抗ngf抗体及其方法
阅读说明：本技术 抗ngf抗体及其方法 (anti-NGF antibodies and methods thereof ) 是由 S.C.J.斯泰尼格 W.邓克尔 C.鲁格 S.A.邓纳姆 于 2019-01-18 设计创作，主要内容包括：本公开包含新的抗NGF抗体、抗原结合蛋白和编码它们的多核苷酸。本公开进一步提供了本发明的新抗体、抗原结合蛋白和/或核苷酸用于治疗和/或预防NGF相关的病症的用途,特别是用于管理疼痛的用途。(The present disclosure encompasses novel anti-NGF antibodies, antigen binding proteins, and polynucleotides encoding them. The present disclosure further provides the use of the novel antibodies, antigen binding proteins and/or nucleotides of the present invention for the treatment and/or prevention of NGF related disorders, in particular for the management of pain.)
技术领域
本发明涉及免疫学领域。更具体地说，本发明涉及抗NGF抗原结合蛋白，其特异性结合至已被修饰成变得在相关物种中无免疫原性的NGF。本发明进一步涉及这样的抗原结合蛋白在治疗和/或预防NGF相关的病症，特别是疼痛中的用途。
背景技术
神经生长因子(NGF)是第一个被识别的神经营养因子，并且其在外周和中枢神经元的发育和存活中的作用已经被很好地表征。NGF已经被证明是外周交感神经元和胚胎感觉神经元以及基底前脑胆碱能神经元的发育中的关键存活和维持因子(Smeyne et al.,Nature 368:246-249(1994)and Crowley et al.,Cell 76:1001-101I(1994))。NGF上调感觉神经元中神经肽的表达(Lindsay,et al,Nature 337:362-364(1989))，并且其活性通过两种不同的膜结合受体介导，即TrkA酪氨酸激酶受体和p75普通神经营养因子受体(有时分别被称为“高亲和力”和“低亲和力”NGF受体)，其在结构上与肿瘤坏死因子受体家族的其他成员相关(Chao et al.,Science 232:518-521(1986))。
除了其对神经系统的影响外，NGF也越来越多地参与神经系统以外的过程。例如，NGF已被证明能增强血管通透性(Otten et al.,Eur J Pharmacol.106:199-201(1984))，增强T细胞和B细胞免疫反应(Otten et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10059-10063(1989))，诱导淋巴细胞分化和肥大细胞增殖，并导致从肥大细胞中释放可溶性生物信号(Matsuda et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6508-6512(1988)；Pearce et al.,J.Physiol.372:379-393(1986)；Bischoff,et al.,Blood 79:2662-2669(1992)；Horigomeet al.,J.Bioi.Chem.268:14881-14887(1993))。
NGF由若干种细胞类型产生，包含肥大细胞(Leon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3739-3743(1994))、B淋巴细胞(Torcia,et al.,Cell 85:345-356(1996))、角质形成细胞(Di Marco et al.,J.Biol.Chem.268:22838-22846)、平滑肌细胞(Ueyama,et al.,J.Hypertens.11:1061-1065(1993))、成纤维细胞(Lindholm,etal.,Eur.J.Neurosci.2:795-801(1990))、支气管上皮细胞(Kassel,et al.,Clin,Exp.Allergy 31:1432-40(2001))、肾系膜细胞(Steiner,et al.,Am.J.Physiol.261:F792-798(1991))和骨骼肌肌管(Schwartz et al.,J Photochem.Photobiol.B66:195-200(2002))。NGF受体已经在神经系统以外的多种细胞类型上被发现。例如，在人单核细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞以及肥大细胞上已经发现TrkA。
在人类患者中以及在若干种动物模型中，已经观察到增加的NGF水平和各种炎性病症之间的联系。这些包含全身性红斑狼疮(Bracci-Laudiero,et al.,Neuroreport 4:563-565(1993))、多发性硬化症(BracciLaudiero et al,Neurosci.Lett.147:9-12(1992))、银屑病(Raychaudhuri et al.,Acta Derm.I'enereol.78:84-86(1998))、关节炎(Falcim et al.,Ann.Rheum.Dis.55:745-748(1996))、间质性膀胱炎(Okragly et al.,J.Urology 161:438-441(1999))和哮喘(Braun et al.,Eur.J Immunol.28:3240-3251(1998))。外周组织中NGF的持续升高的水平与痛觉过敏和炎症有关，并且已经在若干种形式的关节炎中观察到。受类风湿性关节炎影响的患者的滑膜表达高水平的NGF，而在非炎症的滑膜中，据报道NGF是检测不到的(Aloe,et al.,Arch.Rheum.35:351-355(1992))。在患有实验诱导的类风湿性关节炎的大鼠中观察到类似的结果(Aloe,et al.,Clin.Exp.Rheumatol.10:203-204(1992))。已经报道了在转基因关节炎小鼠中NGF水平升高以及肥大细胞数量的增加(Aloe et al.,Int.J.Tissue Reactions-Exp.Clin.Aspects15:139-143(1993))。
骨关节炎(OA)是狗中最常见的慢性肌肉骨骼疾病之一，影响20％的超过一岁的犬群。OA的发展主要继发于创伤、关节不稳定和诸如髋关节发育不良的疾病。骨关节炎是整个关节的疾病状态，并且所有关节结构的炎性和退行性改变都导致残疾以及跛行和疼痛的临床症状。疼痛是犬OA的最重要的临床表现，并且其是结构性关节改变、生化和分子改变以及外周和中枢疼痛处理机制之间的复杂相互作用的结果。在该网络中，炎性和痛觉过敏介质(例如细胞因子、***素和神经介质)对外周伤害感受器的激活和敏化是引起关节疼痛的主要外周机制之一。与传统的犬类疼痛治疗相比将提供更长时间的缓解的通过非药物药剂治疗犬类疼痛显然是未得到满足的需求。
仅在美国就有大约1450万只狗患有OA(2010年市场研究)。非甾体抗炎药物(NSAID)是兽医开出的最常见的药物类别，但受到其功效和耐受性的限制。市场研究表明，美国约900万只狗用NSAID治疗。皮质类固醇很少使用，并且通常在短的时间段内使用并且是不得已的手段。对于有效地治疗患有OA的狗的方便、安全的产品显然存在未得到满足的需求。
在猫类中，OA是动关节滑膜关节的病理变化，其特征是关节软骨的退化、骨赘形成、骨重塑、软组织变化和低度非化脓性炎症。尽管猫OA的影像学特征已经被很好地描述，但是疾病的临床体征很少被记录，并且可能无法诊断。评估猫跛行的困难在于它们的小体型和天生的灵活性，这允许它们能够进行补偿。然而，据信猫OA的临床体征包含体重减轻、厌食、抑郁、异常的排便习惯、很少理毛、攻击性行为以及跳跃至明显跛行的能力的逐渐降低。基于误诊，猫OA通常仍未得到治疗，并且是未得到满足的兽医学需求。
发明内容
本发明提供了一种新的抗NGF抗原结合蛋白(如本文所定义的和可互换地使用的抗体、抗体片段、抗原结合片段、抗原结合部分、拮抗剂抗体等)，以及编码它的多核苷酸。本发明进一步提供了制备所述抗原结合蛋白和/或核苷酸以及在治疗和/或预防受试者的NGF相关的病症，特别是疼痛中使用所述抗原结合蛋白和/或核苷酸的方法。本发明进一步提供了用于治疗受试者的NGF相关的病症，特别是疼痛的药物组合物和用途。
在一个方面中，本发明提供了一种特异性地结合至神经生长因子(NGF)的重组抗原结合蛋白，其包括可变轻链(VL)，所述可变轻链包括互补决定区1(CDR1)，所述互补决定区包括与SEQ ID.NO.1或SEQ ID NO.21具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；互补决定区1(CDR2)，其包括与SEQ ID.NO.2或SEQ ID NO.22具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；互补决定区1(CDR3)，其包括与SEQ ID.NO.3或SEQ ID NO.23具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和可变重链(VH)，所述可变重链包括：互补决定区1(CDR1)，其包括与SEQID.NO.4或SEQ ID NO.24具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；互补决定区1(CDR2)，其包括与SEQ ID.NO.5或SEQ ID NO.25具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和互补决定区1(CDR3)，其包括与SEQ ID.NO.6或SEQ ID NO.26具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内的CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了抗原结合蛋白包括轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包括互补决定区1(CDR1)，所述互补决定区包括与包括SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；互补决定区2(CDR2)，其包括与包括SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；互补决定区3(CDR3)，其包括与包括SEQ ID NO.3的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区(VH)，所述重链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，其包括与包括SEQ ID NO.4的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；互补决定区2(CDR2)，其包括与包括SEQ ID NO.5的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；互补决定区3(CDR3)，其包括与包括SEQ ID NO.6的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内的CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了本发明的抗原结合蛋白包括轻链可变区(VL)，该轻链可变区包括互补决定区1(CDR1)，该互补决定区包括与包括SEQ ID NO.21的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；互补决定区2(CDR2)，其包括与包括SEQ IDNO.22的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；互补决定区3(CDR3)，其包括与包括SEQ ID NO.23的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；和重链可变区(VH)，所述重链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，其包括与包括SEQ ID NO.24的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；互补决定区2(CDR2)，其包括与包括SEQID NO.25的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；互补决定区3(CDR3)，其包括与包括SEQ ID NO.26的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内的CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸取代。
在一个方面中，本发明提供了一种与神经生长因子(NGF)特异性结合的重组抗原结合蛋白，其包括可变轻链，该可变轻链包括与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.9；SEQ ID NO.27；SEQ IDNO.29；SEQ ID NO.55；SEQ ID NO.71；SEQ ID NO.73；SEQ ID NO.83；SEQ ID NO.85；SEQ IDNO.87；SEQ ID NO.89；和SEQ ID NO.91；和可变重链，所述可变重链包括与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.28；SEQ ID NO.30；SEQ ID NO.56；SEQ ID NO.67；SEQ ID NO.69；SEQ IDNO.75；SEQ ID NO.77；SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.81；以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内具有一个或多个保守氨基酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了本发明的重组抗原结合蛋白包括可变轻链，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.7具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和可变重链，所述可变重链包括与SEQ ID NO.8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内具有一个或多个保守氨基酸取代。在一个实施例中，本发明提供了一种抗原结合蛋白，其中可变轻链包括与SEQ IDNO.27具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且可变重链包括与SEQ ID NO.28具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内具有一个或多个保守氨基酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了本发明的重组抗原结合蛋白包括可变轻链，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.9具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和可变重链，所述可变重链包括与SEQ ID NO.10具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内具有一个或多个保守氨基酸取代。在一个实施例中，本发明提供了本发明的重组抗原结合蛋白包括可变轻链，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.29具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和可变重链，所述可变重链包括与SEQ ID NO.30具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内具有一个或多个保守氨基酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了本发明的重组抗原结合蛋白包括可变轻链，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.55具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和可变重链，所述可变重链包括与SEQ ID NO.56具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内具有一个或多个保守氨基酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了本发明的重组抗原结合蛋白包括可变轻链，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.91具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和可变重链，所述可变重链包括与SEQ ID NO.79具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内具有一个或多个保守氨基酸取代。在一个实施例中，本发明提供了本发明的重组抗原结合蛋白包括可变轻链，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.87具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和可变重链，所述可变重链包括与SEQ ID NO.79具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内具有一个或多个保守氨基酸取代。在一个实施例中，本发明提供了本发明的重组抗原结合蛋白包括可变轻链，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.91具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和可变重链，所述可变重链包括与SEQ ID NO.75具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内具有一个或多个保守氨基酸取代。在一个实施例中，本发明提供了本发明的重组抗原结合蛋白包括可变轻链，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.87具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和可变重链，所述可变重链包括与SEQ ID NO.89具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内具有一个或多个保守氨基酸取代。在一个实施例中，本发明提供了本发明的重组抗原结合蛋白包括可变轻链，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.91具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和可变重链，所述可变重链包括与SEQ ID NO.75具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内具有一个或多个保守氨基酸取代。在一个实施例中，本发明提供了一种与神经生长因子(NGF)特异性结合的重组抗原结合蛋白，其进一步包括恒定区，该恒定区包括选自SEQ ID NO.41或43的氨基酸。在一个实施例中，本发明提供了一种编码恒定区的核苷酸序列，所述恒定区选自由SEQ ID NO.42或SEQ ID NO.44组成的组。在一个实施例中，本发明的抗原结合蛋白的恒定区缺乏效应子功能。在一个实施例中，对本发明的抗原结合蛋白的恒定区的改变防止了抗原结合蛋白的降解。
在一个实施例中，本发明提供了一种与NGF特异性结合的重组抗原结合蛋白，该蛋白进一步包括恒定区，所述恒定区包括包括有SEQ ID.62的氨基酸序列。在一个实施例中，本发明提供了一种编码包括SEQ ID NO.63的恒定区的核苷酸序列。在一个实施例中，本发明的抗原结合蛋白的恒定区缺乏效应子功能。在一个实施例中，对本发明的抗原结合蛋白的恒定区的改变防止了抗原结合蛋白的降解。
在一个方面中，本发明提供了编码本发明的重组抗原结合蛋白的核苷酸序列，所述重组抗原结合蛋白特异性地结合至神经生长因子(NGF)，其包括可变轻链(VL)，所述可变轻链包括互补决定区1(CDR1)核酸序列，所述互补决定区核酸序列与SEQ ID.NO.11或SEQID NO.31具有至少90％的序列同一性；互补决定区1(CDR2)，其包括与SEQ ID.NO.12或SEQID NO.32具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；互补决定区1(CDR3)，其包括与SEQID.NO.13或SEQ ID NO.33具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；和可变重链(VH)，其包括：互补决定区1(CDR1)，其包括与SEQ ID.NO.14或SEQ ID NO.34具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；互补决定区1(CDR2)，其包括与SEQ ID.NO.15或SEQ ID NO.35具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；和互补决定区1(CDR3)，其包括与SEQ ID.NO.15或SEQ ID NO.36具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内的CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个中的遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了一种编码本发明的抗原结合蛋白的核苷酸序列，所述抗原结合蛋白包括轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包括互补决定区1(CDR1)，所述互补决定区包括与包括SEQ ID NO.11的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列；互补决定区2(CDR2)，其包括与包括SEQ ID NO.12的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列；互补决定区3(CDR3)，其包括与包括SEQ ID NO.13的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列；和重链可变区(VH)，其包括：互补决定区1(CDR1)，其包括与包括SEQ ID NO.14的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列；互补决定区2(CDR2)，其包括与包括SEQ ID NO.15的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列；互补决定区3(CDR3)，其包括与包括SEQ ID NO.16的核酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列，及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内的CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个中的遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了一种编码本发明的抗原结合蛋白的核苷酸序列，并且包括编码轻链可变区(VL)的核苷酸，所述轻链可变区包括互补决定区1(CDR1)，所述互补决定区1包括与包括SEQ ID NO.31的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列；互补决定区2(CDR2)，其包括与包括SEQ ID NO.32的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列；互补决定区3(CDR3)，其包括与包括SEQ ID NO.33的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列；和编码重链可变区(VH)的核苷酸序列，所述重链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，其包括与包括SEQ ID NO.34的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列；互补决定区2(CDR2)，其包括与包括SEQ ID NO.35的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列；互补决定区3(CDR3)，其包括与包括SEQ ID NO.36的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性的核苷酸序列，及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内的CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个中的遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。
在一个方面中，本发明提供了一种编码本发明的重组抗原结合蛋白的核苷酸序列，所述重组抗原结合蛋白特异性地结合至神经生长因子(NGF)，其包括编码可变轻链的核苷酸，所述可变轻链包括与选自由以下组成的组的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列蛋白：SEQ ID NO.17；SEQ ID NO.19；SEQ ID NO.37；SEQ ID NO.39；SEQ IDNO.57；SEQ ID NO.88；SEQ ID NO.90；和SEQ ID NO.92；和编码可变重链的核苷酸，所述可变重链包括与选自由以下组成的组的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列：SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.20；SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.40；SEQ ID NO.58；SEQ ID.76；和SEQ ID NO.80，以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了编码本发明的重组抗原结合蛋白的核苷酸序列包括编码可变轻链的核苷酸序列和编码可变重链的核苷酸序列，所述可变轻链包括与SEQ IDNO.17具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，所述可变重链包括与SEQ ID NO.18具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。在一个实施例中，本发明提供了一种编码本发明的抗原结合蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码可变轻链，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.37具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；和编码可变重链的核苷酸序列，其包括与SEQ ID NO.38具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内的遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了编码本发明的重组抗原结合蛋白的核苷酸序列包括编码可变轻链的核苷酸序列和编码可变重链的核苷酸序列，所述可变轻链包括与SEQ IDNO.19具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，所述可变重链包括与SEQ ID NO.20具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。在一个实施例中，本发明提供了一种编码本发明的抗原结合蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码可变轻链，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.39具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；和编码可变重链的核苷酸序列，所述可变重链包括与SEQ ID NO.40具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内的遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了编码本发明的重组抗原结合蛋白的核苷酸序列包括编码可变轻链的核苷酸序列和编码可变重链的核苷酸序列，所述可变轻链包括与SEQ IDNO.57具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，所述可变重链包括与SEQ ID NO.58具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。
在一个实施例中，本发明提供了编码本发明的重组抗原结合蛋白的核苷酸序列包括编码可变轻链的核苷酸序列和编码可变重链的核苷酸序列，所述可变轻链包括与SEQ IDNO.92具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，所述可变重链包括与SEQ ID NO.80具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。在一个实施例中，本发明提供了一种编码本发明的抗原结合蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码可变轻链，其包括与SEQ ID NO.88具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；和编码可变重链的核苷酸序列，所述可变重链包括与SEQ ID NO.80具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。在一个实施例中，本发明提供了编码本发明的重组抗原结合蛋白的核苷酸序列包括编码可变轻链的核苷酸序列和编码可变重链的核苷酸序列，所述可变轻链包括与SEQ ID NO.92具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，所述可变重链包括与SEQ ID NO.76具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。在一个实施例中，本发明提供了一种编码本发明的抗原结合蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码可变轻链，其包括与SEQ ID NO.88具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；和编码可变重链的核苷酸序列，所述可变重链包括与SEQ ID NO.76具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。在一个实施例中，本发明提供了编码本发明的重组抗原结合蛋白的核苷酸序列包括编码可变轻链的核苷酸序列和编码可变重链的核苷酸序列，所述可变轻链包括与SEQID NO.90具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，所述可变重链包括与SEQ ID NO.76具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，以及其任何变体，所述变体基于所述抗原结合蛋白的任何可变轻链区或可变重链区内遗传密码的简并性而具有一个或多个核酸取代。
在一个或多个实施例中，本发明的抗原结合蛋白抑制NGF与TrkA受体的结合。在一个或多个实施例中，本发明的抗原结合蛋白抑制和NGF与TrkA受体的结合相关的生物功能。在一个或多个实施例中，本发明的抗原结合蛋白抑制NGF与TrkA受体的结合。在一个或多个实施例中，抗原结合蛋白在有或没有p75受体的情况下抑制和NGF与TrkA的结合相关的生物功能，其包含阻断和NGF与TrkA受体结合相关的信号转导和途径。
在一个或多个实施例中，本发明的抗原结合蛋白通过破坏和NGF与TrkA和p75受体结合相关的信号来减少或消除NGF相关的病症。在一个或多个实施例中，NGF相关的病症选自由以下组成的组：心血管疾病、动脉粥样硬化、肥胖症、2型糖尿病、代谢综合征、疼痛和炎症。在一个实施例中，NGF相关的病症是疼痛。在一个实施例中，所述NGF相关的病症是疼痛病症，并且选自由以下组成的组：骨关节炎疼痛、类风湿性关节炎疼痛、手术和术后疼痛、切口疼痛、全身炎性疼痛、癌症疼痛、由创伤引起的疼痛、神经病理性疼痛、神经痛、糖尿病性神经病疼痛、与风湿性疾病相关的疼痛、与肌肉骨骼疾病相关的疼痛、内脏疼痛和胃肠疼痛。在一个实施例中，NGF相关的病症包括骨关节炎疼痛。在一个实施例中，NGF相关的病症包括手术和术后疼痛。在一个实施例中，NGF相关的病症包括癌症疼痛。
在一个或多个方面中，本发明的抗原结合蛋白选自由以下组成的组：单克隆抗体；嵌合抗体、单链抗体、四聚体抗体、四价抗体、多特异性抗体、结构域特异性抗体、结构域缺失抗体、融合蛋白、ScFc融合蛋白、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、ScFv片段、Fd片段、单结构域抗体、dAb片段、小模块免疫药物(SMIP)、纳米体和IgNAR分子。在一个实施例中，抗原结合蛋白是单克隆抗体。在一个实施例中，抗原结合蛋白是嵌合抗体。
在一个实施例中，本发明的抗原结合蛋白选自犬或犬源化单克隆抗体、猫源化单克隆抗体、马源化单克隆抗体或人源化单克隆抗体。在一个实施例中，抗原结合蛋白是犬或犬源化抗体。在一个实施例中，本发明的抗原结合蛋白是猫源化抗体。在一个实施例中，本发明的抗原结合蛋白是马源化抗体。在一个实施例中，本发明的抗原结合蛋白是人源化抗体。
在一个或多个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包括治疗有效量的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。在一个实施例中，本发明提供了一种兽用组合物，其包括治疗有效量的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。在一个实施例中，本发明提供了一种药物组合物或兽用组合物，其包括治疗有效量的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。在一个实施例中，本发明的药物组合物用于治疗NGF相关的病症。在一个实施例中，NGF相关的病症选自由以下组成的组：心血管疾病、动脉粥样硬化、肥胖症、2型糖尿病、代谢综合征、疼痛和炎症。在一个实施例中，NGF相关的病症包括疼痛。在一个实施例中，药物组合物用于治疗疼痛。在一个实施例中，所述药物组合物用于治疗疼痛，并且疼痛的类型选自骨关节炎疼痛、类风湿性关节炎疼痛、手术和术后疼痛、切口疼痛、全身炎性疼痛、癌症疼痛、由创伤引起的疼痛、神经病理性疼痛、神经痛、糖尿病性神经病疼痛、与风湿性疾病相关的疼痛、与肌肉骨骼疾病相关的疼痛、内脏疼痛和胃肠疼痛。在一个实施例中，疼痛包括骨关节炎疼痛。在一个实施例中，疼痛包括手术和术后疼痛。在一个实施例中，疼痛包括癌症疼痛。在一个或多个实施例中，本发明的药物组合物用于犬。在一个或多个实施例中，本发明的药物组合物用于猫类。在一个或多个实施例中，本发明的药物组合物用于马。在一个或多个实施例中，本发明的药物组合物用于人类。
在一个或多个实施例中，本发明的药物组合物对犬的免疫系统没有显著的副作用。在一个实施例中，本发明的组合物对猫的免疫系统没有显著的副作用。在一个或多个实施例中，本发明的组合物对马的免疫系统没有显著的副作用。在一个实施例中，本发明的组合物对人的免疫系统没有显著的副作用。在一个实施例中，药物组合物是兽用组合物。
在一个或多个实施例中，本发明提供了一种产生任何一种或多种本发明的抗原结合蛋白的宿主细胞。
在一个或多个实施例中，本发明提供了一种包括本发明的任何一种或多种核酸的载体。
在一个或多个实施例中，本发明提供了一种包括本发明的任何一种或多种核酸的宿主细胞。
在一个或多个实施例中，本发明提供了一种包括载体的宿主细胞，所述载体包括本发明的任何一种或多种核酸。
在一个或多个实施例中，本发明提供了一种包括本发明的任何一种或多种核酸的宿主细胞。
在一个或多个方面中，本发明提供了一种通过以下来生产本发明的抗原结合蛋白的方法：在导致产生抗原结合蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，并且然后从宿主细胞或宿主细胞的培养基中分离抗原结合蛋白。
在一个或多个方面中，本发明提供了一种治疗受试者NGF相关的病症的方法，其包括给所述受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物或兽用组合物。在一个实施例中，本发明提供了NGF相关的病症选自由以下组成的组：心血管疾病、动脉粥样硬化、肥胖症、2型糖尿病、代谢综合征、疼痛和炎症。在一个实施例中，NGF相关的病症包括疼痛。在一个实施例中，NGF相关的病症是疼痛病症，并且选自由以下组成的组：骨关节炎疼痛、类风湿性关节炎疼痛、手术和术后疼痛、切口疼痛、全身炎性疼痛、癌症疼痛、由创伤引起的疼痛、神经病理性疼痛、神经痛、糖尿病性神经病疼痛、与风湿性疾病相关的疼痛、与肌肉骨骼疾病相关的疼痛、内脏疼痛和胃肠疼痛。在一个实施例中，NGF相关的病症包括骨关节炎疼痛。在一个实施例中，NGF相关的病症包括手术和术后疼痛。在一个实施例中，NGF病症是癌症疼痛。在一个实施例中，受试者选自由以下组成的组：犬类、猫类、人类和马类。在一个实施例中，受试者包括犬类。在一个实施例中，受试者包括猫类。在一个实施例中，受试者包括马类。在一个实施例中，受试者包括人类。
在一个或多个实施例中，本发明提供了一种检测或定量生物样品中NGF水平的方法，该方法包括：
(a)在本发明的任何一种抗原结合蛋白的存在下孵育含有NGF的临床或生物样品；和
(b)检测样品中与NGF结合的抗原结合蛋白。
在一些实施例中，本发明的抗原结合蛋白被可检测地标记。在一些实施例中，未标记的抗原结合蛋白与可检测地标记的第二抗原结合蛋白或片段结合使用。在一个实施例中，本发明包括一种包括本发明的抗原结合蛋白的试剂盒。
附图说明
图1是突出抗原结合位点的小鼠免疫球蛋白G(IgG)分子的一般结构的示意图。
图2是小鼠/犬嵌合IgG的一般结构的示意图。
图3是示出了小鼠IgG的物种形成或“犬源化”的示图，小鼠CDR被接枝到犬框架上。该图还代表了如本文定义的猫源化、马源化、人源化和其他物种形成。
图4是“异源嵌合体”单克隆抗体的示图，该抗体将嵌合体轻链与完全犬源化的重链配对。
图5是抗体可变链的示图，其示出了恒定区的引物和针对小鼠可变区的简并引物。
图6是抗NGF mAb ZTS-841和ZTS-842对caTrkA-CHO细胞中犬NGF诱导的pERK-1/2信号传导的作用的表示。
图7是对caTrkA-CHO细胞中犬NGF诱导的pERK-1/2信号传导的aD11 mAb、阴性对照和13L11 mAb的犬源化版本的表示。
图8是对ZTS-841和ZTS-842mAb的犬NGF诱导的TF-1细胞增殖的抗NGF mAb的表示。
图9是使用48L2嵌合体、fel48L2VH1.1和fel48L2VH1.2 mAb对犬NGF诱导的TF-1增殖的抗NGF mAb的表示。
图10是以2.0mg/kg的SC/SC/IV剂量给药的抗NGF mAb ZTS 841的药代动力学研究的表示。
图11是以2.0mg/kg的SC/SC/IV剂量给药的抗NGF mAb ZTS 842的药代动力学研究的表示。
图12是大鼠MIA测定的示意图。
图13是在大鼠MIA测定中剂量范围为0.1-2mg/kg的mAb 841的图形表示。
图14是在大鼠MIA测定中剂量范围为0.01-2.0mg/kg的mAb 841的图形表示。
图15是在大鼠MIA测定中剂量为0.5mg/kg和2mg/kg的mAb 842的图形表示。
图16是在LPS滑膜炎模型中诱导滑膜炎后三小时和五小时治疗组的mAb 841跛行VAS的图形表示。
序列的简要描述
具体实施方式
本文公开的发明提供了以高亲和力结合NGF的抗NGF抗原结合蛋白。本发明进一步提供了抗原结合蛋白和也结合至作为所述抗原结合蛋白变体的NGF的多肽，以及制备和使用这些抗原结合蛋白的方法。在一些实施例中，本发明还提供了编码所述抗原结合蛋白和/或多肽的多核苷酸。本文公开的发明还提供了通过施用治疗有效量的本发明的抗NGF抗原结合蛋白来预防和/或治疗疼痛的方法。
通用技术
应当理解，本发明不限于本文描述的特定的方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文中使用的术语仅仅是为了描述特定的实施例，而不是意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
除非另有定义，否则与本文所述的抗原结合蛋白结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包含复数，并且复数术语应包含单数。通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、和蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的术语和这些方面的技术是本领域公知和常用的那些，并且不限于单一描述。本领域公知的是，不同的技术可以代替所描述的技术。
为了描述和公开在例如可能与本发明结合使用的这样的出版物中描述的方法，所有被识别的专利和其他出版物通过引用明确地并入本文。提供这些出版物仅仅是为了在本申请的申请日之前将其公开。
标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转染(例如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术按照制造商的说明或如本领域中通常完成的或如本文所述的来进行。前述技术和程序通常根据本领域中公知的常规方法来执行，并且如所描述的，但不限于在整个本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献，参见例如Sambrook etal.MOLECULAR CLONING:LAB.MANUAL(3rd ed.,Cold Spring Harbor Lab.Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,2001)and Ausubel et al.Current Protocols in MolecularBiology(New York:Greene Publishing Association J Wiley Interscience),Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)AcademicPress；Animal Cell Culture(R.1.Freshney,ed.1987)；Introduction to Cell andTissue Culture(1.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)；Gene TransferVectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)；PCR:ThePolymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols inImmunology(E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRLPress,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd andC.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:a laboratorymanual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；TheAntibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)；andCancer:Principles and Practice of Oncology(Y.T.DeVita et al.,eds.,J.B.Lippincott Company,1993).
除了在操作示例中，或者在其中另外指出的情况下，本文使用的表示成分的量或反应条件的所有数字都应该被理解为在所有情况下用术语“约”修饰。
定义
在详细地描述本发明之前，将定义在本发明的上下文中使用的若干个术语。除了这些术语之外，其他术语在说明书中的其他位置根据需要进行定义。除非本文中另有明确定义，否则本说明书中使用的技术术语将具有其本领域公认的含义。
如在说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该”包含复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，提及“一种抗体”包含多种这样的抗体。
如本文中所使用的，术语“包括”旨在表示组合物和方法包含所述的要素，但不排除其他要素。
如本文中所使用的，术语“神经生长因子”和“NGF”是指神经生长因子及其保留NGF的至少部分生物活性的变体。
“NGF受体”是指被NGF结合或激活的多肽。NGF受体包含犬类的TrkA受体，并且在较小的程度上包含犬类的p75受体。
NGF的“生物活性”通常是指结合NGF受体和/或激活NGF受体信号传导途径的能力。生物活性包含但不限于以下中的任何一种或多种：结合NGF受体(例如TrkA和/或p75)的能力；促进TrkA受体二聚化和/或自身磷酸化的能力；激活NGF受体信号传导途径的能力；促进细胞分化、增殖、存活、生长和其他细胞生理变化的能力，包含(在神经元(包含外周和中枢神经元)的情况下)神经元形态的变化、突触发生、突触功能、神经递质和/或神经肽释放和损伤后再生；促进小鼠E13.5三叉神经元的存活的能力；和调节疼痛(包含术后疼痛)的能力。
如本文中所使用的，“抗NGF抗原结合蛋白”(可互换地称为“抗NGF抗体”和“抗NGF拮抗剂抗体”、“抗原结合片段”、“抗原结合部分”等)是指能够结合至NGF并抑制NGF生物活性和/或由NGF信号传导介导的下游途径的抗原结合蛋白。抗NGF抗原结合蛋白包含这样的结合蛋白和抗体，它们阻断、拮抗、抑制或降低(包含显著降低)NGF生物活性，包含由NGF信号传导介导的下游途径和/或抑制NGF与其受体trkA结合，例如受体结合和/或引发对NGF的细胞反应。为了本发明的目的，将明确地理解，术语“抗NGF抗原结合蛋白”或“抗NGF拮抗剂抗体”包含所有先前识别的术语、名称以及功能状态和特征，其中NGF本身、NGF生物活性(包含但不限于其介导骨关节炎疼痛、炎性疼痛、术后疼痛、癌症疼痛等的任何方面的能力)或生物活性的后果在任何有意义的程度上被基本上抵消、降低或中和。在一些实施例中，抗NGF拮抗剂抗体结合NGF并防止NGF二聚化和/或与NGF受体(例如TrkA和/或p75)的结合。在其他实施例中，抗NGF抗原结合蛋白与NGF结合，并且防止TrkA受体二聚化和/或TrkA自身磷酸化。本文提供了抗NGF拮抗剂抗体的示例。
如本文中所使用的，术语“抗原结合蛋白”、“抗体”、“抗原结合蛋白”等可以互换使用，是指包括抗原结合位点的多肽或其片段。在本发明的一个实施例中，本发明的抗原结合蛋白进一步提供了能够通过位于免疫球蛋白分子的一个或多个可变区中的至少一个抗原识别位点特异性地结合至靶标的免疫球蛋白，例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。在一些实施例中，抗体具有两条轻链和两条重链。因此，分离的完整抗体可以是从多克隆抗体、单克隆抗体、合成抗体、重组抗体、嵌合抗体、异源嵌合抗体或被认为是特殊的抗体的池中分离的，如本文所定义的。在一些实施例中，术语“抗原结合蛋白”、“抗体”、“拮抗剂抗体”等优选地是指单克隆抗体及其片段，以及可以结合至NGF蛋白及其片段的免疫结合等同物。如本文中所使用的，该术语不仅包含全长(根据标准定义是指两条重链和两条轻链)多克隆抗体或单克隆抗体，而且还包含其片段。为了本发明的目的，“抗体”和“抗原结合蛋白”也包含抗体片段，除非另有说明。示例性的抗体片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、双抗体、它们的抗原识别片段、小模块免疫药物(SMIP)、纳米体、IgNAR分子和本领域技术人员认为是抗原结合蛋白或抗体片段的等同物，以及任何上述的片段和它们的化学或遗传操纵的对应物，以及它们的其它抗体片段和突变体、包括抗体部分的融合蛋白和包括抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型。抗体和抗原结合蛋白可以通过例如传统的杂交瘤技术(Kohler et al.,Nature 256:495-499(1975))、重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)或使用抗体库的噬菌体展示技术(Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991))来制备。关于各种其他抗体生产技术，参见Antibodies:A Laboratory Manual,eds.Harlow et al.,Cold Spring HarborLaboratory,1988，以及本领域技术人员熟知的其他技术。
如本文定义的“单克隆抗体”是由单个细胞克隆(具体地说，单个杂交瘤细胞克隆)产生的抗体，并且因此是单个纯的同源型抗体。从同一克隆产生的所有单克隆抗体都是相同的，并且具有相同的抗原特异性。单克隆抗体是同源抗体群，其中单克隆抗体由参与抗原的选择性结合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)组成。单克隆抗体的群体是高度特异性的，针对单一抗原位点。术语“单克隆抗体”不仅包含完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且还包含其片段(Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、双抗体、它们的抗原识别片段、小模块免疫药物(SMIP)、纳米体、IgNAR分子等)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白，以及免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型，其包括所需特异性的抗原识别位点和结合至抗原的能力。它并不旨在限于抗体的来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)。
本文中的单克隆抗体具体地包含“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来自另一物种的抗体中的相应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性。典型地，嵌合抗体是这样的抗体，其轻链和重链基因通常已经通过基因工程从属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因被构建。例如，来自小鼠单克隆抗体的可变基因片段可以连接到犬恒定片段。图2是小鼠：犬IgG的一个实施例的一般结构的示意图。在该实施例中，抗原结合位点来自小鼠，而Fc部分是犬。
如本文定义的术语“异源嵌合体”是指一种抗体，其中抗体链之一(重链或轻链)被犬源化，而另一条是嵌合的。图4描绘了异源嵌合分子的一个实施例。在该实施例中，犬源化的可变重链(其中所有的CDR是小鼠，并且所有的FR是犬)与嵌合可变轻链(其中所有的CDR是小鼠，并且所有的FR是小鼠)配对。在该实施例中，可变重链和可变轻链都融合至犬恒定区。
为了简单起见，以下描述了“犬源化的”抗体，然而同样可以应用于猫源化的、马源化的、人源化的或任何其它“特化的”抗原结合蛋白。作为示例，“犬源化”被定义为一种用于将非犬抗原结合信息从供体抗体转移到较低的免疫原性的犬抗体受体的方法，以产生对犬的治疗有用的治疗。犬源化的抗体是犬抗体序列(其中受体的高变区残基被来自非犬物种(供体抗体)的高变区残基取代，所述非犬物种例如诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、山羊、鸡、牛、马、骆马、骆驼、单峰骆驼、鲨鱼、非人灵长类动物、人)、人源化、重组序列或具有所需性质、特异性、亲和力和能力的工程化序列。此外，犬源化的抗体可能包含在受体抗体中或在供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步提高抗体的性能。如本文所描述的，对高变区和/或框架区的修饰是基于本领域技术人员已知的但在实验之前无法预测的所述实验，针对每个单独工程化的特化的(犬源化的)抗体来确定的。犬源化的抗体任选地可以包括免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是犬免疫球蛋白恒定区)的完整部分或至少一部分。图3是示出了小鼠IgG的物种形成或犬源化的一个实施例的示图。抗原结合蛋白的犬源化和犬源化的抗原结合蛋白的所有描述在概念上都可适用于任何特化的抗体，无论其是犬源化、猫源化、马源化、人源化等。
短语“重组犬抗体”、“重组猫抗体”、“重组马抗体”、“重组人抗体”等都包含通过重组手段制备、表达、产生或分离的特异性抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组、组合犬(或猫、人等)抗体库分离的抗体、从针对犬免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.et al.(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287-6295)或通过涉及将犬(或猫、人等)免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。
如本文所使用的术语“犬抗体”、“猫抗体”、“马抗体”、“人抗体”等是指针对靶标产生的抗体(抗原结合蛋白)和从来自靶物种内的淋巴细胞分离的抗体。如本文所述，这些抗体已经在体外被重组修饰，以包含靶物种的特定恒定区。此外，如本文所述的抗体被识别、分离、修饰以改变抗体恒定区，随后从本领域技术人员已知并常规使用的体外细胞培养系统中表达和分离。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻链(l)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每个重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每个重链在一端具有可变结构域(VH)，后面是许多恒定结构域。每个轻链在一端具有可变结构域(VL)，并且在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。图1是突出抗原结合位点的天然小鼠免疫球蛋白G(IgG)的一般结构的示例。
本文中的“亲本”抗体是由用于制备变体的氨基酸序列编码的抗体。优选地，亲本抗体具有犬框架区，并且如果存在的话，具有犬抗体恒定区。例如，亲本抗体可以是犬源化抗体或犬抗体。
根据抗体的重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分为不同的类别。目前主要有五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中几类可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2(如由小鼠和人类名称所定义的)。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型在多种物种中是公知的。与这些恒定结构域相关的个体同种型和功能活性的流行是物种特异性的，并且必须通过实验来定义。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以根据其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型之一，被称为κ(K)和λ(Λ)。
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独的或组合的。重链和轻链的可变区各自由四个框架区(FR)组成，这四个框架区由也被称为高变区的三个互补决定区(CDR)连接。每条链上的CDR通过FR紧密结合在一起，并与来自另一条链的CDR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列可变性的方法(即Kabat et al.Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,(5th ed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.))；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Chothia et al.(1989)Nature 342:877；Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Bioi.273:927-948)。如本文中所使用的，CDR可以指由任一方法或由两种方法的组合定义的CDR。
当在本文中使用时术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(上文Kabat,et al.(1991))和/或来自“高变环”的氨基酸残基(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“框架”或“FR”残基是除本文中所定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
如本文中所使用的，术语“抗原结合区”是指抗体分子的含有与抗原相互作用并赋予抗体对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的部分。抗体结合区包含维持抗原结合残基的正确构象所必需的“框架”氨基酸残基。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的至少一种效应子功能。示例性的“效应子功能”包含C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；新生儿受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。这样的效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合，并且可以使用本领域已知的用于评估这样的抗体效应子功能的各种测定来评估。
“天然序列Fc区”包括与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”或“突变的”或“突变”Fc区包括由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列，并且可以保留或可以不保留天然序列Fc区的至少一个效应子功能。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约一个至约十个氨基酸取代，优选地约一个至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的序列同一性，并且最优选地与其具有至少约90％的序列同一性，更优选地与其具有至少约95％的序列同一性。变体或突变的Fc区也可能基本上消除抗体的Fc区的功能。例如，Fc区突变可能消除抗体的效应子功能。在本发明的一个实施例中，本发明的抗体包括突变的Fc区。
如本文中所使用的，“Fc受体”和“FcR”描述了结合至抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列FcR。此外，优选的FcR是一种结合IgG抗体(γ受体)的FcR并且包含FcyRI、FcyRII和FcyRIII亚类的受体，包含这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcyRII受体包含FcyRIIA(一种“激活受体”)和FcyRIIB(一种“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，但主要在其胞质结构域上不同。在Ravetch and Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92；Capel et al.,1994,Immunomethods,4:25-34；and de Haas et al.,1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41中回顾了FcR。“FcR”还包含新生儿受体FcRn，其负责将亲本IgG转移至胎儿(Guyer et al.,1976,J.Immunol.,117:587；and Kim et al.,1994,J.Immunol.,24:249)。
如本文中所使用的，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，并且随后导致靶细胞的裂解。相关分子的ADCC活性可以使用体外ADCC测定来评估，例如在美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中描述的。用于这样的测定的有用的效应细胞包含外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。可替代地或另外地，相关分子的ADCC活性可以在体内进行评估，例如，在动物模型中，例如在Clynes etal.,1998,PNAS(USA),95:652-656中公开的动物模型中。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指在补体存在的情况下靶标的裂解。补体激活途径是通过补体系统(C1q)的第一组分与和同源抗原复合的分子(例如抗体)的结合来启动的。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如如在Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods,202:163(1996)中所描述的。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，被称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点；和残留的“Fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离的硫醇基团。F(ab')2抗体片段最初是以成对Fab'片段(在它们之间具有铰链半胱氨酸)的形式产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体以紧密的非共价结合组成。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用，以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。这六个高变区共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包括三个对抗原特异性的高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
如本文所使用的“抗原”是指由如本文所述的抗原结合蛋白或抗体的CDR识别的抗原决定簇。换句话说，表位是指能够被抗体识别和被抗体结合的任何分子的部分。除非另有说明，否则如本文所使用的术语“表位”是指抗NGF抗原结合蛋白/抗体/药剂结合的NGF的区域。
术语“抗原结合结构域”、“抗体的活性片段”等是指抗体或抗原结合蛋白的一部分，其包括与抗原的一部分或全部特异性结合或互补的区域。在抗原很大的情况下，抗体可能仅结合至抗原的特定部分。“表位”、“表位的活性片段”或“抗原决定簇”等是负责与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的抗原分子的一部分。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域(例如由VH结构域组成的所谓的Fd抗体片段)提供。抗原结合结构域可以包括抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)(美国专利第5,565,332号)。
抗体(或“抗体部分”)或抗原结合多肽等的术语“结合部分”包含一个或多个完整结构域，例如一对完整结构域，以及保留特异性地结合至抗原(例如NGF)的能力的抗体的片段。已经表明，抗体的结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。结合片段通过重组DNA技术产生，或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解产生。结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、F(abc)、Fd、dAb、Fv、单链、单链抗体(例如scFv)和单结构域抗体(Muyldermans etal.,2001,26:230-5)，以及分离的互补决定区(CDR)。Fab片段是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段。F(ab')2片段是二价片段，其包括两个通过铰链区的二硫键连接的Fab片段。Fd片段由VH和CH1结构域组成，并且Fv片段由单个抗体臂的VL和VH结构域组成。dAb片段由VH结构域组成(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546)。虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因编码的，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使它们能够形成为单个蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)(Bird et al.,1988,Science 242:423-426)。这样的单链抗体也旨在包含在抗体的术语“结合部分”中。也包含其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但是使用的接头太短以致于不能允许在同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。抗体或其结合部分也可以是通过抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白质或肽共价或非共价结合形成的较大免疫粘附分子的一部分。这样的免疫粘附分子的示例包含使用链霉亲和素核心区来制造四聚体scFv分子(Kipriyanov,S.M.,et al.,(1995)HumanAntibodies and Hybridomas 6:93-101)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C-末端多组氨酸标签来制造二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.et al.(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。结合片段(例如Fab和F(ab')2片段)可以使用常规技术(例如分别对整个抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化)从整个抗体制备。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得，如本文所述和本领域已知的。除了“双特异性”或“双功能”抗体，抗体被理解为具有相同的每个结合位点。“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体还可以包含两个带有中间恒定区的抗原结合区。双特异性抗体可以通过多种方法(包含杂交瘤的融合或Fab'片段的连接)产生。参见例如Songsivilai et al.,Clin.Exp.Immunol.79:315-321,1990.；Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148,1547-1553。
术语“反向突变”是指一种其中用来自同源种系抗体序列的相应种系残基替换犬抗体的部分或全部体细胞突变的氨基酸的过程。本发明的犬抗体的重链和轻链序列分别与种系序列比对，以识别具有最高同源性的序列。本发明的犬抗体的差异通过突变编码这样的不同氨基酸的限定的核苷酸位置而返回到种系序列。应当研究由此被识别为反向突变的候选物的每种氨基酸的作用，以了解在抗原结合中的直接或间接作用，并且在突变后发现的影响犬抗体的任何所需特性的任何氨基酸不应被包含在最终的犬抗体中；作为示例，通过选择性诱变方法识别的活性增强氨基酸将不经历反向突变。为了使经历反向突变的氨基酸的数量最小化，那些被发现不同于最近种系序列但与第二种系序列中相应氨基酸相同的氨基酸位置可以保留，只要第二种系序列与本发明的犬抗体的序列相同且共线性。可能需要将选定的靶框架残基反向突变为相应的供体残基，以恢复和/或提高亲和力。
如本文中所使用的，抗体的“免疫特异性”结合是指在抗体的抗原结合位点与由该抗体识别的特异性抗原之间发生的抗原特异性结合相互作用(即，抗体在ELISA或其它免疫测定中与蛋白质反应，而不与不相关的蛋白质可检测地反应)。与抗体或多肽“特异性结合”或“优先结合”(在本文中可互换使用)的表位是本领域中公知的术语，并且确定这样的特异性或优先结合的方法也是本领域公知的。如果分子以与替代的细胞或物质相比更频繁、更迅速、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力与特定的细胞或物质反应或结合，则该分子被称为表现出“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体以比其与其他物质结合更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间与目标结合，则该抗体“特异性结合”或“优先结合”至靶标。例如，特异性地或优先地结合至NGF表位的抗体是以比其结合至其它NGF表位或非NGF表位更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合该表位的抗体。通过阅读该定义还可以理解，例如，特异性地或优先地结合至第一靶标的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性地或优先地结合至第二靶标。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包含)排他性结合。一般而言，但不是必须的，提及结合意味着优先结合。
在抗体结合的上下文中，术语“特异性”是指抗体与特定抗原(即多肽或表位)的高亲合力和/或高亲和力结合。特异性地结合抗原的抗体比同一抗体与其他抗原的结合更强。特异性地结合至多肽的抗体可能能够以弱的但可检测的水平(例如，被显示为与相关多肽的10％或更少的结合)结合其他多肽。这样的弱结合或背景结合很容易从与受试者多肽结合的特异性抗体中辨别出来，例如通过使用适当的对照。通常，特异性抗体以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小或10-13M或更小等的Kd的结合亲和力结合至抗原。
如本文中所使用的，术语“亲和力”是指单个抗原结合位点与抗原决定簇结合的强度。亲合力取决于抗体或抗原结合蛋白结合位点与抗原决定簇之间立体化学匹配的紧密程度、它们之间接触面积的大小、带电的和疏水性基团的分布等。抗体亲和力可以通过平衡分析或通过表面等离子体共振“SPR”方法(例如BIACORETM)来测量。SPR方法依赖于表面等离子体共振(SPR)的现象，这种现象发生在表面等离子体波在金属/液体界面被激发时。光被引导到不与样品接触的表面的一侧并从该侧反射，并且在特定的角度和波长的组合下，SPR导致反射光的强度降低。双分子结合事件引起表面层处折射率的变化，这种变化被检测为SPR信号的变化。
如本文中使用的术语“KD”旨在是指抗体-抗原相互作用的解离常数。解离常数KD和缔合常数Ka是亲和力的定量度量。在平衡时，游离抗原(Ag)和游离抗体(Ab)与抗原-抗体复合物(Ag-Ab)处于平衡，并且速率常数ka和kd定量各个反应的速率。在平衡时，ka[Ab][Ag]＝kd[Ag-Ab]。解离常数Kd由以下给出：Kd＝kd/ka＝[Ag][Ab]/[Ag-Ab]。KD具有浓度的单位，最典型的是M、mM、μM、nM、pM等。当比较以KD表示的抗体亲和力时，对NGF具有较大的亲和力由较低的值表示。缔合常数Ka由以下给出：Ka＝ka/kd＝[Ag-Ab]/[Ag][Ab]。Ka具有逆浓度的单位，最典型的是M-1、mM-1、μ.M-1、nM-1、pM-1等。如本文中所使用的，术语“亲合力”是指在形成可逆复合物后抗原-抗体键的强度。抗NGF抗体可以根据它们与NGF蛋白结合的KD来表征，其以“在约(下KD值)至约(上KD值)范围内的解离常数(KD)”结合。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链的或支链的，它可以包括修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语还包含已经被天然或通过干预(例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分的结合)修饰的氨基酸聚合物。此外，在定义中包含例如含有氨基酸(包含例如非天然氨基酸等)的一种或多种类似物以及本领域中已知的其它修饰的多肽。应当理解，因为本发明的多肽基于抗体，所以多肽可以以单链或相关链的形式存在。
术语“保守氨基酸取代”表示对于给定的氨基酸残基的任何氨基酸取代，其中取代残基在化学上与给定的残基如此相似，以致于不会导致多肽功能(例如，酶活性)的显著降低。保守氨基酸取代在本领域中是公知的，并且其示例描述在例如美国专利第6,790,639号、第6,774,107号、第6,194,167号或第5,350,576号中。在优选的实施例中，保守氨基酸取代将是发生在以下六个组之一中的任何一个：
·小的脂肪族的基本上非极性的残基：Ala、Gly、Pro、Ser和Thr；
·大的脂肪族的非极性残基：Iie、Leu和Val；Met；
·极性的带负电荷的残基及其酰胺：Asp和Glu；
·极性的带负电荷的残基的酰胺：Asn和Gin；His；
·极性的带正电荷的残基：Arg和Lys；His；和
·大的芳香残基：Trp和Tyr；Phe。
在一个优选的实施例中，保守氨基酸取代将是下列中的任一种，其作为天然残基(保守取代)对列出：Ala(Ser)；Arg(Lys)；Asn(Gin；His)；Asp(Glu)；Gin(Asn)；Glu(Asp)；Gly(Pro)；His(Asn；Gln)；Ile(Leu；Val)；Leu(Ile；Val)；Lys(Arg；Gin；Glu)；Met(Leu；Ile)；Phe(Met；Leu；Tyr)；Ser(Thr)；Thr(Ser)；Trp(Tyr)；Tyr(Trp；Phe)；和Val(Ile；Leu)。
术语“核酸”、“多核苷酸”、“核酸分子”等在本文中可以互换使用，并且指的是DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也被称为“核苷酸”)。核酸可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。术语“核酸”包含例如单链和双链分子。核酸可以是，例如，基因或基因片段、外显子、内含子、DNA分子(例如cDNA)、RNA分子(例如mRNA)、重组核酸、质粒和其他载体、引物和探针。包含5'至3'(有义)和3'至5'(反义)多核苷酸。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶掺入到聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在聚合物的组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可能被非核苷酸组分中断。在聚合后，可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分结合。其他类型的修饰包含，例如，“帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(诸如例如带有不带电荷的连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺酯、氨基甲酸酯等)和带电的连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有侧链部分的那些(诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚左旋赖氨酸等))、具有嵌入剂的那些(例如吖啶、补骨脂素等)、含有螯合剂的那些(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)、含有烷化剂的那些、具有修饰的连接的那些(例如α异头核酸等))，以及多核苷酸的未修饰形式。此外，通常存在于糖中的任何羟基基团可以被取代，例如被膦酸酯基团、磷酸酯基团取代，被标准保护基团保护，或者被激活以制备与额外核苷酸的额外连接，或者可以与固体支持物缀合。5'和3'端OH可以被1至20个碳原子的胺或有机封端基团部分磷酸化或取代。其他羟基也可以被衍生成标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域公知的类似形式的核糖或脱氧核糖糖，包含，例如，2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-核糖或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、异头糖、差向异构糖(诸如***糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、无环类似物和脱碱基核苷类似物(诸如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键可以被替代的连接基团取代。这些替代的连接基团包含但不限于这样的实施例，其中磷酸酯被P(O)S(“硫代化物”)、P(S)S(“二硫代化物”)、“(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)取代，其中每个R或R'独立地为H或取代的或未取代的烷基(1-2C)，任选地包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有连接都需要相同。前面的描述适用于本文提到的所有多核苷酸，包含RNA和DNA。
如本文中所使用的，“载体”是指能够在宿主细胞中递送并优选地表达一个或多个相关基因或序列的构建体。载体的示例包含但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。如本文所述，载体具有表达控制序列，这意味着指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子(例如组成型或诱导型启动子)，或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列‘可操作地连接’。当核酸与另一个核酸序列处于功能关系时，该核酸是“可操作连接的”。例如，如果其被表达为参与多肽的分泌的前蛋白，则前序列或分泌前导的DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便促进翻译，则核糖体结合位点可操作地连接到编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导的情况下，是连续的并且处于阅读阶段。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在方便的限制性位点连接来完成的。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头。
正如多肽可以含有保守氨基酸取代，其多核苷酸可以含有保守密码子取代。如上所述，如果密码子取代在表达时产生保守的氨基酸取代，则该密码子取代被认为是保守的。简并密码子取代(其不会导致氨基酸取代)也可用于根据本发明的多核苷酸。因此，例如，编码在本发明的实施例中有用的所选多肽的多核苷酸可以通过简并密码子取代进行突变，以便接近待由其转化的表达宿主细胞所表现出的密码子使用频率，或者以其他方式提高其表达。
“变体”抗NGF抗原结合蛋白在本文中是指这样的分子，所述分子由于亲本抗体序列中一个或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或取代而在氨基酸序列上不同于“亲本”抗NGF抗体氨基酸序列，并保留亲本抗NGF抗体的至少一种所需活性。如本文所描述的，变体抗NGF可以在抗体的高变区包括保守氨基酸取代。期望的活性可以包含特异性结合抗原的能力，降低、抑制或中和动物体内NGF活性的能力。在一个实施例中，变体在亲本抗体的一个或多个高变区和/或框架区中包括一个或多个氨基酸取代。例如，变体可以在亲本抗体的一个或多个高变区和/或框架区中包括至少一个取代，例如约一个至约十个，并且优选地约两个至约五个取代。通常，变体将具有与亲本抗体重链或轻链可变结构域序列具有至少50％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，更优选地至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列同一性。关于该序列的同一性或同源性在本文中被定义为在比对序列并引入缺口(如果需要)以获得最大百分比的序列同一性之后，在候选序列中的与亲本抗体残基相同的氨基酸残基的百分比。抗体序列中的N-末端、C-末端或内部延伸、缺失或***都不应被解释为影响序列同一性或同源性。该变体保留了结合NGF的能力，并且优选地具有与亲本抗体相同或优于亲本抗体的所需活性。例如，该变体可以具有更强的结合亲和力、增强的降低、抑制或中和动物体内NGF活性的能力和/或增强的抑制NGF与TrkA和p75结合的能力。
TrkA(其被认为是高亲和力的NGF受体)是神经营养酪氨酸激酶受体(NTKR)家族的成员。这种激酶是一种膜结合受体，其在神经营养蛋白结合时，自身磷酸化(自身磷酸化)并将MAPK途径的成员磷酸化。这种激酶的存在导致细胞分化，并且可能在确定感觉神经元亚型中发挥作用。p75受体被认为是低亲和力NGF受体。
“变体”核酸在本文中是指序列不同于“亲本”核酸的分子。多核苷酸序列差异可能是由突变的变化引起的，例如一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加。这些变化中的每一个都可以以给定的顺序单独或组合地出现一次或多次。
术语“分离的”是指从其自然环境的组分中分离和/或回收材料(例如，如本文所述的抗原结合蛋白或核酸)。其自然环境的污染物组分是会干扰材料的诊断或治疗用途的材料，并且可能包含酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。就核酸而言，分离的核酸可以包含从5'至3'序列中分离的核酸，该核酸在染色体中通常与其相关联。在优选的实施例中，材料将被纯化至大于材料的按重量计95％，并且最优选地大于按重量计99％。分离的材料包含重组细胞中的原位材料，因为材料的自然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常，分离的材料将通过至少一个纯化步骤来制备。
如本文中所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。这些术语还包含它们的后代，它们都是下一代。应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代可能并不相同。在表达异源核酸序列的上下文中，“宿主细胞”是指无论位于体外还是体内的原核或真核细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞)。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。宿主细胞可以被用作载体的受体，并且可以包含能够复制载体和/或表达由载体编码的异源核酸的任何可转化生物。
词语“标记”当在本文中使用时是指直接或间接地与抗体或核酸缀合的可检测化合物或组合物。标记本身可以是本身可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。
“受试者”或“患者”是指需要治疗的动物，其可能受到本发明的分子的影响。根据本发明可以治疗的动物包含脊椎动物，其中哺乳动物如犬是特别优选的示例。
“组合物”意图是指活性剂的组合，无论是化学组合物、生物组合物还是生物治疗剂(特别是如本文所述的抗原结合蛋白)，以及可以是惰性的(例如标记)或活性的另一种化合物或组合物，例如佐剂。
如本文所定义的，适合用于本发明的“药学上可接受的载体”为本领域技术人员所熟知。这样的载体包含但不限于水、盐水、缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、醇/水溶液、乳液或悬浮液。根据常规技术，可以加入其它常规使用的稀释剂、佐剂和赋形剂。这样的载体可以包含乙醇、多元醇及其合适的混合物、植物油和可注射的有机酯。也可以使用缓冲液和pH调节剂。缓冲液包含但不限于由有机酸或碱制备的盐。代表性的缓冲液包含但不限于有机酸盐，例如柠檬酸的盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸-Hel盐、碳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐或邻苯二甲酸盐、Tris盐、盐酸三甲胺盐或磷酸盐缓冲液。肠胃外载体可以包含氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖、海藻糖、蔗糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内载体可以包含液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如那些基于林格氏葡萄糖的补充剂等。防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂(例如EDTA)、惰性气体等也可以提供在药物载体中。本发明不受载体的选择的限制。由上述组分制备这些药学上可接受的组合物在本领域技术范围内，所述组合物具有合适的pH等渗性、稳定性和其它常规特征。参见例如文章诸如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th ed,Lippincott Williams&Wilkins,publ.,2000；and The Handbook of PharmaceuticalExcipients,4.sup.th edit.,eds.R.C.Rowe et al,APhA Publications,2003。
“治疗有效量”(或“有效量”)是指当施用于受试者或患者时，足以产生有益或期望结果的活性成分(例如根据本发明的药剂)的量。有效量可以以一次或多次给药、应用或剂量给药。根据本发明的组合物的治疗有效量可由本领域普通技术人员容易地确定。在本发明的上下文中，“治疗有效量”是指在与NGF相关的病症相关的一种或多种参数上产生客观测量的变化的量，该量足以产生有益或期望的结果，包含临床结果，例如疼痛感的减轻或降低。有效量可以以一次或多次给药施用。为了本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是足以治疗、改善、降低疼痛的强度和/或预防疼痛的量，所述疼痛包含术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛和/或骨关节炎疼痛。在一些实施例中，“有效量”可以减轻静止时的疼痛(静息痛)或机械诱发的疼痛(包含运动后的疼痛)，或两者，并且其可以在疼痛刺激之前、期间或之后施用。正如在临床环境中所理解的，有效量的药物、化合物或药物组合物可以与或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物联合实现。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他药剂联合，可以获得或获得期望的结果，则可以考虑以有效量施用单一药剂。当然，治疗有效量将根据特定受试者和所治疗的病症、受试者的体重和年龄、病症的严重程度、选择的特定化合物、要遵循的给药方案、给药时间、给药方式等而变化，所有这些都可以由本领域普通技术人员容易地确定。
如本文中所使用的，术语“治疗性”包含对疾病、病症或病症的全部范围的治疗。本发明的“治疗”剂可以以预防性或防止性的方式起作用，包含结合了针对可以被识别为处于危险中的靶动物的程序(药物遗传学)的那些；或者以本质上改善或治愈的方式起作用；或者可以用来减缓正在治疗的疾病或病症的至少一种症状的进展的速度或程度。
在进一步的方面中，本发明的特征在于兽用组合物，其中提供了本发明的抗体用于治疗性或预防性用途。本发明的特征在于一种用于治疗具有特定抗原(例如，与疾病或病症相关的抗原)的狗受试者的方法。该方法包含与本文所述的重组抗体一起施用治疗有效量的对特定抗原特异性的重组抗体。
可用于产生治疗效果的抗体的量可以通过本领域普通技术人员熟知的标准技术来确定。抗体通常将通过标准技术在药学上可接受的缓冲液中提供，并且可以通过任何期望的途径施用。本发明的抗体或抗原结合部分的给药途径可以是口服的、肠胃外的、通过吸入或局部的。在优选的实施例中，给药途径是肠胃外的。如本文所使用的术语胃肠外包含静脉内、肌肉内、皮下、直肠、***或腹膜内给药。
如本文所使用的“疼痛”是指任何病因的疼痛，包含急性和慢性疼痛，以及任何具有炎性组分的疼痛。疼痛的示例包含炎性疼痛、术后切口疼痛、神经病理性疼痛、骨折疼痛、骨质疏松性骨折疼痛、疱疹后神经痛、癌症疼痛、由烧伤引起的疼痛、与烧伤或伤口相关的疼痛、与创伤相关的疼痛(包含创伤性头部损伤)、神经病理性疼痛、与肌肉骨骼病症相关的疼痛(例如类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、血清阴性(非类风湿性)关节病、非关节风湿病和关节周围病症)以及与癌症相关的疼痛(包含“突破性疼痛”和与晚期癌症相关的疼痛)、周围神经病和疱疹后神经痛。
如本文中所使用的，“治疗”是一种用于获得有益的或期望的临床结果的方法。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包含但不限于以下中的一种或多种：疼痛的任何方面的改善或减轻，所述疼痛包含急性疼痛、慢性疼痛、炎性疼痛、神经病理性疼痛、术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包含但不限于以下中的一个或多个：包含减轻严重性、减轻与疼痛相关的一个或多个症状，包含疼痛的任何方面(例如缩短疼痛的持续时间、降低疼痛敏感性或感觉)。
如本文所描述的，NGF相关的病症是指包含心血管疾病、动脉粥样硬化、肥胖症、2型糖尿病、代谢综合征、疼痛和炎症的病症。在本发明的一些实施例中，NGF相关的病症是指疼痛，特别是慢性疼痛、炎性疼痛、术后切口疼痛、神经病理性疼痛、骨折疼痛、骨质疏松性骨折疼痛、疱疹后神经痛、癌症疼痛、由烧伤引起的疼痛、与烧伤或伤口相关的疼痛、与创伤相关的疼痛(包含创伤性头部损伤)、神经病理性疼痛、与肌肉骨骼病症相关的疼痛(例如类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、血清阴性(非类风湿性)关节病、非关节风湿病和关节周围病症)以及与癌症相关的疼痛(包含“突破性疼痛”和与晚期癌症相关的疼痛)、周围神经病和疱疹后神经痛。
“降低疼痛的发生率”是指降低严重程度(其可以包含降低对通常用于该病症的其他药物和/或疗法的需要和/或量(例如：对其他药物和/或疗法的暴露)，包含例如***剂)、持续时间和/或频率(包含，例如，延迟或增加个体术后疼痛的时间)中的任一种。如本领域技术人员所理解的，个体可以根据其对治疗的反应而变化，并且因此，例如，“减少个体中类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛的发生率的方法”反映了基于合理的预期施用抗-NGF拮抗剂抗体，即这样的施用可能导致在该特定个体中发生率的这样的降低。
“改善”疼痛或疼痛的一种或多种症状(例如类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛)意味着与不施用抗NGF拮抗剂抗体相比，疼痛的一种或多种症状的减轻或改善。“改善”还包含缩短或减少症状的持续时间。
“减轻”疼痛或疼痛的一种或多种症状(例如类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛)意味着减轻用根据本发明的抗NGF拮抗剂抗体治疗的个体或个体群体中的术后疼痛的一种或多种不期望的临床表现的程度。
如本文中所使用的，“延迟”疼痛的发展意味着延迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疼痛(例如术后疼痛、类风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛)的进展。这种延迟可以是不同的时间长度，取决于疾病的历史和/或接受治疗的个体。如对于本领域技术人员来说显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以包含预防，因为个体不会发展疼痛。“延迟”症状的发展的方法是一种当与不使用该方法相比时，在给定的时间范围内降低发展症状的概率和/或在给定的时间范围内降低症状的程度的方法。这样的比较通常基于临床研究，使用统计上显著数量的受试者。
“术后疼痛”(可互换地被称为“切口后疼痛”或“创伤后疼痛”)是指由外部创伤引起或导致的疼痛，例如个体组织中的割伤、穿刺、切口、撕裂或伤口(包含由所有外科手术引起的创伤，无论是侵入性的还是非侵入性的)。如本文中所使用的，术后疼痛不包含在没有外部身体创伤的情况下发生(产生或起源)的疼痛。在一些实施例中，术后疼痛是内部或外部(包含外周)疼痛，并且伤口、割伤、创伤、撕裂或切口可能意外地发生(如创伤性伤口)或有意地发生(如手术切口)。如本文中所使用的，“疼痛”包含伤害感受和疼痛感觉，并且可以使用疼痛评分和本领域公知的其他方法客观地和主观地评估疼痛。如本文所采用的术后疼痛包含异常性疼痛(即，对通常无害的刺激的增加的反应)和痛觉过敏(即，对通常有害的或不愉快的刺激的增加的反应)，其本质上进而可以是热的或机械的(触觉的)。在一些实施例中，疼痛的特征在于热敏感性、机械敏感性和/或静息痛。在一些实施例中，术后疼痛包括机械诱发的疼痛或静息痛。在其他实施例中，术后疼痛包括静息痛。如本领域公知的，疼痛可以是原发性或继发性疼痛。
在描述本发明的方法之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这样的方法和条件可以变化。还应当理解，本文中使用的术语仅仅是为了描述特定的实施例的目的，而不是旨在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求来限定。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文描述的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用以其整体并入本文。
本文公开的发明涉及抗原结合蛋白(如本文所描述的，可与术语“抗体”、“拮抗剂抗体”、“抗体片段”等互换使用)，其特异性地结合至神经生长因子(NGF)，并且特别是抗体(无论其是犬、猫、马、鼠、牛、人或任何其它物种)，犬源化的、猫源化的、牛源化的、马源化的、人源化的或任何其它通过重组方法、杂交瘤技术或噬菌体展示技术产生的特化的抗体或完全“犬源化的”(特化的)单克隆抗体，其特异性地结合至NGF，并且从而防止NGF结合至犬TrkA，并在较小程度上结合至犬p75受体，从而作为拮抗剂，因为信号传导通路阻止被NGF激活。
NGF是第一个被识别的神经营养因子，并且它在外周和中枢神经元的发育和存活中的作用已经被很好地表征。NGF已经被证明是外周交感神经元和胚胎感觉神经元以及基底前脑胆碱能神经元发育的关键存活和维持因子(Smeyne et al.(1994)Nature 368:246-249；Crowley et al.(1994)Cell 76:1001-1011)。NGF上调感觉神经元中神经肽的表达(Lindsay et al.(1989)Nature 337:362-364)并且其活性通过两种不同的膜结合受体(TrkA受体和被认为是低亲和力的p75普通神经营养因子受体)介导。
在NGF相关的病症中，NGF已经被证明是升高的，其中在损伤的或患病的组织中存在升高量的NGF。NGF相关的病症可以定义为由于受伤的、患病的或受损的组织中NGF的升高而引起的疼痛增加。如本文所用的疼痛如本文所述的定义，是指一种病症，其包含慢性疼痛、炎性疼痛、术后切口疼痛、神经病理性疼痛、骨折疼痛、骨质疏松性骨折疼痛、疱疹后神经痛、癌症疼痛、由烧伤引起的疼痛、与烧伤或伤口相关的疼痛、与创伤相关的疼痛(包含创伤性头部损伤)、神经病理性疼痛、与肌肉骨骼病症相关的疼痛(例如慢性疼痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、血清阴性(非类风湿性)关节病、非关节风湿病和关节周围病症)以及与癌症相关的疼痛(包含“突破性疼痛”和与晚期癌症相关的疼痛)、周围神经病和疱疹后神经痛。
在本发明的实施例中，NGF病症被定义为受试者(犬类、猫类、马类、人类等)的骨关节炎。骨关节炎(OA)是一种缓慢进行的退行性关节疾病，其特征在于关节软骨的丧失和随后犬类的软骨下骨的暴露。这最终导致一种以关节疼痛为特征的自我延续的隐性病症。在试图限制运动和疼痛中，新骨的形成响应于慢性炎症和局部组织损伤而发生。从宏观上看，存在关节软骨的丧失、关节间隙的变窄、软骨下骨的硬化和关节骨赘的产生(VeterinaryFocus:Vol 17No 3；2007)。
在例如犬类、猫类、马类等的不同物种中，原发性OA的发病取决于品种。例如，对于犬类，在罗特韦尔犬中发病平均年龄为3.5岁，并且在贵宾犬中发病平均年龄例如为9.5岁，其他品种以及混合品种的发病平均年龄范围很广。发育性骨科疾病和相关的骨关节炎是狗最常见的关节疾病，它们占关节疾病和附属骨骼内相关问题的医疗就诊的70％左右。百分之二十二的病例是一岁或一岁以下的狗。OA的发病率通过创伤以及肥胖、衰老和遗传异常而增加。特别是，年龄可以是OA发病率的一个因素，其中在8-13岁的狗中观察到>50％的关节炎病例。肌肉骨骼疾病在老年患者中非常常见，并且近20％的老年狗显示出骨科病症。在年龄>8岁的拉布拉多寻回犬中，在若干关节(肘、肩、髋、膝)中的OA是典型的。此外，犬类的大小也在OA发病中发挥作用。45％的患有关节炎的狗是大型犬种。其中，>50％是大型犬种，而仅28％是中型犬种，并且27％是小型犬种。缓解犬OA疼痛对药物干预的需求非常高。
如本文所述，NGF的升高的水平表明NGF相关的病症，尤其是OA。在转基因关节炎小鼠中已经报告了NGF的升高的水平，以及肥大细胞数量的增加(Aloe et al.,Int.J.TissueReactions-Exp.Clin.Aspects 15:139-143(1993))。PCT公开第WO 02/096458号公开了某些性质的抗NGF抗体在治疗各种NGF相关的病症例如炎性病症(例如类风湿性关节炎)中的用途。据报道，注射到携带人肿瘤坏死因子基因的关节炎转基因小鼠中的纯化的抗NGF抗体导致了肥大细胞数量的减少，以及关节炎小鼠的滑膜中组胺和物质P水平的降低(Aloe etal.,Rheumatol.Int.14:249-252(1995))。已经表明，外源性施用NGF抗体降低了在关节炎小鼠中发生的TNFα的增强水平(Marmi et al.,Rheumatol.Int.18:97-102(1998))。已经报道了啮齿动物抗NGF拮抗剂抗体。参见例如Hongo et al.,Hybridoma(2000)19(3):215-227；Ruberti et al.(1993)Cell.Molec.Neurobiol.13(5):559-568。然而，当啮齿动物抗体被治疗上用于非鼠类哺乳动物时，在大量治疗的个体中产生抗鼠抗体反应。因此，非常需要抗NGF拮抗剂抗原结合蛋白，包含本发明的抗NGF拮抗剂抗体，用于犬用途，特别是用于治疗OA。
尽管抗体的特性使它们成为非常有吸引力的治疗剂，但存在许多局限性。如前所述，绝大多数的单克隆抗体(mAb)是啮齿动物来源的。当这样的抗体以不同的种类施用时，患者可以对这样的异种抗体产生他们自己的抗体反应。这样的反应可能导致抗体的最终中和和消除。如上所述，小鼠被广泛地用于生产单克隆抗体。使用由特定物种产生的抗体(通常最初在小鼠中)的一个问题是，用所述抗体治疗的非鼠受试者对小鼠抗体产生反应，就像它们是外来物质一样，从而产生一组新的针对小鼠抗体的抗体。小鼠抗体被非鼠(例如犬)免疫系统视为外来物，并且然后受试者对该分子产生免疫反应。本领域技术人员将认识到需要能够用抗原特异性抗体治疗受试者，但具有该抗体种类的特异性。由跨物种抗体给药产生的部分反应(例如给犬施用的小鼠单克隆抗体)可以是从温和的形式(例如皮疹)到更极端的和危及生命的反应(例如肾衰竭)的范围。这种免疫反应还可以降低治疗的有效性，或者如果受试者被给予含有小鼠抗体的后续治疗，则可以产生未来的反应。因此，我们着手通过抗体的“犬源化”来克服这一缺点。特别地，该过程集中于免疫球蛋白可变结构域的框架区，但也可以包含可变结构域的互补决定区(CDR)。在本公开中描述了该过程的使能步骤和实践简化。
对来自动物的单克隆抗体(如本文所述的抗原结合蛋白、拮抗剂抗体等以及可互换使用的术语)进行修饰以使其对物种治疗性给药具有较低免疫原性的过程已经被积极地探索，并且已经在许多出版物(例如Antibody Engineering:A practical Guide.CarlA.K.Borrebaeck ed.W.H.Freeman and Company,1992)中描述。然而，直到最近，该过程尚未被应用于非人类，特别是犬类的治疗或诊断的发展。事实上，关于犬可变结构域的报道很少。Wasserman and Capra,Biochem.6,3160(1977)确定了犬IgM和犬IgA重链的可变区的氨基酸序列。Wasserman and Capra,Immunochem.15,303(1978)确定了来自犬IgA的K轻链的氨基酸序列。McCumber and Capra,Mol.Immunol.16,565(1979)公开了犬μ链的完整氨基酸序列。Tang et al.,Vet.Immunology Immunopathology 80,259(2001)公开了单个犬IgG-Ay链cDNA和四个犬IgG-A y链蛋白质序列。其描述了用从人、小鼠、猪和牛的IgG的保守区设计的简并寡核苷酸引物对犬脾脏的cDNA文库进行PCR扩增。缺乏关于犬抗体可得的信息已经阻碍了它们作为用于治疗犬类疾病的疗法的发展。
这些值得注意的限制已经促进了被称为“物种形成”的工程技术的发展，并且在治疗性抗体的“人源化”方面对本领域技术人员来说是公知的。作为特化的分子的示例，犬源化的抗体可以以嵌合抗体或其片段的形式产生，所述嵌合抗体或其片段含有源自非犬免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，犬源化的抗体是犬抗体(即“受体抗体”或“靶物种抗体”)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非犬物种(即“供体抗体”或“来源物种抗体”)例如小鼠的CDR的残基取代，具有所需的特性，例如特异性、亲和力和效力。在一些情况下，犬免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非犬残基取代。这种犬源化策略被称为“CDR接枝”。可能需要将选定的靶框架残基反向突变为相应的供体残基，以恢复和/或提高亲和力。如在US 7,261,890中所述，基于结构的方法也可以用于犬源化和亲和力成熟。
上述方法基本上利用了来自靶物种的一个或多个抗体可变重链或可变轻链的整个框架区，这些抗体可变重链或可变轻链被工程改造成从供体物种接收CDR。当以与犬源化相同的方式将抗体猫源化以使其在给猫施用时抗原性降低时，也使用这种方法。在一些情况下，可变区中选定残基的反向突变被用于增强CDR的表达。设计抗体(该抗体使受试者对抗体中非天然序列的免疫原性反应最小化)同时充分地保留抗体的抗原结合区以保持效力，已被证明具有挑战性。
开发靶向蛋白质的治疗性抗体的另一个挑战是不同物种中同源蛋白质上的表位经常不同，并且与其他蛋白质交叉反应的可能性也不同。因此，必须针对要治疗的特定物种中的特定靶标来制造、测试和开发抗体。
抗体通过与抗体分子的可变区的相互作用，通过其在抗原上的特定表位的结合来靶向抗原。此外，抗体具有介导、抑制(如在本发明的拮抗抗NGF抗原结合蛋白的情况下)和/或启动多种生物活性的能力。对于治疗性抗体具有广泛的功能，例如，抗体可以作为激动剂或拮抗剂来调节受体-配体的相互作用。抗体结合可以启动细胞内信号传导以刺激细胞生长、细胞因子产生或凋亡。抗体可以将结合至Fe区域的药剂输送到特定的位点。抗体也引发抗体介导的细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CDC)和吞噬作用。也存在已经被改变的抗体，其中ADCC、CDC、C1q结合和吞噬功能已经被消除。在本发明的一个实施例中，本发明的抗体包括改变所述抗体的效应子功能的抗体的Fc区的改变。
犬源化和猫源化
如本文中所使用的，“犬源化的抗体”是指具有与由犬产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体和/或已经使用本领域已知的或本文公开的任何技术制备的抗体。相同的过程被用于猫源化过程，并且应该应用于此处的描述。为了简单起见，犬源化将主要用作示例，然而这些示例不仅仅限于犬。相同的概念和设计适用于其他抗原结合蛋白的物种形成，例如猫、马、人等。犬源化抗体的该定义包含包括至少一种犬重链多肽或至少一种犬轻链多肽的抗体。抗体的“物种形成”本身，并且特别是抗体的人源化是本领域技术人员熟知的研究领域。直到最近尚未知道人源化以外的抗体的物种形成是否会产生对任何其他物种都有效的治疗性抗体。本发明举例说明了分别用于狗和猫的治疗用途的抗NGF抗原结合蛋白的犬源化和猫源化。
嵌合抗体包括来自至少两种不同物种的序列。作为一个示例，重组克隆技术可以用于包含来自非受体抗体(即，在用抗原免疫的供体物种中制备的抗体)的含有抗原结合位点的可变区和来自受体免疫球蛋白的恒定区。
特化的(犬源化的、猫源化的等)抗体是一种嵌合抗体，其中负责抗原结合的可变区残基(即互补决定区的残基、缩写互补决定区的残基或参与抗原结合的任何其它残基)来自非犬(或非猫)物种，而剩余的可变区残基(即框架区的残基)和恒定区至少部分地来自犬(或猫)抗体序列。特化的抗体的框架区残基和恒定区残基的子集可以来自非犬(或猫)来源。特化的抗体的可变区也被描述为特化的(即特化的轻链或重链可变区)。非特化的物种通常是用于用抗原免疫的物种，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其他非犬或非猫哺乳动物物种。
互补决定区(CDR)是参与抗原结合的抗体可变区的残基。若干种用于识别CDR的编号系统是常用的。Kabat定义基于序列的可变性，而Clothia定义基于结构环区域的位置。AbM的定义是Kabat和Clothia方法之间的折衷。本发明的特化抗体可以被构建成包括一个或多个CDR。此外，CDR可以单独地或组合地用于合成分子例如SMIP和小抗体模拟物。
框架残基是抗体可变区的那些残基，而不是高变或CDR残基。框架残基可以来源于天然存在的犬(例如，但在概念上适用于其他物种，例如猫、马、人等。为了简单起见，犬将被用作代表性物种，但示例不限于犬本身)抗体，例如与本发明的抗体的框架区基本上相似的犬框架。也可以使用代表单个序列间一致性的人工框架序列。当选择用于犬源化的框架区时，在犬中广泛表达的序列可能优于较少群体的序列。可以对犬框架受体序列进行额外的突变，以恢复被认为参与抗原接触的鼠残基和/或参与抗原结合位点的结构完整性的残基，或者改善抗体表达。
通过用供体抗体(例如，非犬抗体)的CDR替换受体抗体(例如，犬源化的抗体或包括所需框架残基的其它抗体)的一个或多个CDR来进行CDR的接枝。受体抗体可以基于候选受体抗体和供体抗体之间框架残基的相似性来选择。例如，犬框架区被识别为与相关非犬抗体的每个框架区具有实质上的序列同源性，并且非犬抗体的CDR被接枝到不同犬框架区的组合物上。
抗体-抗原复合物的三维结构的分析，结合可用的氨基酸序列数据的分析，可以用于基于在CDR内每个位置出现的氨基酸残基的结构差异来模拟序列可变性。本发明的CDR也可以用于小抗体模拟物，其包括两个CDR区和框架区(Qui et al.Nature BiotechnologyVol 25；921-929；August 2007)。
用于CDR或缩写CDR的接枝的受体框架可以进一步被修饰以引入所需的残基。例如，受体框架可以包括犬共有序列的重链可变区，任选地在一个或多个位置具有非犬供体残基。在接枝后，可以对供体和/或受体序列进行额外的改变，以优化抗体结合和功能性。参见例如国际公开第WO 91/09967号。
本发明进一步提供了表达本发明的抗体的细胞和细胞系。代表性的宿主细胞包含细菌、酵母、哺乳动物和人类细胞，例如CHO细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞、CV-1细胞和COS细胞。用于在将异源构建体转化到宿主细胞中后产生稳定的细胞系的方法是本领域已知的。代表性的非哺乳动物宿主细胞包含昆虫细胞(Potter et al.(1993)Int.Rev.Immunol.10(2-3):103-112)。抗体也可以在转基因动物(Houdebine(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13(6):625-629)和转基因植物(Schillberg et al.(2003)Cell Mol.Life Sci.60(3):433-45)中产生。
如上所讨论的，单克隆抗体、嵌合抗体、物种特异性抗体和特化的抗体也在本发明的范围内，这些抗体已经通过例如抗体的其他部分(例如恒定区)的删除、添加或替换被修饰。例如，抗体可以如下修饰：(i)通过删除恒定区；(ii)通过用另一恒定区域替换所述恒定区，例如意味着增加抗体的半衰期、稳定性或亲和力的恒定区，或者来自另一物种或抗体类别的恒定区；或者(iii)通过修饰恒定区中的一个或多个氨基酸来改变例如糖基化位点的数量、效应子细胞功能、Fc受体(FcR)结合、补体结合等。在本发明的一个实施例中，本发明的抗体包括改变抗体的效应子功能的改变的Fc区。在本发明的一些实施例中，本发明的抗原结合蛋白的Fc区已经被替换、修饰或去除。
用于改变抗体恒定区的方法在本领域中是已知的。具有改变的功能的抗体，例如对效应子配体(例如细胞上的FcR)的改变的亲和力，或者补体的C1组分可以通过用不同的残基替换抗体的恒定部分中的至少一个氨基酸残基来产生(参见例如EP 388,151A1、美国专利第5,624,821号和美国专利第5,648,260号，其全部内容通过引用被并入本文)。
例如，可以通过以下来改变抗体的Fc区对FcR(例如，FcγR1)或者对C1q结合的亲和力：用在其侧链上具有适当官能团的残基替换指定的残基，或者引入带电荷的官能团(例如谷氨酸盐或天冬氨酸盐)，或者可能的芳香族非极性残基(例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸)(参见例如美国专利第5,624,821号)。抗体或其结合片段可以与细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子缀合。在一个实施例中，缀合的蛋白质是抗体或其片段。细胞毒素或细胞毒性药剂包含任何对细胞有害的药剂。非限制性的示例包含刺孢霉素、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***、嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包含但不限于抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷和5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)、烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环硫磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素、博莱霉素、光神霉素和蒽霉素)和抗有丝***剂(例如，长春新碱和长春碱)。用于将这样的部分与蛋白质缀合的技术在本领域中是公知的。
组合物、衍生的组合物和制备组合物的方法
本发明包含组合物(包含药物组合物)，其包括抗原结合蛋白(如在本文中可互换使用的“抗体”、“抗体片段”、“拮抗剂抗体”等)、多肽和多核苷酸，其包括编码本发明的抗原结合蛋白或多肽的序列。
如本文中所使用的，组合物包括一种或多种结合至NGF的抗体、抗原结合蛋白或多肽(其可以是抗体或者可以不是抗体)，和/或一种或多种包括编码一种或多种结合至NGF的抗体或多肽的序列的多核苷酸。这些组合物可以进一步包括合适的赋形剂，例如药学/兽医学上可接受的赋形剂，包含缓冲液，其在本领域中是公知的。本发明还包含分离的抗体、多肽和多核苷酸实施例。本发明还包含基本上纯的抗体、多肽和多核苷酸实施例。
在一个或多个实施例中，本发明提供了特异性地结合至NGF的新型的抗原结合蛋白。在一个或多个实施例中，抗原结合蛋白被定义为抗体或抗体片段。在一个或多个实施例中，抗原结合蛋白是完全犬的、完全猫的、完全牛的、完全马的、完全人类的、犬源化的、猫源化的、马源化的或人源化的。在一个或多个实施例中，本发明的抗原结合蛋白结合至犬、猫、马或人NGF。在一个实施例中，抗原结合蛋白是单克隆抗体。在一个实施例中，本发明的单克隆抗体与NGF结合，并阻止其与其受体TrkA的结合和激活，以及在较小程度上与p75的结合和激活，从而阻止如本文所述的信号级联。本发明的抗原结合蛋白在本文中被识别为ZTS-841。
在一个或多个实施例中，本发明提供了一种分离的和重组的抗原结合蛋白“ZTS-841”，其中可变重链包括与包括SEQ ID NO.4的氨基酸序列(“0ZTS-841”VH CDR1)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，与包括SEQ ID NO.5的氨基酸序列(“ZTS-841”VH CDR2)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，与包括SEQ ID NO.6的氨基酸序列(“ZTS-841”VH CDR3)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中可变轻链包括与包括SEQ ID NO.1的氨基酸序列(“ZTS-841”VL CDR1)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，与包括SEQ ID NO.2的氨基酸序列(“ZTS-841”VL CDR2)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的的氨基酸序列，以及与包括SEQ ID NO.3的氨基酸序列(“ZTS-841”VL CDR3)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链或可变重链内的CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸取代。
在一个或多个实施例中，本发明提供了一种分离的和重组的抗原结合蛋白“ZTS-842”，其中可变重链包括与包括SEQ ID NO.24的氨基酸序列(“0ZTS-842”VH CDR1)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，与包括SEQ ID NO.25的氨基酸序列(“ZTS-842”VH CDR2)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，与包括SEQ ID NO.26的氨基酸序列(“ZTS-842”VHCDR3)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；并且其中可变轻链包括与包括SEQ IDNO.21(“ZTS-842”VL CDR1)的氨基酸序列具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，与包括SEQID NO.22的氨基酸序列(“ZTS-842”VL CDR2)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的的氨基酸序列，以及与包括SEQ ID NO.23的氨基酸序列(“ZTS-842”VL CDR3)具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；以及其任何变体，所述变体在所述抗原结合蛋白的任何可变轻链或可变重链内的CDR1、CDR2或CDR3中的至少一个中具有一个或多个保守氨基酸取代。
在本文所述的一些实施例中，本发明提供了重组的抗原结合蛋白、单克隆抗体和抗体片段，以及它们在临床施用和科学程序(包含诊断程序)中的用途。通过使用分子生物学和重组技术的方法，可以通过重组手段产生抗体和抗体样分子，并且从而生成编码在抗体的多肽结构中发现的特定氨基酸序列的基因序列。这样的抗体可以通过克隆编码所述抗体的多肽链的基因序列或者通过直接合成所述多肽链来产生，通过合成链的组装来形成对特定表位和抗原决定簇具有亲和力的活性四聚体(H2L2)结构。这已经允许容易地生产具有中和来自不同物种和来源的抗体的序列特征的抗体。
不管抗体的来源如何，它们是如何重组构建的，或者它们是如何在体外或体内合成的，使用转基因动物、实验室或商业规模的大细胞培养物、使用转基因植物，或者通过在该过程的任何阶段不使用活生物体的直接化学合成，所有抗体都具有相似的整体三维结构。这种结构通常被称为H2L2，并且指的是抗体通常包括两条轻(L)氨基酸链和两条重(H)氨基酸链的事实。两种链都具有能够与结构上互补的抗原靶标相互作用的区域。与靶标相互作用的区域被称为“可变”或“V”区，并且其特征在于来自不同抗原特异性的抗体的氨基酸序列不同。H链或L链的可变区含有能够特异性地结合至抗原靶标的氨基酸序列。
如本文中所使用的，术语“抗原结合区”是指抗体分子的含有与抗原相互作用并赋予抗体对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的部分。抗体结合区包含维持抗原结合残基的正确构象所必需的“框架”氨基酸残基。在提供抗原结合区的H链或L链的可变区中，有被称为“高变”的更小的序列，这是因为它们在不同特异性的抗体之间具有极端的可变性。这样的高变区也被称为“互补决定区”或“CDR”区。这些CDR区解释了抗体对特定抗原决定簇结构的基本特异性。
CDR代表可变区内的氨基酸的非连续延伸，但是，不管物种如何，已经发现可变重链区和轻链区内这些关键氨基酸序列的位置在可变链的氨基酸序列内具有相似的位置。所有抗体的可变重链和轻链各自具有三个CDR区，每一个CDR区都与其它CDR区不相邻。在所有的哺乳动物物种中，抗体肽含有恒定(即高度保守的)区和可变区，并且在后者中，存在CDR和由重链或轻链的可变区内但在CDR之外的氨基酸序列组成的所谓的“框架区”。
本发明进一步提供了一种包含至少一种上述核酸的载体。因为遗传密码是简并的，因此多于一个的密码子可以用来编码特定的氨基酸。利用遗传密码，可以识别一个或多个不同的核苷酸序列，每个核苷酸序列都将能够编码氨基酸。通过考虑异常碱基配对关系和表达抗NGF抗体或部分的真核或原核细胞中实际使用特定密码子(用于编码特定氨基酸)的频率，可以估计特定寡核苷酸实际将构成实际的编码序列的概率。这样的“密码子使用规则”由Lathe et al.,183J.Molec.Biol.1-12(1985)公开。使用Lathe的“密码子使用规则”，可以识别单个核苷酸序列或一组核苷酸序列，其含有能够编码抗NGF序列的理论上“最可能”的核苷酸序列。还旨在，还可以通过使用标准分子生物学技术改变现有抗体基因来提供用于本发明的抗体编码区，所述标准分子生物学技术产生本文所述的抗体和肽的变体(激动剂)。这样的变体包含但不限于抗NGF抗体或肽的氨基酸序列中的缺失、添加和取代。
例如，一类取代是保守氨基酸取代。这样的取代是在抗NGF抗体肽中给定的氨基酸被另一种具有相似特征的氨基酸取代的取代。通常被视为保守取代的是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Iie之间的相互取代；羟基残基Ser和Thr的交换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gin之间的取代、碱性残基Lys和Arg的交换、在芳香残基Phe、Tyr等之间的取代。关于哪些氨基酸变化可能在表型上是沉默的指导见Bowie et al.,247Science 1306-10(1990)。
变体抗NGF抗原结合蛋白或抗体片段可能是完全功能性的，或者可能在一种或多种活性中缺乏功能。完全功能性的变体通常仅含有保守变体或非关键残基或非关键区域中的变体。功能性的变体也可以含有相似氨基酸的取代，其导致功能不变或无显著变化。可替代地，这样的取代可能在一定程度上积极地或消极地影响功能。非功能性变体通常在关键残基或关键区域中含有一个或多个非保守氨基酸取代、缺失、***、倒位或截短或取代、***、倒位或缺失。
对于功能必需的氨基酸可以通过本领域已知的方法(例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变)来识别。Cunningham et al.,244Science 1081-85(1989)。后一种程序是在分子中的每个残基上引入单个丙氨酸突变。然后测试所得的突变分子的生物活性，例如表位结合或体外ADCC活性。对配体-受体结合至关重要的位点也可以通过结构分析例如结晶学、核磁共振或光亲和标记来确定。Smith et al.,224J.Mol.Biol.899-904(1992)；de Vos et al.,255Science 306-12(1992)。
此外，多肽通常含有除二十种“天然”氨基酸以外的氨基酸。此外，许多氨基酸(包含末端氨基酸)可以通过自然过程(例如加工和其他翻译后修饰)，或者通过本领域公知的化学修饰技术来修饰。已知的修饰包含但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移-RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加，例如精氨酸化和泛素化。这样的修饰对于本领域技术人员来说是公知的，并且已经在科学文献中非常详细地描述。若干特别常见的修饰(例如糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP核糖基化)在大多数基础文章中描述，例如Proteins-Structure and Molecular Properties(2nd ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman&Co.,NY,1993)。可获得关于这一主题许多详细的评论，例如Wold,Posttranslational Covalent Modification of proteins,1-12(Johnson,ed.,Academic Press,NY,1983)；Seifter et al.,182Meth.Enzymol.626-46(1990)；andRattan et al.,663Ann.NY Acad.Sci.48-62(1992)。
因此，本发明的抗体和肽也包含其中取代的氨基酸残基不是由遗传密码编码的氨基酸残基的衍生物或类似物。类似地，刚刚描述的氨基酸序列中的添加和取代以及变体和修饰可以同样适用于NGF抗原和/或其表位或肽的氨基酸序列，并且因此被本发明所涵盖。如上所述，根据本发明的编码单克隆抗体的基因在NGF的识别中特别有效。
抗体衍生物
包含在本发明的范围内的是抗体衍生物。抗体的“衍生物”含有额外的化学部分，其通常不是蛋白质的一部分。蛋白质的共价修饰包含在本发明的范围内。这样的修饰可以通过使抗体的靶向氨基酸残基与有机衍生剂反应而被引入到分子中，所述有机衍生剂能够与选定的侧链或末端残基反应。例如，用本领域公知的双功能药剂进行衍生可用于将抗体或片段交联到水不溶性载体基质或其它大分子载体上。
衍生物还包含被标记的放射性标记的单克隆抗体。例如，用放射性碘(251，1311)、碳(4C)、硫(35S)、铟、氚(H3)等；单克隆抗体与生物素或抗生物素蛋白的缀合物，与酶例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖淀粉酶、羧酸脱水酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖6-磷酸脱氢酶的缀合物；以及单克隆抗体与生物发光试剂(例如荧光素酶)、化学发光剂(例如吖啶酯)或荧光剂(例如藻胆蛋白)的缀合物。
本发明的另一种衍生双功能抗体是双特异性抗体，其通过结合识别两种不同抗原组的两种单独的抗体的部分来生成。这可以通过交联或重组技术来实现。此外，可以将部分添加到抗体或其一部分中以增加体内半衰期(例如，通过延长从血流中清除的时间)。这样的技术包含，例如，添加PEG部分(也称为聚乙二醇化)，并且是本领域公知的。参见美国专利申请公开第20030031671号。
抗体的重组表达
在一些实施例中，将编码受试者单克隆抗体的核酸直接引入到宿主细胞中，并且在足以诱导编码的抗体的表达的条件下孵育细胞。在受试者核酸已经被引入到细胞中之后，通常在37℃(有时在选择下)孵育细胞约1-24小时的时间段，以便允许抗体的表达。在一个实施例中，抗体被分泌到其中细胞正在生长的培养基的上清液中。传统上，单克隆抗体已经作为鼠杂交瘤细胞系中的天然分子被产生。除了该技术，本发明还提供了单克隆抗体的重组DNA表达。这允许在选择的宿主物种中产生犬源化的抗体以及一系列抗体衍生物和融合蛋白。
编码本发明的至少一种抗NGF抗体、部分或多肽的核酸序列可以根据常规技术与载体DNA重组，包含用于连接的平端或错端末端、提供合适的末端的限制性酶消化、合适时粘性末端的填充、避免不期望的连接的碱性磷酸酶处理，以及用合适的连接酶连接。公开了用于这样的操作的技术，例如由Maniatis et al.,MOLECULAR CLONING,LAB.MANUAL,(ColdSpring Harbor Lab.Press,NY,1982and 1989),and Ausubel et al.1993(上文)公开，这些技术可以用于构建编码单克隆抗体分子或其抗原结合区的核酸序列。
如果核酸分子例如DNA含有包含转录和翻译调节信息的核苷酸序列，并且这样的序列与编码多肽的核苷酸序列“可操作地连接”，则称该核酸分子“能够表达”多肽。可操作的连接是这样的连接，其中调节性DNA序列和寻求被表达的DNA序列以这样的方式连接，使得允许以可回收的量作为抗NGF肽或抗体部分的基因表达。基因表达所需的调控区的精确性质可能因生物而异，如在类似领域中公知的。参见例如上文Sambrook et al.,2001；Ausubel et al.,1993。
因此，本发明包含抗NGF抗体或肽在原核细胞或真核细胞中的表达。合适的宿主包含细菌或真核宿主，包含体内或原位的细菌、酵母、昆虫、真菌、鸟类和哺乳动物细胞，或哺乳动物、昆虫、鸟类或酵母来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可以是人类、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫来源的，但是可以使用任何其他哺乳动物细胞。
在一个实施例中，本发明的核苷酸序列将被整合到能够在受体宿主中自主复制的质粒或病毒载体中。多种载体中的任何一种都可以用于此目的。参见例如上文Ausubel etal.,1993。在选择特定的质粒或病毒载体中的重要因素包含：可以识别含有载体的受体细胞并从不含载体的受体细胞中进行选择的容易性；特定宿主中所需的载体的拷贝数；以及是否期望能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”载体。
本领域中已知的示例性原核载体包含质粒，例如那些能够在大肠杆菌中复制的质粒(例如但不限于例如pBR322、ColE1、pSC101、pACYC 184等)。这样的质粒例如由上文Maniatis et al.,1989；Ausubel et al,1993公开。芽孢杆菌质粒包含pC194、pC221、pT127等。这样的质粒由Gryczan在THE MOLEC.BIO.OF THE BACILLI 307-329(Academic Press,NY,1982)中公开。合适的链霉菌质粒包含pIJ101(Kendall et al.,169J.Bacteriol.4177-83(1987)，和链霉菌噬菌体例如phLC31(Chater et al.,in SIXTH INT'L SYMPOSIUM ONACTINOMYCETALES BIO.45-54(Akademiai Kaido,Budapest,Hungary 1986)。假单胞菌质粒在John et al.,8Rev.Infect.Dis.693-704(1986)；Izaki,33Jpn.J.Bacteriol.729-42(1978)；and Ausubel et al.,1993(上文)中综述。
可替代地，可用于表达编码抗NGF抗体或肽的cDNA的基因表达元件包含但不限于(a)病毒转录启动子及其增强子元件，例如SV40早期启动子(Okayama et al.,3Mol.Cell.Biol.280(1983))、劳斯肉瘤病毒LTR(Gorman et al.,79Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 6777(1982))和莫洛尼鼠白血病病毒LTR(Grosschedl etal.,41Cell 885(1985))；(b)剪接区和多聚腺苷酸化位点，例如来自SV40晚期区域的剪接区和多聚腺苷酸化位点(Okayarea et al.,1983)，和(c)多聚腺苷酸化位点，例如SV40中的多聚腺苷酸化位点(Okayama et al.,1983)。
使用SV40早期启动子及其增强子、小鼠免疫球蛋白H链启动子增强子、SV40晚期区域mRNA剪接、兔S-珠蛋白***序列、免疫球蛋白和兔S-珠蛋白多聚腺苷酸化位点以及SV40多聚腺苷酸化元件作为表达元件，免疫球蛋白cDNA基因可以如Weidle et al.,51Gene 21(1987)所述表达。对于由部分cDNA、部分基因组DNA组成的免疫球蛋白基因(Whittle etal.,1Protein Engin.499(1987))，转录启动子可以是人巨细胞病毒，启动子增强子可以是巨细胞病毒和小鼠/人免疫球蛋白，并且mRNA剪接和多聚腺苷酸化区域可以是天然的染色体免疫球蛋白序列。
在一个实施例中，为了在啮齿动物细胞中表达cDNA基因，转录启动子是病毒LTR序列，转录启动子增强子是小鼠免疫球蛋白重链增强子和病毒LTR增强子中的一种或两种，剪接区含有大于31bp的内含子，并且多聚腺苷酸化和转录终止区衍生自对应于正在被合成的免疫球蛋白链的天然染色体序列。在其他实施例中，将编码其他蛋白质的cDNA序列与上述表达元件组合，以实现蛋白质在哺乳动物细胞中的表达。
每个融合基因都可以被组装到或被***到表达载体中。然后将能够表达嵌合免疫球蛋白链基因产物的受体细胞用抗NGF肽或嵌合H或嵌合L链编码基因单独地转染，或者与嵌合H和嵌合L链基因共转染。在允许整合的基因的表达的条件下培养转染的受体细胞，并从培养物中回收表达的免疫球蛋白链或完整的抗体或片段。
在一个实施例中，将编码抗NGF肽或嵌合的H链和L链或其部分的融合基因组装在单独的表达载体中，其然后用于共转染受体细胞。可替代地，编码嵌合H链和L链的融合基因可以被组装在同一表达载体上。为了转染表达载体和产生嵌合抗体，受体细胞系可以是骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞可以合成、组装和分泌由转染的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白，并且具有免疫球蛋白的糖基化的机制。骨髓瘤细胞可以在培养物中或在小鼠的腹膜腔中生长，其中分泌的免疫球蛋白可以从腹水中获得。其他合适的受体细胞包含淋巴细胞，例如人或非人来源的B淋巴细胞、人或非人来源的杂交瘤细胞、或种间异源杂交瘤细胞。
携带本发明的嵌合的、犬源化的抗体构建体或抗NGF多肽的表达载体可以通过多种合适的手段中的任何一种被引入到合适的宿主细胞中，所述手段包含诸如转化、转染、缀合、原生质体融合、磷酸钙沉淀和与聚阳离子例如二乙基氨基乙基(DEAE)葡聚糖的应用的生化手段，以及诸如电穿孔、直接显微注射和微喷射轰击的机械手段。Johnston et al,240Science 1538(1988)。
对于生产免疫球蛋白H链和L链，酵母相对于细菌可以提供显著的优势。酵母进行翻译后肽修饰(包含糖基化)。现在存在若干种重组DNA策略，它们利用强启动子序列和高拷贝数质粒，其可以用于在酵母中产生所需的蛋白质。酵母识别克隆的哺乳动物基因产物的前导序列，并分泌带有前导序列的肽(即前肽)。Hitzman et al.,11th Int'l Conferenceon Yeast,Genetics&Molec.Biol.(Montpelier,France,1982)。
酵母基因表达系统可以常规地评估抗NGF肽、抗体和组装的鼠和嵌合的、异源嵌合的、犬源化的抗体、片段及其区域的生产、分泌和稳定性的水平。当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时，可以使用一系列酵母基因表达系统中的任何一种，该系统结合了来自编码以很大量产生的糖酵解酶的活性表达的基因的启动子和终止元件。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的启动子和终止子信号。可以采用若干种方法来评估用于在酵母中表达克隆的免疫球蛋白cDNA的最佳表达质粒。参见Vol.II DNA Cloning,45-66,(Glover,ed.,)IRL Press,Oxford,UK(1985)。
细菌菌株也可以用作宿主来产生本发明所描述的抗体分子或肽。含有复制子和控制序列的质粒载体与这些细菌宿主结合使用，所述复制子和控制序列来自与宿主细胞相容的物种。该载体携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的特定基因。可以采用多种方法来评估表达质粒，以用于在细菌中产生由克隆的免疫球蛋白cDNA编码的鼠、嵌合的、异源嵌合的、犬源化的抗体、片段和区域或抗体链(参见：(上文Glover,1985；Ausubel,1993；Sambrook,2001；)Colligan et al.,eds.Current Protocols in Immunology,JohnWiley&Sons,NY,NY(1994-2001)；Colligan et al.,eds.Current Protocols in ProteinScience,John Wiley&Sons,NY,NY(1997-2001))。
宿主哺乳动物细胞可以在体外或体内生长。哺乳动物细胞对免疫球蛋白蛋白分子提供翻译后修饰，包含前导肽的去除、H链和L链的折叠和组装、抗体分子的糖基化以及功能性抗体蛋白的分泌。除了上述的淋巴来源的细胞之外，可以用作用于产生抗体蛋白的宿主的哺乳动物细胞还包含成纤维细胞来源的细胞，例如Vero(ATCC CRL 81)或CHO-K1(ATCCCRL 61)细胞。许多载体系统可用于在哺乳动物细胞中表达克隆的抗NGF肽H链和L链基因(参见上文Glover,1985)。可以遵循不同的方法以获得完整的H2L2抗体。可以在相同的细胞中共表达H链和L链，以实现H链和L链在完整的四聚体H2L2抗体和/或抗NGF肽中的细胞内结合和连接。通过在同一宿主中使用相同或不同的质粒，可以发生共表达。可以将用于H链和L链和/或抗NGF肽的基因放入到同一质粒中，然后将其转染到细胞中，从而直接选择表达两条链的细胞。可替代地，可以首先用编码一条链(例如L链)的质粒转染细胞，然后用含有第二种选择性标记物的H链质粒转染所得的细胞系。通过任一种途径产生抗NGF肽和/或H2L2分子的细胞系可以用编码肽、H、L或H+L链的额外拷贝的质粒连同额外的选择性标记物转染，以产生具有增强的性质的细胞系，例如组装的H2L2抗体分子的更高产量或转染的细胞系的增强的稳定性。
对于重组抗体的长期高收率生产，可以使用稳定的表达。例如，可以工程化稳定地表达抗体分子的细胞系。宿主细胞可以用免疫球蛋白表达盒和选择性标记物转化，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。在引入外源DNA后，工程改造的细胞可以允许在富集培养基中生长1-2天，并且然后切换到选择性培养基。重组质粒中的选择性标记物赋予了对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到染色体中，并生长以形成病灶，该病灶进而可以被克隆并扩增到细胞系中。这样的工程改造的细胞系在筛选和评估直接或间接地与抗体分子相互作用的化合物/组分中可能特别有用。
一旦已经产生本发明的抗体，可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法(例如，通过色谱法(例如离子交换、亲合性，特别是对蛋白质A后的特定抗原的亲合性，和尺寸柱色谱法)、离心、差速溶解性)或通过任何其它用于纯化蛋白质的标准技术来纯化抗体。在许多实施例中，抗体从细胞分泌到培养基中，并从培养基中收获。
制药和兽医应用
如本发明在本文描述的抗NGF抗原结合蛋白或抗体片段可以用于例如治疗狗和猫的NGF相关的病症。更具体地，本发明进一步提供了一种药物组合物，其包括药学上可接受的载体或稀释剂以及作为活性成分的根据本发明的抗体或抗体片段。抗体可以是嵌合的、异源嵌合的、犬源化的、猫源化的、马源化的、人源化的或特化的，以适应不同的物种。也可以设想完整的免疫球蛋白或其结合片段例如Fab。本发明的抗体及其药物组合物可用于肠胃外给药，例如皮下注射、肌肉注射或静脉注射。
本发明的抗NGF抗体和/或肽可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合施用。它们可以单独施用，但通常与根据所选的给药途径和标准药物实践选择的药物载体一起施用。本文公开的抗体的施用可以通过任何合适的手段进行，包含肠胃外注射(例如腹膜内、皮下或肌内注射)、口服或通过将抗体(通常在药物制剂中携带)局部施用至气道表面。局部施用至气道表面可以通过鼻内施用(例如通过使用滴管、拭子或吸入器)进行。将抗体局部施用至气道表面也可以通过吸入施用来进行，例如通过产生含有抗体的药物制剂(包含固体和液体颗粒)的可吸入颗粒作为气溶胶悬浮液，并且然后使受试者吸入可吸入颗粒。用于施用药物制剂的可吸入颗粒的方法和设备是公知的，并且可以采用任何常规技术。
在一些期望的实施例中，抗体通过肠胃外注射施用。对于肠胃外施用，抗NGF抗体或肽可以与药学上可接受的肠胃外媒介物一起配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。例如，媒介物可以是溶解在可接受载体中的抗体或其混合物的溶液，例如水性载体，这样的媒介物是水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、海藻糖或蔗糖溶液，或5％血清白蛋白、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。也可以使用脂质体和非水媒介物，例如固定油。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物质。这些组合物可以通过常规的、公知的灭菌技术来灭菌。所述组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中抗体的浓度可以很大地变化，例如从小于约按重量计0.5％，通常为或至少约1％至多达15％或20％，并且将主要基于流体体积、粘度等根据所选择的特定给药模式进行选择。媒介物或冻干粉末可以含有保持等渗性(例如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如缓冲液和防腐剂)的添加剂。该制剂通过常用的技术来灭菌。用于制备肠胃外给药组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的，并且在例如REMINGTON'S PHARMA.SCI.(15th ed.Mack Pub.Co.,Easton,Pa.,1980)中更详细地描述。
本发明的抗体可以被冻干以用于保存，并且在使用前在合适的载体中重构。这项技术已经被证明对常规的免疫球蛋白有效。可以采用任何合适的冻干和重构技术。本领域技术人员将会理解，冻干和重构可以导致不同程度的抗体活性损失，并且可能必须调整使用水平以进行补偿。含有本发明的抗体或其混合物的组合物可以用于预防现有疾病的复发和/或治疗性治疗。在本领域的标准参考文献REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES的最新版本中描述了合适的药物载体。在治疗应用中，将组合物以足以治愈或至少部分地抑制或减轻疾病及其并发症的量施用于已经患有疾病的受试者。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”或“治疗有效量”。用于这种用途的有效量将取决于疾病的严重程度和受试者自身免疫系统的一般状态，但通常范围为约0.1mg抗体/kg体重至约10mg抗体/kg体重，优选地约0.3mg抗体/kg体重至约5mg抗体/kg体重。考虑到外来物质的最小化和通过本发明的犬类和抗体实现的“外来物质”排斥的较低的概率，可能施用大量过量的这些抗体。
当然，施用的剂量将根据已知的因素而变化，例如特定药剂的药效学特征及其给药方式和途径；接受者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度、同时治疗的种类、治疗的频率和期望的效果。
作为非限制性的示例，在需要的剂量范围内，狗和猫中NGF相关的疾病的治疗可以作为本发明的抗NGF抗体的两周或每月剂量来提供。根据本发明，用于犬类治疗用途的示例性抗体是高亲和力(这些也可以是高亲合力)抗体，及其具有有效体内抗NGF活性的片段、区域和衍生物。组合物的单次或多次施用可以通过治疗兽医选择的剂量水平和模式来进行。无论如何，药物制剂应提供一定量的足以有效地治疗受试者的本发明的抗体。
诊断应用
本发明还提供了上述抗NGF抗体和肽，用于检测已知患有或疑似患有NGF相关的病症的物种(特别是犬类和猫类)中的NGF的诊断方法。在本发明的实施例中，NGF相关的病症是疼痛。在另一个实施例中，NGF相关的病症是骨关节炎。本发明的抗NGF抗体和/或肽可用于检测或定量样品中的NGF或抗NGF抗体的免疫测定。用于NGF的免疫测定通常包括在可检测地标记的高亲和力(或高亲合力)抗NGF抗体或本发明的能够选择性地结合至NGF的多肽的存在下孵育临床或生物样品，并检测在样品中结合的标记的肽或抗体。各种临床测定程序在本领域中是公知的。参见例如IMMUNOASSAYS FOR THE 80'S(Voller et al，，eds.,Univ.Park,1981)。这样的样品包含组织活检、血液、血清和粪便样品，或从动物受试者收集并经受如下所述的ELISA测定的液体。因此，抗NGF抗体或多肽可以被固定至硝化纤维素或另一种能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的固体支持物上。然后可以用合适的缓冲液洗涤支持物，随后用可检测地标记的NGF特异性肽、抗体或抗原结合蛋白处理。然后可以用缓冲液再次洗涤固相支持物，以除去未结合的肽或抗体。然后可以通过已知的方法步骤来检测固体支持物上结合的标记的量。
“固相支持物”或“载体”是指能够结合肽、抗原或抗体的任何支持物。公知的支持物或载体包含玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯(PVDF)、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质可以是某种程度上可溶的或不可溶的。支持物材料实际上可以具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合至NGF或抗NGF抗体。因此，支持物构型可以是球形的，例如珠状，或圆柱形的，例如试管的内表面，或杆的外表面。可替代地，表面可以是平的，例如片材、培养皿、测试条等。例如，支持物可以包含聚苯乙烯珠。本领域技术人员将了解许多其他合适的用于结合抗体、肽或抗原的载体，或者可以通过常规实验确定该载体。公知的方法步骤可以确定给定批次的抗NGF肽和/或抗体或抗原结合蛋白的结合活性。本领域技术人员可以通过常规实验来确定操作和最佳测定条件。
可检测地标记NGF特异性肽和/或抗体可以通过连接至用于酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的酶来实现。连接的酶与暴露的底物反应以生成化学部分，该化学部分可以通过例如分光光度法、荧光分析法或通过视觉手段来检测。可以用于可检测地标记本发明的NGF特异性抗体的酶包含但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。通过放射性地标记NGF特异性抗体，可以通过使用放射免疫测定法(RIA)来检测NGF。参见Work et al.,LAB.TECHNIQUES&BIOCHEM.INMOLEC.BIO(No.Holland Pub.Co.,NY,1978)。放射性同位素可以通过例如使用γ计数器或闪烁计数器的手段或者通过放射自显影术来检测。对本发明的目的特别有用的同位素包含：3H、125I、131I、35S和14C。
还可以用荧光化合物标记NGF特异性抗体。当荧光标记的抗体暴露于适当波长的光时，由于荧光，于是可以检测到它的存在。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。NGF特异性抗体或抗原结合蛋白也可以用发射荧光的金属例如125Eu或其他镧系元素可检测地标记。这些金属可以使用金属螯合基团例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)附着至NGF特异性抗体。
NGF特异性抗体也可以通过偶联至化学发光化合物被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光的存在来确定化学发光标记的抗体的存在。有用的化学发光标记化合物的示例是鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
同样，生物发光化合物可以用于标记本发明的NGF特异性抗体、部分、片段、多肽或衍生物。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光，其中催化蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在通过检测发光的存在来确定。用于标记的目的的重要生物发光化合物是荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。
NGF特异性抗体、部分、片段、多肽或衍生物的检测可以通过闪烁计数器来完成(例如，如果可检测的标记是放射性γ发射器)，或者通过荧光计来完成(例如，如果标记是荧光材料)。在酶标记的情况下，检测可以通过使用用于酶的底物的比色方法来完成。检测也可以通过将底物的酶促反应的程度与类似制备的标准品进行视觉比较来完成。
为了本发明的目的，通过上述测定检测的NGF可以存在于生物样品中。可以使用任何含有NGF的样品。例如，样品是生物流体，诸如例如血液、血清、淋巴、尿液、粪便、炎性渗出物、脑脊液、羊水、组织提取物或匀浆等。本发明不限于仅使用这些样品的测定，然而，根据本说明书，本领域普通技术人员可以确定允许使用其他样品的合适条件。
原位检测可以通过从动物受试者中取出组织学样品，并向这样的样品提供本发明的标记的抗体的组合来实现。抗体(或其部分)可以通过将标记的抗体(或部分)施加或覆盖到生物样品上来提供。通过使用这样的程序，不仅可以确定NGF的存在，而且还可以确定NGF在受检的组织中的分布。使用本发明，普通技术人员将容易地意识到，可以修改多种组织学方法(例如染色程序)中的任何一种，以便实现这样的原位检测。
本发明的抗体、片段或衍生物可以适用于免疫测定，也被称为“双位点”或“夹心”测定。在典型的免疫测定法中，一定量的未标记的抗体(或抗体的片段)被结合至不溶于接受测试的流体的固体支持物上，并加入一定量的可检测地标记的可溶性抗体，以允许检测和/或定量在固相抗体、抗原和标记的抗体之间形成的三元复合物。
抗体可以用于定量地或定性地检测样品中的NGF，或者检测表达NGF的细胞的存在。这可以通过免疫荧光技术(采用荧光标记的抗体(参见下文))并结合荧光显微检查、流式细胞术或荧光检测来实现。出于诊断目的，抗体可以被标记或未标记。未标记的抗体可以与其他标记的抗体(第二抗体)结合使用，所述标记的抗体与抗体反应，例如对犬免疫球蛋白恒定区特异性的抗体。可替代地，可以直接标记抗体。可以使用多种标记，例如放射性核素、荧石、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。许多类型的免疫测定法(例如前面讨论的那些)是可获得的，并且是本领域技术人员熟知的。重要的是，本发明的抗体可能有助于诊断犬类的NGF相关的病症。更具体地，本发明的抗体可以识别伴侣动物中NGF的过表达。因此，本发明的抗体可以提供一种重要的免疫组织化学工具。本发明的抗体可以用于抗体阵列，非常适合于测量基因表达概况。
试剂盒
用于实施主题方法的试剂盒也包含在本发明的范围内。试剂盒至少包含一种或多种本发明的抗体、编码该抗体的核酸或含有该抗体的细胞。可以在容器中通常以冻干的形式提供本发明的抗体。抗体(其可以与标记或毒素缀合，或者可以与标记或毒素不缀合)通常包含在具有缓冲液(例如Tris、磷酸盐、碳酸盐等)、稳定剂、生物杀灭剂、惰性蛋白质(例如血清白蛋白)等的试剂盒中。通常，这些材料将基于活性抗体的量以低于5wt％存在，并且通常再次基于抗体浓度以至少约0.001wt％的总量存在。通常，将期望包含惰性增量剂或赋形剂以稀释活性成分，其中赋形剂可以以总组合物的约1wt％至99wt％存在。在测定中使用能够结合至第一抗体的第二抗体的情况下，这将通常存在于单独的小瓶中。第二抗体通常与标记缀合，并以类似于上述抗体制剂的方式配制。该试剂盒通常还将包含一套使用说明。
现在将通过下面的非限制性示例进一步描述本发明。
示例
本发明由以下示例来进一步说明和支持。然而，这些示例绝不应被视为进一步限制本发明的范围。相反，本领域普通技术人员将容易地理解，在不脱离本发明的精神和/或所附权利要求的范围的情况下，存在本发明的其他实施例、修改和等同物。
示例1
犬NGF(cNGF)的合成与纯化
PCR引物被设计成具有适当的限制性位点，以扩增犬前β-NGF(SEQ ID NO:59)。β-NGF基因通过EcoRV/Kpnl位点被克隆到质粒pCTV927(Chromos靶向质粒)中。使用Lipofectamine 2000转染试剂将pCTV927/β-NGF质粒与编码Chromos系统整合酶pSIO343的质粒一起共转染到CHOK1SV细胞中。分析单个稳定克隆的表达，并选择高表达克隆进行扩增和表达，以用于随后的纯化。使用离子交换色谱法纯化由这些转染产生的犬β-NGF(cNGF)。最初的清理是在Q Sepharose FF(GE Healthcare#17-0510-01)上以流通批处理模式进行的。用水将澄清的上清液以1:1稀释，并且用1M Tris将pH调节至8.5。将稀释的样品与QSepharose FF以150:1的比例混合>1.5小时。让树脂沉淀，并且收集未结合的部分。通过阳离子交换层析进一步纯化cNGF；用水以1:1再次稀释，并装载到用20mM Tris、pH 8.5预平衡的SP-Sepharose FF(GE Healthcare#17-0729-01)上。在装载后，洗涤柱，并且然后在20个柱体积上通过从0到210mM NaCl的线性梯度(每个20mM Tris，pH 8.5)洗脱。馏分通过SDS-PAGE分析，合并，在4℃下再次用PBS透析(3.5K mwco)。收集透析液，无菌过滤，并且通过在280nm下的吸光度测量浓度(1mg/ml＝1.48A280)。
示例2：
犬免疫
犬类的免疫可以通过本领域已知的方法进行，并且不限于任何一种方法。在一个示例中，将犬NGF(如示例1中所述)与佐剂一起直接施用到狗体内，以刺激免疫反应。为了获得最佳的抗抗原反应，对犬类施用强化注射，并定期收集血清样品。使用如本领域技术人员公知的并在下文描述的标准抗原直接结合酶联免疫吸附测定(ELISA)方法来监测和确定来自免疫的狗的抗体免疫反应。
示例3：
初级抗原结合和B细胞激活
为了评估犬抗NGF抗体的滴度，将100μL的重组犬NGF(10μg/mL)在4℃的Immunolon2Hb平板中包被过夜。将孔用PBS-T(PBS+0.1％Tween)洗涤三次，并用200μL的PBS+5％的脱脂牛奶在室温下孵育1小时来阻断非特异性结合。在用300μL的PBD-T洗涤三次平板后，将犬血清的系列稀释液孵育一小时。使用0.2μg/mL的Bethyl anti Dog IgG1(A40-120P)和anti-Dog IgG2(A40-121 P)的100μL混合物检测犬抗NGF IgG的结合。在加入生色底物(SureBlue Reserve TMB 1组分微孔过氧化物酶底物，KPL53-00-01)并在室温下孵育十分钟后，通过添加100μL的0.1N HCl来终止反应。在450nm的光密度(OD)下确定每个孔的吸光度。
犬记忆B细胞的激活协议
使用FicollTM梯度分离通过离心来分离外周血单核细胞(PBMC)。从样品中分离出PBMC后，根据本领域技术人员公知的并且如在US 2014/0287402and Callard andKotowicz“Cytokine Cell Biology:A practical approach”Oxford University Press,2000,pg 17-31(其通过引用并入本文)中描述的特异性抗体细胞表面标记物的表达，进行抗体分泌细胞的特异性选择。在将B细胞沉积到分选芯片上之前，在体外激活细胞。在分离并冷冻后，将细胞(PBMC，约107个细胞/小瓶)从液氮中移出并在水浴中快速融化。将细胞转移到15ml的离心管中，并滴加12ml的完全培养基。在将细胞以1000rpm离心10min后，将沉淀重悬于10ml的完全培养基中，并再次以1000rpm离心10min。最后，将细胞重悬于4ml的培养基中。
示例4
编码9L12(ZTS-841)、48L2(ZTS-842)和13L11抗体的DNA序列
通过显微操作从微阵列中回收相关单个细胞，并将其沉积到含有裂解缓冲液和磁珠的微管中，用于mRNA捕获。从总RNA中制备cDNA，其中基因特异性引物的混合物在γHC、κLC和λLC的早期恒定结构域中杂交。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)用于第一链cDNA产物的3'末端拖尾。对于随后的第一次PCR，使用基因特异性反向引物和通用引物正向引物的混合物。随后，分别对每个VH和VL链进行嵌套式PCR以扩增抗体可变区。用于此目的的反向引物与通用正向引物一起位于HC或LC恒定结构域。通过琼脂糖凝胶上的凝胶电泳来分离从PCR扩增的片段。从单个细胞分离的全长VH和VL扩增子被克隆到含有相应HC或LC的恒定部分的表达载体中。犬可变结构域序列如下：9L12(841)可变轻链(SEQ ID NO:7)，相应的核苷酸序列(SEQ ID NO:17)；9L12(841)可变重链(SEQ ID NO:8)，相应的核苷酸序列(SEQ ID NO:18)；48L2(842)可变轻链(SEQ ID NO:27)，相应的核苷酸序列(SEQ ID NO:36)；48L2(842)可变重链(SEQ ID NO:28)，相应的核苷酸序列(SEQ ID NO:38)；13L11可变轻链(SEQ IDNO:51)，相应的核苷酸序列(SEQ ID NO:53)；13L11可变重链(SEQ ID NO:52)，相应的核苷酸序列(SEQ ID NO:54)。
如上所述分离的分离的抗体的恒定区不用于本发明的抗体的后续构建。本发明的重组抗体的Fc区包括犬IgGB的修饰版本(Bergeron et al.,Vet Immunol Immunopathol2014Jan 15:157(1-2):31-41)，并根据其半衰期、生物物理性质和缺乏效应子功能进行选择。正如Bergeron等人所报道的，犬IgGB对犬FcRn具有良好的亲和力，并且具有适于下游加工的生物物理特性。仅在犬Fc区上进行的差示扫描量热法(DSC)显示恒定区的热稳定性为约70℃和83℃。这些熔化温度与针对销售的人源化mAb所报道的熔化温度相似或比其更高。
对犬IgGB的CH2结构域进行三点突变以消除ADCC和CDC活性。突变的Fc在本文中被称为IgGB(e-)(SEQ ID NO.43)。尽管NGF是一个可溶的靶标，但效应子功能被从抗NGF抗体中消除，以保护其免受任何潜在的非特异性靶标或效应子功能相关的不利影响。这些突变似乎没有影响这种mAb的免疫原性。此外，对Fc区的突变以消除效应子功能不影响FcRn或蛋白A结合。观察到与犬FcγRI和FcγRIII的降低的结合以及ADCC活性的降低。C1q蛋白是补体级联反应中的第一种蛋白，并且是细胞经历补体依赖性细胞毒性(CDC)所必需的。已经证明IgGB(e-)缺乏与C1q蛋白的结合。如上所述，犬恒定HC-65的氨基酸序列被表示为SEQ IDNO:41，并且其相应的核苷酸序列被表示为SEQ ID NO:42。犬恒定λ的氨基酸序列被表示为SEQ ID NO:60，并且其相应的核苷酸序列被表示为SEQ ID NO:61。
示例5：
抗原结合亲和力测定
针对犬NGF的抗体的抗体结合亲和力通过Biacore系统(Biocore Life Sciences(GE Healthcare),Uppsala,Sweden)上的表面等离子体共振(SPR)来确定。使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)化学通过胺偶联5μg/mL的NGF来获得犬和大鼠NGF的固定化。用乙醇胺淬灭芯片，并评估所有候选mAb与固定化的NGF结合的亲和力。在NGF表面上注射不同浓度的犬和猫源化的抗NGF抗体，同时实时地监测抗体与抗原的结合和形成的复合物的解离。进行动力学分析以获得平衡离解常数(KD)。结果在下表1中示出。
表1：犬和大鼠NGF结合动力学总结
抗原
名称
ZTS
ka(M-1s-1)
kd(s-1)
KD(M)
犬NGF
48L2
ZTS-842
7.03E+05±2.72E+05
2.27E-05±5.30E-05
2.17E-11±5.13E-11
犬NGF
9L12
ZTS-841
5.27E+05±1.44E+05
2.36E-05±2.84E-05
5.06E-11±6.73E-11
犬NGF
fel48L2 1.1
ZTS-205
4.26E+05±2.21E+05
8.93E-05±2.14E-04
1.11E-10±2.56E-10
犬NGF
fel48L2 1.2
ZTS-206
4.22E+05±2.10E+05
8.64E-05±2.04E-04
1.13E-10±2.55E-10
犬NGF
fel48L2嵌合体
4.71E+05±1.26E+05
2.64E-06±1.71E-06
6.25E-12±5.40E-12
大鼠NGF
48L2
ZTS-842
5.73E+05±2.65E+05
1.42E-06±1.45E-06
3.25E-12±3.43E-12
大鼠NGF
9L12
ZTS-841
5.87E+05±2.32E+05
4.61E-05±4.69E-05
1.08E-10±1.21E-10
大鼠NGF
fel48L2 1.1
ZTS-205
6.72E+05±3.41E+05
2.9E-04±5.01E-04
2.77E-10±4.77E-10
大鼠NGF
fel48L2 1.2
ZTS-206
6.42E+05±3.13E+05
2.91E-04±4.83E-04
3.09E-10±4.80E-10
大鼠NGF
fel48L2嵌合体
3.87E+05
1.10E-07
2.85E-13
示例6：
9L12(841)和48L2(842)嵌合抗体的构建
抗体可变结构域负责抗原结合。抗体由两个异源二聚体蛋白的同源二聚体配对组成。异源二聚体的每个蛋白质链(一个重链和一个轻链)由可变结构域和恒定结构域组成。每个可变结构域含有三个有助于抗原结合的互补决定区(CDR)。CDR在可变结构域中被框架区分开，该框架区为抗体上结合位点的适当空间展示提供了支架。CDR和框架区一起有助于抗体结合其同源抗原的能力。将全可变结构域接枝到相应的恒定区预计对抗体结合NGF的能力具有很小的影响或没有影响。为了同时确认重链和轻链可变区的正确序列被识别并且为了产生同源材料，设计了表达载体以在哺乳动物表达系统中产生重组嵌合抗体或犬抗体。文本描述的嵌合抗体由来自宿主物种抗体的可变序列(CDR和框架)组成，所述可变序列被接枝到犬IgG分子的相应重恒定区和轻恒定区上。本文所述的嵌合抗体由犬分子的可变片段(CDR和骨架)组成，该可变片段被接枝到猫IgG分子的相应重恒定区和轻恒定区上。由于可变结构域负责抗原结合，所以将全犬可变结构域接枝到猫恒定结构域上预计对抗体结合NGF的能力具有很小的影响或没有影响。嵌合可变结构域序列如下：canfel_chimera9L12(841)可变轻链(SEQ ID NO:9)，相应的核苷酸序列(SEQ ID NO:19)；canfel_chimera9L12(841)可变重链(SEQ ID NO:10)，相应的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)；canfel_chimera48L2(842)可变轻链(SEQ ID NO:29)，相应的核苷酸序列(SEQ ID NO:39)；canfel_chimera48L2(842)重链(SEQ ID NO:30)，相应的核苷酸序列(SEQ ID NO:40)。将每个可变片段克隆到含有猫IgG重链或轻链的哺乳动物表达质粒中。猫重恒定区的氨基酸序列被表示为SEQID NO:62，并且其相应的核苷酸序列被表示为SEQ ID NO:63。猫轻恒定区的氨基酸序列被表示为SEQ ID NO:64，并且其相应的核苷酸序列被表示为SEQ ID NO:65。
示例7：
48L2和9L12抗体的猫源化
抗药物抗体(ADA)的生成可以与任何生物治疗蛋白(包含单克隆抗体)的功效的丧失有关。文献的综合评价已经表明，单克隆抗体的物种形成可以降低mAb具有免疫原性的倾向。为了帮助减轻与本文提供的犬抗NGF单克隆抗体的ADA形成相关的风险，猫源化策略被用于在猫类中最终使用该抗体。这种猫源化策略是基于识别待用于CDR接枝的最合适的猫种系抗体序列。在对所有可用的猫种系序列(重链和轻链)进行广泛分析后，根据种系候选物与犬mAb的同源性来选择该种系候选物，并使用来自犬祖细胞片段的CDR来替代天然猫CDR。表达了猫源化的mAb，并对其结合NGF的能力进行了表征。目的是利用猫抗体框架来保持高亲和力和基于细胞的活性，以最小化体内免疫原性的潜力。制备了代表使用SEQ ID NO21-26的mAb 48L2(ZTS-842)的猫源化的可变重链和轻链和使用SEQ ID NO 1-6的9L12(ZTS-841)的猫源化的可变重链和轻链的合成构建体。在将每个可变链亚克隆到含有猫恒定重链(SEQ ID NO:62)和猫恒定轻链(SEQ ID NO:64)区域的质粒中之后，将质粒共转染以用于在HEK293细胞中的抗体表达。表达了mAb 48L2和9L12的嵌合的、异源嵌合的和猫源化的版本，并对其通过SPR结合NGF的能力进行了表征。
示例8：
从谷氨酰胺合成酶(GS)质粒生产抗体
根据本领域技术人员熟知的标准分子生物学技术，将如本文所述的编码犬和猫源化的9L12和48L2(分别为ZTS-841和ZTS-842)以及猫源化的9L12重链和轻链的基因克隆到GS质粒pEE 6.4和pEE 12.4(Lonza,Basel,Switzerland)中。按照制造商的方案消化所得的单个质粒，并连接在一起以形成单个哺乳动物表达质粒。为了证明每种抗体的瞬时产生，使用每种质粒来转染HEK 293细胞，并在不同大小的培养物中进行表达。按照标准蛋白质纯化方法，使用蛋白质A亲和色谱法从条件HEK培养基中分离蛋白质。将培养基装载到色谱树脂上，并通过pH变化洗脱。洗脱的蛋白质在使用前进行pH调节、透析和无菌过滤。测试抗体的亲和力和效力。
为了生成产生候选抗体的稳定的细胞系，在用限制性酶Pvul转染之前，将GS质粒线性化，该限制性酶在质粒骨架中的单个位点处切割。通过电穿孔用线性化的质粒DNA来转染GS-CHOK1SV(克隆144E12)细胞。在转染后，将细胞置于48孔板(48WP)中，以便产生稳定的池。当池在48WP中为至少50％汇合时，使用ForteBio Octet和蛋白A生物传感器(PallForteBio,Fremont,CA)分析100μl的上清液的IgG表达。最佳表达的克隆被放大到6个孔板(6WP)，并且然后被放大到125mL摇瓶(SF)中。一旦细胞适应在125mL烧瓶中的悬浮培养，每个细胞系池中的2个小瓶被储存用于LN储存。由于制造细胞系必须是克隆的，通过在96孔培养板中限制稀释来亚克隆前3个最高表达池。为了证明克隆性并避免第二轮限制性稀释，使用分子装置克隆选择成像器(CSI)(Molecular Devices LLC,San Jose,CA)对96孔板进行成像，该成像器捕获单个细胞及其随后生长的图像。基于成功的CSI图像、在96WP中的生长和产量来选择克隆。
为了评估细胞培养物生长和生产率，在125ml的SF中的14天补料批次中进一步评估顶部表达池。将细胞接种在平台培养基和饲料中，该培养基和饲料由Life Technologies的CD CHO加上4种氨基酸、专有饲料CDF v6.2和10％葡萄糖组成。在14天补料批次后，离心池，并且在纯化之前通过经由0.20μm聚醚砜(PES)膜过滤上清液来分离CD CHO产生的mAb。
典型的纯化包含将两升的条件培养基(来自CHO细胞培养物，0.2μm过滤的)装载到235mL的MabSelect(GE healthcare,cat#17-5199-02)的柱上。该柱已经用PBS预平衡。样品以>2.5分钟的停留时间装载。在装载后，再次用PBS洗涤柱，并且然后用25mM醋酸钠(pH约中性)洗涤。该柱用25mM乙酸(pH 3.6)洗脱，并且然后用250mM乙酸、250mM氯化钠(pH约2.2)汽提。在洗脱和汽提步骤期间收集馏分(50mL)。在整个过程中监控A280处的UV吸光度。合并峰馏分，通过加入20mM乙酸钠将pH调节至约5.5，并且然后针对三种缓冲液交换进行透析。收集透析液，无菌过滤，并储存在4℃。
示例9：
犬NGF体外生物活性的中和
如示例5中所述，在Biacore系统(Biocore Life Sciences(GE Healthcare),Uppsala,Sweden)上，使用SPR(表面等离子体共振)测量每只犬和猫源化的抗NGF抗体对犬NGF的亲和力。此外，还开发了一种功能性体外测定以测量mAb抑制NGF与TrkA结合的能力的抑制常数。为了确定本发明的抗NGF mAb是否由于抑制NGF与TrkA的结合而阻断了下游细胞信号传导，在测量犬NGF诱导的细胞外信号调节激酶1和2(pERK1/2)的磷酸化的测定中评估了纯化的抗体。在测定中使用的细胞是表达犬TrkA的CHO-K1细胞(Life Technologies)，其在DMEM/F12+GlutaMAXTM-1培养基(Life Technologies)中在37℃在加湿的5％CO2、95％空气培养箱中生长，该培养基补充有10％透析的FBS、20mM HEPES、500μg/ml遗传霉素和1x抗生素-抗真菌药μg/ml(Life Technologies)。对于pERK 1/2测定，将细胞以每孔5.0×104个细胞接种在96孔组织培养板(Costar)中，并在37℃下孵育过夜以允许粘附。然后，在含有氯化钙和氯化镁的HBSS(Life Technologies)中将细胞血清饥饿2小时。在HBSS连续地稀释抗NGF抗体，并在加入到细胞中之前，在室温下用在HBSS/0.1％BSA中稀释的重组犬NGF预孵育1小时。在测定中犬NGF和BSA的最终浓度分别为15ng/ml(EC90)和0.025％。在去除测定混合物并加入100μl的细胞裂解缓冲液(该缓冲液设置有pERK 1/2 Ultra测定试剂盒(PerkinElmer))之前，在37℃下刺激细胞10分钟。然后根据制造商的说明处理细胞裂解物，并在平板读取器(PerkinElmer)上读取平板。该测定中的最大反应被定义为仅在犬NGF(无mAb)存在时测得的ERK 1/2磷酸化。最小反应被定义为ERK 1/2磷酸化的基础水平(无刺激)。抗NGF抗体的计算的抑制值被表示为最小反应和最大反应的百分比。用GraphPad Prism 5绘制所得的百分比抑制数据，用于IC50测定(4参数曲线拟合)。请参考图6-7。
TF-1细胞增殖测定
TF-1细胞(ATCC)在ATCC改良的RPMI 1640培养基(Life Technologies)中常规生长，该培养基补充有10％FBS和2ng/ml重组人GM-CSF(R&D Systems Inc.)。TF-1增殖测定培养基为RPMI 1640，其补充有10％BIT 9500(Stemcell Technologies)和10μg/ml庆大霉素。在96孔微孔板(Costar)中，通过将每孔15,000个细胞与指定浓度的犬和猫源化的抗NGF抗体和2ng/ml重组犬NGF一起孵育，进行TF-1增殖。在65小时培养期后，使用CellTiter-GLO发光测定试剂盒(Promega)来评估抗NGF抗体对犬NGF诱导的细胞增殖的影响。该测定中的最大反应是仅在犬NGF(无抗体)存在下定义的增殖。最小反应被定义为在没有犬NGF的情况下测量的增殖。抗NGF抗体的计算的抑制(NGF中和)值被表示为最小反应和最大反应的百分比。用GraphPad Prism5绘制所得的百分比抑制数据，用于IC50测定(4参数曲线拟合)。请参考图8-9。
示例10：
药代动力学
犬抗NGF mAb 48L2(ZTS-842)和9L12(ZTS-841)的药代动力学。在每隔28天两次皮下(SC)和一次静脉内(IV)施用2.0mg/kg的剂量后对狗进行了研究。IV数据显示半衰期为13.3±3.4天(平均值±标准偏差)，并且清除率较低，为3.9±0.2mL/d/kg。在SC施用后，在给药后1-7天观察到峰值血清浓度。SC绝对生物利用度平均为88％±41％。使用高度敏感的总NGF(游离的+NGF-mAb复合物)测定证实了与NGF的体内结合。在给药48L2(ZTS-842)之前，NGF浓度低于定量下限，即10pg/mL。在48L2(ZTS-842)给药后，所有动物的总NGF浓度增加，在研究的第84天平均为1300±500pg/mL。在整个研究过程中，48L2(ZTS-842)浓度大量过量，在最后一次给药后的第84天和第28天，平均为7.8±1.3μg/mL，这表明即使是更小的剂量也足以在给药后的至少一个月内捕获内源性NGF。虽然没有直接评估免疫原性，但从48L2(ZTS-842)浓度-时间数据来看，没有迹象表明在三次剂量、84天的研究中，在四只狗中诱导了任何抗药物抗体。请参考图11。此外，还使用与上述相同的参数研究了ZTS-841；以20mg/kg SC/SC/IV剂量给药，间隔28天，显示半衰期为11.8+4.1天。SC生物利用度为94％+12％。请参考图10-11。
在每隔28天两次皮下(SC)和一次静脉内(IV)施用1.5mg/kg的剂量后，在3只雄性和3只雌性猫中研究了猫源化的抗NGF mAb fel48L21.1(ZTS-205)的PK。IV数据显示半衰期为10.8±2.5天(平均值±标准偏差)，并且清除率较低，为3.0±1.0mL/d/kg。在SC给药后，在给药后2-7天观察到峰值血清浓度。SC的绝对生物利用度平均为88％±17％。在整个研究中，fel48L21.1(ZTS-205)的浓度都很高，在最后一次给药后的第84天和第28天，平均为7.2±4.0μg/mL，这表明即使是更小的剂量也足以在给药后的至少一个月内捕获内源性NGF。尽管没有直接评估免疫原性，但从ZTS-842浓度-时间数据来看，没有迹象表明在三次剂量、84天的研究中，在六只猫中诱导了任何抗药物抗体。
生物分析测定方法学
基于生物素化的犬NGF在链霉亲和素GyrolabTM圆盘上捕获游离mAb，并在添加AlexaFluorTM标记的鼠抗犬IgG单克隆抗体后进行荧光检测，开发了游离48L2(ZTS-842)配体结合测定。基于生物素化的犬NGF在链霉亲和素GyrolabTM圆盘上捕获游离mAb，并在添加AlexaFluorTM标记的山羊抗猫IgG多克隆抗体后进行荧光检测，开发了游离fel48L21.1(ZTS-205)配体结合测定。
示例11：
犬和猫源化的抗NGF抗体在大鼠MIA模型中的评价
骨关节炎(OA)是一种退行性关节疾病，其特征是关节疼痛和关节软骨的逐渐丧失。关节内注射MIA导致关节软骨的丧失，伴随着软骨下骨损伤的进展，其类似于OA损伤。该模型提供了一种快速和最小侵入性的方法来复制啮齿动物物种中OA样损伤。
在研究第7天和研究第14天的研究期间，通过分别给药单克隆抗体ZTS-841、ZTS-842，证实了在骨关节炎的大鼠MIA模型中在一个剂量的MIA下特化的(例如犬源化的、猫源化的等)抗NGF抗体的镇痛作用。使用持续疼痛的负重测试和使用痛觉测量器(Ugo Basile)的机械痛觉过敏测试的关节压迫(Randall Selitto)测试来评估疼痛。通过对后爪施加压力来进行测试。通过踩下启动马达的踏板，力以恒定的速率以线性比例增加。当显示疼痛时，注意爪子的退缩或发声，立即松开踏板，并按刻度读取伤害感受阈值。400g的临界值用于避免潜在伤害。Randall-Selitto测试在研究第1天(基线)、第20天和第28天进行。对于大鼠MIA程序的示意图，参见图12。
通过施用代谢抑制剂单碘乙酸盐(MIA)来诱导软骨的损失。用异氟醚(在100％O2中为3-5％)麻醉大鼠。一旦动物被完全麻醉，使用装有27G针头的1cc注射器将40mg的MIA/ml盐水的50μL注射液注入到左后脚踝的关节腔内。从异氟烷中取出动物，并且允许其完全康复，并且然后返回其居住笼。
为了评估本发明的抗NGF mAb在这些动物中的效果，使用Incapacitance Tester来评估动物的负重。将动物放入丙烯酸测试箱中，并且当它处于正确的位置时，对力进行评估。在每个时间点进行三次评估。使用以下公式来计算每次评估的负重百分比得分(WBS)：
3个WBS的平均值作为该时间点的WBS获得。在第21天，在诱导MIA之前计算WBS，将MIA以2mg/0.05mL的剂量滴入左膝关节中。在随机分组的第1天测量WBS。在第0天，施用抗NGF mAb或安慰剂，并且然后在第7天、第14天、第21天和第28天评估负重。每周在负重评估当天记录体重。
在给药后第28天，通过心脏末端穿刺来收集血清样品。在通过CO2窒息进行安乐死后，从心脏穿刺处收集全血并置于血清分离管中，在室温下凝固，然后离心(3500rpm，15min)并以每份300μL的两个等分试样转移到96孔板中，如下表所列出的。样品在≤-10℃下冷冻，直到分析。对于如在大鼠MIA测定中测试的ZTS-841和ZTS-842的图形表示，请参考图13-15。
示例12
对跛行的影响：狗滑膜炎模型中犬源化抗体的评估
软组织的炎症过程被公认为骨关节炎的一个重要组分。在滑膜炎疼痛模型中，通过关节内注射细菌脂多糖(LPS)来诱导单个窒息液中滑膜的短暂炎症。在滑膜炎诱导2h内出现可量化的跛行，峰值出现在3-4h，直到6h逐渐消失，并且在24h后完全消失。这种模型通常已经被用于研究疼痛控制的目标。
与生理盐水安慰剂相比，在犬LPS滑膜炎模型中，通过对完整的雄性比格犬一次静脉注射施用5mg/kg剂量的ZTS-841减少了跛行。如从下面的表2中可以看出，ZTS-841在LPS滑膜炎诱导后3小时和小时表现出疗效。
表2和图16表示滑膜炎诱导后三小时和三小时治疗组跛行VAS的最小二乘均值(具有标准误差)。5mg/kg的ZTS-841和安慰剂之间的差异具有统计学意义。
表2
视觉模拟分数(cm)
给药后数小时
示例13
抗体48L2(ZTS-842)和9L12(ZTS-841)的人源化
与所描述的并且本领域技术人员所熟知的猫源化策略相似，从所有可用于来自mAb 48L2和9L12的CDR接枝的人序列中识别出合适的种系抗体序列。可变轻链和可变重链是根据它们各自的犬框架的最高同源性来选择的。天然人片段的CDR被去除，并且用亲本犬CDR代替。重组人源化的48L2和9L12是使用连接到它们各自的犬恒定重IgG链序列的选定的可变区产生的。抗体由HEK细胞产生，如前所述纯化，并且然后评估其与人NGF结合的能力，如下表3所示。构建了代表mAb 48L2(ZTS-842)和9L12(ZTS-841)的人源化可变重链和轻链的合成构建体。合成两组中可变重链和轻链的不同组合，并测定结合(参见下文)。在构建期间，CDR序列没有改变，只有框架序列改变。
通过表面等离子体共振(SPR)来确定针对人NGF(SEQ ID NO.66)的抗体的抗体结合亲和力。通过直接胺偶联将人NGF固定在BIACORE芯片的表面上。将各种浓度的所描述的人源化抗NGF抗体注射到人NGF表面上，同时实时地监测抗体与抗原的结合和形成的复合物的解离。进行动力学分析以获得平衡离解常数(KD)。结果在下面的表3中示出。
表3
示例14：
抗体48L2 9L12(ZTS-841)和48L2(ZTS-842)的互补位扫描诱变
负责抗原识别的抗体的区域代表互补位。通过重链和轻链可变区的互补决定区(CDR)中的氨基酸的组合来产生互补位。抗体与抗原之间的结合通常由CDR残基的侧链和抗原的侧链或碳水化合物部分介导。为了帮助定义抗体识别中涉及的关键侧链，对重链和轻链中的每个CDR残基进行丙氨酸扫描诱变，该技术如由Cunningham and Wells(1989)Science,Vol.244,Issue 4908,pp.1081-1085描述。然后，使用Biacore分别测试这些突变体对NGF的能力。测量对人NGF(下文中的hN)、犬NGF(下文中的cN)和大鼠NGF(下文中的rN)的结合亲和力，并通过与上文实施例5和9中所述相同的方案来生成KD值。然后将这些值与野生型抗体进行比较，并在表格中以野生型结合的百分比表示。在下面的表4和5中呈现的数据被显示为与野生型相比的“百分比相似性分数”。
为了确定丙氨酸扫描突变体mAb对亲本mAb与NGF包被的芯片的结合概况的相对亲和力，使用Biacore T200在100nM下测定。亲本mAb+/-3标准偏差的四个重复样品的平均响应单位用于生成参数，以定义包括结合速率和解离速率抗体结合的响应单位的阈值。然后，落入该阈值内的每个突变体的数据点的百分比被用于定义“相似性分数％”。在表4和5中，分别将用ZTS-841和ZTS-842的每个重链和轻链CDR位置的丙氨酸取代重链和轻链得到的相似性分数显示为“相对于亲本的百分比抑制”。丙氨酸在每个CDR位置的取代的结果。
表4中的序列涉及ZTS-841(9L12)的可变重链和可变轻链CDR氨基酸序列的丙氨酸诱变。表5涉及ZTS-842(48L2)的可变重链和轻链CDR氨基酸序列的丙氨酸取代。突变的氨基酸在表中根据可变重链和可变轻链序列的野生型编号进行描述，如先前所描述的并包含在下文中。氨基酸位置1、25、50、75和100标记如下。在“样品名称”栏中，重的或轻的可变序列用编号的氨基酸位置丙氨酸取代列出。
ZTS-841 VH：SEQ ID NO.8：
E1VQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVAS25GFTFSSHGMHWVRQSPGKGLQWVAV50INSGGSSTYYTDAVKGRFTISRDNA75KNTVYLQMNSLRAEDTAMYYCAKES100VGGWEQLVGPHFDYWGQGTLVIVSS124
ZTS-841 VL：SEQ ID NO. 7：
Q1SVLTQPTSVSGSLGQRVTISCSGS25TNNIGILGASWYQLFPGKAPKLLVY50GNGNRPSGVPDRFSGADSGDSVTLT75ITGLQAEDEADYYCQSFDTTLGAHV100FGGGTHLTVL110
表4
对于表5：
ZTS-842 VH：SEQ ID NO.28
E1VQLVESGGDLVKPGGSLRLSCVAS25GFTFSTYGINWVRQAPGKGLQWVAY50ISSGGSSTYYADPVKGRFTI75SRDDAKNMLYLQMNSLRAEDTAIYYCAGSRY100TYAYGGGYEFHFWGQGTLVTVSS124
ZTS-842 VL：SEQ ID NO. 27
Q1AVLNQPASVSGALGQKVTISCSGS25TMDIDIFGVSWYQQLPGKAPKLLVD50SDGDRPSGIPDRFSGSRSGNSGTLT75ITGLQAEDEADYHCQSGDSTLGALAI100FGGGTHVTVL110
表5
在表4和5中产生的百分比相似性小于50％的值表明了抗体互补位与NGF结合所必需的氨基酸位置。野生型氨基酸在指定位置与丙氨酸的突变导致与NGF的结合减少或完全缺失，这表明结合需要哪些氨基酸，并且哪些氨基酸至少可以用保守氨基酸取代来取代。
序列表
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<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 1
Thr Asn Asn Ile Gly Ile Leu Gly
1 5
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 2
Gly Asn Gly
1
<210> 3
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<212> PRT
<213> 家犬
<400> 3
Gln Ser Phe Asp Thr Thr Leu Gly Ala His Val
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<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 4
Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Gly
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬
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1 5
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<212> PRT
<213> 家犬
<400> 6
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Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 家犬
<400> 7
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Asn Asn Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Gly Ala Ser Trp Tyr Gln Leu Phe Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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<212> PRT
<213> 家犬
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Ala Val Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ala Val
50 55 60
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65 70 75 80
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 家犬
<400> 20
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcgat ctggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgtgg cgagcggctt tacctttagc agccatggca tgcattgggt gcgccagagc 120
ccgggcaaag gcctgcagtg ggtggcggtg attaacagcg gcggcagcag cacctattat 180
accgatgcgg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgcgaaaaa caccgtgtat 240
ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcgatgt attattgcgc gaaagaaagc 300
gtgggcggct gggaacagct ggtgggcccg cattttgatt attggggcca gggcaccctg 360
gtgattgtct cgagc 375
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 21
Thr Met Asp Ile Asp Ile Phe Gly
1 5
<210> 22
<211> 3
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 22
Ser Asp Gly
1
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 23
Gln Ser Gly Asp Ser Thr Leu Gly Ala Leu Ala Ile
1 5 10
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 24
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 25
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr
1 5
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 26
Ala Gly Ser Arg Tyr Thr Tyr Ala Tyr Gly Gly Gly Tyr Glu Phe His
1 5 10 15
Phe
<210> 27
<211> 111
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 27
Gln Ala Val Leu Asn Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Met Asp Ile Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Val Asp Ser Asp Gly Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Asn Ser Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys Gln Ser Gly Asp Ser Thr Leu
85 90 95
Gly Ala Leu Ala Ile Phe Gly Gly Gly Thr His Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 28
<211> 124
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ser Arg Tyr Thr Tyr Ala Tyr Gly Gly Gly Tyr Glu Phe His
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 110
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 29
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Asn Asn Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Gly Ala Ser Trp Tyr Gln Leu Phe Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Val Tyr Gly Asn Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ala Asp Ser Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Thr Thr Leu
85 90 95
Gly Ala His Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 30
<211> 124
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ser Arg Tyr Thr Tyr Ala Tyr Gly Gly Gly Tyr Glu Phe His
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 31
acaatggaca ttgatatatt tggt 24
<210> 32
<211> 9
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 32
agtgatggg 9
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 33
cagtctggtg attccacgct tggtgccctt gctatt 36
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 34
ggattcacct tcagtaccta tggc 24
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 35
attagtagtg gtggaagtag caca 24
<210> 36
<211> 51
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 36
gcgggtagta gatatacata tgcatacgga ggaggatatg agtttcactt c 51
<210> 37
<211> 333
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 37
caggctgtgc tgaatcagcc ggcctcagtg tctggggccc tgggccagaa ggtcaccatc 60
tcctgctctg gaagcacaat ggacattgat atatttggtg tgagctggta ccaacagctc 120
ccaggaaagg cccctaaact cctcgtggac agtgatgggg atcgaccctc agggatccct 180
gacagatttt ctggctccag gtctggcaac tcaggcaccc tgaccatcac tgggctccag 240
gctgaggacg aggctgatta tcactgtcag tctggtgatt ccacgcttgg tgcccttgct 300
attttcggcg gaggcaccca tgtgaccgtc ctt 333
<210> 38
<211> 372
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 38
gaggtacaac tggtggaatc tgggggagac ctggtgaagc ctgggggatc cctgagactc 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt acctatggca tcaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctgcagtg ggtcgcatac attagtagtg gtggaagtag cacatactat 180
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cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccatat attactgtgc gggtagtaga 300
tatacatatg catacggagg aggatatgag tttcacttct ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gc 372
<210> 39
<211> 333
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 39
caggcggtgc tgaaccagcc ggcgagcgtg agcggcgcgc tgggccagaa agtgaccatt 60
agctgcagcg gcagcaccat ggatattgat atttttggcg tgagctggta tcagcagctg 120
ccgggcaaag cgccgaaact gctggtggat agcgatggcg atcgcccgag cggcattccg 180
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atttttggcg gcggcaccca tgtgaccgtg ctg 333
<210> 40
<211> 372
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 40
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcgat ctggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgtgg cgagcggctt tacctttagc acctatggca ttaactgggt gcgccaggcg 120
ccgggcaaag gcctgcagtg ggtggcgtat attagcagcg gcggcagcag cacctattat 180
gcggatccgg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgatg atgcgaaaaa catgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcgattt attattgcgc gggcagccgc 300
tatacctatg cgtatggcgg cggctatgaa tttcattttt ggggccaggg caccctggtg 360
accgtctcga gc 372
<210> 41
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 41
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 42
<211> 1005
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 42
gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60
agcacagtgg ccctggcttg tctggtgtct ggatatttcc ctgagccagt gaccgtgagt 120
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ttcacctgca acgtggccca tcccgccagc aagaccaaag tggacaagcc cgtgcctaaa 300
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agaactcccg aggtgacctg cgtggtggtg gacctggatc cagaggaccc cgaagtgcag 480
atctcctggt tcgtggatgg gaagcagatg cagacagcca aaactcagcc tcgggaggaa 540
cagtttaacg gaacctatag agtggtgtct gtgctgccaa ttggacacca ggactggctg 600
aagggcaaac agtttacatg caaggtgaac aacaaggccc tgcctagtcc aatcgagagg 660
actatttcaa aagctagggg acaggctcat cagccttccg tgtatgtgct gcctccatcc 720
cgggaggaac tgtctaagaa cacagtgagt ctgacttgtc tgatcaaaga tttctttccc 780
cctgacattg atgtggagtg gcagagcaat gggcagcagg agccagaatc caagtacaga 840
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cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005
<210> 43
<211> 335
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 43
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
145 150 155 160
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
195 200 205
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 44
<211> 1005
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 44
gcctcaacaa ctgctcctag cgtgtttccc ctggccccta gctgcggaag tacctcaggc 60
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cacaatcatt acacacaaga aagtctgtca catagccccg gcaag 1005
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 45
Asn Ile Gly Ser Lys Asp
1 5
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 46
Ser Asp Ser
1
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 47
Gln Val Trp Asp Ile Ser Ala Asp Ala Ile Val
1 5 10
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 48
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 49
Ile Asp Pro Gly Asn Gly Ala Thr
1 5
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 50
Ala Pro Leu Gly Tyr Val Pro Ala Ser Thr Ser Glu Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 51
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Thr Val Thr Leu Arg Gln
1 5 10 15
Thr Ala His Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Ser Lys Asp Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Ser Asp Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Leu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Ser Ala Asp Ala
85 90 95
Ile Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Ala Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Ala Gly Leu Asn Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Gly Asn Gly Ala Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Leu Gly Tyr Val Pro Ala Ser Thr Ser Glu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 324
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 53
tcctatgtgc tgacccagcc accatcagtg actgtgaccc tgaggcagac ggcccacatc 60
acctgtgggg gagacaacat tggaagtaaa gatgtttatt ggtaccagca gaagccgggc 120
caggcccccg tgttgattat ctatagtgat agcaagaggc cgacagggat ccctgagcga 180
ttctccggct ccaactcggg gaacatggcc accctgacca tcagtggggc cttggcggag 240
gatgaggctg actattactg ccaggtatgg gacatcagtg ctgatgctat tgtgttcggc 300
ggaggcaccc atctgaccgt cctt 324
<210> 54
<211> 360
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 54
gaggtccagc tggtgcagtc tgcagctgag gttaagaagc caggggcatc tgtaaaggtc 60
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<210> 55
<211> 111
<212> PRT
<213> 家猫
<400> 55
Gln Ala Val Leu Asn Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Met Asp Ile Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Met Ala Pro Lys Thr Ile
35 40 45
Ile Asp Ser Asp Gly Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ser Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Asp Ser Thr Leu
85 90 95
Gly Ala Leu Ala Ile Phe Gly Gly Gly Thr His Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 56
<211> 124
<212> PRT
<213> 家猫
<400> 56
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Gly Ser Arg Tyr Thr Tyr Ala Tyr Gly Gly Gly Tyr Glu Phe His
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 333
<212> DNA
<213> 家猫
<400> 57
caggcggtgc tgaaccagcc gagcagcgtg agcggcgcgc tgggccagcg cgtgaccatt 60
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atttttggcg gcggcaccca tgtgaccgtg ctg 333
<210> 58
<211> 372
<212> DNA
<213> 家猫
<400> 58
gaggtacaac tggtggaatc tgggggagac ctggtgaagc ctgggggatc cctgagactc 60
tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt acctatggca tcaactgggt ccgccaggct 120
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gcagatcctg tgaagggccg gttcaccatc tccagagacg acgccaagaa catgctgtat 240
cttcagatga acagcctgag agccgaggac acggccatat attactgtgc gggtagtaga 300
tatacatatg catacggagg aggatatgag tttcacttct ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gc 372
<210> 59
<211> 201
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 59
Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala
1 5 10 15
Gly Ala Ile Ala Ala Arg Val Thr Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val
20 25 30
Asp Pro Lys Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu
35 40 45
Phe Ser Thr His Pro Pro Pro Val Ala Ala Asp Ala Gln Asp Leu Asp
50 55 60
Leu Glu Ala Gly Ser Thr Ala Ser Val Asn Arg Thr His Arg Ser Lys
65 70 75 80
Arg Ser Ser Pro His Pro Val Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys
85 90 95
Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile
100 105 110
Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser
115 120 125
Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Thr Pro
130 135 140
Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr
145 150 155 160
Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys
165 170 175
Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val
180 185 190
Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Arg Ala
195 200
<210> 60
<211> 106
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 60
Gly Gln Pro Lys Ala Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Lys Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Ser Ser Phe Ser Cys Leu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Lys Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
<210> 61
<211> 318
<212> DNA
<213> 家犬
<400> 61
ggacaaccga aggcctcccc ctcggtcaca ctcttcccgc cctcctctga ggagctcggc 60
gccaacaagg ccaccctggt gtgcctcatc agcgacttct accccagcgg cgtgacggtg 120
gcctggaagg cagacggcag ccccgtcacc cagggcgtgg agaccaccaa gccctccaag 180
cagagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcctga caagtggaaa 240
tctcacagca gcttcagctg cctggtcacg cacgagggga gcaccgtgga gaagaaggtg 300
gcccccgcag agtgctct 318
<210> 62
<211> 335
<212> PRT
<213> 家猫
<400> 62
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly
1 5 10 15
Thr Thr Ser Gly Ala Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Leu Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ala Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Leu Ser Asp Thr
65 70 75 80
Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Arg Lys Thr Asp His Pro Pro Gly Pro Lys Pro Cys Asp Cys
100 105 110
Pro Lys Cys Pro Pro Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Ile Phe Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Gly Pro Asp Asp Ser Asp Val Gln
145 150 155 160
Ile Thr Trp Phe Val Asp Asn Thr Gln Val Tyr Thr Ala Lys Thr Ser
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
195 200 205
Val Asn Ser Lys Ser Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Lys Gly Gln Pro His Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ala
225 230 235 240
Gln Glu Glu Leu Ser Arg Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Lys
245 250 255
Ser Phe His Pro Pro Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ile Thr Gly Gln
260 265 270
Pro Glu Pro Glu Asn Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser
275 280 285
Asp Gly Thr Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Ser His
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Trp Gln Arg Gly Asn Thr Tyr Thr Cys Ser Val Ser His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Ser His His Thr Gln Lys Ser Leu Thr Gln Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 63
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<212> DNA
<213> 家猫
<400> 63
gcctccacca cggccccatc ggtgttccca ctggccccca gctgcgggac cacatctggc 60
gccaccgtgg ccctggcctg cctggtgtta ggctacttcc ctgagccggt gaccgtgtcc 120
tggaactccg gcgccctgac cagcggtgtg cacaccttcc cggccgtcct gcaggcctcg 180
gggctgtact ctctcagcag catggtgaca gtgccctcca gcaggtggct cagtgacacc 240
ttcacctgca acgtggccca cccgcccagc aacaccaagg tggacaagac cgtgcgcaaa 300
acagaccacc caccgggacc caaaccctgc gactgtccca aatgcccacc ccctgagatg 360
cttggaggac cgtccatctt catcttcccc ccaaaaccca aggacaccct ctcgatttcc 420
cggacgcccg aggtcacatg cttggtggtg gacttgggcc cagatgactc cgatgtccag 480
atcacatggt ttgtggataa cacccaggtg tacacagcca agacgagtcc gcgtgaggag 540
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aaggggaagg agttcaagtg caaggtcaac agcaaatccc tcccctcccc catcgagagg 660
accatctcca aggccaaagg acagccccac gagccccagg tgtacgtcct gcctccagcc 720
caggaggagc tcagcaggaa caaagtcagt gtgacctgcc tgatcaaatc cttccacccg 780
cctgacattg ccgtcgagtg ggagatcacc ggacagccgg agccagagaa caactaccgg 840
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gacaggtccc actggcagag gggaaacacc tacacctgct cggtgtcaca cgaagctctg 960
cacagccacc acacacagaa atccctcacc cagtctccgg gtaaa 1005
<210> 64
<211> 106
<212> PRT
<213> 家猫
<400> 64
Gly Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Asn
1 5 10 15
Glu Glu Leu Ser Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Ser Gly Leu Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Thr Pro
35 40 45
Ile Thr Gln Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Ser Pro Asn Glu Trp Lys
65 70 75 80
Ser Arg Ser Arg Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Asn Val Val Pro Ala Glu Cys Ser
100 105
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<211> 318
<212> DNA
<213> 家猫
<400> 65
ggccagccca agagcgctcc ctccgtgacc ctgttccccc caagcaacga ggaactgagc 60
gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc agcgacttct accccagcgg cctgaccgtg 120
gcctggaagg ccgatggcac ccctatcacc cagggcgtgg aaaccaccaa gcccagcaag 180
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tcccggtccc ggttcacatg ccaggtgaca cacgagggca gcaccgtgga aaagaacgtg 300
gtgcccgccg agtgcagc 318
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<211> 240
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile
1 5 10 15
Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile
20 25 30
Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu
35 40 45
Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala
50 55 60
Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe
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His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly
130 135 140
Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu
145 150 155 160
Gly Glu Val Ser Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu
165 170 175
Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile
180 185 190
Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys
195 200 205
Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile
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Asp Thr Ala Cys Met Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala
225 230 235 240
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<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Val Gly Gly Trp Glu Gln Leu Val Gly Pro His Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser
115 120 125
<210> 68
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 68
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<210> 69
<211> 125
<212> PRT
<213> 智人
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Asn Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Val Gly Gly Trp Glu Gln Leu Val Gly Pro His Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ser
115 120 125
<210> 70
<211> 375
<212> DNA
<213> 智人
<400> 70
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc gtggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc agccatggca tgcattgggt gcgccaggcg 120
ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcgtg attaacagcg gcggcagcag cacctattat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acagcaaaaa caccctgtat 240
ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gaaagaaagc 300
gtgggcggct gggaacagct ggtgggcccg cattttgatt attggggcca gggcaccctg 360
gtgattgtct cgagc 375
<210> 71
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Thr Asn Asn Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Asn Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
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Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Thr Thr Leu
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Gly Ala His Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 72
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人
<400> 72
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agctgcaccg gcagcaccaa caacattggc attctgggcg tgcattggta tcagcagctg 120
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<210> 73
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 73
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Thr Asn Asn Ile Gly Ile Leu
20 25 30
Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Asn Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ala Asp Ser Gly Asp Ser Val Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Thr Thr Leu
85 90 95
Gly Ala His Val Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 74
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人
<400> 74
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<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Gly Ser Arg Tyr Thr Tyr Ala Tyr Gly Gly Gly Tyr Glu Phe His
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 76
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 76
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg 60
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Val
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Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Gly Ser Arg Tyr Thr Tyr Ala Tyr Gly Gly Gly Tyr Glu Phe His
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Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 78
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc acctatggca tgaactgggt gcgccaggcg 120
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<210> 79
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<213> 智人
<400> 79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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Ala Gly Ser Arg Tyr Thr Tyr Ala Tyr Gly Gly Gly Tyr Glu Phe His
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Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 80
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg 60
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<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 82
gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc acctatggca ttaactgggt gcgccaggcg 120
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gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgcgaaaaa cagcctgtat 240
ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gggcagccgc 300
tatacctatg cgtatggcgg cggctatgaa tttcattttt ggggccaggg caccctggtg 360
attgtctcga gc 372
<210> 83
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 83
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Met Asp Ile Asp Ile Phe
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Gly Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys Gln Ser Gly Asp Ser Thr Leu
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Gly Ala Leu Ala Ile Phe Gly Gly Gly Thr His Val Thr Val
100 105 110
<210> 84
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人
<400> 84
cagagcgtgc tgacccagcc ggcgagcgcg agcggcaccc cgggccagcg cgtgaccatt 60
agctgcagcg gcagcaccat ggatattgat atttttggcg tgaactggta tcagcagctg 120
ccgggcaccg cgccgaaact gctgatttat agcgatggcg atcgcccgag cggcgtgccg 180
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agcgaagatg aagcggatta tcattgccag agcggcgata gcaccctggg cgcgctggcg 300
atttttggcg gcggcaccca tgtgaccgtg ctg 333
<210> 85
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人
<400> 85
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Leu Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Met Asp Ile Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asp Gly Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys Gln Ser Gly Asp Ser Thr Leu
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Gly Ala Leu Ala Ile Phe Gly Gly Gly Thr His Val Thr Val Leu
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
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<213> 家犬
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<213> 家犬
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