阅读说明：本技术 一种利用天然低共熔溶剂催化转化丹酚酸b的方法 (Method for catalytic conversion of salvianolic acid B by using natural eutectic solvent ) 是由 李畅 万浩芳 万海同 何新平 于 2020-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物化学领域,具体涉及一种以天然低共熔溶剂作为溶剂兼催化剂催化转化丹酚酸B生成其他丹酚酸类化合物的方法。该方法利用天然低共熔溶剂(NaDES)作为溶剂兼催化剂,将丹参中含量丰富的丹酚酸B催化转化为丹酚酸A、紫草酸、丹参素、原儿茶醛等天然丹参中含量较低的活性成分。主要步骤包括：(1)将丹参根茎粉碎,加水后超声辅助提取,大孔树脂分离纯化丹酚酸B；(2)将纯度大于90％的丹酚酸B加入到不同组成的NaDES水溶液中,加热反应催化丹酚酸B为活性成分混合物,该混合物利用柱层析分离,得到丹酚酸A、紫草酸、丹参素、原儿茶醛等活性成分。本发明方法具有操作简单、转化率高、绿色环保等优势,有望用于工业化生产。(The invention belongs to the field of pharmaceutical chemistry, and particularly relates to a method for catalytically converting salvianolic acid B into other salvianolic acid compounds by taking a natural eutectic solvent as a solvent and a catalyst. The method uses natural eutectic solvent (NaDES) as solvent and catalyst to catalytically convert salvianolic acid B rich in Saviae Miltiorrhizae radix into lower active components such as salvianolic acid A, lithospermic acid, tanshinol, protocatechualdehyde, etc. The method mainly comprises the following steps: (1) pulverizing Saviae Miltiorrhizae radix, adding water, extracting with ultrasonic wave, and separating and purifying salvianolic acid B with macroporous resin; (2) adding salvianolic acid B with purity of more than 90% into NaDES aqueous solution of different compositions, heating to react and catalyze salvianolic acid B to obtain active ingredient mixture, and separating the mixture by column chromatography to obtain salvianolic acid A, lithospermic acid, tanshinol, protocatechualdehyde, etc. The method has the advantages of simple operation, high conversion rate, environmental protection and the like, and is expected to be used for industrial production.)

一种利用天然低共熔溶剂催化转化丹酚酸B的方法

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种以天然低共熔溶剂作为溶剂和催化剂催化转化丹酚酸B生成其他丹酚酸类化合物的方法。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是一种广泛使用的中药材，对脑血管疾病、代谢紊乱、肝炎和癌症都有一定的疗效，其临床疗效已得到广泛认可。丹参的主要有效成分为丹酚酸类化合物，其中丹酚酸B含量最高。而其他丹酚酸，如丹酚酸A、紫草酸、丹参素、原儿茶醛则含量极低。已有研究表明，丹酚酸A具有抗氧化、自由基清除、神经保护、防治心血管疾病等出色的生物活性，在某些方面优于丹酚酸B。丹酚酸A无论是静脉还是口服给药都能显著改善实验动物犬的心肌缺血范围，显著抑制心肌梗塞引起的血清乳酸脱氢酶LDH，肌酸激酶CK活性升高(李磊,任建勋,林治荣,史跃,马彦雷,刘建勋.丹酚酸A不同给药途径对犬急性心肌缺血影响[J].中国中药杂志,2016,41(05):910-916.)。王海港等利用二磷酸腺苷、花生四烯酸和凝血酶诱导的血小板聚集模型发现，与阿司匹林相比,丹酚酸A不仅对血小板聚集具有全面温和的抑制作用,而且对血栓引起的脑缺血具有显著的保护作用(王海港,孔令雷,王睿,陈燕霞,杨时伦,赵晓悦,周启蒙,杜冠华.丹酚酸A与阿司匹林抗血栓作用的比较研究[J].药学学报,2019,54(02):301-307.)。王寿宝等利用大鼠心肌缺血模型发现丹酚酸A给药剂量为5、10mg/kg时比10mg/kg丹酚酸B更有效，进一步发现丹酚酸A给药剂量为2.5mg/kg时治疗效果即等同于10mg/kg丹酚酸B。(Wang S B,Tian S,Yang F,etal.Cardioprotective effect of salvianolic acid A on isoproterenol-inducedmyocardial infarction in rats.Eur J Pharm,2009,615:125)。

然而对丹参药材的化学成分研究显示：丹参主要成分为丹酚酸B，其他丹酚酸类如丹参素、原儿茶醛、紫草酸、丹酚酸A的含量极低，无法通过直接提取获得这些丹酚酸类化合物。目前已有一些技术方法试图通过化学反应使丹酚酸B转化为丹酚酸A等，例如：通过高温高压并调节溶剂的pH，可将丹酚酸B转化为其他丹酚酸类化合物，如丹酚酸B在pH值为1时生成大量丹酚酸A，pH为12时生成大量丹参素(Xia H,Sun L,Lou H,Rahman M M.Conversionof salvianolic acid B into salvianolic acid A in tissues of Radix SalviaeMiltiorrhizae using high temperature,high pressure and highhumidity.Phytomedicine,2014,21,906-911)。申请号为CN201310487751.6的中国专利公开了一种丹酚酸A的制备方法，通过向丹参药材中加入提取剂，经过加热提取后，提取液经过滤浓缩，得丹参提取液；调节丹参提取液的pH4-8，减压浓缩，将浓缩液在70-100℃下加热反应5-40h，得丹酚酸A粗品溶液；调节丹酚酸A粗品溶液pH至6-8，经过反相树脂吸附解析得到丹酚酸A纯品，该方法虽然可以得到一定量的丹酚酸A纯品，但明显存在反应时间长，需要反复调节pH值等缺点。申请号为CN201610806533.8的中国专利公布了另外一种丹酚酸A的制备方法，将丹酚酸B用pH为3.5-4.5的NaOH或NaHCO3水配制成35-45mg/mL的溶液，置于亚临界水反应釜中，加热炉达到170℃-190℃并稳定后，将反应釜放入加热炉，50min-70min后取出反应釜并放入冰水浴或冷水冲中冷却，将液体取出，冷冻干燥，得富含丹酚酸A粗品，然后利用高效逆流色谱对丹酚酸A粗品进行分离纯化，得到纯度大于98％的丹酚酸A，该方法虽然反应时间较短，但也存在明显的不足，如需要调节pH值，且需要耐高压设备，且较高的温度也加大了能源的消耗。除此之外申请号为CN201310192210.0的专利公布了利用高沸点有机溶剂如乙二醇、二甲亚砜、二甲基甲酰胺对丹参提取液进行转化，虽然实现了在常压下转化丹酚酸B，但使用大量有机溶剂使工艺成分增加且毒性大。

除了以上问题，丹酚酸B转化实验也存在反应效率低下，生成物复杂等问题，目前大量专利仅仅在调节pH值、改变反应温度、改变反应溶剂或添加剂上做出调整，但并未有深入的新的方法出现，申请号CN201210487598.2的中国专利公布了利用氯化铁、三氯化钌、氯化锌、氯化钯等作为催化剂催化转化丹酚酸B，除了上述催化剂大部分价格昂贵之外，各个催化剂之间催化效果无明显区别。虽然该方法提高了丹酚酸B转化生成丹酚酸A的效率，但丹酚酸B转化率也仅为63％左右，丹酚酸A的产率在42％左右。申请号为CN201410200983.3的专利认为，在丹酚酸A转化过程中，隔绝空气不但可以保证丹酚酸B最大限度地少被破坏，从而尽可能多地转化为丹酚酸A，而且可避免已生成的丹酚酸A被氧化破坏。因此采用氮气或氩气作为保护气在隔绝空气的条件下进行反应，最佳实验结果如下：将提取液浓缩至400mL，置于高压反应釜中，在氮气保护下135℃、0.31M原儿茶醛反应2h，中止反应。测定提取液中丹酚酸B的含量为0.95％，转化液中丹酚酸A的含量为0.47％，转化率为71.9％。虽然上述方法将转化率提升到约72％，但氮气或氩气的参与不仅使成本大大增加，而且排除空气操作繁碎，并需要昂贵的密封设备，不利于大规模工业生产。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术问题的不足，提供一种绿色、高效的利用天然低共熔溶剂作为溶剂和催化剂，以丹酚酸B为原料选择性制备其他丹酚酸类化合物的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种利用天然低共熔溶剂催化转化丹酚酸B的方法，所述方法是以天然低共熔溶剂为溶剂和催化剂，常压下将丹酚酸B催化转化为其他丹酚酸类化合物，具体方法步骤如下：

(1)提取丹酚酸B：以水为溶剂，在加热超声条件下对丹参进行提取，提取液过滤离心，取上清液减压蒸馏得膏状物，用大孔树脂分离纯化得丹酚酸B；

(2)合成天然低共熔溶剂：将氢键供体HBD与氢键受体HBA和/或去离子水以一定比例混合，加热搅拌得透明澄清溶液，即天然低共熔溶剂；

(3)催化转化丹酚酸B：将丹酚酸B加入到低共熔溶剂中，加热反应一定时间，即得丹酚酸B转化液；

(4)分离纯化：将步骤(3)的丹酚酸B转化液进行柱层析分离纯化得到纯化度达95％的丹酚酸类化合物。

优选的，所述步骤(1)中提取丹酚酸B的具体操作为：丹参粉末加水，在50℃超声提取2小时后，纱布过滤得提取液，提取液于7000G离心10min，收集上清液，残渣继续加水重复超声，提取3次后合并上清液并于50℃浓缩得膏状物，膏状物经AB-8大孔树脂进行柱层析分离纯化，洗脱剂为水和75％乙醇，收集75％乙醇洗脱液于50℃旋干，得丹酚酸B。

优选的，所述步骤(2)中氢键供体包括：甘油(Gly)、乳酸(Lac)、尿素(Ur)；氢键受体包括：氯化胆碱(ChCl)、甜菜碱(Bet)、L-脯氨酸(L-Pro)。

优选的，所述步骤(2)中氢键供体和氢键受体的摩尔比为1:1-2。

优选的，所述步骤(2)中氢键供体、氢键受体和去离子水的摩尔比为1:1-2:1-5。

优选的，所述步骤(2)中加热温度为80-100℃，搅拌时间为0.5-2h；更优选的温度为80℃，时间为1h。

优选的，所述步骤(3)中低共熔溶剂的体积分数为75％-100％。

优选的，所述步骤(3)中丹酚酸B的投料量是2mg/mL低共熔溶剂。

优选的，所述步骤(3)中反应温度为80-140℃，反应时间为2-48h。

优选的，所述步骤(4)中的分离纯化具体步骤为：用乙酸乙酯萃取丹酚酸B转化液后，旋蒸有机相，柱层析分离纯化产物，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯、甲醇。

优选的，所述丹酚酸类化合物为丹酚酸A、紫草酸、丹参素、原儿茶醛，所述丹酚酸B转化为各物质的反应条件为：

a.丹酚酸B转化为丹酚酸A的反应条件：体积分数75％的甜菜碱(Bet)-乳酸(Lac)-去离子水(摩尔比1:1:1)为低共熔溶剂，120℃下反应6h，得丹酚酸B转化率为89.8％，丹酚酸A生成率为72.4％；

b.丹酚酸B转化为紫草酸的反应条件：体积分数75％的甜菜碱(Bet)-乳酸(Lac)-去离子水(摩尔比1:1:1)为低共熔溶剂，80℃下反应36h，得丹酚酸B转化率为67.6％，紫草酸生成率为31.9％；

c.丹酚酸B转化为丹参素、原儿茶醛的反应条件：体积分数75％的甜菜碱(Bet)-尿素(Ur)-去离子水(摩尔比1:1:2)为低共熔溶剂，140℃下反应2h，丹酚酸B被完全转化，丹参素和原儿茶醛的收率分别为0.77和0.56mol/mol SAB(以相对丹酚酸B的物质的量计)。

本发明所述的一种利用天然低共熔溶剂催化转化丹酚酸B的方法，可通过选用不同的天然低共熔溶剂来实现丹酚酸B转化的选择性：

(1)以75％甜菜碱(Bet)-乳酸(Lac)为低共熔溶剂，在120℃下反应6h，丹酚酸B转化率为89.8％，丹酚酸A生成率为72.4％；

(2)以75％甜菜碱(Bet)-乳酸(Lac)为低共熔溶剂，在80℃下反应48h，丹酚酸B转化率为71.4％，生成紫草酸(产率29.0％)和丹酚酸A(产率31.9％)；

(3)以75％甜菜碱(Bet)-尿素(Ur)为低共熔溶剂，在140℃下反应2h，丹酚酸B全部转化，生成大量丹参素(0.77mol/mol SAB)和原儿茶醛(0.56mol/mol SAB)。

本发明与现有技术相比，其有益效果主要体现在：本发明提供一种高效、绿色、简单的利用低共熔溶剂将丹酚酸B转化为丹酚酸A、紫草酸、丹参素、原儿茶醛等丹参中含量较低的活性成分的方法，所述方法通过引入天然低共熔溶剂(Natural Deep EutecticSolvent,NaDES)作为溶剂和催化剂，选择性制备多种天然含量较低的丹酚酸类化合物，其中丹酚酸B转化率达到89.8％-100％，丹酚酸A生成率也高达72.44％。与之前报道的方法相比，本方法在常压下即可进行，无需反复调节pH值，且不会存在有机溶剂易燃易爆的缺点，不仅转化效率高，且随着天然低共熔溶剂种类的不同产物也不同，具有绿色、高效、操作简单、安全等优点，十分适合工业化生产。本实验将天然低共熔溶剂引入中药成分制备中，为中药成分反应制备提供新的研发思路。

附图说明

图1是提取纯化丹酚酸B的高效液相色谱图；

图2是甜菜碱-乳酸催化转化丹酚酸B生成丹酚酸A的高效液相色谱图(4mg丹酚酸B/2mL 75％DES-1、120℃、2h)；

图3是甜菜碱-乳酸催化转化丹酚酸B生成紫草酸、丹酚酸A的高效液相色谱图(4mg丹酚酸B/2mL 75％DES-1、80℃、36h)；

图4是甜菜碱-尿素催化转化丹酚酸B生成丹参素、原儿茶醛的高效液相色谱图(4mg丹酚酸B/2mL 75％DES-2、120℃、2h)；

图5是水加热转化丹酚酸B的对照高效液相色谱图(120℃、2h)。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图对本发明的技术方案作进一步的具体说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，但需要注意的是，本发明的保护范围不限于此。

实施例1甜菜碱-乳酸为溶剂和催化剂催化转化丹酚酸B生成丹酚酸A

将250g丹参(产地云南)粉末倒入2L烧杯中，加入1L去离子水，50℃超声提取2小时后，用纱布过滤，得提取液，提取液于7000G离心10min，收集上清液，向提取残渣再加入1L去离子水，同上，提取3次，合并提取液，上清液于50℃下浓缩，得油状膏状物。准备层析柱(3cm×30cm)，用甲醇浸泡过的AB-8大孔树脂装柱(3cm×30cm)，用大量去离子水冲洗至无甲醇味且澄清，然后将浓缩后的膏状物小心上样，直至整个AB-8大孔树脂柱体全部覆盖油状膏状物(约20mL)，过夜，洗脱程序如下：用2L去离子水冲柱，直至洗脱液颜色澄清，依次使用300mL 25％乙醇、500mL 75％乙醇、300mL 100％乙醇洗脱。收集75％乙醇洗脱液，50℃旋干，以AB-8大孔树脂进行柱层析分离，得纯度大于90％的自制丹酚酸B共4g备用；

将5.00g甜菜碱、3.84g乳酸、0.77g水以摩尔比1:1:1的比例混合，于80℃加热搅拌1小时，形成澄清均一的低共熔溶剂。将1.5mL的甜菜碱-乳酸天然低共熔溶剂与0.5mL的水混合，得2mL的75％甜菜碱-乳酸天然低共熔溶剂，加入到25mL圆底烧瓶中，再精确称量4mg丹酚酸B(自制)，于120℃下加热6h。得丹酚酸B转化的丹酚酸A混合液，将混合液用水定容至10mL，取适量样品并于16200×g下离心10min，取上清液，高效液相色谱(HPLC)检测，根据化合物(丹酚酸B、丹酚酸A)的标准曲线，获得丹酚酸B转化液中所含化合物种类及含量，并计算丹酚酸B转化率和丹酚酸A生成率。测得丹酚酸B转化率为89.8％，丹酚酸A生成率为72.4％。待反应结束后，向体系中加入去离子水15mL并混匀，用15mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相并浓缩。取浓缩后有机相样品适量，以硅胶、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20等常规色谱手段纯化，得粉末状晶体，产物丹酚酸A纯度大于95％。

实施例2甜菜碱-乳酸为溶剂和催化剂催化转化丹酚酸B生成紫草酸、丹酚酸A

将实施例1中加入丹酚酸B后的反应温度和反应时间改为80℃、48h，其他部分同实例1，得丹酚酸B转化率为71.4％，紫草酸生成率为29.0％，丹酚酸A生成率为31.9％。

实施例3甜菜碱-尿素为溶剂和催化剂催化转化丹酚酸B生成丹参素、原儿茶醛

将实施例1中的天然低共熔溶剂由甜菜碱-乳酸改为5g甜菜碱、2.56g尿素、1.54g水以摩尔比1:1:2的比例混合，于100℃加热搅拌2小时，形成澄清均一的低共熔溶剂。将1.5mL的甜菜碱-尿素天然低共熔溶剂与0.5mL的水混合，得2mL的75％甜菜碱-尿素天然低共熔溶剂，加入到25mL圆底烧瓶中，再精确称量4mg丹酚酸B(自制)，于140℃下加热2h。其他操作同上，丹酚酸B转化率大于99％，得丹参素0.77mg/mg SAB，得原儿茶醛0.56mg/mg SAB。

实施例4低共熔溶剂种类对丹酚酸B催化转化的影响

将实施例1中低共熔溶剂改为表1所述，组成为氢键受体、氢键供体和/或去离子水，将4mg丹酚酸B加入到2mL 75％低共熔溶剂中，温度与反应时间分别为120℃、2h，其他操作同实施例1，所制得丹酚酸B转化液中丹酚酸B转化率、丹酚酸A生成率及丹参素、原儿茶醛产量见表1，结果显示，DES-1、DES-2的综合催化转化效果最佳。

表1.低共熔溶剂种类与丹酚酸B催化转化关系考察

实施例5低共熔溶剂水溶液中低共熔溶剂体积浓度对催化转化效果的影响

将实施例1中DES-1体积浓度改成表2所示，反应温度和时间改为120℃，2h，其他操作同实施例1，所得丹酚酸B转化率、丹酚酸A生成率见表2，结果显示，100％DES-1催化转化效果最佳，其次75％DES-1，两者差别不大，为了节约成本和降低操作难度优选75％DES-1。

表2.低共熔溶剂浓度对丹酚酸B催化转化的影响

实施例6低共熔溶剂水溶液中反应温度对催化转化效果的影响

将实施例1中反应温度改成表2所示，反应时间改为4h，其他操作同实施例1，所得丹酚酸B转化率、丹酚酸A生成率见表2，结果显示，120℃时DES-1催化转化效果最佳。

表3.温度对丹酚酸B催化转化的影响

实施例7低共熔溶剂水溶液中反应时间对催化转化效果的影响

将实施例1中反应时间改成表2所示，其他操作同实施例1，所得丹酚酸B转化率、丹酚酸A生成率见表2，结果显示，120℃、6h，丹酚酸A生成率最高。

表4.反应时间对丹酚酸B催化转化的影响

对比例1水作为溶剂转化丹酚酸B

将实例1中的甜菜碱-乳酸改为水作为反应溶剂，反应温度和时间改为120℃、2h，其他操作如实例1。得丹酚酸B转化率为17.51％，丹酚酸A生成率小于12％，高效液相色谱图见附图5。由此对比结果可知，当溶剂为水时，相同条件下丹酚酸B的转化率极低，当溶剂为低共熔溶剂时，相同条件下丹酚酸B能够选择性的高转化率的转化为其他丹酚酸类化合物。

以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。