阅读说明：本技术 瑞香素衍生物制备方法及其医药用途 (Preparation method and medical application of daphnetin derivative ) 是由 蒋建勤 陶冶 于 2020-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域。本发明公开了一种瑞香素衍生物制备方法及其医药用途,涉及结构通式(I)所示的8-OH位取代的瑞香素衍生物,该衍生物通过瑞香素与2-溴乙醇发生醚化反应得到中间体II,中间体II再与非甾体类抗炎药发生酯化反应制备得到。经活性筛选试验证明,本发明的化合物具备COX-2酶抑制作用,且瑞香素衍生物的抗炎活性优于原料瑞香素,具有开发成治疗炎症药物的前景,且本发明提供的瑞香素衍生物的制备方法步骤简单,条件温和,可操作性和可控性较强。现有技术没有公开过本发明衍生物及其制备方法和医药用途。<Image he="577" wi="443" file="DSA0000213450330000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention belongs to the technical field of medicines. The invention discloses a preparation method of daphnetin derivatives and medical application thereof, and relates to daphnetin derivatives substituted at 8-OH position shown in a structural general formula (I), wherein the derivatives are prepared by performing etherification reaction on daphnetin and 2-bromoethanol to obtain an intermediate II, and performing esterification reaction on the intermediate II and non-steroidal anti-inflammatory drugs. The activity screening test proves that the compound has COX-2 enzyme inhibition effect, the anti-inflammatory activity of the daphnetin derivative is superior to that of daphnetin serving as a raw material, and the daphnetin derivative has a prospect of being developed into a medicament for treating inflammation. The prior art does not disclose the derivative, the preparation method and the medical application thereof.)

瑞香素衍生物制备方法及其医药用途

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，涉及新的天然化合物衍生物，具体涉及一种瑞香素衍生物及其制备方法和医药用途。

背景技术

炎症是全球常见的临床疾病，严重威胁着人类的健康。目前已经成为公共卫生系统的一大挑战，虽然许多科学家致力于开发新的治疗方法用于治疗各种炎症，但它仍然是全球关注的临床热点和难点。近年来，大量的抗炎药物被研发，其中大部分都是天然产物或其衍生物。

瑞香素又名祖师麻甲素，是从植物祖师麻中提取的有效成分，主要存在于瑞香科属植物中，具有消炎镇痛的药理作用。但是由于瑞香素存在着水溶性差、生物利用度低、稳定性差等局限，使得瑞香素在医药上的应用受到限制。所以本发明决定以天然植物中的有效成分为先导物进行结构修饰，对瑞香素进行结构改造修饰，以期望获得抗炎活性更强、生物利用度更高的化合物。

本发明通过对瑞香素进行结构修饰，得到了一系列衍生物。并通过初步的药理实验基本达到了上述目的，有望成为治疗炎症的候选药物且具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一类瑞香素衍生物。

本发明的另一目的是提供上述一类瑞香素衍生物的制备方法。

本发明的又一目的是提供上述瑞香素衍生物的医药用途。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一类结构通式(I)所示的8-OH位取代的瑞香素衍生物，并通过COX-2酶抑制活性筛选，发现大多数化合物具有良好的体外活性，可作为进一步开发为COX-2酶抑制剂的前体化合物。

本发明提供的8-OH位取代的瑞香素衍生物用结构通式(I)表示：

结构通式(I)中，R选自具有消炎、镇痛作用的布洛芬、双氯芬酸、氟比洛芬、吲哚美辛、萘普生、酮洛芬等非甾体类抗炎药物。

其中R优选为氟比洛芬、吲哚美辛、萘普生、酮洛芬。

本发明的化合物优选为以下物质：

化合物1：

化合物2：

化合物3：化合物4：

本发明中8位OH取代瑞香素衍生物制备方法包括：醚化反应，酯化反应。

本发明还提供了上述瑞香素8-OH衍生物的制备方法，它包括如下操作步骤：

步骤a、瑞香素与2-溴乙醇发生醚化反应，得到如下结构式所示的中间体II；

步骤b、中间体II再与上述非甾体类抗炎药物发生酯化反应制备结构通式(I)化合物。

优选地，步骤a中醚化反应条件包括：以碘化钾为催化剂，以碳酸钾作碱，反应温度为85～90℃。

更优选地，步骤a包括：首先将瑞香素(1eq)、碳酸钾(3eq)和碘化钾(0.1eq)溶于无水DMF中，搅拌均匀后再向其中加入2-溴乙醇(2eq)，之后在85～90℃下回流反应，TLC检测反应进程；反应完成后，先加入适量稀盐酸搅拌中和至酸性，再用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层；有机层再用蒸馏水、饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干，残留物经柱色谱纯化，得到中间体II。

优选地，步骤b中酯化反应条件包括：以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)为缩合剂，4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，常温反应。

更优选地，步骤b包括：首先将上述非甾体类抗炎药物(1.5eq)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)(2eq)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.4eq)溶于二氯甲烷中，搅拌混合均匀后，将中间体II(1eq)加入反应体系中，之后在常温条件下搅拌反应，TLC检测反应进程；反应完成后，有机层用蒸馏水、饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干，残留物经柱色谱纯化得到目标化合物。

本发明所制备的8-OH位取代的瑞香素衍生物在开发成COX-2酶抑制剂及在炎症等疾病方面的预防和治疗，是以COX-2酶抑制活性的筛选为载体，以此来评价化合物的抗炎活性。

化合物的COX-2酶抑制活性的筛选采用COX-2抑制剂筛选试剂盒(购买自碧云天生物技术公司)。

本发明所制备的8-OH位取代的瑞香素衍生物，经COX-2酶活性筛选，部分化合物在20μmol/L浓度下仍表现出较明显的抑制活性。

根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明技术思想的前提下，还可以做出其他多种形式的修改，替换和变更。

以下通过实施例形式对上述内容作进一步补充说明，但不应该理解为本发明范围仅限于以下实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

通过以下实施例以更好的说明本发明。但本发明不受下述实施例的限制。

工艺流程如下所示，制备方法中的“室温”或“rt”均指代“常温”：

实施例1

化合物1的合成

(1)中间体II的合成

称取瑞香素(1g，5.6mmol)和无水碳酸钾(2.3g，16.8mmol)和碘化钾(0.092g，0.56mmol)加入到三颈烧瓶(100ml)中，以DMF(N，N-二甲基甲酰胺)作溶剂(12ml)，加入2-溴乙醇(796μl，11.2mmol)，85℃下回流反应72h以上，回流装置顶端加干燥管或氮气保护装置，用TLC板检测反应，待反应结束后停止反应，将反应混合物置于室温缓慢冷却，加入20ml冷水稀释，加3mol/L稀盐酸将溶液调至酸性并用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，用蒸馏水洗涤，再用饱和食盐水洗涤，收集有机层，并用无水硫酸钠干燥，抽滤回收溶剂得到粗产品，用石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1(V∶V)洗脱剂柱层析得到中间体II(162mg，13％)。

(2)化合物1的合成

取上述固体(40mg，0.18mmol)置于50ml圆底烧瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)(69mg，0.36mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(8.8mg，0.07mmol)，布洛芬(56mg，0.27mmol)室温搅拌4～5h，TLC板检测反应进程，反应结束后，加蒸馏水洗涤，加饱食盐水洗涤，收集有机层并用无水硫酸钠干燥，抽滤回收溶剂得到粗产品。用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1(V∶V)洗脱剂柱层析得到白色固体产物纯品。总产率：48.8％，熔点：76-78℃。GF₂₅₄nm硅胶板薄层展开为一点，紫外灯UV₂₅₄nm下为暗斑，UV₃₆₅nm下为蓝色荧光。¹H-NMR(500MHz，CDCl₃，δppm)δ7.60(d，J＝9.5Hz，1H)，7.21(d，J＝8.1Hz，2H)，7.10(dd，J＝8.3，4.1Hz，3H)，6.86(d，J＝8.5Hz，1H)，6.21(d，J＝9.5HZ，1H)，4.71(m，4H)，3.78(q，J＝7.1Hz，1H)，2.43(d，J＝7.2Hz，2H)，1.83(dp，J＝13.5，6.8Hz，1H)，1.52(d，J＝7.2Hz，3H)，0.88(d，J＝6.6Hz，6H)；¹³C-NMR(125Hz，CDCl₃，δppm)δ175.24，160.31，152.84，147.42，144.22，140.87，137.32，132.55，129.60，127.18，123.70，112.99，72.81，63.79，45.25，45.11，30.23，22.46，18.60；ESI-MS m/z433.2[M+Na]⁺(calcd forC₂₄H₂₆O₆，410).

实施例2

化合物2的合成

参照实施例1，步骤2用双氯芬酸代替布洛芬，其他条件与实施例1相同，制得白色固体产物。总产率：50.7％，熔点：146-148℃。GF₂₅₄nm硅胶板薄层展开为一点，紫外灯UV₂₅₄nm下为暗斑，UV₃₆₅nm下为蓝色荧光。¹H-NMR(500MHz，CDCl₃，δppm)δ7.59(d，J＝9.6Hz，1H)，7.32(d，J＝8.0Hz，2H)，7.13(td，J＝7.8，1.6Hz，1H)，7.09(d，J＝8.5Hz，1H)，7.02(d，J＝3.7Hz，1H)，6.97(m，2H)，6.87(d，J＝8.5Hz，1H)，6.74(s，1H)，6.55(d，J＝7.9Hz，1H)，6.22(d，J＝9.6Hz，1H)，4.51(m，4H)，3.91(s，2H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃，δppm)δ172.84，160.30，152.72，147.37，144.21，142.81，137.85，132.70，131.06，129.66，128.97，128.34，124.23，123.93，123.77，122.31，118.50，113.09，112.70，112.59，72.84，64.47，38.59；ESI-MS m/z522.2[M+Na]⁺(calcd for C₂₅H₁₉Cl₂NO₆，410).

实施例3

化合物3的合成

参照实施例1，步骤2用氟比洛芬代替布洛芬，其他条件与实施例1相同，制得淡绿色油状物，总产率：28.2％，GF₂₅₄nm硅胶板薄层展开为一点，紫外灯UV₂₅₄nm下为暗斑，UV₃₆₅nm下为蓝色荧光。¹H-NMR(500MHz，CDCl₃，δppm)δ7.60(d，J＝9.5Hz，1H)，7.52(m，2H)，7.40(m，4H)，7.15(m，2H)，7.10(d，J＝8.5Hz，1H)，6.87(d，J＝8.6Hz，1H)，6.22(d，J＝9.5Hz，1H)，4.46(m，4H)，3.85(q，J＝7.2Hz，1H)，1.58(d，J＝7.2Hz，3H)；¹³C NMR(125MHz，CDCl₃，δppm)δ174.56，160.28，152.69，147.35，144.24，141.31，135.53，132.59，131.14，131.11，129.08，129.05，128.55，127.82，123.77，123.62，123.59，115.46，115.27，113.10，112.72，112.54，72.87，64.16，45.17，18.51；ESI-MS m/z 471.2[M+Na]⁺(calcd for C₂₆H₂₁FO₆，448).

实施例4

化合物4的合成

参照实施例1，步骤2用吲哚美辛代替布洛芬，其他条件与实施例1相同，制得黄色固体，总产率：19.8％，熔点：68-70℃。GF₂₅₄nm硅胶板薄层展开为一点，紫外灯UV₂₅₄nm下为暗斑，UV₃₆₅nm下为蓝色荧光。¹H-NMR(600MHz，CDCl₃，δppm)δ7.68(d，J＝8.5Hz，2H)，7.61(d，J＝9.5Hz，1H)，7.46(d，J＝8.5Hz，2H)，7.11(d，J＝8.5Hz，1H)，6.96(d，J＝2.5Hz，1H)，6.84(dd，J＝10.8，8.7Hz，3H)，6.65(dd，J＝9.0，2.5Hz，1H)，6.22(d，J＝9.5Hz，1H)，4.49(m，2H)，4.45(m，2H)，3.81(s，3H)，3.78(s，2H)，2.40(s，3H)；¹³C NMR(150MHz，CDCl₃，δppm)δ171.48，168.42，160.26，156.18，152.64，147.37，144.23，139.41，136.32，133.95，132.52，131.35，130.93，130.53，129.24，123.84，115.15，113.12，112.77，112.50，111.97，111.89，101.21，72.84，64.12，55.81，30.44，13.47.ESI-MS m/z 584.2[M+Na]⁺(calcd forC₃₀H₂₄ClNO₈，561).

实施例5

化合物5的合成

参照实施例1，步骤2用奈普生代替布洛芬，其他条件与实施例1相同，制得乳白色固体，总产率：16.1％，熔点：58-60℃。GF₂₅₄nm硅胶板薄层展开为一点，紫外灯UV₂₅₄nm下为暗斑，UV₃₆₅nm下为蓝色荧光。¹H-NMR(500MHz，CDCl₃，δppm)δ7.69(m，3H)，7.58(d，J＝9.5Hz，1H)，7.41(dd，J＝8.5，1.9Hz，1H)，7.13(dd，J＝8.9，2.5Hz，1H)，7.10(d，J＝2.6Hz，1H)，7.08(d，J＝8.5Hz，1H)，6.92(s，1H)，6.83(d，J＝8.5Hz，1H)，6.20(d，J＝9.5Hz，1H)，4.44(m，3H)，4.36(m，1H)，3.94(q，J＝7.1Hz，1H)，3.91(s，1H)，1.61(d，J＝7.1Hz，3H)；¹³C-NMR(125Hz，CDCl₃，δppm)δ175.28，160.32，157.82，152.75，147.35，144.23，135.18，133.90，132.59，129.43，129.07，127.51，126.17，126.09，123.71，119.20，113.02，112.66，112.54，105.69，72.97，63.96，55.45，45.61，18.67；ESI-MS m/z 457.2[M+Na]⁺(calcd forC₂₅H₂₂O₇，434).

实施例6

化合物6的合成

参照实施例1，步骤2用酮洛芬代替布洛芬，其他条件与实施例1相同，制得深绿色油状物，总产率：58.2％，GF₂₅₄nm硅胶板薄层展开为一点，紫外灯UV₂₅₄nm下为暗斑，UV₃₆₅nm下为蓝色荧光。¹H-NMR(600MHz，CDCl₃，δppm)δ7.79(m，2H)，7.77(t，1.8Hz，1H)，7.67(m，1H)，7.60(d，9.5Hz，1H)，7.56(m，3H)，7.46(dt，J＝15.5，7.7Hz，3H)，7.09(d，J＝8.5Hz，1H)，6.96(s，1H)，6.83(d，8.5Hz，1H)，6.21(d，9.5Hz，1H)，4.43(m，4H)，3.89(q，7.1Hz，1H)，1.57(d，7.2Hz，3H)；¹³C-NMR(150MHz，CDCl₃，δppm)δ196.69，174.65，160.32，152.73，147.38，144.25，140.47，138.16，137.47，132.71，132.57，131.57，130.23，129.37，129.24，128.83，128.43，123.76，113.04，112.67，112.58，72.79，64.15，45.52，18.61；ESI-MS m/z 481.1[M+Na]⁺(calcd for C₂₇H₂₂O₇，458).

实施例7

瑞香素衍生物COX-2酶抑制活性的测定

实验原理：在辅助因子(Cofactor)存在的情况下，COX-2使用其环氧化酶(COX)活性把花生四烯酸(Arachidonic Acid)等底物环氧化生成PGG2等中间产物，继而COX-2使用其过氧化物酶(peroxidase)活性把PGG2等中间产物催化生成PGH2等最终产物，同时把几乎没有荧光的COX-2探针(Probe)催化生成有强荧光的探针(Ex560/Em590)。这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测COX-2的酶活性。如果在反应中加入COX-2抑制剂(Inhibitor)，荧光的生成就会被抑制，荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比，这样就可以检测出抑制剂的抑制效果。本反应生成的强荧光探针的最大激发波长为571nm，最大发射波长为585nm，推荐检测时的激发波长为560nm，发射波长为590nm。

测定方法：根据COX-2抑制剂筛选试剂盒检测各COX-2配体的抑制活性，在96孔黑板中加入COX-2测定缓冲液(75μL)、COX-2辅助因子工作溶液(5μL)、COX-2工作溶液(5μL)和待测化合物(5μL)在37℃下孵育10min。待孵育完成后，在每个孔中加入5μL COX-2探针，然后在所有孔中快速加入5μL的COX-2底物。避光37℃下孵育5min后，用560nm的激发波长和590nm的发射波长测量了每个孔的荧光值。塞来昔布，一种已知的COX-2抑制剂做为阳性药组，在100％酶活对照组中，5μL DMSO代替测试试液，与100％酶活性对照组相比，空白对照组采用COX-2辅助缓冲液代替COX-2辅助因子工作溶液。最后通过以下方程计算每个样品的抑制活性：

抑制活性(％)＝[(A₁-A₂)/A₁-A₃]×100％

其中A₁为100％酶活性对照组的荧光值；A₂为样品组的荧光值；A₃为空白对照组的荧光值。

对于抑制率较好的化合物样品继续选择5个浓度测定其抑制率，每个化合物样品的每个浓度水平均设置3个复孔，并采用GraphPad Prism 5软件计算化合物样品的IC₅₀值。

表1：COX-2酶抑制活性的测定结果

名称	50μmol/L的抑制率(％)	IC<sub>50</sub>(μmol/L)
			瑞香素	31.45	＞50
实施例1	5.10	＞50
			实施例2	9.61	＞50
实施例3	78.00	7.25±0.23
			实施例4	95.69	2.41±0.52
实施例5	65.99	26.62±3.23
			实施例6	86.57	6.80±0.67

其中阳性药塞来昔布IC₅₀约为30nm

测定结果表明，本发明公开的部分化合物对COX-2酶具有较好的抑制作用，且活性优于瑞香素。

以上实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于以上具体实施例。