阅读说明：本技术 一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶及其制备方法 (Magnetic graphene oxide-based immobilized lactase with photo-thermal enhanced enzyme activity and preparation method thereof ) 是由 郇伟伟 郭建忠 李洁 李迎龙 李高羽 于 2020-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶及其制备方法,属于生物化学领域。本发明首先制备磁性纳米颗粒-氧化石墨烯,并用芘丁酸和聚乙烯亚胺对其进行改性,所得材料负载能力高,稳定性好,能够实现近红外光照射下酶活性的光热增强,然后通过戊二醛活化该材料与乳糖酶共价偶联,得到了固定化乳糖酶。本发明突破了以往不能分离和回收可溶性乳糖,限制实践中的连续和长期应用。本发明所得固定化乳糖酶在近红外光照射下酶活性约为可溶性乳糖酶活性的152％,而且酶具有很高的稳定性和可重复利用性,有助于微球反应器的连续运行,使固定化酶技术在未来的工业领域具有广阔的应用前景。(The invention provides a magnetic graphene oxide-based immobilized lactase with photo-thermal enhanced enzyme activity and a preparation method thereof, belonging to the field of biochemistry. According to the invention, firstly, magnetic nanoparticles, namely graphene oxide, are prepared, pyrenebutyric acid and polyethyleneimine are used for modifying the magnetic nanoparticles, the obtained material has high loading capacity and good stability, the photo-thermal enhancement of enzyme activity under near infrared light irradiation can be realized, and then the immobilized lactase is obtained by activating the material by glutaraldehyde and covalently coupling the material with lactase. The invention breaks through the previous problem that the soluble lactose can not be separated and recovered, and limits the continuous and long-term application in practice. The immobilized lactase obtained by the invention has the enzyme activity about 152% of that of soluble lactase under the irradiation of near infrared light, and the enzyme has very high stability and reusability, thereby being beneficial to the continuous operation of a microsphere reactor and leading the immobilized enzyme technology to have wide application prospect in the future industrial field.)

一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶 及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶及其制备方法。

背景技术

酶是一种高度特异性的生物催化剂，在工业过程、环境领域、疾病诊断等领域有着广泛的应用。在各种酶中，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)在催化乳糖转化为半乳糖和葡萄糖乳制品行业中是一个很重要的酶。近年来，水解反应在干酪乳清的改良、产品甜度和品质的改善、有价值的半乳糖和无乳糖乳制品的生产等方面得到了广泛的关注。乳糖不耐症是世界上一半以上人口的普遍情况，它可导致多种消化系统症状，包括腹痛、腹泻和排气。用乳糖酶作为补充物和水解乳糖是解决症状的可行手段。但是在一直变化的热化学环境中其稳定性很差，不能分离和回收可溶性乳糖，限制了在实践中的连续和长期应用。开发有效的方法来提高酶的稳定性和可重复利用性是非常必要的。

在适当的固体载体上固定化酶是克服酶活性低、稳定性差、可重复利用等缺点的有效方法。目前已开发出几种固定化乳糖酶的方法，包括吸附、封装和共价键合。物理吸附方法便捷，但酶与载体间的相互作用较弱，容易导致酶的泄露。水凝胶珠用于乳糖酶的包封，提高了酶的稳定性，但较大的孔径会导致酶的快速泄漏。另外，其机械强度差、尺寸大，限制了进一步的应用。通过比较，化学共价固定化乳糖酶的效果较小尺寸矩阵提供了良好的键合稳定性和可恢复性，几种基质包括有机材料(如天然和合成聚合物)和无机材料 (如多壁碳纳米管、磁性纳米复合材料和二氧化硅颗粒)已成功用于固定化乳糖酶。酶稳定性的提高有助于微球反应器的连续运行，使固定化酶技术在未来的工业领域具有广阔的应用前景。

近年来，人们制备了多种等离子体纳米复合材料作为功能载体，在光辐射条件下实现酶的固定化和增强酶的活性。与传统的散体加热方法不同，等离子体纳米结构具有良好的光热转换能力，可以实现快速局部加热。酶活性可通过调节光照时间和光照功率来控制。 Singamaneni等报道了金纳米棒介导的固定化酶活性的光热增强。 Fan等采用Ti₃C₂T_x纳米片作为载体和光热材料，提高了脂肪酶的催化活性。

氧化石墨烯(GO)是一种典型的二维纳米片材料，具有高比表面积、大量的活性基团和优异的光热性能。由于这些独特的物理和化学特性，氧化石墨烯和氧化石墨烯基纳米复合材料已被证明是蛋白质固定化、药物传递和光热转换的高性能平台。可以预见，氧化石墨烯基是有希望同时实现乳糖酶的固定化和酶活性的光热增强这个目标的候选材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶及其制备方法，解决了乳糖酶(β-半乳糖苷酶) 的酶的活性易受影响，稳定性差及可溶性乳糖酶的重复利用性差，阻碍了其连续、长期的使用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶，该固定化乳糖酶采用戊二醛激活功能载体上的氨基与乳糖酶键合；

所述功能载体为改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料，所述材料以氧化石墨烯为原料由溶剂热反应合成磁性纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合材料，并用芘丁酸和聚乙烯亚胺对其改性而得。

进一步的，该固定化乳糖酶的最适反应pH值为5.0，最适反应温度为38～41℃，反应动力学常数Km为8.52mmol/L，Vmax为 38.2mmol/min。

进一步的，所述改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料固定化乳糖酶的负载比例达到278.8mg/g。

进一步的，所述改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料的制备及固定酶的过程使得结构更加粗糙，保障了酶的稳定性和可重复利用性。

进一步的，该固定化乳糖酶分散有纳米磁性粒子，在磁分离和水解反应的连续操作过程中可表现出良好的重复使用性能。

一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)取氧化石墨烯进行超声处理后，分散于氧化石墨烯质量 900～1100倍的乙二醇中混合，得混液，依次加入混液质量0.48～0.55％的六水氯化铁、混液质量1.98～2.43％的乙酸钠、混液质量0.085～0.11％的柠檬酸钠混合，得混合物，将混合物以超声波处理，转移到高压釜在190～220℃条件下反应，冷却，收集产物后用乙醇和去离子水清洗，干燥，得mGO，然后按质量比4～6：1取mGO和芘丁酸分散在mGO质量460～520倍的丙酮溶液中，并将混合溶液在 25～35℃下超声处理，搅拌，磁分离mg-pba产物，再用无水乙醇洗涤，干燥，得到mGP，按质量比10：3～4：700～900取mGP和聚乙烯亚胺分散在乙醇溶液中，在28～32℃下进行交联反应，得 mGP-PEI，水洗，干燥，即为改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料；

(2)按质量比1：560～650取干燥后的mGP-PEI分散于乙酸缓冲液中，在28～33℃下震荡，再用醋酸缓冲液洗涤，将活化后的 mGP-PEI与含有1.0mg/mL乳糖酶的醋酸缓冲液混合，将悬浮液在 28～32℃下放置4～6h，用醋酸缓冲液磁选洗涤，即得具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶。

进一步的，所述步骤(1)中经高压釜处理后用磁铁收集产物。

进一步的，所述步骤(1)中的乙醇溶液中含有20mmol/L的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和8mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺。

进一步的，所述步骤(2)中的所述乙酸缓冲液的浓度为0.1mol /L，pH为5.0，并含有质量分数为2.5％的戊二醛。

进一步的，所述步骤(2)中的醋酸缓冲液浓度0.1mol/L，pH 为5.0。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

(1)本发明制备用于乳糖酶固定化的功能性磁性氧化石墨烯纳米复合材料的过程，采用了包括溶剂热反应合成磁性纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合材料(MGO)，以及随后通过各自的π相互作用和静电相互作用对芘丁酸和聚乙烯亚胺表面改性，在戊二醛激活后，乳糖酶共价固定在功能载体上的氨基上，受益于芘丁酸和聚乙烯亚胺的引入，表面活性基团和由此产生的键合能力显著提高，由于氧化石墨烯组分的光热特性，在近红外光照射下，固定化乳糖酶周围的局部温度升高，通过调节光照参数，可使固定化乳糖酶的酶活性显著提高。

(2)本发明突破了以往不能分离和回收可溶性乳糖限制了其在实践中的连续和长期应用的问题；近红外光照射下mGPP-乳糖酶的酶活性约为可溶性乳糖酶活性的152％，能够有效地降解聚乳糖；提高酶的稳定性和可重复利用性，有助于微球反应器的连续运行，使固定化酶技术在未来的工业领域具有广阔的应用前景。

(3)本发明提供了一种制备磁性纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合材料的方法，并将所得材料作为乳糖酶共价固定的功能载体，并详细研究了几种固定参数对负载量、固定效率和酶活性的影响，由于mGPP具有多种组分和独特的结构，使其具有高的负载能力，所以其能在较广的pH溶液和温度条件下具有良好的稳定性。此外，本申请还试验了mGPP的光热特性对固定化乳糖酶酶活性的影响，结果表明，mGPP在近红外光照射下可以产生热量，导致局部表面温度升高，使得固定化乳糖酶活性较游离乳糖酶活性增强，mGPP-乳糖酶在磁分离和水解反应的连续操作过程中表现出良好的重复使用性能，此外，在乳糖水解中，mGPP-乳糖酶表现出比可溶性乳糖酶更好的性能，通过近红外光照射进一步增强了mGPP-乳糖酶的水解能力，因此，用磁性氧化石墨烯固定化乳糖酶有望在生物催化领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为用透射电子显微镜(TEM)对制备材料的结构特征表征图，其中，(a)GO、(b)mGO、(c)mGPP、(d)mGPP-乳糖酶。

图2为利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)研究所制备材料的化学成分所得谱图，其中，(a)FTIR光谱(b)Zeta电位(i)GO,(ii)mGO,(iii) mGP,(iv)mGPP,(v)mGPP-乳糖酶。

图3为用X射线衍射(XRD)分析测定了GO、mGO和mGPP-乳糖酶的晶体结构谱图，其中，(a)XRD图谱：(i)GO,(ii)mGO,and(iii) mGPP-Lactase，(b)磁化曲线(i)mGO,and(ii)mGPP-Lactase；在(b)中的嵌体是分散在水溶液(左)和磁分离(右)后的mGPP-Lactase的数字图像。

图4为乳糖酶在mGO、mGE和mGPP三种不同载体上的负载能力和固定化效率柱状图。

图5为pH和温度对可溶性和固定化乳糖酶活性的影响谱图。

图6为在近红外光照射不同时间mGPP-乳糖酶的酶活性变化柱状图，初始活性为100％。

图7为在近红外光照射下mGPP-乳糖酶的可重用性柱状图。

图8为不同条件下可溶性或固定化乳糖酶水解乳糖谱图：

(a)近红外光照射下的mGPP-乳糖酶；(b)不受近红外光照射下的mGPP-乳糖酶；(c)近红外光照射下的可溶性乳糖酶；(d)不受近红外光照射的可溶性乳糖酶。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶，该固定化乳糖酶采用戊二醛激活功能载体上的氨基与乳糖酶键合；所述功能载体为改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料，所述材料以氧化石墨烯为原料由溶剂热反应合成磁性纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合材料，并用芘丁酸和聚乙烯亚胺对其进行改性而得。该固定化乳糖酶的最适反应pH值为5.0，最适反应温度为38～41℃，反应动力学常数Km为8.52mmol/L，Vmax为38.2mmol/min。所述改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料固定化乳糖酶的负载比例达到 278.8mg/g。所述改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料在近红外光照射下会产生热量，导致局部表面温度升高，使得固定化乳糖酶活性较游离乳糖酶活性增强。所述改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料的制备及固定酶的过程使得结构更加粗糙，保障了酶的稳定性和可重复利用性。该固定化乳糖酶在磁分离和水解反应的连续操作过程中表现出良好的重复使用性能。

一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)取氧化石墨烯进行超声处理后，分散于氧化石墨烯质量 900～1100倍的乙二醇中混合50～70min，得混液，然后依次加入混液质量0.48～0.55％的六水氯化铁、混液质量1.98～2.43％的乙酸钠、混液质量0.085～0.11％的柠檬酸钠混合，得混合物，将混合物以超声波处理1～1.8h，然后转移到Teflon-lined不锈钢高压釜在190～220℃条件下反应5～7h，冷却至室温，得到的产品用磁铁收集，之后用乙醇和去离子水清洗三次，在50～60℃下干燥7～10h，得mGO，然后按质量比4～6：1取mGO和芘丁酸分散在mGO质量460～520 倍的丙酮溶液中，并将混合溶液在25～35℃环境下超声25～45min，继续搅拌20～24h，磁分离mg-pba(简称mGP)产物，用无水乙醇洗涤3次，在50～60℃下干燥7～10h，按质量比10：3～4：700～ 900取mGP和聚乙烯亚胺分散在体积分数为25％的乙醇溶液中，其中同时含有20mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和8mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺，交联反应在28～32℃下进行 7～10h，最后将得到的mGP-PEI(简称mGPP)用去离子水清洗3次，干燥，即为改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料；

(2)按质量比1：560～650取干燥后的mGPP分散于含2.5％戊二醛的乙酸缓冲液(0.1mol/L，pH 5.0)中，混合溶液在28～33℃下轻轻震荡3～5h，将戊二醛活化的mGPP用醋酸缓冲液(0.1mol/L， pH 5.0)洗涤三次，随后，将活化后的mGPP与醋酸缓冲液混合(0.1mol/L，pH5.0)含有乳糖酶(1.0mg/mL)，悬浮液在28～32℃下放置4～6h，用醋酸缓冲液磁选洗涤三次后(0.1mol/L，pH5.0)，得到了乳糖酶固定化载体(mGPP-乳糖酶)。

收集清洁过程中的洗涤液，用Bradford蛋白法测定蛋白质浓度。固定乳糖酶的负载量用固定乳糖酶的量除以载体的量，固定化效率由固定乳糖酶的量除以乳糖酶的初始量来确定。

实施例1

一种具有光热增强酶活性的磁性氧化石墨烯基固定化乳糖酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)取氧化石墨烯进行超声处理后，分散于氧化石墨烯质量 1100倍的乙二醇中混合60min，得混液，然后依次加入混液质量0.51％的六水氯化铁、混液质量2.23％的乙酸钠、混液质量0.093％的柠檬酸钠混合，得混合物，将混合物以超声波处理1.2h，然后转移到Teflon-lined不锈钢高压釜在200℃条件下反应6h，冷却至室温，得到的产品用磁铁收集，之后用乙醇和去离子水清洗三次，在55℃下干燥8h，得mGO，然后按质量比5：1取mGO和芘丁酸分散在mGO 质量480倍的丙酮溶液中，并将混合溶液在30℃环境下超声35min，继续搅拌22h，磁分离mg-pba(简称mGP)产物，用无水乙醇洗涤3 次，在55℃下干燥8h，按质量比10：3.4：800取mGP和聚乙烯亚胺分散在体积分数为25％的乙醇溶液中，其中同时含有20mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和8mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺，交联反应在30℃下进行8h，最后将得到的 mGP-PEI(简称mGPP)用去离子水清洗3次，干燥，即为改性磁性氧化石墨烯纳米复合材料；

(2)按质量比1：620取干燥后的mGPP分散于含2.5％戊二醛的乙酸缓冲液(0.1mol/L，pH 5.0)中，混合溶液在30℃下轻轻震荡 4h，将戊二醛活化的mGPP用醋酸缓冲液(0.1mol/L，pH 5.0)洗涤三次，随后，将活化后的mGPP与醋酸缓冲液混合(0.1mol/L，pH5.0)含有乳糖酶(1.0mg/mL)，悬浮液在30℃下放置5h，用醋酸缓冲液磁选洗涤三次后(0.1mol/L，pH5.0)，得到了乳糖酶固定化载体(mGPP- 乳糖酶)。

实施例1中的mGPP和固定化乳糖酶的表征：

用透射电子显微镜(TEM)对实施例1所得载体材料结构特征进行表征。如图1a所示，GO具有分层、起皱和地毯状的结构。与GO 纳米片的光滑表面相比，Fe₃O₄纳米粒子在溶剂热反应后分散在GO 纳米片上变得粗糙一些。Fe₃O₄纳米粒子的平均直径约为105nm(图 1b)。此外，用芘丁酸和聚乙烯亚胺改性后，GO纳米片和Fe₃O₄纳米粒子的形貌略有变化(图1c)。此外，乳糖酶共价固定后的mGPP 表面比原始的mGO和mGPP表面粗糙(图1d)。

利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)研究所制备材料的化学成分。如图2a所示，GO的FTIR光谱中1718cm^-1和1047cm^-1的特征吸收峰分别归因于C-O伸缩振动和C＝O伸缩振动。在582cm^-1处的吸收峰对应于Fe₃O₄的Fe-O带的伸缩振动，表明了mGO的成功合成。此外，mGP的FTIR光谱与mGO相比略有变化。在mGPP的FTIR 光谱中，明显观察到2938cm^-1和2854cm^-1处的特征吸收峰与聚乙烯亚胺上CH₂基团的C-H伸缩振动有关。mGPP在1566cm^-1处呈现出一个吸收带，对应于改性聚乙烯亚胺上NH₂基团的对称弯曲振动。在mGPP-乳糖酶的FTIR光谱中，在1651cm^-1和1548cm^-1处出现了两个新的吸收峰，属于酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ带的固定化蛋白。这些结果证明了乳糖酶在功能载体上成功固定化。

合成材料的Zeta电位值如图2b所示。与纯水中负zeta电位 (-29.5mV)的GO相比，mGO的zeta电位增强为-12.8mV。芘丁酸和聚乙烯亚胺交替改性后，mGP和mGPP的电位分别变为-34.2mV和 +30.8mV。结果表明，芘丁酸表面改性后，羧基含量增加。mGPP- 乳糖酶的电位相对较低为+9.8mV，这说明乳糖酶通过戊二醛化学键合成功。

用X射线衍射(XRD)分析测定了GO、mGO和mGPP-乳糖酶的晶体结构。在图3a中，在GO的XRD图谱中观察到位于2θ＝10.20 的衍射峰。在30.00、35.13、42.98、56.56和62.36处出现了5个新的衍射峰，分别为Fe₃O₄(JCPD S19-6)的(220)、(311)、(400)、(511) 和(440)晶面。此外，mGPP-乳糖酶XRD图谱中的衍射峰与mGO 的衍射峰相似，但观察到的峰强度相对较低，其结果归因于存在改性聚合物和固定化蛋白。

用振动试样磁强计研究了mGO和mGPP-乳糖酶的磁性能。得到的磁滞曲线如图3b所示。确定mGO和mGPP-乳糖酶的磁化强度饱和值分别为30.8emug^-1和9.46emug^-1。尽管磁化强度饱和值相对较低，但mGPP-乳糖酶具有足够的磁分离能力。正如数字图像图3b 所显示的，均匀分散的磁性纳米复合材料可以在施加外部磁铁时快速去除并附着在玻璃瓶内壁上。

对实施例1所得载体材料和固定化酶进行如下测试：

1.乳糖酶活性测定

用显色底物邻硝基苯-β-半乳糖苷测定可溶性乳糖酶和固定化乳糖酶(实施例1所得酶)的酶活性。详细地，将0.2mL的可溶性乳糖酶或固定化乳糖酶与1.0mL的乙酸缓冲液(0.1mol/L，pH4.5)在50℃下反应5min，其中含有邻硝基苯β-半乳糖苷(15m mol/L)。用紫外分光光度计测量波长405nm处的吸光度值，测定邻硝基苯酚释放量。乳糖酶活性被定义为一个单位每分钟释放1μmol邻硝基苯酚的酶量。并进行三次平行试验。

2.pH、温度、近红外辐射对乳糖酶活性影响的研究

通过在不同pH值范围为2.0～8.0的缓冲溶液中培育混合物，评估pH溶液对可溶性乳糖酶或固定化乳糖酶(实施例1所得酶)活性的影响(甘氨酸-HCl，pH2.0-3.0；乙酸缓冲液，pH4.0-5.5；磷酸盐缓冲液，pH6.0-8.0)在50℃下放置1h。测定酶的持续活性。相对活性以最大活性(100％)的百分比表示。

研究温度条件对可溶性乳糖酶或固定化乳糖酶活性的影响，将混合物在不同温度(30～70℃)下在醋酸缓冲液中放置1h(pH4.5)，测定酶的持续活性。相对活性以最大活性(100％)的百分比表示。

采用标准乳糖酶活性测定反应，在近红外光照射(808nm，1Wm) 下，研究近红外光照射对固定化乳糖酶活性的影响，环境温度为25℃，分别为5、10、20和30min。相对活性以最大活性(100％)的百分比表示。

在标准条件下，除25℃和近红外光照射30分钟反应温度外，通过对邻硝基苯-β-半乳糖苷在标准条件下的水解，研究了固定化乳糖酶(实施例1所得酶)的可重用性。在每次循环后，固定化乳糖酶与反应液磁分离。将收集到的固定化乳糖酶用乙酸缓冲液(pH5.0)连续洗涤20次，相对酶活性显示为初始活性(100％)的百分比。

3.动力学参数的确定

用Lineweaver-Burk线性化方法测定了可溶性乳糖酶和固定化乳糖酶(实施例1所得酶)的动力学参数(Michaelis常数Km，最大反应速度Vmax)。酶活性测定采用单硝基苯-β-半乳糖苷浓度为0～15mmol/L。

4.固定化乳糖酶的重复利用

在标准条件下，除25℃和近红外光照射30分钟反应温度外，通过对邻硝基苯-β-半乳糖苷在标准条件下的水解，研究了固定化乳糖酶的可重用性。在每次循环后，固定化乳糖酶与反应液磁分离。将收集到的固定化乳糖酶用乙酸缓冲液(pH5.0)连续洗涤20次，相对酶活性显示为初始活性(100％)的百分比。

5.乳糖的水解

以脱脂乳为原料，测定乳糖水解酶的可溶性和固定化乳糖酶的酶解能力。可溶性乳糖酶和固定化乳糖酶(实施例1所得酶)分别与脱脂乳溶液(10m L)在25℃或连续近红外光光照射下反应。在一定的时间段内，提取0.20mL的溶液，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联实验测定生成的葡萄糖量。

A.mGPP的蛋白固定化性能

为了达到固定化乳糖酶高负荷能力、固定化效率和酶活性的平衡。研究了乳糖酶初始浓度、反应时间和pH值等系统参数。同时合成了mGO和mGO-PEI(简称mGE)，用于固定化乳糖酶，特别是乳糖酶通过范德华力和静电相互作用固定在mGO上。如图4、5所示，固定化乳糖酶在这三种载体上的负载能力随着乳糖酶初始浓度的增加和反应时间的延长而增加，直至达到平衡值。例如对于mGPP-乳糖酶，乳糖酶的优化初始浓度为1.0mg/ml，反应时间为5h，适当的 pH条件为5.0。如图4所示，固定化乳糖酶在每个优化条件下的负载量分别为35.6、189.6和278.8mg/g。改性的芘丁酸分子有大量的羧基，随后产生大量氨基，然后得到固定化乳糖酶。另外，乳糖酶在这三种载体上的固定效率分别为58.4％、73.9％和86.8％。mGPP-乳糖酶的负载量也高于以前开发的几种材料，其结果可归因于高比表面积、丰富的氨基以及乳糖酶与功能载体之间的强键相互作用。

固定化乳糖酶的保留酶活性与反应时间、pH条件和载体有关。在初始阶段，mGE-乳糖酶和mGPP-乳糖酶的酶活性增加，但随着交联反应的进行，酶活性降低(图5a)。酶活性下降可归因于乳糖酶与多个戊二醛分子之间的过度交联反应。mGE-乳糖酶和mGPP-乳糖酶的最佳反应时间分别为4h和5h。pH条件对mGE-乳糖酶和mGPP- 乳糖酶的酶活性有很大的影响，适宜的pH条件均为5.0(图5a)。另外，mGPP-乳糖酶的酶活性是mGE-乳糖酶的1.4倍，其原因是由于载体上乳糖酶的结合量较高。

测定了可溶性和固定化乳糖酶的动力学参数。计算得到可溶性乳糖酶和mGPP-乳糖酶的Km值分别为6.98mmol/L和8.52mmol/L, 酶固定化后Km值的增加也在之前的其他报道中研究到过。可溶性乳糖酶和mGPP-乳糖酶，Vmax值分别为47.8mmol/min和 38.2mmol/min。与可溶性乳糖酶相比，mGPP-乳糖酶具有较高的 Km值和较低的Vmax值，其结果可能是由于载体上的乳糖酶具有较强的多点共价键，阻止了乳糖酶构象的变化。

研究了pH和温度对可溶性和固定化乳糖酶活性的影响谱图。如图5a所示，使mGPP上的固定化乳糖酶的最佳pH值从4.5改变到 5.0，在酸性和碱性pH范围内，mGPP-乳糖酶的活性均高于可溶性乳糖酶。例如，在pH为2的酸性溶液中，mGPP-乳糖酶保留76.3％的活性，而可溶性乳糖酶仅保留32.3％的活性。在pH为8.0时，mGPP -乳糖酶保留62.9％的活性，而可溶性乳糖酶仅保留23.6％的活性。酶活性的提高可能是由于柔性载体与乳糖酶之间存在很强的共价键，从而提高了乳糖酶对pH变化的耐受性。如图5b所示，乳糖酶固定化的最佳温度从50℃提高到55℃，且mGPP-乳糖酶在高温和低温下均表现出较高的活性。例如，mGPP-乳糖酶和可溶性乳糖酶在30℃时的相对活性分别为63.6％和40.2％。在70℃条件下，mGPP-乳糖酶保持81.7％活性，可溶性乳糖酶仅保持48.5％活性。结果表明，在 mGPP载体上固定化后，乳糖酶结构的构象刚性可能发生了变化， mGPP-乳糖酶比可溶性乳糖酶具有更高的耐高温性能。

B.光热增强mGPP-乳糖酶活性

氧化石墨烯纳米片具有很强的光吸收和光热转换能力，有望成为一种有前途的光热材料，用于控制固定化乳糖酶的酶活性。为了检测这种可能性，在近红外光照射下测定了mGPP-乳糖酶的活性。如图6所示，在近红外光照射下，mGPP-乳糖酶的酶活性明显增强，连续照射30min后，mGPP-乳糖酶的酶活性较无近红外光照射时提高了近1.90倍。即使mGPP-乳糖酶保留了约80％的可溶性乳糖酶活性，但近红外光照射下mGPP-乳糖酶的酶活性约为可溶性乳糖酶活性的152％。酶活性的提高可归因于氧化石墨烯纳米片具有良好的光热效应，可以在近红外光照射下产生热量，提高固定化乳糖酶的局部温度，进而提高固定化乳糖酶的活性。与温度相关的活性与图5b 中的分析结果一致。

由于游离乳糖酶在缓冲溶液中的溶解度大，一般难以回收利用。相比之下，通过施加磁场，制备出的mGPP-乳糖酶却可以很容易并且快速地从反应溶液中分离出来。通过重复使用几个周期来研究 mGPP-乳糖酶的可重用性，图7显示了连续酶促反应后mGPP-乳糖酶的相对活性。由图所示，mGPP-乳糖酶活性缓慢下降，连续20 个周期后仍保持83.1％的初始活性，其酶活性的降低可能与操作过程中乳糖酶蛋白的变性有关。与其他固体载体相比，制备的mGPP- 乳糖酶具有良好的稳定性和可操作性，其结果可能与温和的磁性分离、灵活的固体载体以及乳糖酶与固体载体间的共价相互作用有关。

研究可溶性乳糖酶和固定化乳糖酶的乳糖水解性能。图8显示了不同时间间隔无近红外光照射和近红外光照射的乳糖水解。没有近红外光照射，可溶性乳糖酶和mGPP-乳糖酶分别在6h内从牛奶中水解247μmol和316μmol乳糖，乳糖水解量越大，说明mGPP-乳糖酶的水解性能越好。mGPP-乳糖酶在近红外光光照6h下水解 438μmol乳糖，比可溶性乳糖酶水解乳糖254μmol的量略有提升。在没有mGPP支持的情况下，在近红外光照射下可溶性乳糖酶的局部温度几乎没有变化，而mGPP-乳糖酶在近红外光照射下的局部温度显著提高，这有助于水解能力的提高。因此，制备的mGPP是一种很有前途的光热生物催化剂，可用于降低牛奶中乳糖的含量。

综上所述，本发明提供了一种制备磁性纳米粒子-氧化石墨烯纳米复合材料(mGPP)的方法，并将所得材料作为乳糖酶共价固定的功能载体，并详细研究了几种固定参数对负载量、固定效率和酶活性的影响，由于mGPP具有多种组分和独特的结构，使其具有高的负载能力，所以其能在较广的pH溶液和温度条件下具有良好的稳定性。此外，本申请还试验了mGPP的光热特性对固定化乳糖酶酶活性的影响，结果表明，mGPP在近红外光照射下可以产生热量，导致局部表面温度升高，使得固定化乳糖酶活性较游离乳糖酶活性增强。mGPP-乳糖酶在磁分离和水解反应的连续操作过程中表现出良好的重复使用性能。此外，在乳糖水解中，mGPP-乳糖酶表现出比可溶性乳糖酶更好的性能，通过近红外光照射进一步增强了mGPP-乳糖酶的水解能力。因此，用磁性氧化石墨烯固定化乳糖酶有望在生物催化领域具有广阔的应用前景。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。