具体实施方式

本文提供了包含具有增强的抗体导向免疫应答的人自然杀伤(NK)细胞亚群的组合物，包括富集此类亚群的组合物。在一些实施方案中，所提供的组合物含有或富集在第158氨基酸位置带有CD16(FcγRIII)基因的特定遗传多态性的NK细胞，其中缬氨酸(V)已取代苯丙氨酸(F)(称为158V+)。在一些实施方案中，所提供的组合物含有或富集158V+且缺乏FcRγ的NK细胞(称为g-NK)，从而提供了含有或富集CD16 158V+/g-NK细胞的组合物。还提供了将所提供的组合物与用于治疗疾病或病症的抗体组合给予至受试者的方法。

在一些实施方案中，所提供的组合物包含人NK细胞，其中所述组合物中的NK细胞或所述组合物的总细胞的大于或大于约40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多是CD16158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞。

自然杀伤(NK)细胞是先天性淋巴细胞，对于通过细胞因子和趋化因子的分泌以及细胞毒性颗粒的释放介导抗病毒和抗癌免疫力至关重要(Vivier等人Science 331(6013):44-49(2011)；Caligiuri,Blood112(3):461-469(2008)；Roda等人,Cancer Res.66(1):517-526(2006))。NK细胞是包含第三大淋巴细胞群的效应细胞，并且对于宿主针对肿瘤和病原体感染细胞的免疫监测是重要的。然而，与T和B淋巴细胞不同，NK细胞被认为使用种系编码的激活受体识别靶标的能力仅是有限的(Bottino等人,Curr Top MicrobiolImmunol.298:175-182(2006)；Stewart等人,Curr Top Microbiol Immunol.298:1-21(2006))。

NK细胞的激活可通过NK细胞受体与靶细胞上配体的直接结合而发生，如直接肿瘤细胞杀伤所见，或者通过结合至与带有抗原的细胞结合的抗体的Fc部分，通过Fc受体(CD16；也称为CD16a或FcγRIIIa)的交联而发生。在激活后，NK细胞大量产生细胞因子和趋化因子，并且同时展现出有效的细胞溶解活性。NK细胞能够通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀死肿瘤细胞。在一些情况下，当NK细胞表面上的受体(诸如CD16)识别与细胞表面结合的IgGl或IgG3抗体时，触发ADCC。这触发释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞质颗粒，从而导致靶细胞死亡。由于NK细胞表达识别IgG包被的靶细胞的激活型Fc受体CD16，因此靶标识别范围扩大了(Ravetch&Bolland,Annu Rev Immunol.19:275-290(2001)；LanierNat.Immunol.9(5):495-502(2008)；Bryceson&Long,Curr Opin Immunol.20(3):344-352(2008))。ADCC和抗体依赖性细胞因子/趋化因子产生主要通过NK细胞介导。

除了在NK细胞上表达的CD16参与抗体依赖性应答(诸如NK细胞介导的ADCC)外，CD16还以糖基磷脂酰肌醇锚定的形式(也称为FcγRIIIB或CD16B)存在。应当理解，本文中对CD16的提及是指在NK细胞上表达的CD16a形式，并不意味着指糖基磷脂酰肌醇锚定的形式。所述CD16受体能够与衔接子即TCR-CD3复合物的ζ链(CD3ζ)和/或FcRγ链缔合，从而通过基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)转导信号。在一些方面，CD16接合(CD16交联)经由通过CD16相关衔接子链FcRγ或CD3ζ中的一种或两种产生的细胞内信号引发NK细胞应答。CD16的触发导致γ或ζ链的磷酸化，这进而募集酪氨酸激酶(syk和ZAP-70)，从而引发导致快速和有效效应子功能的信号转导级联。最熟知的效应子功能是释放携带有毒蛋白质的细胞质颗粒，以通过抗体依赖性细胞毒性的过程杀伤附近的靶细胞。CD16交联还导致产生细胞因子和趋化因子，其进而激活并协调一系列免疫应答。

细胞因子和趋化因子的这种释放可在体内在NK细胞的抗癌活性方面起作用。NK细胞还在其细胞质中具有含有穿孔素和蛋白酶(颗粒酶)的小颗粒。当从NK细胞释放时，穿孔素在靶定细胞的细胞膜中形成孔，颗粒酶和相关分子可通过所述孔进入，从而诱导细胞凋亡。NK细胞诱导靶细胞的细胞凋亡而不是坏死的事实是显著的——病毒感染的细胞的坏死将释放病毒粒子，而细胞凋亡导致细胞内部病毒的破坏。

大多数人表达对IgGl抗体具有相对低亲和力的CD16。然而，已经发现个体的NK细胞在CD16基因(核苷酸526[胸苷(T)→鸟嘌呤(G)])中带有单核苷酸多态性(SNP rs396991)导致蛋白成熟(已加工)形式中在第158位缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)(F158V，在本文中也称为158V+)的氨基酸(aa)取代，与对IgGl抗体的亲和力显著更高有关，并有能力建立更稳健的NK细胞介导的ADCC应答(Mellor等人(2013)Journal of Hematology&Oncology,6:1；Musolino等人(2008)Journal of Clinical Oncology,26:1789-1796和Hatjiharissi等人(2007)Blood,110:2561-2564)。

还已经发现，缺乏FcRγ链的NK细胞的亚群(称为g-NK)也能够介导强大的ADCC应答(参见例如公开的专利申请号US2013/0295044)。应答增加的机制可能是由于影响FcRγ表达的表观遗传修饰的变化。所述g-NK细胞大量地表达信号传导衔接子ζ链，但是缺乏信号传导衔接子γ链的表达。与常规NK细胞相比，这些缺乏γ的g-NK细胞在被抗体激活后展现出显著增强的活性。例如，可通过抗体介导的CD16的交联或通过抗体包被的肿瘤细胞激活所述g-NK细胞。在一些方面，与表达所述γ链的常规NK细胞相比，所述g-NK细胞产生更大量的细胞因子(例如IFN-γ或TNF-α)和趋化因子(例如MIP-1α、MIP-1β和RANTES)和/或展示更高的脱粒响应。所述g-NK细胞提供了颗粒酶B的高表达，颗粒酶B是自然杀伤细胞细胞毒性机制的组成部分。此外，与常规NK细胞相比，所述g-NK细胞具有延长的寿命，并且它们的存在可以长期维持。在一些实施方案中，g-NK细胞在功能和表型上是稳定的。

在一些实施方案中，CD16 158V+NK细胞和CD16 158V+/g-NK细胞在引发ADCC应答方面比常规NK细胞(例如，不包含158V+多态性和/或不缺乏γ链的NK细胞)更有效。在一些情况下，ADCC是治疗性抗体(包括抗癌抗体)的作用机制。在一些方面，通过给予NK细胞的细胞疗法可与抗体配合用于治疗和相关目的。本文提供了涉及组合给予富集所提供的CD16158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞的组合物与抗体(例如抗癌抗体)的方法。在一些实施方案中，由于CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞亚群的亲和力、细胞毒性和/或细胞因子介导的作用功能改进，CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞的抗体导向靶向导致患者的结果改进。

在一些实施方案中，与表达FcRγ的自然杀伤细胞相比，所述g^-NK细胞产生显著更大量的细胞因子。在另一个实施方案中，所述细胞因子是干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其组合。在一个实施方案中，所述g^-NK细胞产生显著更大量的趋化因子。在一个实施方案中，所述趋化因子是MIP-1α、MIP-1β或其组合。在另一个实施方案中，当通过所述Fc受体CD16刺激时，所述g^-NK细胞产生细胞因子或趋化因子。

本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利出版物、以及科学文献和数据库均出于所有目的通过引用以其整体并入本文至如同指明每个单独的参考文献具体且单独地通过引用并入的相同程度。

为了公开内容的清楚，而不是通过限制的方式，将详细说明划分为以下小节。本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题。

I.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不一定应当被解释为代表与本领域通常所理解的含义有实质性差异。

如在本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“一种分子”任选地包括两种或更多种此类分子的组合等。

如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)涉及所述值或参数本身的实施方案。

应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含多个方面和实施方案”、“由多个方面和实施方案组成”和/或“基本上由多个方面和实施方案组成”。

如本文所用，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形发生或不发生，并且所述描述包括所述事件或情形发生的情况和不发生的情况。例如，任选取代的基团意指所述基团未取代或被取代。

如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论是天然的还是部分或完全合成的，如重组产生的，包括其含有免疫球蛋白分子的可变重链和/或轻链区的至少一部分的任何片段，所述片段足以形成抗原结合位点，并且当组装时，足以特异性地结合抗原。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白质。典型地，抗体最小限度地包括可变重(V_H)链和/或可变轻(V_L)链的全部或至少一部分。通常，V_H和V_L的配对一起形成抗原结合位点，但在一些情况下，单个V_H或V_L结构域足够用于抗原结合。所述抗体还可包括恒定区的全部或一部分。本文提及的抗体包括全长抗体和抗原结合片段。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”可互换使用。

术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”可互换使用，以指代基本上完整形式的抗体，与抗体片段相反。全长抗体是典型地具有两个全长重链(例如，VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两个全长轻链(VL-CL)以及铰链区的抗体，如通过分泌B细胞的抗体从哺乳动物物种(例如人、小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物等)产生的抗体和合成产生的具有相同结构域的抗体。具体地，整个抗体包括具有重链和轻链(包括Fc区)的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可以具有一种或多种效应子功能。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分、所述完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、Fv片段、二硫键连接的Fvs(dsFv)、Fd片段、Fd'片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子，包括单链Fv(scFv)或单链Fab(scFab)；以上任一项的抗原结合片段和来自抗体片段的多特异性抗体。出于本文的目的，抗体片段典型地包括足以接合或交联NK细胞表面上的CD16的抗体片段。

术语“自体”是指源自个体自身组织内部或取自个体自身组织的细胞或组织。例如，在NK细胞的自体转移或移植中，供体和受体是同一个人。

术语“同种异体”是指属于或获自相同物种，但在遗传上不同的细胞或组织，并且因此在一些情况下，是免疫学不相容的。典型地，术语“同种异体”用于定义从供体移植到相同物种的受体的细胞。

术语“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果所述多核苷酸来源于基因组DNA，则在真核细胞中表达可以包括mRNA的剪接。

提及蛋白质或核酸时，术语“异源”是指源自不同遗传来源的蛋白质或核酸。例如，对于细胞而言异源的蛋白质或核酸源自除在其中表达它的细胞之外的生物或个体。

如本文所用，术语“引入”包括在体外或在体内将DNA引入细胞中的各种方法，此类方法包括转化、转导、转染(例如电穿孔)和感染。载体可用于将编码分子的DNA引入细胞中。可能的载体包括质粒载体和病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体或其他载体，如腺病毒载体或腺相关载体。

术语“组合物”是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞或抗体)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。所述制剂通常呈允许活性成分(例如抗体)的生物活性有效的形式。

提及细胞组合物，术语“富集的”是指这样的组合物，其中与相同体积的起始组合物(诸如直接从受试者获得或分离的起始组合物)中的细胞类型的数目或百分比相比，所述细胞类型或群体的数目或百分比增加了。所述术语不需要从组合物中完全去除其他细胞、细胞类型或群体，并且不需要如此富集的细胞在富集的组合物中以等于或甚至接近100％存在。

“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所用，组合是指两个或更多个项目之间或之中的任何相关联。所述组合可以是两个或更多个单独的项目，如两种组合物或两个集合，可以是其混合物，如两个或更多个项目的单一混合物，或其任何变化。组合的元素通常在功能上相关联或相关。

如本文所用，试剂盒是包装的组合，其出于包括但不限于治疗用途的目的，任选地包括其他元素，如另外的药剂和所述组合或其元素的使用说明。

如本文所用，术语“治疗(treatment和treating)”指设计用于在临床病理学的进程中改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预。希望的治疗效果包括降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态、消退或者预后改进。例如当与障碍(例如，嗜酸性粒细胞介导的疾病)相关的一种或多种症状得到减轻或消除时，个体得到成功“治疗”。例如，如果治疗导致提高患有疾病的那些人的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、减少疾病复发的频率、减轻疾病的严重性、延缓疾病的发展或进展、和/或延长个体的存活时间，则个体成功地得到“治疗”。

“有效量”是指至少在必需的剂量和时间上有效实现所需的或指示的效果(包括治疗或预防结果)的量。有效量可在一次或多次给予中提供。“治疗有效量”至少是实现特定障碍的可测量改进所需要的细胞的最低剂量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低动物中与癌症、病毒感染、微生物感染或脓毒性休克相关的严重性、持续时间和/或症状的组合物的量。本文的治疗有效量可根据如患者的疾病状态、年龄、性别和重量的因素而变化。治疗有效量还可以是其中治疗上有益的效果超过抗体的任何毒性或有害影响的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现希望的预防结果的量。典型地但不是必需地，因为在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量可小于治疗有效量。

如本文所用，“个体”或“受试者”是哺乳动物。出于治疗目的的“哺乳动物”包括人、家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施方案中，所述个体或受试者是人。

II.获取和制备包含自然杀伤亚群的组合物的方法

提供了制备包含或富集原代CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞的组合物的方法。还提供了包含或富集原代CD16 158V+或CD16 158V+/g-NK细胞亚群的所得组合物。在一些实施方案中，所提供的原代细胞自受试者富集，诸如哺乳动物受试者，例如人类受试者。在一些实施方案中，提供了包含或富集原代人CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞的组合物。

在一些实施方案中，所述受试者是健康受试者。在一些实施方案中，所述受试者是患有疾病或病症(例如癌症)的受试者。在一些实施方案中，可以给予含有或富集原代CD16158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞的组合物进行同种异体或自体过继细胞疗法。

在一些实施方案中，富集NK细胞的方法包括：(a)从被鉴定为具有CD16 158V+NK细胞基因型的受试者中分离NK细胞或其亚群；以及(b)在用以扩增所述细胞的条件下培养所分离的NK细胞或其亚群，从而从所述受试者富集NK细胞或其亚群。在一些实施方案中，在步骤(a)之前，所述方法包括针对CD16 158V+NK细胞基因型的存在对受试者进行筛选。

在一些实施方案中，针对CD16 158V+筛选受试者，即针对CD16中V158F多态性(SNPrs396991)的存在进行筛选。在一些实施方案中，基因组DNA是从所述受试者的生物样品(诸如血液样品或骨髓样品)中提取的。在一些实施方案中，所述样品是或包含血细胞，例如外周血单核细胞。在一些实施方案中，所述样品是来自健康供体受试者的样品。可以采用从所述样品提取DNA的任何方法。例如，使用诸如硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取等标准技术(Chomocyznski等人(1987)Anal.Biochem.162:156)，可以将核酸容易地从样品(例如细胞)中分离出来。市售试剂盒也很容易用于提取基因组DNA，诸如Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega，威斯康辛州麦迪逊)。

基因分型可以在任何合适的样品上进行。在本文所述的任何实施方案中，所述基因分型反应可以是，例如，焦磷酸测序反应、DNA测序反应、MassARRAY MALDI-TOF、RFLP、等位基因特异性PCR、实时等位基因鉴别或微阵列。在一些实施方案中，使用用于多态性的等位基因特异性引物进行基因组DNA的基于PCR的技术，诸如RT-PCR。用于扩增样品中的靶核酸序列的PCR方法在本领域中是众所周知的，并且已经在以下中描述，例如Innis等人(编辑)PCR Protocols(Academic Press,NY 1990)；Taylor(1991)Polymerase chainreaction:basic principles and automation,PCR:A Practical Approach,McPherson等人(编辑)IRL Press Oxford；Saiki等人(1986)Nature324:163；以及美国专利号4,683,195、4,683,202和4,889,818，全部通过引用以其整体并入本文。

用于检测所述158V+多态性的引物是已知的，或者可以由熟练的技术人员容易地设计，参见例如国际公开的PCT申请号WO 2012/061814；Kim等人(2006)Blood,108:2720-2725；Cartron等人(2002)Blood,99:754-758；Koene等人(1997)Blood,90:1109-1114。在一些实施方案中，可以使用巢式引物进行PCR，随后进行等位基因特异性限制酶消化。在一些实施方案中，第一PCR引物包含核酸序列5'-ATA TTT ACA GAA TGG CAC AGG-3'(SEQ IDNO:1)和5'-GAC TTG GTA CCC AGG TTG AA-3'(SEQ ID NO:2)，而第二PCR引物是5'-ATCAGA TTC GAT CCT ACT TCT GCA GGG GGC AT-3'(SEQ ID NO:3)和5'-ACG TGC TGA GCTTGA GTG ATG GTG ATG TTC AC-3'(SEQ ID NO:4)，其在某些情况下取决于等位基因的性质产生94-bp的片段。在一些实施方案中，所述引物对包含SEQ ID NO:5(CCCAACTCAACTTCCCAGTG TGAT)和SEQ ID NO:6(GAAATCTACC TTTTCCTCTA ATAGGGCAAT)所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述引物对包含SEQ ID NO:5(CCCAACTCAA CTTCCCAGTG TGAT)和SEQ ID NO:7(GAAATCTACC TTTTCCTCTA ATAGGGCAA)所示的核酸序列。在一些实施方案中，所述引物对包含SEQ ID NO:5(CCCAACTCAA CTTCCCAGTG TGAT)和SEQ ID NO:8(GAAATCTACCTTTTCCTCTA ATAGGGCA)所示的核酸序列。

CD16a的基因组序列可在NCBI数据库NG_009066.1获得。CD16A的基因ID是2214。CD16的序列信息(包括基因多态性)可以UniProt登录号P08637获得。CD16(F158)的序列在SEQ ID NO:9中列出(残基F158是粗体并加下划线)。在一些实施方案中，CD16(F158)进一步包含一种信号肽，其如MWQLLLPTALLLLVSA(SEQ ID NO:10)所示。

CD16 158V+(导致F158V的多态性)的序列被称为VAR_003960，并且具有在SEQ IDNO:11中所示的序列(158V+多态性以粗体表示并加下划线)。在一些实施方案中，CD16(158V+)进一步包含一种信号肽，其如MWQLLLPTALLLLVSA(SEQ ID NO:10)所示。

在一些实施方案中，所提供的细胞包括或富集CD16 158V+NK细胞，所述CD16 158V+NK细胞具有在SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:11至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性并含有158V+多态性的氨基酸序列。在一些实施方案中，与表达在SEQ ID NO:9中所示的CD16(F158)的NK细胞相比，所述CD16 158V+NK细胞展现出对Fc(诸如IgG Fc区)的更高的结合亲和力，和/或与增加的肿瘤细胞杀伤力相关。在一些实施方案中，所述增加大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。

在一些实施方案中，使用等位基因特异性探针对基因组脱氧核糖核酸(DNA)样品进行单核苷酸多态性(SNP)分析，所述等位基因特异性探针包含在5'端的荧光染料标签(例如FAM或VIC)、在3'端的小沟粘合剂(MGB)和非荧光淬灭剂(NFQ)、和未标记的PCR引物，以检测特定的SNP靶标。在一些实施方案中，所述测定通过与所述探针相关的染料的荧光变化来测量或检测SNP的存在。在此类实施方案中，探针在两个未标记的引物之间与靶DNA杂交，并且通过荧光共振能量转移(FRET)，在5'端的荧光染料的信号通过在其3'端的NFQ淬灭。在PCR期间，Taq聚合酶使用模板作为指导序列延伸未标记的引物，并且当聚合酶到达标记的探针时，它将切割将染料与淬灭剂分离的分子。在一些方面，qPCR仪器可以检测来自未淬灭的标记的荧光。此类的示例是市售SNP测定，例如用于rs396991的代码C_25815666_10(Applied Biosystems，目录号4351379，用于CD16中V158F的SNP基因分型)。

在一些实施方案中，鉴定了在CD16 158V+(V158F)多态性上杂合的或纯合的受试者。在一些实施方案中，鉴定了在CD16 158V+(V158F)多态性上纯合的受试者。在一些实施方案中，从被鉴定为在CD16 158V+多态性上杂合的或纯合的受试者中分离NK细胞或NK细胞亚群。在一些实施方案中，从被鉴定为在CD16 158V+多态性上纯合的受试者中分离NK细胞或NK细胞亚群。分离NK细胞的方法是熟练的技术人员众所周知的。

在一些实施方案中，首先分离自然杀伤细胞，然后使用可用的程序进行分选。例如，可以获得淋巴细胞或外周血单核细胞(PBMC)的群体。从所述细胞群中分离出表达一种或多种如上所述的自然杀伤细胞特异性标记物的自然杀伤细胞。选择特定的标记物或表面标记物的组合在熟练的技术人员的水平内。在一些实施方案中，所述一种或多种表面标记物是以下表面抗原中的任何一种或多种：CD11a、CD3、CD7、CD14、CD16、CD19、CD25、CD27、CD56、CD57、CD161、CD226、NKB1、CD62L；CD244、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2A、NKG2C、KIR2DL1和/或KIR2DL3。用于检测此类表面抗原的试剂，包括荧光染料缀合的抗体，是众所周知的，并且是熟练的技术人员可用的。

在一些实施方案中，基于CD19和/或CD14的阳性表面表达排除了非NK细胞。

在一些实施方案中，将NK细胞分离为按CD3^-CD56^dim群体门控的子群中存在的那些。在一些实施方案中，分离的NK细胞以按CD3^-CD56^dimCD14^-CD19^-门控的子群存在。

在一些实施方案中，从所述受试者分离或富集g-NK细胞亚群。在一些实施方案中，从被鉴定为带有CD16 158V+多态性，例如被鉴定为在所述多态性上杂合或纯合的受试者分离或富集g-NK细胞。在一些实施方案中，提供了从带有CD16 158V+多态性，例如被鉴定为在所述多态性上杂合的或纯合的受试者中鉴定g^-NK细胞的方法，所述方法包括：鉴定来自所述受试者的淋巴细胞群中不表达实质FcRγ的自然杀伤细胞的亚群，从而鉴定g^-NK细胞。在一个实施方案中，从所述受试者获得或分离淋巴细胞。在一些实施方案中，鉴定不表达实质FcRγ但表达至少一种自然杀伤细胞标记物的细胞。

FcRγ链(智人，也称为高亲和力免疫球蛋白γFc受体I)的氨基酸序列可在NCBI数据库中以登录号NP_004097.1(GI:4758344)获得，并在以下复制为SEQ ID NO:12。

MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLT LLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ(SEQ ID NO:12)

在一些实施方案中，通过基于免疫亲和力的方法进行g-NK细胞的分离或富集。在一些实施方案中，可以采用阳性和/或阴性策略来富集对于一种或多种标记物呈表面阳性和/或对于一种或多种标记物分别呈表面阴性或低的细胞。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(FAC)，通过收集一种或多种特定标记物的表面表达门控的或对于一种或多种特定标记物的表面表达呈阳性的细胞(阳性富集)和/或通过排除对于一种或多种特定标记物的表面表达呈阳性的细胞(阴性富集)，来进行分离或富集。在一些实施方案中，通过使淋巴细胞与结合有一种或多种对标记物具有特异性的抗体的固体表面接触，以及回收未与所述抗体结合的细胞(阴性富集)或与所述抗体结合的细胞(阳性富集)，来进行分离或富集。

在一些方面，通过将NK细胞与其他淋巴细胞或免疫细胞区分开并且将g-NK细胞与常规NK细胞区分开的一种或多种各种标记物的表面表达的存在、不存在或水平来鉴定g-NK细胞。在一些实施方案中，可以如公开的专利申请号US 2013/0295044或Zhang等人(2013)J.Immunol.,190:1402-1406中所述分离g-NK细胞。

在一些实施方案中，如果特定标记物(典型地是表面标记物)在细胞上或细胞中有可检测到的存在，则所述细胞(例如NK细胞亚群)对于所述特定标记物呈阳性。在实施方案中，表面表达可以通过流式细胞术来确定，例如，通过用与所述标记物特异性结合的抗体染色并检测所述抗体与所述标记物的结合，其中如果染色在如下水平是可检测到的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知呈所述标记物阳性的细胞的水平相似或在一些情况下更高，和/或所述水平基本上高于已知呈所述标记物阴性的细胞的水平，则表面表达呈阳性。

在一些实施方案中，如果特定标记物(典型地是表面标记物)在细胞上或细胞中没有可检测到的存在，则所述细胞(例如NK细胞亚群)对于特定标记物呈阴性。在实施方案中，表面表达可以通过流式细胞术来确定，例如，通过用与所述标记物特异性结合的抗体染色并检测所述抗体与所述标记物的结合，其中如果染色在如下水平是不可检测到的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上比已知呈所述标记物阳性的细胞的水平更低，和/或所述水平基本上与已知呈所述标记物阴性的细胞的水平相似，则表面表达呈阴性。

在一些实施方案中，与已知对于所述标记物呈阳性的细胞相比，如果特定标记物(典型地是表面标记物)在细胞上或细胞中有较低水平的可检测到的存在，则所述细胞(例如NK细胞亚群)对于特定标记物呈低。在实施方案中，表面表达可以通过流式细胞术确定，例如通过用与所述标记物特异性结合的抗体染色并检测所述抗体与所述标记物的结合，其中如果染色水平比已知呈所述标记物阳性的细胞的水平更低，则表面表达呈低。

在一些实施方案中，已知对于表面标记物呈阳性的NK细胞可以是常规NK细胞和/或代表受试者中存在的大多数NK细胞，或代表受试者群体中平均存在的大多数NK细胞的NK细胞亚群。

在一些实施方案中，可以通过观察FcRγ是由NK细胞群还是NK细胞子群表达来检测NK细胞的g-NK细胞亚群。不表达FcRγ的NK细胞是g-NK细胞。在一些实施方案中，检测任何上述其他NK细胞标记物的表达作为所述细胞为自然杀伤细胞的阳性鉴定法，同时还确认所述细胞不表达FcRγ可能是有用的。与FcRγ的表达相关的自然杀伤细胞表面标记物的表达(或其缺少)可以通过任何不损伤细胞的可用程序来检测。例如，通过使用与FcRγ表达相关的此类细胞表面标记物，可以通过流式细胞术检测、鉴定和/或分离所述g^-NK细胞。

CD3ζ和/或FcRγ蛋白是细胞内蛋白，其不容易被检测，除非所述细胞被处理以允许细胞内蛋白被检测，例如通过固定和透化。尽管可以使用这种处理来确认基本上纯的细胞群的身份，但在许多情况下，可以使用在鉴定和分离g^-NK细胞时不损伤细胞的情况下可检测出的细胞表面标记物。在一些实施方案中，可以基于KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)的阳性表面表达和/或基于自然细胞毒性受体(NCR)的低或阴性表面表达来鉴定g-NK细胞。

在一些实施方案中，g-NK细胞对于KIR(例如，KIR2DL1、KIR2DL2/3和/或KIR3DL1)的表面表达呈阳性，并且可以用诸如通过阳性选择方法来鉴定和分离g^-NK细胞。在一些实施方案中，g-NK细胞对于KIR2DL1、KIR2DL2/3和KIR3DL1中的一种或多种呈表面阳性。

在一些实施方案中，通常在NK细胞上表达的NCR(例如Nkp30和/或Nkp46)在g^-NK细胞上不表达或以低水平表达，并且可以用于鉴定和分离g^-NK细胞，诸如通过阴性选择方法。在一些实施方案中，g-NK细胞对于NkP30和/或Nkp46呈表面阴性或低。在一些实施方案中，g-NK细胞对于NKG2C呈表面阳性。在一些实施方案中，g-NK细胞表达高CD57和低NKG2A。

抗体和其他结合实体可用于检测标记蛋白(例如，KIR和/或NCR)的表达水平，并分离g^-NK细胞。例如，在一些实施方案中，对表达FcRγ的细胞具有特异性的抗体(例如，对与FcRγ表达相关的细胞表面标记物诸如NCR具有特异性的抗体)可以结合至固体底物，可以使自然杀伤细胞与所述抗体-底物接触，并收集不结合所述抗体的细胞。也可以采用本领域技术人员可用的其他方法。合适的抗体可包括多克隆、单克隆、片段(如Fab片段)、单链抗体和其他形式的特异性结合分子。

在一些实施方案中，可以基于典型人自然杀伤细胞标记物(诸如KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD16、CD56和CD161)的表面表达来鉴定自然杀伤细胞。在一些实施方案中，鉴定淋巴细胞群中的自然杀伤细胞亚群，其包括使淋巴细胞样品与结合至自然杀伤细胞特异性抗原的抗体接触。在一个实施方案中，自然杀伤细胞的标记物是CD16、KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR3DL1、NKp30、NKp46或其组合。可以基于任何上述标记物的阳性或阴性/低表面表达来分离包括g-NK细胞的NK细胞。在一种方法中，所述方法涉及诸如基于KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD16、CD56和/或CD161的表面表达，分离基本上纯的自然杀伤细胞群。

在一些实施方案中，将g^-NK细胞鉴定为不表达NCR蛋白或NCR蛋白表面表达低的细胞。在一些实施方案中，所述NCR是Nkp30和/或Nkp46。例如，可以使用对NCR蛋白具有特异性的抗体(例如，Nkp30和/或Nkp46)通过流式细胞术对含有自然杀伤细胞的细胞群进行分选。丢弃被所述抗NCR抗体标记的细胞，将未被所述抗NCR抗体标记的细胞保留为是或富集含有g^-NK细胞的细胞。可替代地，可使含有自然杀伤细胞的细胞群与结合抗NCR抗体的固体底物接触。未结合的细胞是或富集g^-NK细胞。在另一个实施方案中，可以将含有自然杀伤细胞的细胞群与结合有抗NCR抗体的磁珠接触，在孵育后，将磁珠从所述细胞群中移出，留下的是或富集g^-NK细胞的细胞为基本上纯的细胞群。

在一些实施方案中，将g^-NK细胞鉴定为表达一种或多种KIR的细胞。在一些实施方案中，所述KIR是KIR2DL1、KIR2DL2/3和/或KIR3DL1。例如，可以使用对KIR蛋白(例如，KIR2DL1、KIR2DL2/3和/或KIR3DL1)具有特异性的抗体通过流式细胞术对含有自然杀伤细胞的细胞群进行分选。被抗KIR抗体标记的细胞被保留为是或富集g-NK细胞的NK细胞亚群，而未被抗KIR抗体标记的细胞被丢弃。可替代地，可以将含有自然杀伤细胞的细胞群与结合抗KIR抗体的固体底物接触。结合的细胞是或富集g^-NK细胞。在另一个实施方案中，可使含有自然杀伤细胞的细胞群与结合有抗KIR抗体的磁珠接触，在孵育后回收所述磁珠，从而从细胞群中分离或获得是或富集g-NK细胞的细胞。

在一些实施方案中，鉴定出g-NK细胞，其对于CD16和KIR呈表面阳性(例如KIR2DL1、KIR2DL2/3和/或KIR3DL1)和/或对于NCR呈表面阴性或低(例如NKp30和/或NKp46)，例如CD16⁺、KIR⁺和NCR^-/lo(例如Nkp30^-/lo和/或Nkp46^-/lo)。在一些实施方案中，所述g-NK细胞还展现出为CD3^-CD56^dimCD14^-CD19^-的表面表型。

在一些实施方案中，在分离或富集之后，将富集CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g^-NK细胞的细胞在细胞培养基中培养，诸如用于扩增所述分离或富集的细胞。在一些情况下，可能有必要或需要先培养所述NK细胞以使其扩增，然后再将它们配制成用于给予的组合物。在一些实施方案中，产生包含工程化NK细胞的组合物的方法包括培养或孵育针对CD16158V+NK细胞或CD16 158V+/g^-NK细胞分离或富集的NK细胞，诸如在将所述细胞扩增至治疗有效量之后，将所述NK细胞给予至有需要的个体。

用于培养和扩增NK细胞的合适方法是已知的。例如，可使用饲养细胞或在细胞因子的存在下培养NK细胞，以增强其生长和/或激活。如本文所用，“培养”包括提供NK细胞维持所需的化学和物理条件(例如温度、气体)以及生长因子。在一个实施方案中，培养NK细胞包括为NK细胞提供增殖的条件。可支持NK细胞增殖的化学条件的例子包括但不限于缓冲液、营养物、血清、维生素和抗生素以及细胞因子和典型地在生长(即培养)培养基中提供的其他生长因子。在一个实施方案中，NK培养基包括包含10％FCS的MEMα或包含5％人血清/FBS替代物(Lifeblood产品)的CellGro SCGM(Cell Genix)。适用于本发明的其他介质包括但不限于Glascow培养基(Gibco，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、RPMI培养基(Sigma-Aldrich,St Louis Mo.)或DMEM(Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯)。应注意，许多培养基含有烟酰胺作为维生素补充剂，例如MEMα(8.19μM烟酰胺)、RPMI(8.19μM烟酰胺)、DMEM(32.78μM烟酰胺)和Glascow培养基(16.39μM烟酰胺)。

在一些实施方案中，如对于将细胞引入(或再引入)人类受试者的应用，使用无血清配制品(如用于淋巴细胞培养的AIM V^TM无血清培养基或MARROWMAX^TM骨髓培养基)进行培养。此类培养基配制品和补充剂可从商业来源获得，如Invitrogen(GIBCO)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。培养物可补充有氨基酸、抗生素和/或细胞因子，以促进最佳生存力、增殖、功能和/或存活。

在一些实施方案中，培养包含工程化NK细胞的细胞群在没有饲养层或饲养细胞的情况下进行。在这些实施方案的一些中，工程化NK细胞可用生长因子培养。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子包括选自SCF、FLT3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21的生长因子。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子是IL-2或IL-7和IL-15。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子仅是IL-2。在一些实施方案中，将细胞培养3至30天，诸如7至28天，例如至少或至少约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，17、18或更多天。

在一些实施方案中，在分离或富集CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g^-NK细胞之前，向受试者给予IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或CCL5。

在一些实施方案中，可以从被选择表达所希望MHC(HLA)限制的HLA等位基因的受试者中分离所述细胞。在一些实施方案中，可以在分离或富集之前或之后进行细胞的HLA分型。在一些实施方案中，细胞(包括从受试者获得的原代细胞)的HLA分型可以使用本领域熟知的程序确定，诸如使用分子单倍型测定(BioTest ABC SSPtray,BioTest DiagnosticsCorp.，新泽西州丹维尔；SeCore Kits,Life Technologies，纽约州格兰德岛)进行组织分型。在一些情况下，如通过使用基于序列的分型(SBT)进行细胞的标准分型以确定HLA基因型完全在熟练技术人员的水平内(Adams等人,(2004)J.Transl.Med.,2:30；Smith(2012)Methods Mol Biol.,882:67-86)。

III.组合物和试剂盒

本文提供了包含富集CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞的细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含约5％-99％的CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞，或任何百分比的在5％-99％(包括端值)之间的CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞。在一些实施方案中，与CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK相对于总NK细胞或自然存在于从中分离细胞的所述受试者中的总细胞的百分比相比，所述组合物可包括相对于总NK细胞或总细胞增加或更大百分比的CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞。在一些实施方案中，所述百分比增加至少或至少约2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍或更多。

在一些实施方案中，所述组合物可包括20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上100％的CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含超过50％的CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞。在另一个实施方案中，所述组合物包含超过70％的CD16158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞。在另一个实施方案中，所述组合物包含超过80％的CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞。在一些实施方案中，所提供的组合物包括其中CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞占所述组合物中细胞或所述组合物中NK细胞的至少或至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多的那些组合物。

所述组合物包括用于给予(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和配制品。在一些实施方案中，将工程化细胞与药学上可接受的载体一起配制。

药学上可接受的载体可以包括与药物给予相容的所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等(Gennaro,2000,Remington:The science andpractice of pharmacy,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。此类载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介物，如固定油。补充性活性化合物也可掺入到组合物中。药物载体应是适用于NK细胞的载体，如盐水溶液、右旋糖溶液或包含人血清白蛋白的溶液。

在一些实施方案中，此类CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞的药学上可接受的载体或媒介物是其中在足以允许给予活CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞的时间内可以维持CD16158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞或者使其保持活力的任何无毒水溶液。例如，所述药学上可接受的载体或媒介物可以是盐溶液或缓冲盐溶液。所述药学上可接受的载体或媒介物还可以包括各种生物材料，这些材料可以增加CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞的效率。细胞媒介物和载体可例如包括多糖，诸如甲基纤维素(M.C.Tate,D.A.Shear,S.W.Hoffman,D.G.Stein,M.C.LaPlaca,Biomaterials 22,1113,2001，其通过引用以其整体并入本文)、壳聚糖(Suh J K F,Matthew H W T.Biomaterials,21,2589,2000；Lahiji A,Sohrabi A,Hungerford D S等人,J Biomed Mater Res,51,586,2000，各自通过引用以其整体并入本文)、N-异丙基丙烯酰胺共聚物P(NIPAM-co-AA)(Y.H.Bae,B.Vernon,C.K.Han,S.W.Kim,J.Control.Release 53,249,1998；H.Gappa,M.Baudys,J.J.Koh,S.W.Kim,Y.H.Bae,Tissue Eng.7,35,2001，各自通过引用以其整体并入本文)，以及聚(氧乙烯)/聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(B.Jeong,K.M.Lee,A.Gutowska,Y.H.An,Biomacromolecules 3,865,2002，其通过引用以其整体并入本文)、P(PF-co-EG)(Suggs L J,Mikos AG.Cell Trans,8,345,1999，其通过引用以其整体并入本文)、PEO/PEG(Mann B K,Gobin A S,Tsai A T,Schmedlen R H,West J L.,Biomaterials,22,3045,2001；Bryant S J,Anseth K S.Biomaterials,22,619,2001，其通过引用以其整体并入本文)、PVA(Chih-Ta Lee,Po-Han Kung and Yu-Der Lee,Carbohydrate Polymers,61,348,2005，其通过引用以其整体并入本文)、胶原蛋白(Lee C R,Grodzinsky AJ,Spector M.,Biomaterials 22,3145,2001，其通过引用以其整体并入本文)、藻酸盐(Bouhadir K H,LeeK Y,Alsberg E,Damm K L,Anderson K W,Mooney D J.Biotech Prog 17,945,2001；Smidsrd O,Skjak-Braek G.,Trends Biotech,8,71,1990，各自通过引用以其整体并入本文)。

在一些实施方案中，所述CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞可以有效量存在于所述组合物中。激活的CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞的有效量可以根据患者以及疾病的类型、严重性和程度而有所不同。因此，医师可以在考虑受试者的健康、疾病的程度和严重性以及其他变量之后确定有效量。

在某些实施方案中，所述组合物中的细胞数量以治疗有效量提供CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞。在一些实施方案中，所述量是降低动物中与癌症、病毒感染、微生物感染或脓毒性休克相关的严重性、持续时间和/或症状的量。在某些其他实施方案中，治疗有效量是细胞的剂量，其导致相对于未给予本文所述组合物的患者(或动物)或一组患者(或动物)中癌症的生长或扩散，给予所述组合物的患者或动物中癌症的生长或扩散减少至少2.5％、至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少35％、至少45％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，细胞毒性的有效量被定义为能够抑制或减少癌症、病毒和微生物细胞生长的NK细胞的量。

在一些实施方案中，所述组合物包含一定剂量的富集CD16158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞的组合物，其为从或从约10⁵至约10¹²个细胞、或约10⁵至约10⁸个细胞、或约10⁶至约10¹²个细胞、或约10⁸至约10¹¹个细胞、或约10⁹至约10¹⁰个细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含大于或大于约10⁵、约10⁶、约10⁷、约10⁸、约10⁹、约10¹⁰、约10¹¹或约10¹²个细胞。在一些实施方案中，可以向癌症患者给予这样的量。

在一些实施方案中，所述组合物的体积是至少或至少约10mL、50mL、100mL、200mL、300mL、400mL或500mL，诸如从或从约10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、100mL至200mL或200mL至500mL，包括端值。在一些实施方案中，所述组合物具有至少或至少约1x 105个细胞/mL、5x10⁵个细胞/mL、1x 10⁶个细胞/mL、5x 10⁶个细胞/mL、1x 10⁷个细胞/mL、5x 10⁷个细胞/mL或1x 10⁸个细胞/mL的细胞密度。在一些实施方案，所述组合物的细胞密度在或在约1x 10⁵个细胞/mL至1x 10⁸个细胞/mL、1x 10⁵个细胞/mL至1x 10⁷个细胞/mL、1x 10⁵个细胞/mL至1x10⁶个细胞/mL、1x 10⁶个细胞/mL至1x 10⁷个细胞/mL、1x 10⁶个细胞/mL至1x 10⁸个细胞/mL、1x 10⁶个细胞/mL至1x 10⁷个细胞/mL或1x 10⁷个细胞/mL至1x 10⁸个细胞/mL之间，包括端值。

在一些实施方案中，包括药物组合物的组合物是无菌的。在一些实施方案中，所述细胞的分离或富集是在封闭或无菌环境中进行的，例如，以最小化错误、用户处理和/或污染。在一些实施方案中，可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。

本文还提供了适合冷冻保存所提供的NK细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含是或富集CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞的NK细胞和冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述冷冻保护剂是或包含DMSO和/或甘油。在一些实施方案中，配制用于冷冻保存的组合物可在低温(如超低温)下储存，例如，以范围从-40℃至-150℃，如或约80℃±6.0℃的温度储存。

在一些实施方案中，所述组合物可在给予至患者之前在超低温下保存。从哺乳动物受试者中分离后并且在扩增和/或给予至受试者之前，也可以将所述组合物保存在超低温下。例如，可以分离或富集CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞，在超低温下储存，然后进行处理或扩增以在给予至受试者之前产生。可替代地，可以分离、处理或扩增CD16158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞，然后在给予至受试者之前在超低温下储存。

一种在超低温下小规模保存的典型方法描述于例如美国专利号6,0168,991中。对于小规模，细胞可通过在预先冷却的5％人白蛋白血清(HAS)中的低密度悬浮液(例如，浓度为约200×106/ml)在超低温下保存。可向HAS溶液中加入等量的20％DMSO。可将混合物的等分试样放入小瓶中，并在约-80℃的超低温室内冷冻过夜。

在一些实施方案中，所述冷冻保存的NK细胞通过解冻准备用于给予。在一些情况下，可将NK细胞在解冻后立即给予至受试者。在这样的实施方案中，所述组合物无需任何进一步处理即可使用。在其他情况下，NK细胞在解冻后被进一步处理，如通过用药学上可接受的载体重悬、用激活剂或刺激剂孵育、或者在给予至受试者之前被激活洗涤并重悬在药学上可接受的缓冲液中。

本文还提供了包含所提供的组合物的试剂盒，所述组合物富集或包含CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞。例如，在本文提供的一些实施方案中是如下的试剂盒，其包含CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞和另外的药剂。在一些实施方案中，另外的药剂包含Fc结构域。在一些实施方案中，另外的药剂是Fc融合蛋白或抗体。在一些实施方案中，另外的药剂是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在这些实施方案的一些中，另外的药剂是全长抗体。以下描述示例性抗体。

IV.治疗方法

在一些实施方案中，本文提供了治疗个体中的病症的方法，所述方法包括向有需要的个体给予包含或富集CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞的组合物，诸如任何所述的组合物。

在一些实施方案中，所述方法包括向个体给予有效量的包含CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞的组合物。在一些实施方案中，向所述受试者给予从或从约10⁵至约10¹²个细胞、或约10⁵至约10⁸个细胞、或约10⁶至约10¹²个细胞、或约10⁸至约10¹¹个细胞、或约10⁹至约10¹⁰个细胞。在一些实施方案中，向所述个体给予约10⁵、约10⁶、约10⁷、约10⁸、约10⁹、约10¹⁰、约10¹¹或约10¹²个细胞。在一些实施方案中，细胞的数量是指所给予的组合物中CD16158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞的数量。在一些实施方案中，向所述受试者给予约10⁶至10¹⁰个CD16 158V+NK细胞/kg或CD16 158V+/g-NK细胞/kg。

在一些实施方案中，在分离后不久向个体给予CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞。在一些实施方案中，在分离和工程化1、2、3、4、5、6、7、14、21或28天内，向个体给予CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞。

在其他实施方案中，在给予前通过在培养基中生长来存储或扩增(诸如通过上述方法)CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞。例如，在给予至个体之前，可将NK细胞储存大于6、12、18或24个月。

在一些实施方案中，可以通过任何方便的途径向受试者给予所提供的CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞和组合物，所述途径包括肠胃外途径，诸如皮下、肌内、静脉内和/或硬膜外给予途径。

所提供的CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞和组合物可用于治疗患有肿瘤或过度增殖性障碍或微生物感染(诸如病毒感染、酵母菌感染、真菌感染、原生动物感染和/或细菌感染)的个体的方法中。所公开的用所提供的CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞和组合物治疗受试者的方法可以与治疗性单克隆抗体(诸如抗肿瘤抗原或抗癌抗体、抗病毒抗体或抗菌抗体)组合。可以给予所提供的CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞和组合物以治疗动物，诸如哺乳动物，例如人类受试者。

在一些例子中，所述方法包括治疗过度增殖性障碍，诸如血液恶性肿瘤或实体瘤。可以用本文所述的组合物治疗的癌症和增殖性障碍的类型的例子包括但不限于白血病(例如，成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病、红白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞白血病)、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、纤维肉瘤、粘肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、尤因氏肿瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肾细胞癌、肝癌，威尔姆氏肿瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、不典型增生和超常增生。癌症的治疗和/或预防包括但不限于减轻与癌症相关的一种或多种症状，抑制或减少癌症的进展，促进癌症的消退和/或促进免疫应答。

在一些例子中，所述方法包括治疗病毒感染，诸如由体内病毒的存在引起的感染。病毒感染包括慢性或持续性病毒感染，其是能够感染宿主并在证明致命之前在宿主的细胞内长时间(通常为数周、数月或数年)繁殖的病毒感染。可根据本发明治疗的引起慢性感染的病毒包括，例如，人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒和其他疱疹病毒、乙型和丙型肝炎病毒以及其他肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和麻疹病毒，所有这些均可产生重要的临床疾病。长期感染可能最终导致疾病的诱发，例如在丙型肝炎病毒肝癌的情况下，对患者是致命的。可根据本发明治疗的其他慢性病毒感染包括爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)，以及其他病毒，如可能与肿瘤相关的那些病毒。

可用本文所述的组合物和方法治疗或预防的病毒感染的例子包括但不限于由以下引起的病毒感染：逆转录病毒(例如，I型和II型人T细胞淋巴细胞营养型病毒(HTLV)和人免疫缺陷病毒(HIV))、疱疹病毒(例如，I型和II型单纯疱疹病毒(HSV)、爱泼斯坦巴尔病毒和巨细胞病毒)、沙粒病毒(例如，拉沙热病毒)、副粘病毒(例如，麻疹病毒、人呼吸道合胞病毒和肺炎病毒)、腺病毒、布尼亚病毒(例如，汉坦病毒)、角膜病毒、丝状病毒(例如，埃博拉病毒)、黄病毒(例如，丙型肝炎病毒(HCV)、黄热病病毒和日本脑炎病毒)、肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒(HBV))、正粘液病毒(例如，仙台病毒以及甲型、乙型和丙型流感病毒)、乳头病毒(例如，乳头瘤病毒)、小核糖核酸病毒(例如，鼻病毒、肠病毒和甲型肝炎病毒)、痘病毒、呼肠孤病毒(例如，轮状病毒)、披膜病毒(例如，风疹病毒)和弹状病毒(例如，狂犬病病毒)。病毒感染的治疗和/或预防包括但不限于减轻与所述感染相关的一种或多种症状，抑制、减少或抑制病毒复制，和/或增强免疫应答。

在一些实施方案中，所提供的CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞和组合物用于治疗酵母或细菌感染的方法中。例如，所提供的CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞和本文所述的组合物和方法可治疗与以下相关的感染：酿脓链球菌、肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟氏菌、白喉棒状杆菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)、鼻硬结克雷伯氏菌(Klebsiella rhinoscleromotis)、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌、胎儿弯曲杆菌(弧菌)、空肠弯曲杆菌、嗜水气单胞菌、蜡状芽孢杆菌、迟钝爱德华氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、梅毒螺旋体、梅毒螺旋体、斑点病密螺旋体、奋森氏螺旋体、伯氏疏螺旋体、出血性黄疸钩端螺旋体、结核分支杆菌、弓形虫、卡氏肺孢子虫、土拉弗朗西斯菌、流产布氏杆菌、猪布鲁氏杆菌、羊布鲁氏杆菌、支原体属、立克次体、立克次体虫、衣原体属、幽门螺杆菌或其组合。

组合疗法

在一些实施方案中，所提供的CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞在被抗体或包含Fc的蛋白激活或与之接触时展现出增强的活性。例如，CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞可通过抗体介导的CD16交联或被抗体包被的肿瘤细胞激活。

在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体中的病症的方法，所述方法包括向受试者给予CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞或其组合物和抗体。诸如取决于个体的特定疾病或病症，本领域普通技术人员可选择适当的治疗性(例如，抗癌)单克隆抗体，以与所提供的CD16158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞和本文所述的组合物一起给予至受试者。合适的抗体可包括多克隆、单克隆、片段(如Fab片段)、单链抗体和其他形式的特异性结合分子。

在一些实施方案中，所述抗体可以进一步包括人源化或人抗体。非人抗体的人源化形式是嵌合Ig、Ig链或片段(诸如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原结合亚序列)，其包含源自非人Ig的最小序列。在一些实施方案中，所述抗体包含Fc结构域。

通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。人源化通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来实现(Jones等人,1986；Riechmann等人,1988；Verhoeyen等人,1988)。此类“人源化”抗体是嵌合抗体(1989)，其中显著小于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体典型地是人抗体，其中一些CDR残基和可能一些Fc残基被来自啮齿动物抗体中的类似部位的残基取代。人源化抗体包括人抗体(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR的具有所希望特异性、亲和力和能力的残基替代。在一些情况下，相应的非人残基替代人抗体的Fv框架残基。人源化抗体可包含在受体抗体或输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体包含至少一个(并且典型地两个)可变结构域的基本上全部，其中大多数(如果不是全部)CDR区与非人Ig的CDR区对应并且大多数(如果不是全部)FR区是人抗体共有序列的那些。人源化抗体最佳地还包含抗体恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人抗体恒定区(Jones等人,1986；Presta,1992；Riechmann等人,1988)。

人抗体还可使用各种技术产生，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom等人,1991；Marks等人,1991)和人mAb的制备(Boerner等人,1991；Reisfeld和Sell,1985)。类似地，可利用在其中内源抗体基因已经部分或完全失活的转基因动物中引入人Ig基因来合成人Ab。在激发后，观察到人抗体产生，这在各个方面均与在人中观察到的相似，包括基因重排、组装和抗体库(1997a；1997b；1997c；1997d；1997；1997；Fishwild等人,1996；1997；1997；2001；1996；1997；1997；1997；Lonberg和Huszar,1995；Lonberg等人,1994；Marks等人,1992；1997；1997；1997)。

具体地，本发明的细胞可通过与识别肿瘤相关抗原的抗体一起给予来靶向肿瘤。本领域普通技术人员将理解，本发明的CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞适合与识别肿瘤相关抗原的多种抗体一起使用。肿瘤相关抗原的非限制性例子包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、离散因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、黏结蛋白聚糖(Syndecan)1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或生腱蛋白(tenascin)。在一些情况下，所述抗体是抗CD20抗体、抗HER2抗体、抗CD52抗体、抗EGFR抗体和抗CD38抗体。示例性抗体包括利妥昔单抗、曲妥珠单抗、阿洛珠单抗、阿仑珠单抗、达雷木单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌妥昔单抗(ublituximab)、卡妥珠单抗(ocaratuzumab)。可选择对所选择癌症类型具有特异性的抗体，并且包括批准用于治疗癌症的任何抗体。例子包括乳腺癌的曲妥珠单抗(Herceptin)、淋巴瘤的利妥昔单抗(Rituxan)和头颈部鳞状细胞癌的西妥昔单抗(Erbitux)。技术人员熟悉能够结合特定肿瘤或疾病抗原的经FDA批准的单克隆抗体，其中任一种均可根据所提供的治疗肿瘤或疾病的方法使用。

CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞和另外的药剂可以依序或同时给予。在一些实施方案中，可以在给予CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞之前给予另外的药剂。在一些实施方案中，可以在给予CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞之后给予另外的药剂。例如，CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞可以与对所选癌症类型具有特异性的抗体同时给予。可替代地，可以在与给予对所选癌症类型具有特异性的抗体的时间不同的所选时间给予CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞。

在特定例子中，在CD16 158V+NK细胞群或CD16 158V+/g-NK细胞群之前、之后或基本上同时向所述受试者给予有效剂量的抗体。在一些例子中，向受试者给予约0.1mg/kg至约100mg/kg的抗体(如约0.5-10mg/kg、约1-20mg/kg、约10-50mg/kg、约20-100mg/kg，例如约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约8mg/kg、约10mg/kg、约16mg/kg、约20mg/kg、约24mg/kg、约36mg/kg、约48mg/kg、约60mg/kg、约75mg/kg或约100mg/kg)。考虑到特定抗体、特定疾病或病症(例如肿瘤或其他障碍)、受试者的一般状况、受试者正在接受或先前已经接受的任何另外治疗以及其他相关因素，可由熟练的临床医生选择抗体的有效量。还向所述受试者给予本文所述的CD16 158V+NK细胞群或CD16158V+/g-NK细胞群。抗体和CD16 158V+NK细胞群或CD16 158V+/g-NK细胞群典型地两者均是非肠道给予的，例如静脉内给予的；然而，还可使用对肿瘤或肿瘤附近的注射或输注(局部给予)或对腹膜腔的给予。本领域技术人员可确定适当的给予途径。

CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞也可以与抗微生物、抗病毒和其他治疗剂同时或依序给予。在本文提供的一些实施方案中，可以将CD16 158V+NK细胞或CD16158V+/g-NK细胞与细胞因子和/或生长因子组合给予至个体。根据一些实施方案，所述至少一种生长因子包括选自SCF、FLT3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21的生长因子。在一些实施方案中，将CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞和细胞因子或生长因子依序给予。例如，可以首先给予CD16 158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞，随后给予细胞因子和/或生长因子。在一些实施方案中，将CD16158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞与细胞因子或生长因子同时给予。

在一些实施方案中，向所述受试者给予一种或多种细胞因子(诸如IL-2、IL-15、IL-21和/或IL-12)以支持NK细胞的存活和/或生长。可在NK细胞之前、之后或基本上同时给予所述一种或多种细胞因子。在一些例子中，可在NK细胞之后给予所述一种或多种细胞因子。在一个特定例子中，在给予NK细胞的约1-8小时内(如约1-4小时、约2-6小时、约4-6小时或约5-8小时内)向受试者给予所述一种或多种细胞因子。

在一些实施方案中，所提供的方法还可以包括与化学治疗剂组合向个体给予CD16158V+NK细胞或CD16 158V+/g-NK细胞。在一些实施方案中，所述化学治疗剂可包括环磷酰胺、氟达拉滨、甲基泼尼松。在一些实施方案中，所述化学治疗剂选自：沙利度胺、顺铂(顺式-DDP)、奥沙利铂、卡铂、蒽二酮、米托蒽醌；羟基脲、甲基肼衍生物、甲基苄肼(N-甲基肼，MM)、肾上腺皮质抑制剂、米托坦(.omicron.,.rho.'-DDD)、氨鲁米特、RXR激动剂、贝沙罗汀、酪氨酸激酶抑制剂、伊马替尼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-肌溶素)、苯丁酸氮芥、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、六甲基三聚氰胺、噻替帕、白消安、卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀(甲基-CCNTJ)、洛莫司汀(CCNU)、链脲霉素(脲佐菌素)、DNA合成拮抗剂、雌莫司汀磷酸盐、三嗪、达卡巴嗪(OTIC，二甲基三叠氮基咪唑甲酰胺)、替莫唑胺、叶酸类似物、甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)、嘧啶类似物、氟尿嘧啶(fiuorouracin)(5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，5-FU，5FTJ)、氟尿苷(氟脱氧>'尿苷，FUdR)、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、吉西他滨、嘌呤类似物、巯基嘌呤(6-巯基嘌呤，6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤，TG)、喷司他丁(2'-脱氧助间型霉素，脱氧助间型霉素)、克拉屈滨和氟达拉滨、拓扑异构酶抑制剂、安吖啶、长春花生物碱、长春碱(VLB)、长春新碱、紫杉烷、紫杉醇，结合蛋白的紫杉醇(Abraxane(R))、多西紫杉醇(Taxotere(R))；表鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、放线菌素D(放线菌素D)、道诺霉素(柔红霉素、红比霉素)、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素(丝裂霉素C)、伊达比星、表柔比星、布舍瑞林、肾上腺皮质激素、泼尼松、孕激素、己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮、甲地孕酮、己烯雌酚、乙炔雌二醇、他莫昔芬、阿那曲唑；丙酸睾酮、氟甲睾酮、氟他胺、比卡鲁胺和亮丙瑞林。

在一些实施方案中，所述癌症药物是沙利度胺或其衍生物。在一些实施方案中，所述癌症药物选自顺铂、卡铂和奥沙利铂。在某些实施方案中，所述癌症药物选自紫杉醇、Abraxane(R)和Taxotere(R)。在一个实施方案中，所述化学治疗剂选自天冬酰胺酶、贝伐单抗、博来霉素、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、羟基脲、链脲霉素和6-巯基嘌呤、环磷酰胺、紫杉醇和吉西他滨。

V.示例性实施方案

所提供的实施方案包括：

1.一种组合物，其包含对CD16 158V+呈表面阳性的自然杀伤(NK)细胞亚群，其中所述组合物中至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞包含所述CD16 158V+NK细胞亚群。

2.根据实施方案1所述的组合物，其中所述CD16 158V+NK细胞亚群不表达FcRγ链(CD16 158V+/g-)，对于KIR呈表面阳性和/或对于Nkp30和/或Nkp46呈表面阴性或低。

3.一种组合物，其包含对CD16 158V+呈表面阳性且缺乏FcRγ链(CD16 158V+/g-)表达的自然杀伤(NK)细胞亚群，其中所述组合物中至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞包含所述CD16 158V+/g-NK细胞亚群。

4.根据实施方案1-3中任一项所述的组合物，其中CD16 158V+包含SEQ ID NO:11所示的序列或展现出与SEQ ID NO:11至少85％、90％或95％的序列同一性并包含158V+多态性的序列。

5.根据实施方案1-4中任一项所述的组合物，其中所述NK细胞亚群对于KIR、任选地对于KIR2DL2/3呈表面阳性。

6.根据实施方案1-5中任一项所述的组合物，其中所述NK细胞亚群对于Nkp30和/或Nkp46的表面表达呈阴性或低。

7.根据实施方案1-6中任一项所述的组合物，其中所述NK细胞亚群对于KIR、任选地对于KIR2DL2/3呈表面阳性，而对于Nkp30和/或Nkp46的表面表达呈阴性或低。

8.根据实施方案1-7中任一项所述的组合物，其中所述NK细胞亚群对于NKG2C呈表面阳性。

9.根据实施方案1-8中任一项所述的组合物，其包含从或从约10⁵至约10¹²个细胞、从或从约10⁵至约10⁸个细胞、从或从约10⁶至约10¹²个细胞、从或从约10⁸至约10¹¹个细胞、或者从或从约10⁹至约10¹⁰个细胞。

10.根据实施方案1-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物的体积为至少或至少约10mL、50mL、100mL、200mL、300mL、400mL或500mL和/或所述组合物包含1x 10⁵与1x 10⁸个细胞/mL之间。

11.根据实施方案1-10中任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。

12.根据实施方案1-11中任一项所述的组合物，其进一步包含冷冻保护剂。

13.根据实施方案1-12中任一项所述的组合物，其中所述NK细胞亚群是从受试者获得的原代NK细胞。

14.根据实施方案13所述的组合物，其中所述受试者是人。

15.一种用于富集NK细胞的方法，所述方法包括：

(a)从鉴定为具有CD16 158V+NK细胞基因型的受试者中分离NK细胞或其亚群；并且

(b)在用以扩增所述细胞的条件下培养所分离的NK细胞或其亚群，从而从所述受试者富集NK细胞或其亚群。

16.根据实施方案15所述的方法，其包括在步骤(a)之前，针对CD16158V+NK细胞基因型的存在对受试者进行筛选。

17.根据实施方案16所述的方法，其中所述NK细胞或其亚群是从包含淋巴细胞的细胞群中分离的。

18.根据实施方案17所述的方法，其中所述细胞群包含外周血单核细胞(PBMC)样品、单采术产物或白细胞单采术产物。

19.根据实施方案15-18中任一项所述的方法，其中从所述受试者中分离NK细胞亚群，所述NK细胞亚群包含或富集不表达FcRγ链(CD16158V+/g-)的细胞。

20.根据实施方案19所述的方法，其中所述NK细胞亚群对于KIR、任选地对于KIR2DL2/3呈表面阳性。

21.根据实施方案15-20中任一项所述的方法，其中所述NK细胞亚群对于Nkp30和/或Nkp46的表面表达呈阴性或低。

22.根据实施方案15-21中任一项所述的方法，其中所述NK细胞亚群对于KIR、任选地对于KIR2DL2/3呈表面阳性，而对于Nkp30和/或Nkp46的表面表达呈阴性或低。

23.根据实施方案15-22中任一项所述的方法，其中所述NK细胞或其亚群对于NKG2C呈表面阳性。

24.根据实施方案15-23中任一项所述的方法，其中将所述细胞在饲养细胞的存在下或在一种或多种细胞因子任选地IL-2、IL-15和/或IL-7的存在下培养。

25.根据实施方案15-24中任一项所述的方法，其中将所述NK细胞培养一段时间以实现与在所述培养前分离的NK细胞的数量相比，所述细胞扩增至少5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或更多。

26.根据实施方案15-25中任一项所述的方法，其中将所分离的NK细胞培养7至28天，任选地约14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天。

27.根据实施方案15-26中任一项所述的方法，其中培养所分离的细胞以实现治疗有效量。

28.根据实施方案15-27中任一项所述的方法，其中培养所分离的细胞以实现从或从约10⁵至约10¹²个细胞、从或从约10⁵至约10⁸个细胞、从或从约10⁶至约10¹²个细胞、从或从约10⁸至约10¹¹个细胞、或者从或从约10⁹至约10¹⁰个细胞的大量富集的NK细胞。

29.根据实施方案15-28中任一项所述的方法，其进一步包括对所分离的或富集的细胞进行HLA分型。

30.根据实施方案15-29中任一项所述的方法，其进一步包括在冷冻保护剂的存在下冷冻保存所述细胞和/或配制所述细胞。

31.根据实施方案15-30中任一项所述的方法，所述方法包括在分离所述NK细胞或其亚群之前向所述受试者给予IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或CCL5。

32.根据实施方案15-31中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

33.根据实施方案15-31中任一项所述的方法，其中所述受试者是健康的。

34.一种组合物，其包含通过根据实施方案15-33中任一项所述的方法产生的富集的NK细胞。

35.根据实施方案34所述的组合物，其包含药学上可接受的赋形剂。

36.根据实施方案34或实施方案35所述的组合物，其包含冷冻保护剂。

37.根据实施方案1-14和34-36中任一项所述的组合物，其是无菌的。

38.一种试剂盒，其包含根据实施方案1-14和34-37中任一项所述的组合物和用于治疗疾病的另外的药剂。

39.根据实施方案38所述的试剂盒，其进一步包含关于给予所述组合物和用于治疗疾病或病症的另外的药剂的说明书。

40.一种试剂盒，其包含根据实施方案1-14和34-37中任一项所述的组合物和关于在组合疗法中与用于治疗疾病的另外的药剂一起给予所述组合物的说明书。

41.根据实施方案38-40中任一项所述的试剂盒，其中所述另外的药剂是抗体或Fc-融合蛋白。

42.根据实施方案41所述的试剂盒，其中所述抗体识别或特异性地结合肿瘤相关抗原。

43.根据实施方案42所述的试剂盒，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、离散因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、黏结蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或生腱蛋白。

44.根据实施方案41-43中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体是全长抗体和/或包含Fc结构域。

45.一种治疗疾病或病症的方法，其包括将根据实施方案1-14和34-37中任一项所述的组合物给予至有需要的个体。

46.根据实施方案45所述的方法，其中所述给予包括向所述个体给予从或从约1x10⁸至1x 10¹⁰个细胞/m²，或者从或从约1x 10⁶至1x 10¹⁰个NK细胞/kg。

47.根据实施方案45或实施方案46所述的方法，其进一步包括给予另外的药剂。

48.根据实施方案47所述的方法，其中所述另外的药剂是抗体或Fc-融合蛋白。

49.根据实施方案48所述的方法，其中所述抗体识别肿瘤相关抗原。

50.根据实施方案48或实施方案49所述的方法，其中所述抗体识别或特异性结合CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、间皮素、甲胎蛋白、粘蛋白、PDGFR-α、TAG-72、CAIX、PSMA、叶酸结合蛋白、离散因子受体激酶、神经节苷脂、细胞角蛋白、卷曲受体、VEGF、VEGFR、整合素αVβ3、整合素α5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2(HER2)、ERBB3、纤连蛋白、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-α、磷脂酰丝氨酸、黏结蛋白聚糖1、SLAMF7(CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、波形蛋白或生腱蛋白。

51.根据实施方案48-50中任一项所述的方法，其中所述抗体包含Fc结构域和/或是全长抗体。

52.根据实施方案47-51中任一项所述的方法，其中将所述另外的药剂和所述组合物依序给予。

53.根据实施方案52所述的方法，其中在给予所述组合物之前给予所述另外的药剂。

54.根据实施方案47-53中任一项所述的方法，其中将所述另外的药剂和所述组合物同时给予。

55.根据实施方案45-54中任一项所述的方法，其中所述病症选自炎性病症、感染和癌症。

56.根据实施方案55所述的方法，其中所述感染是病毒感染或细菌感染。

57.根据实施方案55所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症，并且所述癌症是白血病或淋巴瘤。

58.根据实施方案55所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症，并且所述癌症包括实体瘤。

59.根据实施方案45-58中任一项所述的方法，其中所述个体是人。

60.根据实施方案45-59中任一项所述的方法，其中所述组合物中的NK细胞对所述个体而言是同种异体的。

61.根据实施方案45-59中任一项所述的方法，其中所述组合物中的NK细胞对所述受试者而言是自体的。

VI.实施例

以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。

实施例1：人类供体的g-158V+NK细胞亚群的分离和富集

为了鉴定携带V158+多态性的受试者，从源自健康供体的样品的外周血中提取DNA。使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega，威斯康辛州麦迪逊)从血液样品中提取基因组DNA。使用巢式PCR基本上如先前所述进行CD16 158V+(V158V多态性)的基因分型，例如Cartron等人(2002)Blood,99:754-758；Koene等人(1997)Blood,90:1109-1114)，随后进行等位基因特异性限制酶消化。

简而言之，第一次PCR使用特异性引物5'-ATATTTACAGAATGGCACAGG-3'(SEQ IDNO:1)和5'-GACTTGGTACCCAGGTTGAA-3')(SEQ ID NO:2)来扩增包含多态性位点的1.2kb碱基片段。使用约1.25μg基因组DNA，200ng每种引物，200μM每种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和1U Taq DNA聚合酶进行初始PCR测定。第一次PCR在95℃下进行10分钟，进行35个循环(每个循环包括在95℃下进行1分钟，在57℃下进行1.5分钟，在72℃下进行1.5分钟的步骤)，以及在72℃下进行8分钟，以实现完整的扩展。第二次PCR使用引物5'-ATCAGATTCGATCCTACTTCTGCAGGGGGCAT-3'(SEQ ID NO:3)和5'-ACGTGCTGAGCTTGAGTGATGGTGATGTTCAC-3'(SEQ IDNO:4)，从而扩增94个碱基对(bp)片段并仅在158V+等位基因中产生NlaIII限制性酶切位点。用1μL扩增的DNA，150ng每种引物，200μM每种dNTP和1U Taq DNA聚合酶进行巢式PCR。所述循环包括在95℃下进行5分钟，然后进行35个循环(每个循环包括在95℃下进行1分钟，在64℃下进行1分钟，在72℃下进行1分钟的步骤)，以及在72℃下进行9.5分钟，以完成扩展。

然后将扩增的DNA(10μL)用10U NlaIII在37℃下消化12小时，并通过在8％聚丙烯酰胺凝胶上的电泳分离。用溴化乙锭染色后，在UV光下可视化DNA条带。对于纯合158F供体，仅可见一个未消化的条带(94bp)。在杂合个体中观察到三个条带(94bp、61bp和33bp)，而对于纯合158V+患者，仅获得2个消化的条带(61bp和33bp)。

从供体获得158V+纯合的外周血单核细胞(PBMC)，并使用对CD56(N901)、CD3(UCHT1)、CD14(HCD14)和CD19(HIB19)具有特异性的抗体对PBMC的表面标记物进行染色，随后通过对具有表型CD56^dimCD3^-CD14^-CD19^-且对于KIR、KIR2DL1(CD158a；HP-MA4)、KIR2DL2/3(CD158b；CH-L)或KIR3DL1(CD158e；DX9)呈表面阳性，和/或对于NCR、Nkp46(CD335；9E2)或NKp30(CD337；p30-15)呈表面阴性的细胞进行门控来进行荧光激活细胞分选，从而排除非NK细胞，并从新鲜分离的PBMC中富集FcRγ缺乏型(g^–NK)至约70％或更高纯度，如在Hwang等人(2012)Int.Immunol.,24:793-802中所述。抗体可从商业提供商获得，诸如BeckmanCoulter(美国加利福尼亚州)、BD Biosciences(美国加利福尼亚州)、Biolegend(美国加利福尼亚州)或eBiosciences(美国加利福尼亚州)。

对于扩增，所得富集细胞可通过在NK克隆培养基[RPMI1640(Invitrogen，美国纽约州)，补充有5％汇集的人AB血清(Cellgro，美国弗吉尼亚州)、10％胎牛血清(Hyclone，美国犹他州)、1μg/ml PHA(Roche，美国印第安纳州)、100U ml^-1IL-2和10ng ml^-1IL-15(Peprotech，美国新泽西州)]以及PHA刺激(1μg ml^-1持续1h)的同种异体PBMC和用丝裂霉素C(Sigma-Aldrich，美国密苏里州)在37℃处理2h的RPMI 8866细胞中限制稀释来铺板。每10-14天以每孔25,000个添加饲养细胞，持续长达2个月。

为了评估富集的CD16 158V+/g-NK细胞的抗体导向活性，在37℃用100μCi of ⁵¹Cr标记大约多个骨髓瘤MM1S目标细胞1小时，用PBS洗涤两次，然后重悬于RPMI培养基中。在存在或不存在10μg/mL抗CD38抗体达雷木单抗的情况下，将100μl RPMI培养基中的总共3×10⁴个靶细胞一式三份放入V型底96孔板中。将肿瘤细胞在室温下孵育约20分钟，然后洗涤两次以去除抗体。将所述细胞重悬于100μL培养基中，向其中添加等体积的CD16158V+/g-NK细胞(1:3至10:1的各种效应子:靶标比率)，并将细胞孵育4小时。使用Packard CobraAuto-Gamma 5000系列计数系统(Meridien，美国康涅狄格州)对上清液的等分试样进行计数。根据以下公式计算特定⁵¹Cr释放百分比：特定释放百分比＝[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100。作为对照，使用CD56+常规NK细胞或在不存在抗CD38抗体达雷木单抗的情况下进行实验。结果表明，在抗CD38包被的肿瘤细胞的存在下，CD16158V+/g-NK细胞展现出ADCC活性，所述活性高于常规NK细胞的ADCC活性。

用利妥昔单抗包被的CD20+B细胞淋巴瘤细胞进行相似的实验。结果表明，与常规的NK细胞或对照相比，与利妥昔单抗包被的EBV转化的B细胞淋巴瘤细胞共培养时，CD16158V+/g-NK细胞展现出更大的介导ADCC的能力。

实施例2：评估NK细胞亚群的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)

158V是CD16的遗传多态性，其中氨基酸缬氨酸(V)存在于蛋白的第158个氨基酸位置，而不是更常见的苯丙氨酸(F)(Koene等人,1997,Blood 90:1109-14)。这导致CD16的表达和抗体亲和力更高，从而导致CD16158V+NK细胞增强ADCC(Hatjiharissi等人,2007,Blood 110:2561-4)。具体而言，158V/V和158V/F供体通过ADCC杀死ARH-77和Daudi细胞的效果远远好于158F/V供体，其中158V/V供体表现最佳(Hatjiharissi等人,2007)。

筛选了来自BloodWorks NW的四十(40)个CMV血清反应阳性供体，以确定g-NK比例最高的12个供体。这些供体g-NK细胞通过磁珠分离(CD3-/CD57+)从PBMC中富集。通过磁珠分离(CD3-/CD57+)，还从来自没有g-NK的供体的PBMC中富集了来自常规供体的大量NK细胞。使用流式细胞术，针对以下细胞外标记物使用荧光抗体，测定g-NK细胞的比例：CD45、7-AAD、CD3、CD56、CD16、CD57、CD7和CD161。在室温下于黑暗中与抗体孵育20分钟后，用PBS洗涤细胞，并通过流式细胞术定量7-AAD^neg/CD45^pos白细胞的数量。洗涤细胞，用4％多聚甲醛固定，然后洗涤并重悬于0.2％皂苷中以透化细胞膜。然后，添加荧光缀合的抗FceRI抗体。在室温下于黑暗中再孵育15分钟后，用流式细胞术分析细胞，并将g-NK的百分比评估为CD45^pos/7-AAD^neg/CD3^neg/CD56^pos/FceRI^neg淋巴细胞的百分比。

测试富集的细胞对以下肿瘤/抗体组合的ADCC：1)SW-480/西妥昔单抗；2)SKOV3/曲妥珠单抗；3)SKOV3/西妥昔单抗；4)MM.1S/达雷木单抗；和5)MM.1S/埃罗妥珠单抗。

对于以卵巢癌细胞系SKOV3(ATCC；美国维吉尼亚州马纳萨斯)为靶标的ADCC细胞毒性测定，将NK细胞与CD71标记的SKOV3靶细胞(1.0x 10⁴个细胞)以0.5:1、1:1、2.5:1和5:1的NK细胞与靶细胞比率共培养在最终体积为2.2mL的靶细胞特异性培养基中(Bigley等人,2014,Brain Behav Immuno.,39:160-71)。用于ADCC测定的培养基是补充了10％FBS的McCoy的5A培养基，含1μg/mL曲妥珠单抗(抗HER2)或5μg/mL西妥昔单抗(抗EGFR)。在每种情况下，在不存在治疗抗体的情况下也测量了基础细胞毒性。仅靶细胞的试管用于控制自发性细胞死亡(所有测定均小于10％)。在37℃下孵育4h后，将细胞洗涤并用抗CD3和CD56抗体染色以定量管中NK细胞的数量。最后一次洗涤后，加入碘化丙啶(PI)，并使用4色流式细胞术解析NK细胞、活靶细胞和死靶细胞的数量(Bigley等人,2018,J Appl Physiol,126:842-853)。

对于以多发性骨髓瘤细胞系MM.1S(ATCC；美国维吉尼亚州马纳萨斯)作为靶标的ADCC细胞毒性测定，将NK细胞与CD71标记的MM.1S靶细胞(1.0x 10⁴个细胞)以0.5:1、1:1、2.5:1和5:1的NK细胞:靶细胞比率共培养在最终体积为2.2mL的靶细胞特异性培养基中。用于ADCC测定的培养基是补充了10％FBS的RPMI-1640培养基，含1μg/mL的达雷木单抗(抗CD38)或1μg/mL的埃罗妥珠单抗(抗CD319)。在每种情况下，在不存在治疗抗体的情况下也测量了基础细胞毒性。仅靶细胞的试管用于控制自发性细胞死亡(所有测定均小于10％)。在37℃下孵育4h后，将细胞洗涤并用抗CD3和CD56抗体染色以定量管中NK细胞的数量。最后一次洗涤后，加入碘化丙啶(PI)，并使用4色流式细胞术解析NK细胞、活靶细胞和死靶细胞的数量(Bigley等人,2018)。

对于以CRC细胞系SW-480(ATCC；美国维吉尼亚州马纳萨斯)作为靶标的ADCC细胞毒性测定，将NK细胞与CD71标记的SW-480靶细胞(1.0x 10⁴个细胞)以0.5:1、1:1、2.5:1和5:1的NK细胞:靶细胞比率共培养在最终体积为2.2mL的靶细胞特异性培养基中。用于ADCC测定的培养基是补充了10％FBS的Leibovitz's L-15培养基，含5μg/mL西妥昔单抗(抗EGFR)。在没有西妥昔单抗的情况下也测量了基础细胞毒性。仅靶细胞的试管用于控制自发性细胞死亡(所有测定均小于10％)。在37℃下孵育4h后，将细胞洗涤并用抗CD3和CD56抗体染色以定量管中NK细胞的数量。最后一次洗涤后，加入碘化丙啶(PI)，并使用4色流式细胞术解析NK细胞、活靶细胞和死靶细胞的数量(Bigley等人,2018)。

如图1所示，将g-NK的ADCC与没有g-NK的供体的常规NK细胞(c-NK)进行了比较(n＝4)。在这12个供体中，有5个‘超级供体’因其一致的高ADCC值而引人注目。

然后评估供体以确定关于CD16的158V多态性(V/V、V/F和F/F)，每个供体属于哪个亚组。预期分布为35％V/V、25％V/F和40％F/F(Hatjiharissi等人,2007；Somboonyosdech等人,2012,Asian Biomedicine,6:883-89)，因此任何与这一预期的偏差都将与158V多态性可能在这些供体所看到的高ADCC中起作用的发现相一致。为了进行多态性测试，将冷冻的NK细胞解冻并用PBS洗涤，并以100g离心。洗涤步骤之后，倾析上清液，并将所述NK细胞重悬于10mL中，以通过流式细胞术进行细胞计数。简而言之，将50μL细胞悬液收集到流管中，并用2μL CD45荧光抗体(从残留的红细胞中辨别出白细胞)和2μL 7-AAD(活性染料)染色。在室温下于黑暗中孵育10分钟后，用500μL PBS稀释细胞，并通过流式细胞术定量7-AAD^neg/CD45^pos白细胞的数量。细胞计数后，进行磁珠分离以分离CD16^pos NK细胞群。对于此方案，按照制造商的说明使用Miltenyi MACS^TM CD16微珠进行磁珠分离。磁珠分离后，使用10XGenomics单细胞RNA测序确定供体所属的CD16多态性组(V/V、V/F或F/F)。如图1所示，158V(V/V或V/F)供体具有最高的ADCC。

本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。

序列表

<110> 因达普塔治疗公司

G·迪皮埃罗

G·多斯桑托斯

<120> 具有增强的抗体导向免疫应答的人自然杀伤细胞亚群

<130> 776032000340

<140> 尚未分配

<141> 同时提交

<150> 62/671,358

<151> 2018-05-14

<160> 12

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 158V引物

<400> 1

atatttacag aatggcacag g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 158V引物

<400> 2

gacttggtac ccaggttgaa 20

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 158V引物

<400> 3

atcagattcg atcctacttc tgcagggggc at 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 158V引物

<400> 4

acgtgctgag cttgagtgat ggtgatgttc ac 32

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 158V引物

<400> 5

cccaactcaa cttcccagtg tgat 24

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 158V引物

<400> 6

gaaatctacc ttttcctcta atagggcaat 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 158V引物

<400> 7

gaaatctacc ttttcctcta atagggcaa 29

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 158V引物

<400> 8

gaaatctacc ttttcctcta atagggca 28

<210> 9

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD16 (F158)

<400> 9

Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro

1 5 10 15

Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln

20 25 30

Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr

50 55 60

Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu

65 70 75 80

Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln

85 90 95

Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys

100 105 110

His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn

115 120 125

Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro

130 135 140

Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe

145 150 155 160

Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln

165 170 175

Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln

180 185 190

Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly

195 200 205

Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp

210 215 220

Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys

225 230 235

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 10

Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala

1 5 10 15

<210> 11

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD16 (158V+)

<400> 11

Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro

1 5 10 15

Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln

20 25 30

Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr

50 55 60

Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu

65 70 75 80

Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln

85 90 95

Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys

100 105 110

His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn

115 120 125

Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro

130 135 140

Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val

145 150 155 160

Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln

165 170 175

Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln

180 185 190

Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly

195 200 205

Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp

210 215 220

Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys

225 230 235

<210> 12

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FcRγ链

<400> 12

Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu Gln Ala

1 5 10 15

Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu

20 25 30

Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile

35 40 45

Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val

50 55 60

Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys

65 70 75 80

His Glu Lys Pro Pro Gln

85