过(DCM:MeOH＝200:1至50:1)纯化，得到呈白色固体的8-10(3.0g，53.8mmol，90.9产率)。

(8-11)的制备：向8-10(2.36g，4.23mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液中添加DMAP(103mg，0.8mmol)和DIPEA(2.2g，16.92mmol，2.96mL)。然后添加CEPCl(1.0g，4.23mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时。TLC显示8-10消耗，用饱和NaHCO₃(5mL)洗涤，分离有机层，并用DCM(10mL*2)洗涤水层。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，浓缩，并通过快速制备型HPLC纯化，得到呈白色固体的8-11(2.45g，3.23mmol，76.36％产率)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.62(s,1H),7.74(dd,J＝1.4Hz,0.5H),7.60-7.50(m,4H),7.51-7.41(m,2H),7.34-7.16(m,7H),7.12(d,J＝1.4Hz,0.5H),6.88-6.76(m,2H),5.66(s,1H),4.37-4.23(m,1H),4.16-4.05(m,1H),4.05-3.94(m,0.5H),3.88-3.74(m,4.5H),3.72-3.35(m,3H),3.22(td,J＝10.3,4.7Hz,0.5H),3.03-2.89(m,1.5H),2.80-2.69(m,1H),2.61(t,J＝6.5Hz,1H),2.37(td,J＝6.6,1.3Hz,1H),1.97(d,J＝3.5Hz,0.5H),1.91(dd,J＝11.4,1.2Hz,3H),1.52(d,J＝4.7Hz,0.5H),1.29-1.17(m,12H),1.08(td,J＝7.0,4.9Hz,3H)。³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ149.31,147.14。ESI-LCMS：m/z 576[M+H]⁺。

粗寡聚体的定量或原始分析

将样品溶解在去离子水(1.0mL)中，并按以下进行定量：首先仅用水(1.0mL)进行空白化，将20ul样品和980μL水在微量离心管中充分混合，转移至比色杯中，并且在260nm获得吸光度读取。将粗物质干燥并储存在-20℃中。

粗HPLC/LC-MS分析

将0.1OD的粗样品提交进行粗MS分析。在确认了粗LC-MS数据之后，然后进行纯化步骤。

HPLC纯化

具有和不具有缀合物的、氨基磷酸酯(NP)和硫代氨基磷酸酯(NPS)修饰的寡核苷酸通过阴离子交换HPLC纯化。缓冲液是在10％CH₃CN，pH8.5中的20mM磷酸钠(缓冲液A)和在10％CH₃CN，1.8MNaBr，pH8.5中的20mM磷酸钠(缓冲液B)。合并含有全长寡核苷酸的级分，脱盐并冻干。

纯化的寡聚体脱盐

然后使用Sephadex G-25 M(阿曼莎生物科学公司(Amersham Biosciences))将纯化的干燥寡聚体脱盐。柱体用10mL去离子水调理三次。然后将纯化的寡聚体完全溶于2.5mL无RNA酶的水中，然后以非常缓慢的逐滴洗脱方式应用于柱体。将无盐寡聚体用3.5ml去离子水直接洗脱到旋盖小瓶中。

体外测定

合成了靶向人MAPT外显子5的反义寡核苷酸(ASO)。合成了具有硫代磷酸酯键联化学和2’-甲氧基乙基(2’MOE)保护基(所述保护基位于分子任一末端的5个核苷酸长的翼中)的ASO，并使用P5’-N3’氨基磷酸酯键联ASO化学(而不是硫代磷酸酯化学)合成了具有靶向MAPT外显子5的相同序列的ASO。在用硫代磷酸酯(OPS)或氨基磷酸酯(NPS)化学(但翼中具有相同的2’MOE保护基)处理后，在从人诱导多能干细胞(iPSC)分化的人神经元中评估了MAPT mRNA水平，以确定这些ASO是否和在多大程度上有效降低了tau mRNA和蛋白水平，以及它们在AD转基因小鼠模型中对tau病理的影响(DeVos等人,Sci Transl Med[科学转化医学],2017)。

iPSC生成和分化为皮质神经元。

亲本iPSC系(西格玛公司目录号iPSC0028)是通过使用逆转录病毒载体，用四种Yamanaka因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)对来自24岁女性供体的上皮细胞进行重新编程而产生的。将人iPSC在免饲养情况下培养，每天添加新鲜的mTeSR培养基(干细胞技术公司(Stem Cell Technologies))。细胞在融合时与EDTA(吉布科公司(Gibco))一起传代，并使用经典的双重SMAD抑制方案进行分化为神经祖细胞(NPC)和皮质神经元。该方案主要生成表达TBR1(约20％)和CTIP2(约80％)的谷氨酸能层V皮质神经元。简而言之，将iPSC解离为单细胞悬浮液，并通过随后用SB431542和Dorsomorphin(神经诱导培养基，见表1)处理12天来触发神经元诱导。

表1.N2B27培养基(组成)

诱导后，将神经元祖细胞(NPC)用分散酶处理，然后亚铺板再扩增三次(大约在第17、20和25天)。在第25天到第30天之间，在神经元祖细胞冷冻培养基(参见表2)中制备NPC冷冻储备物，并保存在液氮中以备后续实验。将NPC在NPC重构培养基中解冻(参见表3)，并在三天内保持培养，然后进行最终亚铺板进行ASO处理。

表2.神经诱导培养基(组成)

表3.神经元重构培养基(组成)

将NPC以15,000个细胞/孔的密度接种在N2B27培养基(见表3)的被聚鸟氨酸/层粘连蛋白(西格玛公司)包被的96孔板中。

为了阻断增殖，在亚铺板后第7天和第11天，用10μM N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT，西格玛公司)对细胞进行两次处理。解冻后14天，将N2B27培养基替换为最终分化培养基(参见表4)，所述培养基每周更换2-3次(50％)，直到进行ASO处理的第15或25天为止。

表4.最终神经元分化培养基(组成)

靶向MAPT mRNA的反义寡核苷酸(ASO)处理。

如本领域中已知的，ASO被合成为全硫代磷酸酯(OPS)。根据本公开进行了硫代氨基磷酸酯(NPS)ASO的合成。NPS ASO包含在ASO任一末端的5个核苷酸中由NPS连接的核苷，以及具有OPS连接的核苷酸的有10个核苷酸长的中心缺口。对于OPS和NPS ASO，ASO任一侧的5个核苷酸长的侧翼包含2’甲氧基乙基(MOE)保护基。ASO在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(西格玛公司)中重构，并且其最终浓度通过比尔-朗伯(Beer-Lambert)定律通过测量其在260nm处的吸光度来确定。具有以下序列的20个核苷酸长的MAPT ASO：GCTTTTACTGACCATGCGAG(SEQ ID NO:1)被修饰具有2’MOE取代和硫代磷酸酯(OPS)键联(OPS修饰的对照SEQ ID NO:1)和被修饰具有2’MOE取代和硫代氨基磷酸酯(NPS)键联(NPS修饰的SEQ ID NO:1)。具有以下序列的非靶向加扰ASO被用作阴性对照：CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC(非MAPT对照)。可以通过以指定的剂量和指定的时间段自由递送ASO来处理人iPSC衍生的皮质神经元。

表5

RNA分离和实时定量PCR。

根据制造商的说明，使用试剂盒(凯杰公司(Qiagen))分离RNA。简而言之，我们通过添加150μL RLT缓冲液并在定轨振荡器上振荡30分钟然后添加等体积的70％(v/v)乙醇来裂解细胞。随后将混合物转移至柱中，并通过使用西格玛4-18K离心机在室温下以5,600xg离心4分钟将RNA结合到滤膜上。用RW1缓冲液(700μl，4分钟)、RPE缓冲液(700μl，4分钟)和第二RPE缓冲液步骤(700μl，10分钟)进行的连续洗涤步骤均在室温下以5,600x g完成。使用60μl无核酸酶的水通过在室温下以5,600x g离心4分钟来洗脱RNA。使用ND-8000(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))通过光谱法确定RNA浓度。根据制造商的说明，使用高容量cDNA反转录试剂盒(赛默飞世尔公司)以20μl的最终反应体积反转录等量的RNA。在25℃下孵育10分钟后，在37℃下2小时内发生逆转录，然后在85℃下5分钟使酶失活。为了量化总的MAPT mRNA水平，将cDNA以1:10稀释，并与2X Power SYBR^TM Green Plus预混液(赛默飞世尔公司)和DNA引物混合至最终反应体积为10μl。以下引物用于检测最终浓度为500nM的总MAPT mRNA(表6)。

表6

测定_id	正向	反向
			MAPT_B01	CCTCCAAGTGTGGCTCATTA	CAATCTTCGACTGGACTCTG
MAPT_B02	CAGTGGTCCGTACTCCA	TGGACTTGACATTCTTCAGG
			MAPT_B04	ATTGAAACCCACAAGCTGAC	GAGGAGACATTGCTGAGATG
MAPT_B06	TCAGGTGAACTTTGAACCAG	CTTCCATCACTTCGAACTCC
			MAPT_JPNV-1	CCAAGTGTGGCTCATTAGGCA	CCAATCTTCGACTGGACTCTGT
MAPT_JPNV-2	GAGTCCAGTCGAAGATTGGGT	GGCGAGTCTACCATGTCGATG
			3R MAPT	AGGCGGGAAGGTGCAAATA	GCCACCTCCTGGTTTATGATG
4R MAPT	CGGGAAGGTGCAGATAATTAA	TATTTGCACACTGCCGCCT

还进行了使用DNA引物扩增8个不同管家基因的测定(参见表8)。所有DNA引物均购自整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)。使用标准循环参数，在HT7900热循环仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems))上进行RT-qPCR反应。使用解链曲线分析确认了DNA引物的特异性。GeNorm分析用于使用qBase+(拜盖泽公司(Biogazelle))确定最稳定的管家基因。将所有数据标准化为最稳定管家基因的几何平均值，并校准为对照条件。

免疫测定。

在室温(RT)在定轨振荡器中，使用40μL/孔RIPA缓冲液(西格玛公司)(含有磷酸酶抑制剂(PhosSTOP^TM，罗氏公司)和蛋白酶抑制剂(cOmplete^TM，罗氏公司))，在96孔培养板中于30-60分钟内裂解细胞。HT7(赛默飞世尔公司)和hTAU10抗体(詹森公司(Janssen))的组合用于使用技术(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))的总tau定量。每次使用5μl1:3稀释的裂解液一式三份进行测量。将每个样品转移到384孔测定板中进行反应，其中5μl细胞提取物与生物素化抗体和受体珠的混合物在室温下孵育2小时(参见表7)。

表7.

测定中使用的抗体和珠的浓度(最终浓度)

组分	最终浓度
		生物素化Ab(HT7)	1.2nM
受体珠(hTAU10)	10μg/ml
		供体珠	30μg/ml

随后，将供体珠添加至孔中，并在室温下孵育30分钟，然后在EnVision读板仪(珀金埃尔默公司)上于615nm(在680nm照射后)读取。

总蛋白定量。

使用二辛可宁酸试剂盒(Bicinchoninic Acid Kit)(西格玛公司)进行总蛋白定量。为了评估NPS化学相对于OPS化学的优越性，使用各种浓度的MAPT ASO处理了人iPSC衍生的皮质神经元。在分化过程开始后的第25天，将MAPT ASO直接添加到培养基中，最终浓度为1.25μM至10.0μM。具有相同化学的等摩尔浓度的非靶向对照ASO用作阴性对照。5天后，通过RT-qPCR测定相对总MAPT mRNA水平(表8)。

表8.管家基因的DNA引物

两种阴性对照ASO均不影响总MAPT mRNA水平(表9)。

表9.ASO处理后的相对总MAPT mRNA水平。

NPS ASO对总MAPT mRNA水平的降低是OPS ASO的量的2x，如表8所示。

为了评估NPS MAPT ASO是否比OPS MAPT ASO更有效地降低tau蛋白水平，从分化开始后第15天开始处理人iPSC衍生的皮质神经元，并且每5天添加一次ASO，总共15天。这种治疗方法是必要的，因为考虑到tau蛋白具有稳定微管的功能，特别是具有长轴突的神经元，认为tau蛋白的半衰期很长。在延长的ASO处理时间之后，裂解细胞，并使用基于珠的免疫测定法评估tau蛋白水平(表10)。

表10.ASO处理后通过确定的相对总tau蛋白水平。

阴性对照ASO不影响tau蛋白水平。但是，如表9所示，MAPT NPS ASO剂量依赖性降低的tau蛋白水平比MAPT OPS ASO多2倍。

从这些实例中，与具有相同序列但采用OPS化学的ASO相比，使用NPS化学的MAPTASO被确定在降低人iPSC衍生的神经元中的总MAPT mRNA和tau蛋白水平方面出人意料地优越。

IEX HPLC和电喷雾LC/MS分析

复合的寡核苷酸的稳定性测试

将约0.10OD的寡聚体溶于水，并且然后将其吸移到专用小瓶中，以进行IEX-HPLC和LC/MS分析。分析性HPLC和ESLC-MS确定了寡核苷酸的完整性。

在实施例中，与具有相同序列的未修饰的寡核苷酸相比，公开的寡核苷酸显示出对靶核酸序列的增加的亲和力。例如，在一些序列中，公开的寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列以比具有相同序列的未修饰的寡核苷酸更高的亲和力与靶核酸序列互补并杂交。在实施例中，与互补靶核酸序列复合/杂交的公开的寡核苷酸具有>37℃的解链温度T_m。所述双链体/复合物可以在生理条件或接近生理条件的条件下(例如在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)形成。在实施例中，双链体/复合物的Tm是>50℃。在实施例中，双链体/复合物的Tm是50℃-100℃。在实施例中，在生理条件或接近生理条件下与靶核酸序列双链化的公开的寡核苷酸的T_m是>50℃。

使用双链体的热解离数据评估了与靶RNA序列结合的公开的寡核苷酸的双链体稳定性。通过使用连接到Shimadzu温度控制器和Julabo F12-ED恒温浴的Shimadzu UV2600光谱仪测量双链体在260nm处的温度依赖性UV吸光度，进行热解离研究。以等摩尔比混合所公开的寡核苷酸和靶核酸序列，以得到2μM的最终双链体浓度。所有样品均在1xPBS缓冲液条件下(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄、1.8mM KH₂PO₄，pH7.2)制备。记录260nm处的UV-Vis吸光度，并使用380nm处的吸光度进行校正(UV池路径长度＝1cm)。加热(20℃-95℃)和冷却(95℃-20℃)运行均以1℃/min的速率(间隔为1℃)记录。使用LabSolutions T_m分析软件，通过获取加热S形曲线的一阶导数来确定T_m值。最终的T_m是三个独立试验的平均值，误差代表标准偏差。如表11中所述，NPS修饰的SEQ ID NO：1具有约+0.8℃ Tm/3’-NH。

表11

TAU GAPmer的验证

为了评估TAU GAPmer的功效，对人神经元细胞系(KELLY细胞)进行了处理，其中不同浓度范围为80nM至20μM。先导GAPmer的两个版本：评估了2’-O-甲基(2’OMe)和2’-O-甲氧基乙基(2’MOE)。这些GAPmer的形式为5-10-5，这意味着前5个核苷酸和后5个核苷酸包括NPS和2’化学，而中间的10个核苷酸是具有OPS化学的“缺口”。处理开始三天后，收集总RNA并使用6种不同的测定通过RT-qPCR评估总Tau mRNA水平(参见表6)。通过RT-qPCR在处理的细胞中评估3R和4R Tau mRNA的表达(参见表6)。

表12

所有GAPmer均以剂量依赖性方式显示总3R和4R Tau mRNA的剂量依赖性降低。与其他GAPmer相比，靶向Tau mRNA外显子10的GAPmer C和D在降低4R Tau mRNA水平方面更有效。

为了确认这些GAPmer也降低了人神经元中Tau mRNA的水平，在人iPSC衍生的神经元中进行了相同的实验，并用相同的GAPmer处理了这些细胞72小时。与KELLY细胞相比，在iPSC衍生的神经元中对于每个GAPmer都获得了非常相似的结果。

GAPmer生物分布

另外的ASO GAPmer是用未修饰的化学以及NPS化学合成的。表13列出了这些ASO的ID、化学、序列和靶位点。这些GAPmer的形式为5-10-5，这意味着前5个核苷酸和后5个核苷酸包括所示的键和2’化学，而中间的10个核苷酸是具有OPS化学的“缺口”。为了评估NPSTAU GAPmer是否具有不同/优越的生物分布谱，GAPmer E被碘125放射性标记。遵循类似的方法用碘125放射性标记GAPmer G。

表13

经放射性标记的化合物通过鞘内弹丸式注射进入大鼠体内，并在注射后的第一小时内对动物进行4x成像，然后在注射后6小时和24小时以及7天和14天使用单光子发射计算机体层显像(SPECT/CT)进行图像采集。这项生物分布研究的结果表明，对比性GAPmer G可以更快地进入脑，但到注射后6-24小时迅速清除出脑，达到稳态水平(表14-15)。与对比性GAPmer G相比，GAPmer E更慢地进入脑，但在脑中达到更高的稳态水平(表14-15)。此外，与对比性GAPmer G相比，GAPmer E在不同的CNS区域(包括更深的脑区域和脊髓)似乎可以保留更长的时间(表14-15)。总而言之，这项研究表明，与对比性GAPmer G相比，靶向TAU的GAPmer E在啮齿类动物CNS中保留时间更长。

表14

GAPmer E

对比性GAPmer G

表15

GAPmer E

对比性GAPmer G

TAU GAPmer在人iPSC衍生的神经元中的评估

接下来，将先导GAPmer之一(GAPmerE)在减少人iPSC衍生的神经元(iNeuron)中的TAU mRNA方面的功效与Ionis TAU GAPmer(GAPmer G)的功效相比较。用各种剂量的两种GAPmer处理iNeuron总计72小时，并收集总细胞RNA。用6种不同的测定以及3R和4R TAU特异性测定来测量TAU mRNA(表16)。两种化合物剂量依赖性地降低了TAU mRNA水平。但是，GAPmer E始终显示出约4-5倍更小的IC₅₀值，表明所述GAPmer比GAPmer G更有效。

表16

治疗方法

通过任何合适的施用途径，例如鞘内或脑室内的施用途径来向患有tau蛋白病变(例如阿尔茨海默病(AD))的成年人施用治疗有效的本发明的化合物和寡核苷酸，例如具有对应于SEQ ID NO:1的核碱基序列并且根据本公开修饰的寡核苷酸。合适的施用途径可包括全身性施用，例如静脉内或皮下施用途径或通过鞘内或脑室内施用途径直接向CNS施用。持续治疗直到tau蛋白病变(例如AD)的一种或多种症状得到缓解或例如tau蛋白水平降低为止。