白头翁皂苷b4雾化吸入制剂及应用
阅读说明：本技术 白头翁皂苷b4雾化吸入制剂及应用 (Pulsatillae saponin B4 atomization inhalation preparation and application ) 是由 高红伟 杨世林 于 2021-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种白头翁皂苷B4雾化吸入制剂,所述雾化吸入制剂包括B4溶液或B4纳米制剂。B4溶液将白头翁皂苷B4溶解在生理盐水中,B4纳米制剂包括：将白头翁皂苷B4用乙醇配制成浓度为2.5-10mg/mL的溶液,置于常温环境,得到B4乙醇溶液,将吐温80用水配制成质量分数为0.02％的溶液,置于0-4℃冷藏,得到水相溶液；冰盐浴条件下,将B4乙醇溶液快速加入其20-30倍体积的水相溶液,水相溶液搅拌速度保持在900-2000r/min,搅拌时间不短于4min,析出的为药物纳米晶体。本发明通过与TNFR2蛋白和Foxp3蛋白结合,从而抑制TNFR2和Foxp3及Treg细胞发挥作用。(The invention discloses an atomized inhalation preparation of pulsatilla saponin B4, which comprises a B4 solution or a B4 nano preparation. B4 solution dissolving Pulsatillae saponin B4 in physiological saline, and B4 nanometer preparation comprises: preparing solution with concentration of 2.5-10mg/mL with ethanol of Pulsatillae saponin B4, placing in normal temperature environment to obtain B4 ethanol solution, preparing solution with mass fraction of 0.02% with Tween 80 with water, and refrigerating at 0-4 deg.C to obtain water phase solution; under the condition of ice salt bath, rapidly adding the B4 ethanol solution into the aqueous phase solution with the volume of 20-30 times of the ethanol solution, keeping the stirring speed of the aqueous phase solution at 900-2000r/min, and keeping the stirring time not shorter than 4min to separate out the drug nanocrystals. The invention can inhibit TNFR2, Foxp3 and Treg cells from playing a role by combining with TNFR2 protein and Foxp3 protein.)
技术领域
本发明涉及医药
技术领域
。更具体地说，本发明涉及一种白头翁皂苷B4雾化吸入制剂及应用。背景技术
白头翁是毛茛科白头翁属植物白头翁(Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel)的干燥根，具有清热解毒、凉血止痢的功效。现代药理学研究表明，白头翁中皂苷类成分是其主要活性成分，具有增强免疫功能、抗炎等作用。白头翁皂苷B4是白头翁中提取具有药理活性的五环三萜类皂苷，其具有抗炎抗菌、免疫调节、抗氧化、抗病毒等药理作用。2015版《中国药典》一部白头翁含量测定项规定：白头翁皂苷B4含量不得少于4.6％。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种白头翁皂苷B4雾化吸入制剂及应用，其通过与TNFR2蛋白和Foxp3蛋白结合，从而抑制TNFR2和Foxp3及Treg细胞发挥作用。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种白头翁皂苷B4雾化吸入制剂，所述雾化吸入制剂包括B4溶液或B4纳米制剂。
优选的是，B4溶液的制备方法为：将白头翁皂苷B4溶解在生理盐水中，浓度达到5-25mg/mL。
优选的是，B4纳米制剂的制备方法为：
将白头翁皂苷B4用乙醇配制成浓度为2.5-10mg/mL的溶液，置于常温环境，得到B4乙醇溶液，将稳定剂用水配制成质量分数为0.01-0.03％的溶液，置于0-4℃冷藏，得到水相溶液；
冰盐浴条件下，将B4乙醇溶液快速加入其20-30倍体积的水相溶液，水相溶液搅拌速度保持在900-2000r/min，搅拌时间不短于4min，析出的为药物纳米晶体。
优选的是，得到的药物纳米晶体的粒径不大于1000nm。
优选的是，冰盐浴条件为-15℃，碎冰与NaCl以4:1重量比混合。
优选的是，水相溶液的初始温度为3℃。
优选的是，B4乙醇溶液的初始温度为20℃。
优选的是，水相溶液搅拌速度保持在1200r/min。
优选的是，B4乙醇溶液与水相溶液的体积比为1:30。
所述的白头翁皂苷B4雾化吸入制剂作为TNFR2和Foxp3蛋白抑制剂的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明进行体外实验：①计算机模拟白头翁皂苷B4(B4)与TNFR2结合力；②利用放线菌素D和TNF诱导WEHI-13var细胞检测B4对细胞死亡的保护作用；③将TNFR2报告基因质粒转入Jurkat细胞中，检测B4对TNFR2的影响；④从C57BL/6小鼠淋巴结分离T淋巴细胞，利用分选流式细胞仪筛选出CD4+Foxp3+双阳性细胞及Treg细胞，检测B4处理后对TGF-β和IL-10的影响；⑤检测B4对A549细胞的杀伤作用；⑥将TNFR2转染A549细胞，检测B4对TNFR2的影响。
第二、本发明体内实验：①B4治疗C57BL/6接种Liews肺癌(LLC)作用：将LLC细胞以2×106个/mL浓度接种100μL到C57BL/6小鼠右前肢皮下，待肿瘤体积长到100mm3左右，分组给不同浓度的B4进行治疗，每天一次，连续给药2周，每2天测量一次肿瘤体积。从小鼠体内取出脾脏、肿瘤组织，检测Treg细胞。肿瘤组织检测Treg和TNFR2蛋白表达；②B4治疗C57BL/6接种B16F10作用：将B16F10细胞以2×106个/mL浓度100μL细胞通过尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内，B4不同浓度雾化给药，每天2次，连续给药2周后，观察B16F10肺转移情况。按照上述方法将B16F10-luc细胞尾静脉注射到C57BL/6体内，按照上述给药方法，每三天用小动物活体成像仪，检测小鼠肺组织荧光强度。
第三、本发明选择雾化吸入用白头翁皂苷B4溶液与纳米制剂为研究对象，探究白头翁皂苷B4纳米制剂雾化吸入的制备工艺和制剂处方设计，并对其进行体内外抗肺癌作用评价，白头翁皂苷B4纳米制剂雾化吸入给药通过与TNFR2结合，从而抑制TNFR2及Treg细胞发挥作用，调节免疫。为B4纳米制剂雾化吸入治疗肺癌的临床使用提供了依据。相比较于其他剂型，雾化给药可以直接快速到达肺部组织，对肺部具有特异治疗作用，其中B4纳米制剂直径小，使药物粒径更小(常规雾化药物粒径不大于10μM)，雾化更好吸收。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为析晶温度对结果的影响(n＝3)；
图2为搅拌时间对试验结果的影响；
图3为水相初始溶液温度对结果的影响(n＝3)；
图4为B4乙醇溶液初始温度的影响(n＝3)；
图5为水相搅拌速度对结果的影响(n＝3)；
图6为B4乙醇溶液加入速度的影响(n＝3)；
图7为B4乙醇溶液浓度的影响；
图8为B4乙醇溶液与水溶液体积比的影响；
图9为B4与TNFR2受体蛋白计算机模拟Docking；
图10为B4对WEHI-13var细胞的作用；
图11为B4对TNFR2报告基因质粒的作用；
图12为B4对Treg细胞作用评价；
图13为B4对A549和H1299细胞直接杀伤作用；
图14为B4对稳定表达TNFR2-GFP的A549细胞影响；
图15为B4纳米制剂雾化吸入给药对小鼠LLC肿瘤的生长作用；
图16为B4纳米制剂雾化吸入给药对小鼠LLC肿瘤组织中TNFR2和Foxp3蛋白表达的影响；
图17为B4纳米制剂雾化给药对黑色素瘤B16F10肺癌转移的影响；
图18为小动物成像检测B4雾化给药对黑色素瘤B16F10肺癌转移的影响；
图19为B4纳米制剂雾化吸入给药对小鼠血常规的影响；
图20为HE染色观察B4纳米制剂雾化吸入给药对小鼠肺组织的影响(100×)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实例1>
雾化吸入用白头翁皂苷B4溶液的制备方法，将白头翁皂苷B4溶解在生理盐水中，浓度达到5mg/mL。得到的药物粒径不大于10μM。
<实例2>
雾化吸入用白头翁皂苷B4溶液的制备方法，将白头翁皂苷B4溶解在生理盐水中，浓度达到25mg/mL。得到的药物粒径不大于10μM。
<实例3>
雾化吸入用白头翁皂苷B4溶液的制备方法，将白头翁皂苷B4溶解在生理盐水中，浓度达到15mg/mL。得到的药物粒径不大于10μM。
<实例4>
雾化吸入用白头翁皂苷B4纳米制剂的制备方法，包括：
将白头翁皂苷B4用乙醇配制成浓度为2.5mg/mL的溶液，置于常温环境(20℃)，得到B4乙醇溶液，将吐温80用水配制成质量分数为0.02％的溶液，置于3℃冷藏，得到水相溶液；
冰盐浴条件(-15℃，碎冰与NaCl以4:1重量比混合)下，将B4乙醇溶液快速加入其30倍体积的水相溶液，水相溶液搅拌速度保持在1200r/min，搅拌时间4min，析出的为药物纳米晶体，粒径不大于1000nm。
<实例5>
雾化吸入用白头翁皂苷B4纳米制剂的制备方法，包括：
将白头翁皂苷B4用乙醇配制成浓度为5mg/mL的溶液，置于常温环境(20℃)，得到B4乙醇溶液，将吐温80用水配制成质量分数为0.02％的溶液，置于3℃冷藏，得到水相溶液；
冰盐浴条件(-15℃，碎冰与NaCl以4:1重量比混合)下，将B4乙醇溶液快速加入其30倍体积的水相溶液，水相溶液搅拌速度保持在1200r/min，搅拌时间4min，析出的为药物纳米晶体，粒径不大于1000nm。
<实例6>
雾化吸入用白头翁皂苷B4纳米制剂的制备方法，包括：
将白头翁皂苷B4用乙醇配制成浓度为10mg/mL的溶液，置于常温环境(20℃)，得到B4乙醇溶液，将吐温80用水配制成质量分数为0.02％的溶液，置于3℃冷藏，得到水相溶液；
冰盐浴条件(-15℃，碎冰与NaCl以4:1重量比混合)下，将B4乙醇溶液快速加入其30倍体积的水相溶液，水相溶液搅拌速度保持在1200r/min，搅拌时间4min，析出的为药物纳米晶体，粒径不大于1000nm。
<制备工艺和制剂处方设计>
以药物粒子平均粒径大小为指标，进行药物纳米晶体制备工艺研究。
1.1试剂与仪器
1.1.1仪器
Thermo sicentific磁力加热搅拌器；BSA2245-CW型电子分析天平；LA-920Horiba激光粒度一。
1.1.2试剂
白头翁皂苷B4原料药(纯度＞98％，实验室制备)。
1.1.3实验方法与结果
采用LA-920Horiba激光粒度仪测定制备的液体中药物晶体粒径的大小，并以粒径的大小为指标，在保证其他条件一定的情况下，分别考察了析晶温度、搅拌时间、水相溶液初始温度、B4乙醇溶液初始温度、水相搅拌速度、药液加入速度、B4乙醇液浓度、B4乙醇溶液和水溶液体积比对试验结果的影响。
1.1.3.1析晶温度的影响
析晶温度对纳米晶体的形成至关重要，因而工艺参数研究中首先考察了析晶温度对试验结果的影响。析晶温度分别设置为常温(20℃)、冰水浴(0℃)和冰盐浴(-15℃；碎冰80g与NaCl 20g混合)，其它试验条件同实施例4-6设置。实验结果如图1。随着析晶温度的降低，药物平均粒径逐渐减小，可能原因是随着温度降低，药物的溶解度降低，药物容易达到饱和状态，从而药物成核速率增加，而低温又可以抑制晶核成长，从而形成较小的纳米晶体。
1.1.3.2搅拌时间对试验结果的影响
为确定B4乙醇溶液和水相溶液混合后的搅拌时间，分别对室温、冰水浴、冰盐浴三种析晶温度下的搅拌时间对实验结果的影响进行探索，其它试验条件同实施例4-6设置。室温和水浴条件考察了5、10、15、20min四个时间点的试验结果，而冰盐浴条件下，4min左右时，药液会大量结冰，因而考察了1、3、4min三个时间点的试验结果。结果如图2，常温及冰水浴条件下，搅拌时间由5min增至15min时，药物晶体平均粒径逐渐减小，搅拌时间再增加时，药物晶体平均粒径增大；冰盐浴条件下，搅拌时间由1min增至4min时，药物晶体平均粒径逐渐减小。所以冰盐浴条件下，B4乙醇溶液加入水相溶液后搅拌时间设为4min。
1.1.3.3水相溶液初始温度的影响
水相溶液初始温度分别设置为常温(20℃)、3℃，考察了其对实验结果的影响，其它试验条件同实施例4-6设置。析晶温度设为冰盐浴。结果如图3，水相溶液初始温度为3℃，得到的药物晶体平均粒径较小。
1.1.3.4 B4乙醇溶液初始温度的影响
B4乙醇溶液初始温度分别设置为常温(20℃)、3℃，考察了其对实验结果的影响，其它试验条件同实施例4-6设置。析晶温度设为冰盐浴。结果如图4，B4乙醇溶液初始温度为20℃时，得到的药物晶体平均粒径较小。可能由于常温B4乙醇溶液加入放置于冰盐浴中3℃的水相溶液中时，温度骤降，药物的溶解度下降，易形成饱和状态而形成大量晶核，而低温和稳定剂又抑制晶核生长，从而形成较小的纳米晶体。
1.1.3.5水相搅拌速度的影响
水相搅拌速度设置为600、900、1200、2000r/min，考察了其对试验结果的影响，其它试验条件同实施例4-6设置。试验中析晶温度设为冰盐浴。结果如图5，搅拌速度由600r/min增加至1200r/min时，药物粒径逐渐减小，粒径再增加至2000r/min时，药物粒径无显著减小，可能搅拌速度增大，药液与水相混合速度加快，药物更易达到饱和状态而形成大量晶核，而转速增大到一定值后，影响不明显。
1.1.3.6 B4乙醇溶液加入速度的影响
B4乙醇溶液加入速度设置为快速加入和逐滴加入，考察其对试验结果的影响，其它试验条件同实施例4-6设置。本实验中析晶温度为冰盐浴。实验结果如图6，快速加入时药物平均粒径小于逐滴加入时的药物平均粒径。可能原因是，快速加入时，局部药物浓度更高，药物更易达饱和状态而形成大量晶核。
1.1.3.7 B4乙醇溶液浓度的影响
B4乙醇溶液浓度设置为2.5、10、20mg/mL，考察了其对试验结果的影响，其它试验条件同实施例4-6设置。本实验中析晶温度为冰盐浴。试验结果如图7所示，B4乙醇溶液浓度为10mg/mL时，药物平均粒径最小，可能原因是，药物浓度增大时，更容易形成饱和状态从而形成晶核，另外药物浓度过大时，局部晶核浓度过高而易于碰撞聚集导致结晶长大。因此本试验探究B4纳米制剂雾化给药浓度确定为2.5、5、10mg/mL。
1.1.3.8 B4乙醇溶液与水溶液体积比的影响
VB4乙醇溶液：水相溶液设置为1:10、1:20、1:30，考察其对试验结果的影响，其它试验条件同实施例4-6设置。本实验中析晶温度为冰盐浴。如图8所示，随着乙醇溶液和水溶液体积比的逐渐增大，药物平均粒径逐渐减小，可能原因是，随水相体积的增大，形成的晶核之间更不易聚集。
1.1.4小结
根据试验结果，最终选择的工艺参数为冰盐浴为析晶温度，B4乙醇溶液浓度为2.5、5、10mg/mL，搅拌速度为1200r/min，B4乙醇溶液与水溶液的体积比为1:30，乙醇溶液快速加入。B4乙醇溶液为常温，水相溶液冷藏至3℃。搅拌时间为4min。
<体外作用评价>
2.1实验方法
①B4与TNFR2受体亲和力检测：在前期autodock软件模拟计算出B4与TNFR2结合力学参数。
②B4对小鼠纤维肉瘤细胞WEHI-13var细胞作用：将WEHI-13var细胞与放线菌素D(1μg/mL)一起培养，B4(5，10，2 0μM)预孵2h后，加入TNF-α(5IU/mL)诱导24h，MTS方法检测B4对TNF诱导WEHI-13var细胞死亡的保护作用。
③B4对TNFR2报告基因质粒的作用：采用Promoter Driven Control Firefly andRenilla Luciferase Vectors质粒载体pGL4.54[luc2/TK]Vector将TNFR2基因片段导入载体中，形成一个报告基因载体质粒。将质粒导入Jurkat细胞后，B4(5，10，20μM)处理细胞24h，用Dual Glo luciferase assay system kit检测孔板中的荧光强度。
④B4对Treg细胞作用评价：C57BL/6小鼠淋巴结分离T淋巴细胞，利用分选流式细胞仪筛选出CD4+Foxp3+双阳性细胞及Treg细胞，加入B4(20μM)预处理Treg细胞2h后，加入TNF诱导(10ng/mL)诱导24h。收集上清检测IL-10及TGF-β。
⑤B4对A549和H1299细胞直接杀伤作用：选择表达TNFR2受体的非小细胞肺癌细胞A549和H1299，B4(5，10，20μM)处理细胞24h后，MTS检测B4对细胞的杀伤作用。
⑥B4对稳定表达TNFR2-GFP的A549细胞影响：将A549-TNFR2-GFP细胞种在96孔黑板中，B4(5，10，20μM)处理24h后，采用PE Automated Workstation JANUS G3全自动处理工作站及PE Operetta CLS高内涵细胞成像系统，检测荧光强度。
2.2实验结果
①B4与TNFR2受体结合
使用Autodock软件检测B4与TNFR2结合情况，结果发现B4与TNFR2受体蛋白结合力为-9.6kcal/mol。如图9所示，具体结合氨基酸为SER65、ASN171、GLY24、ARG77、GLU23。
②B4对WEHI-13var细胞作用
将WEHI-13var细胞与放线菌素D(1μg/mL)一起培养，B4(5，10，20μM)预孵2h后，加入TNF-α(5IU/mL)诱导24h，MTS检测细胞活力结果如图10所示，###P＜0.001与空白对照组比较；***P＜0.001与TNF-α(5IU/mL)组比较，B4对TNF-α诱导WEHI-13var细胞死亡的保护作用。
③B4对TNFR2报告基因质粒的作用
将TNFR2质粒导入Jurkat细胞后，B4(5，10，20μM)处理细胞24h，用Dual Gloluciferase assay system kit检测孔板中的荧光强度，结果如图11所示，B4能够抑制TNFR2荧光强度，对TNFR2具有抑制作用。
④B4对Treg细胞作用评价
C57BL/6小鼠淋巴结分离T淋巴细胞，利用分选流式细胞仪筛选出CD4+Foxp3+双阳性细胞及Treg细胞，加入B4(20μM)预处理Treg细胞2h后，加入TNF诱导(10ng/mL)诱导24h。收集上清检测IL-10及TGF-β水平，结果如图12A和12B所示，图12A为B4对Treg细胞上清中IL-10水平的影响；图12B为B4对Treg细胞上清中TGF-β水平的影响，###P＜0.001与空白对照组比较；***P＜0.001与TNF-α(5IU/mL)组比较，B4能够抑制Treg细胞上清中IL-10和TGF-β水平。
⑤B4对A549和H1299细胞直接杀伤作用
选择表达TNFR2受体的非小细胞肺癌细胞A549和H1299，B4(5，10，20μM)处理细胞24h后，MTS检测B4对细胞不具有杀伤作用，结果如图13A和13B所示，图13A为B4对A549细胞的杀伤作用，图13B为B4对H1299细胞的杀伤作用，B4可能通过调节免疫和肿瘤微环境发挥治疗非小细胞肺癌作用。
⑥B4对稳定表达TNFR2-GFP的A549细胞影响
将A549-TNFR2-GFP细胞种在96孔黑板中，B4(5，10，20μM)处理24h后，检测TNFR2荧光强度。如图14所示，***P＜0.001与空白对照组比较，B4能够抑制A549细胞中TNFR2荧光强度。
<制剂体内作用评价>
雾化吸入给药通过小鼠口鼻暴露在气溶胶雾化器(上海玉研科学仪器有限公司)完成雾化给药。将B4纳米制剂加入气溶胶雾化器中，对小鼠进行治疗。具体为：将B4纳米制剂溶液置于连接雾化器的烧杯中，将小鼠放置固定器，暴露口鼻，将固定器置于雾化器上，雾化给药15min，取下固定器，拿出小鼠，完成给药。
3.1实验方法
①B4纳米制剂雾化吸入治疗C57BL/6接种Lewis肺癌(LLC)作用：将LLC细胞以2×106个/mL浓度接种100μL到C57BL/6小鼠右前肢皮下，待肿瘤体积长到100mm3左右，将小鼠分为模型组、B4 2.5mg/kg、B4 5mg/kg、B4 10mg/kg和吉非替尼阳性药组(40mg/kg)，每组10只，进行治疗。B4纳米制剂雾化吸入每天2次，连续给药2周，吉非替尼组灌胃给药每天一次，连续给药2周，模型组雾化吸入相同剂量生理盐水每天一次，连续给药2周。每隔2天测量一次肿瘤体积。从小鼠体内取脾脏检测Treg细胞。取肿瘤组织检测肿瘤组织中TNFR2和Foxp3蛋白的表达情况。
②B4纳米制剂雾化吸入给药治疗C57BL/6接种B16F10肺癌转移作用：将B16F10细胞以5×106个/mL浓度100μL细胞通过尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内建立黑色素瘤肺癌转移模型。造模4天后将小鼠分为模型组、B4 2.5mg/kg、B4 5mg/kg、B4 10mg/kg和吉非替尼阳性药组(40mg/kg)，每组10只，进行治疗。模型组和B4纳米制剂各剂量组进行雾化给药，每天2次，连续给药2周。吉非替尼组灌胃给药，每天一次，连续给药2周。观察小鼠肺转移情况、检测小鼠血液中中性粒细胞、白细胞和淋巴细胞水平以及肺组织HE染色。按照上述方法将B16F10-luc细胞尾静脉注射到C57BL/6体内，按照上述给药方法，给药第14天后用小动物活体成像仪，检测小鼠肺组织荧光强度。
3.2实验结果
3.2.1 B4纳米制剂雾化吸入治疗C57BL/6接种Lewis肺癌(LLC)作用
①B4纳米制剂雾化吸入给药对小鼠LLC肿瘤的生长作用
小鼠给药14天后，处死小鼠后，取肿瘤称重，量体积。结果如图15A和15B所示，图15A为B4对小鼠肿瘤重量的影响，图15B为B4对小鼠肿瘤体积的影响，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与模型组比较，与模型组比较B4纳米制剂雾化吸入给药14天，能够抑制LLC的瘤重和瘤体积，且其抑制作用较阳性对照药吉非替尼效果好。
②B4纳米制剂雾化吸入对小鼠LLC肿瘤组织中TNFR2和Foxp3蛋白表达的影响
将小鼠肿瘤组织研磨，取上清定量后，Western blot检测肿瘤组织中TNFR2和Foxp3蛋白表达的情况。结果如图16所示，B4能够抑制TNFR2和Foxp3蛋白的表达。
以上结果提示，B4能够通过抑制TNFR2，调节Treg细胞而发挥治疗非小细胞肺癌作用。
3.2.2 B4纳米制剂雾化给药治疗C57BL/6接种B16F10肺癌转移作用
①B4纳米制剂雾化给药对黑色素瘤B16F10肺癌转移的影响
B4纳米制剂2.5mg/kg、B4 5mg/kg、B4 10mg/kg雾化给药14天，取小鼠肺组织，如图17所示，与空白对照组比较，模型组黑色素瘤肺转移显著，B4雾化给药能够抑制黑色素瘤B16F10肺癌转移情况，且B4抑制肺癌转移效果较阳性对照药吉非替尼组更好。
②小动物成像检测B4纳米制剂雾化给药对黑色素瘤B16F10肺癌转移的影响
将B16F10-luc细胞以5×106个/mL浓度100μL细胞通过尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内建立黑色素瘤肺癌转移模型。小鼠雾化给药后，利用小动物成像仪检测肺部转移细胞荧光。如图18所示，B4纳米制剂雾化给药后，抑制黑色素瘤肺转移。
③B4纳米制剂雾化吸入给药对小鼠血常规的影响
Day15，小鼠摘眼球取血，血常规仪器检测小鼠血浆中白细胞(WBC)、中性粒细胞(NEU)和淋巴细胞(LYMPH)水平。实验结果如图19所示，A.血浆中WBC水平；B.血浆中NEU水平；C.血浆中LYMPH水平*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001vs模型组，图19A-19C中自左至右依次为：空白组、模型组、吉非替尼阳性药组、B4低剂量组、B4中剂量组、B4高剂量组，图19A中，与空白组比较，模型组WBC水平显著升高，B4雾化吸入给药低、中剂量能够明显抑制WBC水平；图19B中，与空白组比较，模型组小鼠血浆中NEU显著升高，B4雾化吸入给药低、中、高剂量和吉非替尼阳性药能够显著抑制NEU水平；图19C中，与空白组比较，模型组LYMPH水平降低，B4雾化吸入给药高剂量组显著升高LYMPH水平。以上结果提示，B4纳米制剂雾化吸入给药可能通过调节小鼠WBC、NEU和LYMPH水平而发挥抑制肺癌转移。
④B4纳米制剂雾化吸入给药对小鼠肺组织的影响
HE染色进一步检测B4纳米制剂雾化吸入给药读黑色素瘤肺转移的影响，结果如图20所示，模型组肺组织结节显著，而B4纳米制剂低、中、高剂量组和吉非替尼组能够显著抑制肺组织结节。说明B4纳米制剂雾化吸入对黑色素瘤肺转移具有显著抑制作用，且效果较吉非替尼阳性药更显著。
以上实验结果表明，B4纳米制剂雾化吸入能够调节B16-F10黑色素瘤小鼠血液中WBC、NEU和LYMPH水平，抑制黑色素瘤肺转移。且B4低剂量效果较吉非替尼阳性药防治黑色素瘤肺转移作用更为显著。
以上结果提示，B4可以通过结合TNFR2而抑制TNFR2水平，降低Treg细胞数，作为TNFR2小分子抑制剂，以TNFR2和Foxp3为靶点发挥治疗肺癌的作用。此外，B4纳米制剂雾化给药能够通过调节免疫细胞水平抑制小鼠黑色素瘤肺癌转移情况，且B4纳米制剂治疗非小细胞肺癌抑制肺癌转移情况较吉非替尼阳性药效果更显著。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。