7,8-二羟基黄酮衍生物的纯化方法
阅读说明：本技术 7,8-二羟基黄酮衍生物的纯化方法 (Purification method of 7,8-dihydroxyflavone derivative ) 是由 章志宏 陈建丽 于 2019-04-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种7,8-二羟基黄酮衍生物的纯化方法。其包括以下步骤：将如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的溶液滴加至有机溶剂中,或将所述有机溶剂滴加至如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的溶液滴中,得混合物,重结晶即可；溶液采用的溶剂包括DMSO、DMF和DMA中的一种或多种；有机溶剂包括C<Sub>3～6</Sub>酯溶剂、C<Sub>1～5</Sub>醇溶剂、C<Sub>3～6</Sub>酮溶剂和C<Sub>4～10</Sub>醚溶剂中的一种或多种。纯化后的7,8-二羟基黄酮衍生物纯度较高,稳定性较好。例如可制得7,8-二羟基黄酮衍生物晶型A,其不仅纯度较高,而且在水中具有较好的溶解度、高湿条件下具有较好的稳定性以及具有极低的吸湿性。<Image he="471" wi="602" file="DDA0002028168350000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention discloses a purification method of a 7,8-dihydroxyflavone derivative. Which comprises the following steps: dripping the solution of the 7,8-dihydroxyflavone derivative shown in the formula I into an organic solvent, or dripping the organic solvent into the solution of the 7,8-dihydroxyflavone derivative shown in the formula I to obtain a mixture, and recrystallizing; the solvent adopted by the solution comprises one or more of DMSO, DMF and DMA; the organic solvent comprises C 3～6 Ester solvent, C 1～5 Alcohol solvent, C 3～6 Ketone solvent and C 4～10 One or more of ether solvents. The purified 7,8-dihydroxy flavone derivative has high purity and good stability. For example, the crystal form A of the 7,8-dihydroxyflavone derivative can be prepared, and the crystal form A not only has higher purity, but also has better solubility in water, better stability under high-humidity conditions and extremely low hygroscopicity.)
技术领域
本发明涉及一种7,8-二羟基黄酮衍生物的纯化方法。
背景技术
7,8-二羟基黄酮(7,8-Dihydroxyflavon，简称7,8-DHF)是酪氨酸激酶B(TrkB)受体的特异性激动剂，能够激活TrkB受体。体内外的试验证明，7,8-DHF对神经退行性疾病帕金森症、阿尔茨海默病、抑郁症、精神病学障碍、创伤后应激障碍、自闭症谱系障碍、中风、瑞特综合征等有疗效，起到重要的生物学作用。但是，7,8-DHF在体内很容易被代谢成二相代谢物排除体内，体内半衰期比较短，生物利用度较低，成药性较差。
中国专利申请CN201380062367.X公开了将7,8-DHF进行修饰得到7,8-二羟基黄酮衍生物，结构式为
发明内容
本发明提供一种7,8-二羟基黄酮衍生物的纯化方法。本发明纯化后的7,8-二羟基黄酮衍生物纯度较高，稳定性较好。例如本发明纯化方法可制得7,8-二羟基黄酮衍生物晶型A，其不仅纯度较高，而且在水中具有较好的溶解度、高湿条件下具有较好的稳定性以及具有极低的吸湿性。7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A对药物的优化和开发具有重要的价值。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的纯化方法，其包括以下步骤：
将如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的溶液滴加至有机溶剂中，或将所述有机溶剂滴加至如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的溶液滴中，得混合物，将所述混合物重结晶即可；
其中，所述溶液采用的溶剂包括二甲基亚砜DMSO、二甲基甲酰胺DMF和二甲基乙酰胺DMA中的一种或多种；所述有机溶剂包括C3～6酯类溶剂、C1～5醇类溶剂、C3～6酮类溶剂和C4～10醚类溶剂中的一种或多种；
本发明中，如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的溶液中，所述溶液中的溶剂和如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的体积质量比可为本领域常规，优选1～30mL/g，更优选3～15，例如4mL/g、5mL/g、6mL/g、7mL/g、8mL/g或10mL/g。
本发明中，所述有机溶剂的用量可为本领域重结晶操作中常规的用量，优选所述有机溶剂与所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的体积质量比优选为(2～50)mL/g，更优选(10～45)mL/g，例如15mL/g、20mL/g、26mL/g、30mL/g、32mL/g、35mL/g、37mL/g或42mL/g。
本发明中，所述C3～6酯类溶剂可为本领域重结晶操作中的常规碳原子数目为3～6个的酯溶剂，优选乙酸异丙酯、乙酸乙酯和乙酸丙酯中的一种或多种。所述酯类一般是指酸(羧酸或无机含氧酸)与醇起反应生成的一类有机化合物。低分子量酯是无色、易挥发的芳香液体。
本发明中，所述C1～5醇类溶剂一般是指含有碳原子数目为1～5个醇溶剂，可为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇中的一种或多种，优选甲醇或乙醇。
本发明中，所述C3～6酮类溶剂一般是指含有碳原子数目为3～6个的酮溶剂，优选为C3～4酮类溶剂，例如丙酮。
本发明中，所述C4～10醚类溶剂可为本领域重结晶操作中的含有碳原子数目为4～10个的醚溶剂，优选C5～6醚类溶剂。所述C4～10醚类溶剂可为***、异丙醚、甲基叔丁醚和正戊醚中的一种或多种，优选异丙醚和/或甲基叔丁醚。
本发明中，所述重结晶的操作可为本领域中重结晶的常规操作，优选将所述混合物中，如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物形成饱和溶液，冷却，析晶。
本发明中，所述饱和溶液的温度一般为室温，例如为15～40℃，优选15～30℃，例如20℃。
本发明中，所述冷却的操作步骤前，一般将所述混合物搅拌0.5～2h，例如1h。
本发明中，所述冷却进行析晶的过程中，一般搅拌12～24h，以保证晶体充分析出。
本发明中，所述冷却后的温度可为本领域常规，一般为(-20℃)-10℃，例如-10℃、-5℃或者0℃。
本发明中，所述重结晶结束后，其还可包括以下操作步骤：将重结晶过程中得到的产品进行分离、洗涤产物和干燥。
其中，所述分离的方式可采用本领域中的常规分离的方式进行，优选离心或过滤。所述洗涤的方式可采用本领域中的常规洗涤的方式进行，一般用所述有机溶剂洗涤2～4次，例如3次。所述有机溶剂的种类如前所述。所述的干燥可采用本领域中的常规操作方法进行，例如常压干燥或减压干燥，例如50℃真空干燥20h。
本发明中，优选，当所述有机溶剂为C3～6酯类溶剂，所述C3～6酯类溶剂为乙酸异丙酯、乙酸乙酯和乙酸丙酯中的一种或多种时，经所述纯化方法制得如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物晶型A。
本发明中，优选，当所述有机溶剂为C1～5醇类溶剂和/或C3～6酮类溶剂时，经所述纯化方法制得如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物晶型A。
本发明中，优选，当所述有机溶剂为C4～10醚类溶剂，所述C4～10醚类溶剂为***、异丙醚、甲基叔丁醚和正戊醚中的一种或多种时，经所述纯化方法制得如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物晶型A。
如前所述晶型A以2θ角度表示的X-射线粉末衍射，在6.710±0.2°、8.821±0.2°、10.203±0.2°、13.537±0.2°、14.267±0.2°、16.814±0.2°、18.511±0.2°、20.424±0.2°、22.910±0.2°、23.542,24.590，25.631±0.2°、26.857±0.2°、27.351±0.2°、28.830±0.2°、31.064±0.2°和31.854±0.2°处有特征衍射峰。
进一步优选，所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A以2θ角度表示的X-射线粉末衍射，在6.710±0.2°、8.821±0.2°、10.203±0.2°、13.537±0.2°、14.267±0.2°、16.814±0.2°、18.511±0.2°、20.424±0.2°、22.910±0.2°、23.542±0.2°、24.590±0.2°、25.631±0.2°、26.857±0.2°、27.351±0.2°、28.830±0.2°、31.064±0.2°、31.854±0.2°、33.229±0.2°和35.260±0.2°处有特征峰。
更进一步优选，所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A以2θ角度表示的X-射线粉末衍射，在6.710±0.2°、8.821±0.2°、10.203±0.2°、13.537±0.2°、14.267±0.2°、16.814±0.2°、18.511±0.2°、20.424±0.2°、22.910±0.2°、23.542±0.2°、24.590±0.2°、25.631±0.2°、26.857±0.2°、27.351±0.2°、28.830±0.2°、31.064±0.2°、31.854±0.2°、33.229±0.2°、35.260±0.2°、36.131±0.2°和37.594±0.2°处有特征峰。
再进一步优选，所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A以2θ角度表示的X-射线粉末衍射，在6.710±0.2°、8.821±0.2°、10.203±0.2°、13.537±0.2°、14.267±0.2°、16.814±0.2°、18.511±0.2°、20.424±0.2°、22.910±0.2°、23.542±0.2°、24.590±0.2°、25.631±0.2°、26.857±0.2°、27.351±0.2°、28.830±0.2°、31.064±0.2°、31.854±0.2°、33.229±0.2°、35.260±0.2°、36.131±0.2°、37.594±0.2°、38.678±0.2°和39.470±0.2°处有特征峰。
再更进一步优选，所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的X-射线粉末衍射图还基本如图1所示。
所述X-射线粉末衍射均使用Cu靶的Kα谱线测得。
作为优选，所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的热重分析图谱(TGA)中，在100±3℃处失重的质量占失重前的质量的0.07092％，所述“％”为质量百分比。
作为优选，所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A为无溶剂化物。
作为优选，所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的热重分析图还基本上如图2所示。
作为优选，所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的差示扫描热图谱(DSC)中，在193.99±10℃处有吸收峰，其熔化热为223.9J/g，和，在221.1±10℃处有吸收峰，其熔化热为320.9J/g。
作为优选，所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的差示扫描热图谱还基本如图3所示。
作为优选，所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的动态水分吸附图谱(DVS)中，在0％～90％相对湿度范围内增重小于0.2％，例如0.1％，所述“％”为所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A增加的质量占初始质量的质量百分比。
作为优选，所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的动态水分吸附图谱还基本如图4所示。
如前所述的制备方法制得的如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A可在制备用于防治和/或治疗与酪氨酸激酶B(TrkB)受体有关的疾病的药物中的应用。
在本领域技术人员均知，X-射线粉末衍射的峰强度和/或峰情况可能会因为实验条件不同而不同。同时由于仪器不同的精确度，测得的2θ值会有约±0.2度的误差。而峰的相对强度值比峰的位置更依赖于所测定样品的某些性质，如晶体的尺寸大小，纯度高低，因此测得的峰强度可能出现约±20％的偏差。尽管存在试验误差、仪器误差和取向优先等，本领域技术人员还是可以从本专利提供的X射线粉末衍射数据获得足够的鉴别各个晶型的信息。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明纯化后的7,8-二羟基黄酮衍生物纯度较高，可达98.9％以上，稳定性较好。
本发明纯化方法可制得7,8-二羟基黄酮衍生物晶型A，其不仅纯度较高，而且在水中具有较好的溶解度、高湿条件下具有较好的稳定性以及具有极低的吸湿性。7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A对药物的优化和开发具有重要的价值。
附图说明
图1为实施例1得到如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的X-射线粉末衍射图。
图2为实施例1得到如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的热重分析图。
图3为实施例1得到如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的差示扫描热图。
图4为实施例1得到如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的动态水分吸附图。
图5为对比例1得到如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的X-射线粉末衍射图。
图6为效果实施例2中如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A在不同高湿条件下放置七天后的X-射线粉末衍射图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
测试方法
X-射线粉末衍射
仪器：Bruker，D8 advance
测试方法：光源为CuK，X-射线强度为40KV/40mA，扫描模式为Theta-theta，扫描角度范围4°～40°，样品盘转速15rpm，扫描速度为10deg/min。
热失重分析
仪器：TA，Q5000IR。
测试方法：以10℃/min的升温速率从25℃加热至300℃。
差示扫描量热分析(DSC)
仪器：TA，Q2000。
测试方法：样品在25℃平衡，然后以10℃/min的升温速率从25℃加热至300℃。
动态水分吸附分析(DVS)
仪器：SMS，DVS Advantage-1。
测试条件：将10～15mg样品用于DVS检测；平衡dm/dt：0.01％/min：(时间：10min最大180min)；干燥：0％RH，120minRH(％)；测量梯度：10％RH(％)；测量梯度范围：0％～90％～0％。判断标准如表1所示：
表1
引湿性分类
引湿增重
潮解
吸收足量水分形成液体
极具引湿性
引湿增重不小于15％
有引湿性
引湿增重小于15％但不小于2％
略有引湿性
引湿增重小于2％但不小于0.2％
无或几乎无引湿性
引湿增重小于0.2％
实施例和对比例中提及的纯度均采用液相方法测得，具体测试方法如下：
仪器：Agilent 1260
柱子：Waters Xbridge C18,4.6um*150mm,3.5um
波长：220nm
流速：1.0mL/min
流动相A：0.05％TFA in water(v/v)，流动相B：0.05％TFA in ACN(v/v)
洗脱梯度如表2所示。
表2
时间(时间)
A％
B％
0
90
10
20.00
50
50
25.00
5
95
30.00
5
95
30.10
90
10
38.00
90
10
效果实施例中提及的水分含量的测定仪器是梅特勒-托利多水分仪ET08,按照中国药典2015版记载方法测定；DMSO测定方法：参照中国药典2015版记载方法测定。
实施例1
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为97.9％。
将上述式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物进行纯化，纯化方法如下：
将136.7g上述化合物I加入到1000mL圆底烧瓶中，加入540mL DMSO搅拌直至溶清，将溶液滴加至5L的乙酸异丙酯中，室温下搅拌1h，在0℃搅拌12h，过滤，所得滤饼用乙酸异丙酯洗涤3次后，50℃下真空干燥20h，得106.5g化合物I，收率77.9％，纯度为99.47％。
经XRPD检测，上述纯化后的式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物为晶型A，其以2θ角表示的X-射线粉末衍射图，在6.710±0.2°、8.821±0.2°、10.203±0.2°、13.537±0.2°、16.814±0.2°、18.511±0.2°、20.424±0.2°、22.910±0.2°、25.631±0.2°、26.857±0.2°、31.064±0.2°、33.229±0.2°、35.260±0.2°、36.131±0.2°、37.594±0.2°、38.678±0.2°和39.470±0.2°处有特征衍射峰，其XRPD图谱如图1所示。
经TGA检测，其为100±3℃处失重的重量占失重前的重量的0.45％，其为无溶剂化物，此处的失重为吸附在晶型表面的溶剂的重量，其TGA图谱如图2所示。
经DSC检测，其在183.4±10℃处有吸收峰，熔化热为211.7J/g，和，202.9±10℃处有吸收峰，熔化热为202.9J/g，其DSC图谱如图3所示。
所述如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的动态水分吸附图(DVS)中，在0％～90％相对湿度范围内增重0.1％，其DVS图谱如图4所示。
实施例2
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为97.9％。
将上述式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物进行纯化，纯化方法如下：
将570g上述化合物I，加入2.3L的DMSO，搅拌直至溶清，将24L的乙酸异丙酯缓慢滴加至前述所得溶液中，室温下搅拌1h，在0℃搅拌12h，过滤，所得滤饼用乙酸异丙酯洗涤3次后，50℃下真空干燥20h，得399g化合物I，收率70％，纯度为99.08％。
上述纯化后的式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物为晶型A，其鉴定数据同实施例1。
实施例3
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为84％。
将10g化合物I加入到1000mL圆底烧瓶中，加入50mL DMSO搅拌直至溶清，将溶液滴加至300mL的乙酸异丙酯中，室温下搅拌1h，在0℃搅拌12h，过滤，所得滤饼用乙酸异丙酯洗涤3次后，50℃下真空干燥20h，得7.9g化合物I，收率79％，HPLC纯度为99.42％。
实施例4
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为93％。
将10g化合物I，加入40mL的DMSO，搅拌直至溶清，将所得溶液缓慢滴加至200mL的乙酸异丙酯中，室温下搅拌1h，在0℃搅拌12h，过滤，所得滤饼用乙酸异丙酯洗涤3次后，50℃下真空干燥20h，得6.2g化合物I，收率62％，纯度为99.45％。
上述纯化后的式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物为晶型A，其鉴定数据同实施例1。
实施例5
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为93％。
将10g化合物I，加入30mL的DMF，搅拌直至溶清，将所得溶液缓慢滴加至150mL的乙酸乙酯中，室温下搅拌1h，在-5℃搅拌12h，过滤，所得滤饼用乙酸乙酯洗涤3次后，50℃下真空干燥20h，得7.1g化合物I，收率71％，纯度为99.62％。
上述纯化后的式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物为晶型A，其鉴定数据同实施例1。
实施例6
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为96％。
将10g化合物I，加入100mL的DMF，搅拌直至溶清，将所得溶液缓慢滴加至600mL的甲基叔丁基醚中，室温下搅拌1h，在-10℃搅拌12h，过滤，所得滤饼用甲基叔丁基醚洗涤3次后，50℃下真空干燥20h，得6.9g化合物I，收率69％，纯度为99.37％。
上述纯化后的式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物为晶型A，其鉴定数据同实施例1。
实施例7
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为96％。
将10g化合物I，加入80mL的DMA，搅拌直至溶清，将所得溶液缓慢滴加至320mL的丙酮中，室温下搅拌1h，在-10℃搅拌12h，过滤，所得滤饼用丙酮洗涤3次后，50℃下真空干燥20h，得7.5g化合物I，收率75％，纯度为99.71％。
上述纯化后的式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物为晶型A，其鉴定数据同实施例1。
实施例8
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为96％。
将10g化合物I，加入70mL的DMF，搅拌直至溶清，将所得溶液缓慢滴加至350mL的乙酸异丙酯中，室温下搅拌1h，在-10℃搅拌12h，过滤，所得滤饼用乙酸异丙酯洗涤3次后，50℃下真空干燥20h，得6.7g化合物I，收率67％，纯度为99.62％。
上述纯化后的式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物为晶型A，其鉴定数据同实施例1。
实施例9
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为92％。
将10g化合物I，加入60mL的DMF，搅拌直至溶清，将所得溶液缓慢滴加至300mL的乙醇中，室温下搅拌1h，在-10℃搅拌12h，过滤，所得滤饼用乙酸异丙酯洗涤3次后，50℃下真空干燥20h，得7.8g化合物I，收率78％，纯度为98.93％。
上述纯化后的式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物为晶型A，其鉴定数据同实施例1。
实施例10
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为92％。
将10g化合物I，加入50mL的DMSO，搅拌直至溶清，将所得溶液缓慢滴加至260mL的乙醇中，室温下搅拌1h，在-10℃搅拌12h，过滤，所得滤饼用乙酸异丙酯洗涤3次后，50℃下真空干燥20h，得8.6g化合物I，收率86％，纯度为98.93％。
上述纯化后的式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物为晶型A，其鉴定数据同实施例1。
对比例1
如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型D的制备
参照专利CN201380062367.X中4-氧代-2苯基-4H-色烯-7,8-二基双(二甲基氨基甲酸酯)化合物R7的制备，将原料中二甲基氨基甲酰氯替换为甲基氨基甲酰氯，得到如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物。
经XRPD检测，其以2θ角表示的X-射线粉末衍射图，在6.745±0.2°、7.896±0.2°、8.212±0.2°、8.839±0.2°、9.433±0.2°、10.201±0.2°、10.890±0.2°、13.300±0.2°、13.500±0.2°、14.432±0.2°、15.961±0.2°、16.814±0.2°、17.742±0.2°、18.472±0.2°、19.224±0.2°、19.692±0.2°、20.484±0.2°、21.078±0.2°、22.319±0.2°、22.873±0.2°、23.542±0.2°、24.545±0.2°、25.613±0.2°、26.146±0.2°、26.760±0.2°、28.653±0.2°、30.654±0.2°和31.061±0.2°处有特征衍射峰；其XRPD图谱如图5所示。
对比例2
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为97.9％。
10g化合物I加入到250mL圆底烧瓶中，加入20mL DMSO搅拌直至溶清，0℃搅拌12h，过滤，50℃下真空干燥20h，得4.7g化合物I，HPLC纯度98％。
对比例3
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为97.9％。
10g化合物I加入到250mL圆底烧瓶中，加入20mL NMP中搅拌直至溶清，滴加到30mL乙酸异丙酯中，室温下搅拌1h，0℃搅拌12h，过滤，50℃下真空干燥20h，得7.6g化合物I，HPLC纯度95％。
对比例4
按照对比例1的方法制备如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物，其HPLC纯度为97.9％。
将10g化合物I加入到250mL圆底烧瓶中，加入30mL DMSO搅拌直至溶清，将溶液倾倒至300mL的乙酸异丙酯中，室温下搅拌1h，在0℃搅拌12h，过滤，所得滤饼用乙酸异丙酯洗涤3次后，50℃下真空干燥20h，得8g化合物I，收率80％，纯度为98.2％。
效果实施例1
实施例1和实施例2如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A在水中的溶解度
分别称取实施例1或实施例2中如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物晶型A50mg，加入1mL蒸馏水，超声5min，过滤，进行HPLLC，按照外标法计算溶解度。对比例1中如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物晶型D的测试方法如前实施例1。具体结果如表3：
表3
测试项目
对比例1
实施例1
溶解度/mg/mL
2.5×10<sup>-3</sup>
3.6×10<sup>-3</sup>
溶解度结果表明，室温时，在水中，如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A溶解度为3.6×10-3mg/mL；如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型D溶解度为2.5×10- 3mg/mL。如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的溶解度是如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型D的1.44倍。
效果实施例2
实施例1如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A在高湿条件下的稳定性
将适量的如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的样品置于培养皿上，分别于高湿25℃/60％RH和40℃/75％RH的条件下敞开放置。于7天、取样试验进行X-射线粉末衍射表征，具体结果图6。
由图6的X-射线粉末衍射图谱可知，将如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A分别在25℃/60％RH和40℃/75％RH放置7天，该晶型无转晶现象产生，几乎没有发生任何变化，其在高湿条件下较稳定。
实施例2～10的晶型A在高湿条件下的稳定性如上述实施例1。
将实施例1～2所得产品分别置于双层LDPE袋(浙江周庆盖业有限公司)中，每层LDPE袋分别用扎口扎紧，然后放在纤维桶中，拧紧金属盖子，在40±2℃/75±5％做稳定性试验。具体测试结果如表4、表5所示。表4为实施例1的产品在40±2℃/75±5％RH下起始、静置1个月、静置3个月、静置6个月稳定性结果，表5为实施例2的产品在40±2℃/75±5％RH下下起始、静置1个月、静置3个月、静置6个月稳定性结果。
表4
注：T1表示降解杂质；上述百分比均表示各组分相对于产品总量的质量百分比。
表5
将实施例3～10所得产品分别置于双层LDPE袋(浙江周庆盖业有限公司)中，每层LDPE袋分别用扎口扎紧，然后放在纤维桶中，拧紧金属盖子，在40±2℃/75±5％做稳定性试验。具体测试结果如表6所示。表6为实施例3～10的产品在40±2℃/75±5％RH下起始、静置3个月稳定性结果。
表6
效果实施例3
实施例1如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的吸湿性
取样品约10～15mg，湿度0％RH条件下干燥120分钟后，测试湿度从0％RH～90％RH变化时样品的吸湿特征，以及湿度从90％RH～0％RH变化时样品的去湿特征，湿度变化步长10％RH，平衡标为5min内重量变化率小于0.01％/min，最长平衡时间为180分钟。
结果显示：如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A增加的质量相比于初始的质量，从0％RH～90％RH样品增重0.1％，几乎无吸湿性，具体如图4所示。
实施例2～10制得的如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的吸湿性与实施例1效果相当。
效果实施例4
实施例1如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A在食蟹猴体内药物动力学分析
如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物进入受试体内之后，将代谢生成7,8-DHF。进一步地，7,8-DHF通过激活TrkB受体，进而发挥其生物活性。
1、药物、动物及试剂
药物如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A、药物如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型D、7,8-DHF由上海博芮健制药有限公司提供。以下试剂由测试公司购买和制备：乙腈为分析纯试剂(Sigma Aldrich)，甲酸(HCOOH)为分析纯试剂(河北百灵威超精细材料有限公司)，甲酸胺为分析纯(Honeywell公司)；分析用纯水由去离子水经MilliQ纯水仪制备而成；辅料二甲基亚砜(DMSO)由J&K公司提供，聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯(solutol)，甲基纤维素(MC)，吐温80(Tween 80)由Sigma公司提供，柠檬酸钠由Adamas-deta公司提供。
食蟹猴，雄性，2.5-5kg,由海南金港生物技术股份有限公司提供。
实验仪器：液相-质谱联用分析系统(LC/MS/MS-AK)由Waters AcQuity UPLC串联QTRAP 6500质谱检测器组成(用于分析食蟹猴血浆样品)，
2、实验方法
将所有的待测化合物按照以下的方法配制成混悬液(浓度为5mg/mL)用于给药，口服灌胃给药食蟹猴。混悬液的溶媒为0.5％甲基纤维素/0.2％吐温80的水溶液(pH为3.0到3.2)，状态为均一混悬液。
将待测化合物药物如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A、药物如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型D按照25mg/kg剂量给予食蟹猴给药。
食蟹猴为灌胃给药组，一组3只，灌胃给药25mg/kg，灌胃给药前，给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、24小时后前肢头静脉取血0.4mL。
所有的血浆样品在采集后置于4℃、3000g离心力下离心10到15min，之后取血浆于带有标签的离心管中，并即刻进行样品的后续沉淀处理。
3、样品处理和检测方法
取出至少200μL食蟹猴血浆样品加入4倍体积的且含有内标维拉帕米的沉淀剂(v/v，1:4)，涡旋，混合均匀后在12000g离心力下离心10分钟，上清用于进样。
仪器：液相色谱系统：Acquity UPLC液相色谱系统(包括二元输液泵、自动进样器、柱温相、脱气机)，美国Waters公司
MS/MS系统：Triple Quad 6500+Low Mass
数据采集：Analyst 1.6.3软件，美国Applied Biosystems公司。
检测7,8-Dihydroxyflavone的LC条件：分析柱：ACQUITY UPLC ACE 5 PhenylColumn(50×2.1mm I.D.)，美国Waters公司
流速：0.6mL/min；进样量：3μL；柱温：45℃，采用的梯度洗脱顺序如表7所示：
表7
化合物7,8-DHF，其保留时间为1.59分钟，7,8-DHF的检测限为1-3000ng/mL，最低检测限为1ng/mL。
MS条件：离子源为电喷雾电离源(Turbo Spray IonDrive,ESI)；源喷射电压为5500V；温度为550℃。
表8食蟹猴灌胃给药后7,8-DHF在体内血浆药物浓度
备注：表8中“ND”表示未检测到或是峰信号太弱而未列在表中；“BQL”表示低于检测限。
表9灌胃给药后食蟹猴体内7,8-DHF主要的药代动力学参数
如表9所示，当剂量为25mg/kg时，如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A在食蟹猴体内药-时浓度(AUC(0-last))为1116ng·h/mL，如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型D的AUC为285ng·h/mL。如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的AUC为晶型D相应的AUC值的3.9倍。
实施例2～10制得的如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A的在食蟹猴体内药物动力学分析与实施例1效果相当。
综上，本发明的如式I所示的7,8-二羟基黄酮衍生物的晶型A在水中具有较高的溶解性、高湿条件下较好的稳定性和极低的吸湿性；在受试体内具有较高的生物利用度。
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