阅读说明：本技术 一种同时提取dna和rna的试剂盒及其使用方法 (Kit for simultaneously extracting DNA and RNA and use method thereof ) 是由 卢秀劲 王小芳 于 2020-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种同时提取DNA和RNA的试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒包括以下试剂：细胞裂解液、核酸结合液、核酸吸附材料、洗脱液A、去蛋白漂洗液、去盐分漂洗液和洗脱液B。本发明通过选择性的洗脱DNA,将RNA继续保留在吸附材料上,达到分级分离DNA与RNA的效果。本发明区别于用于同时提取DNA和RNA的TRIzol法,所用的试剂种类少,不使用苯酚、氯仿等有毒溶剂,且能够用于核酸纯化仪上,具有快速、高效、高通量、环保、可自动化同时提取DNA和RNA的优点。(The invention relates to a kit for simultaneously extracting DNA and RNA and a using method thereof. The kit of the invention comprises the following reagents: cell lysate, nucleic acid binding solution, nucleic acid adsorption material, eluent A, deproteinized rinsing solution, desalted rinsing solution and eluent B. The invention can keep RNA on the adsorbing material by selectively eluting DNA, thereby achieving the effect of separating DNA and RNA by grades. The method is different from a TRIzol method for simultaneously extracting DNA and RNA, uses few reagents, does not use toxic solvents such as phenol, chloroform and the like, can be used on a nucleic acid purification instrument, and has the advantages of rapidness, high efficiency, high flux, environmental protection and capability of automatically and simultaneously extracting DNA and RNA.)

一种同时提取DNA和RNA的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种同时提取DNA和RNA的试剂盒及其使用方法。

背景技术

DNA和RNA统称为核酸，核酸是分子生物学研究与应用中最基本的研究检测对象，如何获得高质量的核酸已成为重要且基本的实验技术。目前的技术路线都是针对单独提取DNA或RNA的，如果要同时提取DNA与RNA就必须要把实验材料一分为二来进行。目前用于核酸提取的技术主要包括：酚氯仿萃取法、硅胶柱分离法、盐析法和磁珠法。这些技术基本上都只能提取DNA或 RNA，不能使用同一份样品同时提取到DNA和RNA。

用于提取RNA的经典方法TRIzol法目前是同时提取DNA与RNA最常用的方法。所谓TRIzol法，即“胍-酚-氯仿”法，是把胍盐与苯酚配成单一溶液，细胞裂解后游离出核酸，再加入氯仿提取，经离心后水相与有机相分离，RNA存在于水相中，DNA存在于有机相中，进而到达同时提取DNA和RNA的效果。这种方法操作复杂，而且苯酚、氯仿等都是有毒的有机溶剂，既不环保也无法实现高通量自动化提取。

专利号为ZL201510982621.9的发明(申请人为北京艾德莱生物科技有限公司)公开了一种用于DNA和RNA同时提取的试剂，提取方法和通途。该发明操作复杂而且使用了酚氯仿等有毒的有机溶剂，且该方法是把RNA从总核酸中洗脱掉下来，因为RNA与硅质材料吸附更紧密，所以很难保证特异性洗脱RNA 而不洗脱DNA。

目前，随着二代测序技术的成熟，临床上越来越多的样品运用二代测序技术进行疾病预测与诊断，如何快速、高效、高通量地同时提取DNA与RNA具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种快速、高效、环保、高通量的同时提取DNA和RNA的试剂盒及提取方法。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种同时提取DNA和RNA的试剂盒，包括以下试剂：细胞裂解液、核酸结合液、核酸吸附材料、洗脱液A、去蛋白漂洗液、去盐分漂洗液和洗脱液B。

细胞裂解液将细胞裂解，使细胞内核酸游离出来；核酸结合液能够创建核酸与吸附材料相结合的环境，使核酸特异性地吸附到吸附材料上，通过吸附材料的特异性选择而去掉蛋白等杂质；去蛋白漂洗液及去盐分漂洗液可以进一步去除痕量杂质，保证核酸样品的纯净；核酸吸附材料可吸附核酸，根据吸附力的不同可以使用不同的洗脱液将DNA与RNA分别洗脱。

优选地，所述细胞裂解液包含以下成分：表面活性剂1～20％(v/v)、蛋白变性剂1～5mol/L、核酸酶抑制剂0.1～1mol/L、pH稳定剂0.1～1mol/L。

优选地，所述表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、曲拉通X-100、吐温20中的至少一种。

优选地，所述蛋白变性剂为盐酸胍、异硫氰酸胍或尿素中的至少一种。

蛋白变性剂可高效地使核酸酶等蛋白质变性而失活，从而保护核酸不被水解。

优选地，所述核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸、乙二醇-双-(2-氨基***)四乙酸、巯基乙醇、TCEP与二硫苏糖醇中的至少一种。

优选地，所述的pH稳定剂为三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、3- 吗啉丙磺酸、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸中的至少一种。

核酸酶抑制剂可以抑制细胞内核酸酶的活性，保护核酸防止被水解。

优选地，所述核酸结合液为含胍盐的溶液、醇溶液中的至少一种；所述含胍盐的溶液中胍盐的浓度为0.1～8mol/L，所属醇溶液中醇的体积百分比为40～ 80％。

优选地所述胍盐为盐酸胍、异硫氰酸胍中的至少一种，所述胍盐的浓度为 1～4mol/L。

优选地，所述醇溶液中的醇为乙醇、聚乙二醇或异丙醇，所述醇溶液中醇的体积百分比为40～60％。

优选地，所述核酸吸附材料为硅质纯化柱或二氧化硅四氧化三铁纳米磁珠。

优选地，所述洗脱液A为含氯化物的溶液、醇溶液中的至少一种；所述含氯化物的溶液中氯化物的浓度为0.05～6mol/L,所述醇溶液中醇的体积百分比为 5～40％。

DNA洗脱液是根据DNA、RNA各自与硅质材料结合强度不同，能够特定地使DNA从吸附材料中游离出来，而且能够保证RNA与吸附材料继续稳定结合，达到将RNA与DNA分离的目的。

优选地，所述氯化物为氯化钠、氯化铵或氯化镁中至少一种；所述醇溶液中的醇为乙醇或异丙醇，所述醇溶液中醇的体积百分比为4～30％。

优选地，所述去蛋白漂洗液为胍盐或乙醇溶液中至少一种；所述去盐漂洗液为乙醇溶液；所述洗脱液B为DEPC处理水。

上述同时提取DNA和RNA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)在样品中加入裂解液，混匀并离心获得上清液；

(2)取步骤(1)中的上清液加入核酸结合液，混匀后转移到核酸吸附材料中；

(3)当所述核酸吸附材料为硅质纯化柱时，将步骤(2)中的核酸吸附材料离心弃除离心液，并向核酸吸附材料中加入去蛋白漂洗液，离心保留吸附材料；

当所述核酸吸附材料为二氧化硅四氧化三铁纳米磁珠时，将步骤(2)得到的核酸吸附材料置于磁场中，去除液体并保留核酸吸附材料；

(4)DNA洗脱：向步骤(3)处理后的核酸吸附材料中加入洗脱液A，离心收集滤液；

(5)向步骤(4)处理后的核酸吸附材料中加入洗脱液A，离心保留吸附材料并干燥；

(6)RNA洗脱：向步骤(5)处理后的核酸吸附材料中加入洗脱液B，离心即获得RNA；

(7)DNA纯化：取步骤(4)获得的滤液，加入等体积的核酸结合液，混匀，转移到吸附材料，离心吸附DNA，去除滤液，加入去盐分洗脱液，室温离心，重复一次后室温干燥，加入洗脱液B，即获得DNA。优选地，所述离心的转速为12000rpm，离心的时间为1min。

优选地，所述干燥的温度为20～25℃，干燥的时间为1min。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的试剂盒中不含有酚氯仿等有毒有机溶剂，成分环保；与传统TRIzol 法相比操作简单，且提取的DNA与RNA纯度高，具有快速、高效、可同时提取DNA和RNA的优点。另外，本发明的试剂盒可以用于核酸纯化仪上，并自动化操作，可实现高通量提取DNA与RNA，满足了二代测序的需要。

附图说明

图1为本发明提取DNA和RNA的1％琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将列举具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种同时提取DNA和RNA的试剂盒，包括以下成分：

细胞裂解液：2％SDS、100mM Tris、2％PVP、0.5％巯基乙醇、1.4M NaCl、 10mMEDTA；

核酸结合液：75％乙醇溶液；

核酸吸附材料：硅质纯化柱；

洗脱液A：0.1M氯化钠，30％乙醇；

去蛋白漂洗液：1M盐酸胍50％乙醇；

去盐分漂洗液：75％乙醇溶液；

洗脱液B：DEPC处理水。

本实施所述同时提取DNA和RNA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将100mg植物样品经液氮研磨后中加入到含有0.6ml细胞裂解液的 1.5ml离心管中，剧烈涡旋混匀，70℃水浴10分钟后，加入0.2ml 3M乙酸铵溶液，混匀常温12000rpm离心1min，获得上清；

(2)取上述步骤(1)获得的上清0.4ml，加入0.4ml核酸结合液，混匀后转移混合物到硅质纯化柱中，离心过滤吸附核酸；

(3)向步骤(2)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml去蛋白漂洗液，离心除掉漂洗液；

(4)DNA洗脱：向步骤(3)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml洗脱液A，离心收集过滤液用于DNA提取与纯化；

(5)向步骤(4)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml DNA洗脱液，室温下 12000rpm离心1min并干燥；

(6)RNA洗脱：向步骤(5)处理后的硅质纯化柱中加入0.1ml DEPC水，离心洗脱即获得RNA；

(7)DNA纯化：取步骤(4)获得的滤液，加入等体积的核酸结合液，混匀后室温下12000rpm离心1min，去掉上清保留沉淀，加入0.6ml去盐分漂洗液，混匀后室温下12000rpm离心1min，重复两次后室温干燥1min，加入0.1ml DEPC 处理水溶解沉淀，即获得高纯度DNA。

步骤(1)中加入乙酸铵沉淀除去多糖多酚等植物次代谢产物。

实施例2

一种同时提取DNA和RNA的试剂盒，包括以下成分：

细胞裂解液：4M异硫氰酸胍、100mM Tris、30mM TCEP、1％Triton X-100、 10mMEDTA；

核酸结合液：75％乙醇溶液；

核酸吸附材料：硅质纯化柱；

洗脱液A：0.1M氯化铵、40％乙醇；

去蛋白漂洗液：3M异硫氰酸胍、40％乙醇；

去盐分漂洗液：75％乙醇溶液；

洗脱液B：DEPC处理水。

上述同时提取DNA和RNA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将30mg动物组织样品加入到含有0.6ml细胞裂解液的1.5ml离心管中，用研磨杵将组织彻底研磨，混匀常温12000rpm离心1min，获得上清；

(2)取上述步骤(1)获得的上清0.4ml，加入0.4ml核酸结合液，混匀后转移混合物到硅质纯化柱中，离心过滤吸附核酸；

(3)向步骤(2)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml去蛋白漂洗液，离心除掉漂洗液；

(4)DNA洗脱：向步骤(3)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml洗脱液A，离心收集过滤液用于DNA提取与纯化；

(5)向步骤(4)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml DNA洗脱液，室温下 12000rpm离心1min并干燥；

(6)RNA洗脱：向步骤(5)处理后的硅质纯化柱中加入0.1ml DEPC水，离心洗脱即获得RNA；

(7)DNA纯化：取步骤(4)获得的滤液，加入等倍体积的无水乙醇，混匀后转移混合液到新的硅质纯化柱中，室温下12000rpm离心1min，用0.6ml 去盐分漂洗液漂洗纯化柱2次后，空柱子离心1分钟，干燥柱子，向纯化加入 0.1ml去离子水，离心洗脱，获得高纯度DNA。

实施例3

一种同时提取DNA和RNA的试剂盒，包括以下成分：

细胞裂解液：5M盐酸胍、0.1M Tris、1％曲拉通X-100、4mg/ml蛋白酶K；

核酸结合液：3M异硫氰酸胍，60％乙醇；

核酸吸附材料：硅质纯化柱和二氧化硅四氧化三铁纳米磁珠；

洗脱液A：1M氯化钠，0.1M氯化铵，35％乙醇；

去蛋白漂洗液：3M异硫氰酸胍、40％乙醇；

去盐分漂洗液：80％乙醇溶液；

洗脱液B：DEPC处理水。

上述同时提取DNA和RNA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)取1ml微生物培养液置于1.5ml离心管中，室温下8000rpm离心1分钟收集菌体，去掉培养基；

(2)向菌体加入0.2ml重悬液(0.1M Tris，0.5％Trition x-100,10mM EDTA，10mg/ml溶菌酶)重悬菌体，37℃水浴处理30分钟；

(3)向处理液加入0.2ml细胞裂解液,65℃水浴处理10分钟。

(4)加入0.4ml核酸结合液与25ul二氧化硅四氧化三铁纳米磁珠，混匀室温放置2分钟让磁珠充分吸附核；

(5)将离心管置于高强磁场中吸附磁珠，除去液体，保留磁珠；

(6)DNA洗脱：向含磁珠的离心管中加入0.5ml洗脱液A重悬磁珠并室温静置2分钟，将离心管置于高强磁场中吸附磁珠，吸取液体并保留用于DNA 提取；

(7)向含磁珠的离心管中加入0.5ml去盐分漂洗液，漂洗磁珠，置离心管于磁场中，吸附磁珠弃液体；

(8)RNA洗脱：室温干燥磁珠5分钟，加入0.1ml洗脱液B水溶解RNA，置离心管于磁场中，收集液体即为高质量的RNA；

(9)DNA纯化：向第6步获得的DNA洗脱液加入结合液(4M盐酸胍， 50％异丙醇)与25ul二氧化硅四氧化三铁纳米磁珠，混匀后室温放置2分钟让磁珠充分吸附核酸。置离心管于磁场中吸附磁珠，弃液体；再加入0.5ml去盐分漂洗液，漂洗磁珠，置离心管于磁场中，吸附磁珠弃液体。室温干燥磁珠5 分钟，加入0.1ml去离子水水溶解DNA，置离心管于磁场中，收集液体即为高质量的DNA。

实施例4

本实施例提供一种同时提取DNA和RNA的试剂盒，包括以下成分：

细胞裂解液：1％CTAB、2M异硫氰酸胍、0.1M EDTA；

核酸结合液：40％乙醇溶液；

核酸吸附材料：硅质纯化柱；

洗脱液A：0.05M氯化钠，5％乙醇；

去蛋白漂洗液：1M盐酸胍50％乙醇；

去盐分漂洗液：75％乙醇溶液；

洗脱液B：DEPC处理水。

本实施所述同时提取DNA和RNA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将100mg植物样品经液氮研磨后中加入到含有0.6ml细胞裂解液的 1.5ml离心管中，剧烈涡旋混匀，常温12000rpm离心1min，获得上清；

(2)取上述步骤(1)获得的上清0.4ml，加入0.4ml核酸结合液，混匀后转移混合物到硅质纯化柱中，离心过滤吸附核酸；

(3)向步骤(2)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml去蛋白漂洗液，离心除掉漂洗液；

(4)DNA洗脱：向步骤(3)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml洗脱液A，离心收集过滤液用于DNA提取与纯化；

(5)向步骤(4)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml DNA洗脱液，室温下 12000rpm离心1min并干燥；

(6)RNA洗脱：向步骤(5)处理后的硅质纯化柱中加入0.1ml DEPC水，离心洗脱即获得RNA；

(7)DNA纯化：取步骤(4)获得的滤液，加入等体积的异丙醇，混匀后室温下12000rpm离心1min，去掉上清保留沉淀，加入0.6ml去盐分漂洗液，混匀后室温下12000rpm离心1min，重复两次后室温干燥1min，加入0.1ml DEPC 处理水溶解沉淀，即获得高纯度DNA。

实施例5

一种同时提取DNA和RNA的试剂盒，包括以下成分：

细胞裂解液：20％吐温20/5M异硫氰酸胍、1M EGTA；

核酸结合液：80％乙醇溶液；

核酸吸附材料：硅质纯化柱；

洗脱液A：6M氯化铵、40％乙醇；

去蛋白漂洗液：3M异硫氰酸胍、40％乙醇；

去盐分漂洗液：75％乙醇溶液；

洗脱液B：DEPC处理水。

上述同时提取DNA和RNA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将30mg动物组织样品加入到含有0.6ml细胞裂解液的1.5ml离心管中，用研磨杵将组织彻底研磨，混匀常温12000rpm离心1min，获得上清；

(2)取上述步骤(1)获得的上清0.4ml，加入0.4ml洗脱液A，混匀后转移混合物到硅质纯化柱中，离心过滤吸附核酸；

(3)向步骤(2)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml去蛋白漂洗液，离心除掉漂洗液；

(4)DNA洗脱：向步骤(3)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml DNA洗脱液，离心收集过滤液用于DNA提取与纯化；

(5)向步骤(4)处理后的硅质纯化柱中加入0.5ml DNA洗脱液，室温下 12000rpm离心1min并干燥；

(6)RNA洗脱：向步骤(5)处理后的硅质纯化柱中加入0.1ml DEPC水，离心洗脱即获得RNA；

(7)DNA纯化：取步骤(4)获得的滤液，加入等倍体积的无水乙醇，混匀后转移混合液到新的硅质纯化柱中，室温下12000rpm离心1min，用0.6ml 80％乙醇漂洗纯化柱2次后，空柱子离心1分钟，干燥柱子，向纯化加入0.1ml去离子水，离心洗脱，获得高纯度DNA。

对比例1

取与实施例1相同的样品100mg，采用TRNzol法(TRNsol，来自GBCBIO 公司产品)进行提取DNA和RNA。

效果例1

采用实施例1的试剂盒及使用方法分别提取三叶草叶片和玉米粒的DNA和 RNA；采用实施例2的试剂盒及使用方法分别提取罗非鱼肝脏和青蛙心肌的DNA与RNA；采用实施例3的试剂盒及使用方法分别提取细菌培养物和霉菌培养物的DNA和RNA；采用对比例1的方法分别提取罗非鱼肝脏与三叶草叶片的DNA和RNA。

使用Nanodrop测定上述提取DNA与RNA的纯度，结果如表1和表2。从表1和表2可以看出，实施例1～3提取的DNA纯度(OD260/OD280比值在1.8 左右)与RNA的纯度都十分高(OD260/OD280比值在2.0左右)；对比例1提取的DNA的OD260/280比值低于1.8，表表明所得DNA纯度不高。

表1：各实例提取的DNA含量与纯度评价表

表2各实例提取的DNA含量与纯度评价表

对上述提取DNA与RNA使用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果图1。从图1可以看出，实施例1～3所提取的RNA条带完整，无明显的DNA污染；对比例1提取的植物RNA有降解的现象。

综上所述，本发明的平时提取DNA和RNA的试剂盒效果稳定，提取质量高，具有快速、高效，环保、可同时提取DNA和RNA的优点。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。