阅读说明：本技术 一种真核生物低起始量转录组文库构建方法 (Method for constructing low-initial-quantity transcriptome library of eukaryote ) 是由 杨新鑫 刘艳艳 朱月艳 孙子奎 于 2020-06-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种真核生物低起始量转录组文库构建方法,其特征在于,包括了全长cDNA扩增步骤和转座酶建库步骤。将全长cDNA的扩增后的扩增产物在转座酶的作用下进行转录和建库。将才能达到低起始量建库成功的效果。将样本起始量在5-50ng或50ng以上的样本均能获得更好的建库结果,方便后续的样本检测。(The invention discloses a construction method of a low initial transcriptome library of a eukaryote, which is characterized by comprising a full-length cDNA amplification step and a transposase library construction step. And (3) transcribing and constructing a library of amplified products of the full-length cDNA under the action of transposase. The effect of successful library building with low initial quantity can be achieved. The sample with the initial amount of 5-50ng or more than 50ng can obtain better library building result, and the subsequent sample detection is convenient.)

一种真核生物低起始量转录组文库构建方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种真核生物低起始量转录组文库构建方法。

背景技术

目前市场上的普通真核生物转录组测序，对样品RNA的量要求较高，致使许多RNA量产出较少的组织样本难以满足测序要求，无法进行普通转录组测序。如：来源稀少的干细胞、肿瘤等临床样本，弥足珍贵的考古样本以及一些RNA提取困难、容易降解的特殊样本等。

这些RNA量产出较少的组织样本即使进行普通转录组建库，其建库成功率、文库质量、测序数据也均会受到很大影响，使得RNA样品量不足成为制约普通真核生物转录组文库构建的重要瓶颈之一。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种真核生物低起始量转录组文库构建方法。

为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：

一种真核生物低起始量转录组文库构建方法，包括如下步骤：

全长cDNA扩增步骤：

首先将采集到的样品的RNA进行水解变性后进行逆转录得逆转录产物；

将逆转录产物进行孵育后进行cDNA扩增得cDNA扩增产物后孵育纯化并进行质量控制得最终纯化后的cDNA扩增产物，

其中，

所述逆转录反应体系包括：

反转录酶III和\或RNA水解酶抑制剂和\或反转录酶III第一链和\或还原剂DTT和\或三甲铵乙内酯和\或MgCl2、逆转录引物,所述逆转录引物为AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G；

所述的质量控制为：

1)取1μl纯化后的DNA产物qubit定量；

2)取适量样品稀释至1ng/μl，进行片段检测；

转座酶建库步骤：

根据cDNA扩增后的qubit定量结果，将全长cDNA扩增步骤的最终产物择一进行50ng起始DNA纯化产物的片段化操作或5ng起始DNA纯化产物的片段化操作，后进行PCR富集操作得PCR纯化产物后进行文库质量检测得最终产物。

在本发明的一个优选实施例中，所述cDNA扩增为将cDNA扩增体系加入到逆转录产物当中，其中，所述cDNA扩增体系包括：

KAPA HiFi高保真热启动DNA聚合酶预混液和\或A-IS PCR primers扩增引物和\或Nuclease-free water无核酸酶水，

其中，所述A-IS PCR primers扩增引物为AGCAGTGGTATCAACGCAGAGT。

在本发明的一个优选实施例中，所述文库质量检测的步骤具体为：

制备所得的文库使用Qubit进行浓度定量，并使用PE Labchip GX Touch HT芯片和DNA High Sensitivity试剂盒进行labchip检测，

若质检结果显示：文库峰型图主峰大小在300-550bp之间，基线平整、峰型单一平滑、无杂峰、无大片段、无接头和无引物二聚体，则文库质量和浓度均合格。

在本发明的一个优选实施例中，所述将全长cDNA扩增步骤的最终产物择一进行50ng起始DNA纯化产物的片段化操作步骤或5ng起始DNA纯化产物的片段化操作步骤，具体是当cDNA全长扩增产物总量≥50ng采用50ng起始DNA纯化产物的片段化操作步骤；

而cDNA全长扩增产物总量在5-50ng之间采用5ng起始DNA纯化产物的片段化操作步骤。

在本发明的一个优选实施例中，所述50ng起始DNA纯化产物的片段化操作步骤具体包括：

1)室温解冻5×TTBL，上下颠倒混匀后备用，在PCR管中配置如下表一的反应体系：

表一

2)使用移液器轻轻吹打20次充分混匀，置于PCR仪中，运行如下表二的反应程序：

表二

温度	时间
		105℃	热盖
55℃	10min
		10℃	Hold

3)片段化产物使用DNA Clean Beads进行纯化：

步骤1,涡旋振荡混匀DNA Clean Beads并吸取50μl至50μl片段化产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min；

步骤2,将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后小心移除上清；

步骤3,保持反应管始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清；

步骤4,重复步骤3，总计漂洗两次；

步骤5,保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min；

步骤6,将反应管从磁力架上取出，加入26μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min；

步骤7,将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后小心吸取24μl上清至新的灭菌PCR管中后进行PCR富集。

在本发明的一个优选实施例中，所述5ng起始DNA纯化产物的片段化操作步骤具体包括：

1)室温解冻5×TTBL，上下颠倒混匀后备用，在PCR管中配置如下表三反应体系：

表三

2)使用移液器轻轻吹打20次充分混匀，置于PCR仪中，运行如下表四反应程序：

表四

温度	时间
		105℃	热盖
55℃	10min
		10℃	Hold

3)反应完成后立即向产物中加入5μl 5×TS，使用移液器轻轻吹打充分混匀，置于室温放置5min后进行PCR富集。

本发明的有益效果在于：

本发明通过将全长cDNA的扩增后的扩增产物在转座酶的作用下进行转录和建库。将才能达到低起始量建库成功的效果。将样本起始量在5-50ng或50ng以上的样本均能获得更好的建库结果，方便后续的样本检测。

附图说明

图1为文库长度分布检测图。

具体实施方式

本发明的主要原理在于：

目前市场上的普通真核生物转录组测序，对样品RNA的量要求较高，本方法突破低起始量或珍贵样品进行普通转录组建库风险高、成功率低的瓶颈，实现真核生物低起始量(微量)高效、稳定的转录组测序，从而有助于更好地推动功能基因组学研究。

和传统普通真核生物文库构建方法相比，本方法具有以下创新和优点：

1.所需样品总RNA起始量可低至5--50ng，且无物种偏好性，广泛用于动物、植物、真菌等真核生物；

2.以待测样本的总RNA为模板，利用Superscript III逆转录酶将总RNA中的mRNA逆转录成全长片段的双链cDNA，再对双链cDNA进行扩增以达到文库构建所需要的DNA的量，保证后续文库顺利构建；

3.采用新型的转座酶法进行DNA片段化，简化了建库步骤，显著降低了cDNA模板的投入量，并缩短了文库构建的时间。

通过以上多处改进创新，本方法不仅能够高敏感度、无偏好性地富集完整全长的转录本并扩增cDNA，维持了原始mRNA各转录本的丰度，还将繁琐的DNA片段化、末端修复和接头连接反应等步骤简化为一步简单的酶促反应，有效地减少了文库构建过程中的工作量，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性，极大地降低了文库构建成本的同时，实现真核生物微量样本转录组文库的构建。

下面结合具体实施例对本发明的方法作进一步说明：

一、全长cDNA扩增

1.RNA变性

1)在0.2ml PCR管中配置如下反应体系见表1(冰上操作)：

表1

组分	添加量(μl)	浓度
			总RNA(50ng)	2.51
3′CDS primer(10μM)	1	1μM
			dNTP(10mM)	1	1mM
RNA水解酶抑制剂(40U/μl)	0.05	2U
			总含量	4.56

2)样品混匀后置于PCR仪，72℃孵育3min(热盖105℃)，结束后立即放置冰上保存。

2.逆转录

1)按如下表2配置逆转录反应体系：

表2

其中，所牵涉到的逆转录引物为:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G；3'末端有两个核糖鸟苷(rG)和一个LNA修饰的鸟苷(+G)。

(即逆转录引物为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG。)

2)将5.44μl逆转录反应体系加入RNA变性反应和孵育后的溶液中，吹打混匀，短暂离心后置于PCR仪中，按表3的如下反应条件孵育：

表3

3)反应结束后短暂离心，冰上保存。

3.cDNA扩增

1)按如下表4在冰上配制PCR扩增反应体系：

此步骤当中使用的是Kapa biosystems品牌生产的试剂盒KAPA HiFi HotStartReadyMix，货号KM2605

表4

组分	添加	浓度
			KAPA HiFi高保真热启动DNA聚合酶预混液	12.5	1×
A-IS PCR primers扩增引物(10μM)	1	0.1μM
			Nuclease-free water无核酸酶水	1.5
总含量	15

所涉的A-IS PCR primers扩增引物为AGCAGTGGTATCAACGCAGAGT；5'末端的C6位置加一个胺基Amine(NH2)。

2)将配制好的PCR扩增反应体系加入逆转录完的反应液中，此时反应体系为25μl，吹打混匀，放入PCR仪中，按如下表5参数孵育：

表5

4.磁珠纯化

1)扩增结束后，加20μl(0.8×)混匀的磁珠至PCR扩增产物中，轻柔吸打10次充分混匀，室温孵育5min；

2)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min，弃掉上清；

3)加入200μl 80％乙醇，保持PCR管在磁力架上不要掉落，室温孵育30s，弃废液；

4)重复步骤3)一次；

5)室温晾干3-5min，在观察到磁珠表面干燥或不反光后，将PCR管移下磁力架；

6)加入27.5μl灭菌水，用枪轻柔吹打10次混匀，室温孵育2min；

7)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min至溶液变透明，转移25μl上清至新PCR管。

5.cDNA质控

1)取1μl纯化后的DNA产物qubit定量；

2)取适量样品稀释至1ng/μl，进行片段检测(Labchip或2100)。

二.转座酶建库

此步骤采用的Vazyme品牌生产的试剂盒TruePrep DNA Library Prep Kit V2for Illumina，1-A使用货号TD501；1-B使用货号：TD502。

1-A.50ng起始DNA片段化操作：

(A与B择一选择，选择标准根据上一步骤中测定的qubit浓度而定，具体是当cDNA全长扩增产物总量≥50ng时，选择A的步骤：当cDNA全长扩增产物总量在5-50ng之间时，选择B的步骤。)

1)室温解冻5×TTBL，上下颠倒混匀后备用，在PCR管中配置如下表6的反应体系：

表6

2)使用移液器轻轻吹打20次充分混匀，置于PCR仪中，运行如下表7的反应程序：

表7

温度	时间
		105℃	热盖
55℃	10min
		10℃	Hold

反应完成后应立即进行产物纯化，否则DNA样品将过度片段化，导致最终文库片段变小。

3)片段化产物使用DNA Clean Beads进行纯化：

步骤1,涡旋振荡混匀DNA Clean Beads并吸取50μl至50μl片段化产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

步骤2,将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(5min)小心移除上清。

步骤3,保持反应管始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清。

步骤4,重复步骤3，总计漂洗两次。

步骤5,保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥约5min。

步骤6,将反应管从磁力架上取出，加入26μl灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min。

步骤7,将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(5min)小心吸取24μl上清至新的灭菌PCR管中，立即进行步骤2.PCR富集。

B.5ng起始DNA片段化操作：

1)室温解冻5×TTBL，上下颠倒混匀后备用，在PCR管中配置如下表8反应体系：

表8

2)使用移液器轻轻吹打20次充分混匀，置于PCR仪中，运行如下表9反应程序：

表9

温度	时间
		105℃	热盖
55℃	10min
		10℃	Hold

3)反应完成后立即向产物中加入5μl 5×TS，使用移液器轻轻吹打充分混匀，置于室温放置5min。

反应完成后应立即加入5×TS，否则DNA样品将过度片段化，导致最终文库片段变小。

4)立即进行步骤2.PCR富集。

2.PCR富集

1)将PCR管置于冰上，配置如下表10反应体系：

表10

组分	体积
		片段化产物+ddH2O	24μl
5×TAB	10μl
		PPM	5μl
N5XX*	5μl
		N7XX*	5μl
TAE	1μl

2)使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管置于PCR仪中，运行如下表11反应程序：

表11

扩增循环数需根据实际情况自行选择，选择原则如下表12：

表12

起始cDNA量	扩增循环数
		50ng	5--9
5ng	9--15

3.PCR产物纯化

1)涡旋振荡混匀

DNA Clean Beads并吸取50μl(1×)至50μl PCR产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次充分混匀，室温孵育5min；

2)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min；

3)弃掉上清，不能碰到磁珠，保持PCR管在磁力架上不要掉落；

4)加入200μl的80％乙醇，室温孵育30s，弃掉废液；

重复步骤4)一次。

5)室温晾干3-5min，在观察到珠子表面干燥或不反光时，将PCR管移下磁力架；

6)加入52.5μl无酶水，用枪轻柔吹打10次混匀，盖上PCR管盖，室温孵育2min；

7)将PCR管置于磁力架上，室温孵育5min；

8)转移50μl上清至新PCR管。

4.文库片段分选

1)往上述50μl纯化后的DNA中加入27.5μl(0.55×)磁珠，充分吹打混匀，室温放置5min；

2)将PCR管置于磁力架上，静置5min；

3)转移75ul上清至新的PCR管中，加入7.5μl(0.15×)磁珠，室温放置5min；

4)将PCR管置于磁力架上，静置5min；

5)弃掉上清，加入200μl的80％乙醇，室温孵育30s，弃掉废液；

6)重复步骤5)一次，室温干燥3-5min；

7)加入27.5μl无酶水，用枪充分吹打混匀，室温静置2min；

8)转移25μl洗脱后的文库产物转移到新的管中，-20℃保存。

三、文库质量检测

取1ul制备所得的文库，使用Qubit进行浓度定量；取1ul制备所得的文库，使用PELabchip GX Touch HT芯片和DNA High Sensitivity试剂盒进行labchip检测，质检结果显示，文库峰型图主峰大小在300-550bp之间，基线平整、峰型单一平滑、无杂峰、无大片段、无接头和无引物二聚体，文库质量和浓度均合格。

1.文库浓度见表13：

表13

2.文库长度分布检测如图1，其中，绿色线表示：通过磁珠分选得到的约450bp文库；橘色线：通过磁珠分选得到的约470bp文库；

紫色线表示：通过磁珠分选得到的约500bp文库；蓝色线：通过磁珠分选得到的约520bp文库。

而本发明当中是通过：一个方面是对全长cDNA的扩增，另一方面是将转座酶引用到转录组建库中，两方面的作用下，才能达到低起始量建库成功的效果。

序列表

<110> 南京派森诺基因科技有限公司

<120> 一种真核生物低起始量转录组文库构建方法

<130> 20200609

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agtacatggg 30

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

agcagtggta tcaacgcaga gt 22