一种酿酒酵母中2-苯乙醇的制备方法
阅读说明：本技术 一种酿酒酵母中2-苯乙醇的制备方法 (Preparation method of 2-phenethyl alcohol in saccharomyces cerevisiae ) 是由 王肇悦 姜明月 杜正达 郭雪娜 何秀萍 于 2019-04-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种酿酒酵母中2-苯乙醇的制备方法。本发明保护一种提高酿酒酵母生产2-苯乙醇的产量的方法,包括如下步骤：提高酿酒酵母中转录因子Cat8p的表达量和/或活性,从而提高酿酒酵母生产2-苯乙醇的产量。本发明还保护将转录因子Cat8p的编码基因导入酿酒酵母后得到的重组菌株。本发明提供的产2-苯乙醇的酿酒酵母菌株与宿主菌相比,艾氏途径关键调控因子及关键酶基因表达水平增强,细胞的2-苯乙醇合成能力显著提高,且该酵母菌株发酵条件简单,发酵周期短,有利于该菌株工业化生产2-苯乙醇。(The invention discloses a preparation method of 2-phenethyl alcohol in saccharomyces cerevisiae. The invention discloses a method for improving the yield of 2-phenethyl alcohol produced by saccharomyces cerevisiae, which comprises the following steps: the expression quantity and/or activity of transcription factor Cat8p in the saccharomyces cerevisiae is improved, so that the yield of 2-phenethyl alcohol produced by the saccharomyces cerevisiae is improved. The invention also protects a recombinant strain obtained by introducing the coding gene of the transcription factor Cat8p into the saccharomyces cerevisiae. Compared with the host bacteria, the saccharomyces cerevisiae strain for producing the 2-phenethyl alcohol provided by the invention has the advantages that the expression level of key regulatory factors and key enzyme genes in the aldrin pathway is enhanced, the synthesis capacity of the 2-phenethyl alcohol of the cell is obviously improved, the fermentation condition of the saccharomyces cerevisiae strain is simple, the fermentation period is short, and the industrial production of the 2-phenethyl alcohol by the strain is facilitated.)
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种酿酒酵母中2-苯乙醇的制备方法。
背景技术
2-苯乙醇(2-phenylethanol)是一种具有玫瑰风味的芳香醇，存在于玫瑰、茉莉等多种植物精油中，也是葡萄酒、黄酒、啤酒、面包等多种发酵食品的自然风味物质，是决定发酵食品品质的一个关键因素。2-苯乙醇的香气颇受人们欢迎，是国际香精香料的主流风格，在食品和日化用品等领域中应用广泛，其使用量仅次于香兰素，是第二大香料成分。此外，2-苯乙醇作为杀菌剂和血管紧张素转化酶抑制剂，在医药行业也具有重要的应用。
目前，工业生产的2-苯乙醇主要有化学合成法和自然合成法，由于化学合成法副产物难以去除，严重影响了产品的品质和使用范围。自然合成法包括植物提取和微生物发酵，植物提取法虽然产物纯度高，但是生产成本高，产率低，不足以满足日益增长的市场需求。
微生物发酵法成本低，周期短，效率高，是提高2-苯乙醇生产的主要途径。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种安全的模式生物，是2-苯乙醇合成能力较高的微生物之一，同时对多种环境胁迫具有很好的适应性，因此是微生物发酵法生产2-苯乙醇的理想菌种。已有研究主要集中在菌种的自然筛选、传统的微生物育种或发酵工艺改进上，存在2-苯乙醇合成能力有限，难于进行大规模工业化生产的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种酿酒酵母中2-苯乙醇的制备方法。
本发明提供了一种提高酿酒酵母生产2-苯乙醇的产量的方法，包括如下步骤：提高酿酒酵母中转录因子Cat8p的表达量和/或活性，从而提高酿酒酵母生产2-苯乙醇的产量。
所述转录因子Cat8p的氨基酸序列为如下(a1)或(a2)或(a3):
(a1)序列表的序列5所示的氨基酸序列；
(a2)将序列表的序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(a3)与序列表的序列5所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
所述“提高酿酒酵母中转录因子Cat8p的表达量和/或活性”是通过向酿酒酵母中导入转录因子Cat8p的编码基因实现的。
所述转录因子Cat8p的编码基因(CAT8基因)如下(b1)或(b2)或(b3):
(b1)序列表的序列2自5’端第657至4958位所示的DNA分子；
(b2)与(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，且编码转录因子CAT8的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码转录因子CAT8的DNA分子。
所述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
所述酿酒酵母中，由组成型启动子启动所述编码基因的表达。所述组成型启动子具体可为TEF1启动子。
所述“向酿酒酵母中导入转录因子Cat8p的编码基因”具体可通过向酿酒酵母中导入表达CAT8基因的表达载体实现。所述表达载体中，具体可由组成型启动子启动CAT8基因的表达。
所述组成型启动子具体可为ADH1启动子。所述表达载体具体可为序列表的序列2所示的环状质粒。
所述组成型启动子具体可为TEF1启动子。所述表达载体具体可为序列表的序列3所示的环状质粒。
本发明还保护所述转录因子Cat8p或其编码基因在提高酿酒酵母生产2-苯乙醇的产量中的应用。
本发明还保护含有转录因子Cat8p的编码基因的表达盒在提高酿酒酵母生产2-苯乙醇的产量中的应用；所述表达盒中，由组成型启动子启动所述编码基因的表达。
所述组成型启动子具体可为ADH1启动子。所述表达盒具体可为序列表的2自5′末端起第251位至第5169位所示。
所述启动子具体可为TEF1启动子。所述表达盒具体可如序列表的3自5′末端起5117位至第10117位所示。
本发明还保护一种重组菌，是将转录因子Cat8p的编码基因导入酿酒酵母得到的。
所述“将转录因子Cat8p的编码基因导入酿酒酵母”具体可通过向酿酒酵母中导入表达CAT8基因的表达载体实现。
本发明还保护一种重组菌，是将含有转录因子Cat8p的编码基因的表达盒导入酿酒酵母得到的；所述表达盒中，由组成型启动子启动所述编码基因的表达。
所述组成型启动子具体可为ADH1启动子。所述表达盒具体可为序列表的2自5′末端起第251位至第5169位所示。
所述组成型启动子具体可为TEF1启动子。所述表达盒具体可如序列表的3自5′末端起5117位至第10117位所示。
所述“将含有转录因子Cat8p的编码基因的表达盒导入酿酒酵母”具体可通过向酿酒酵母中导入含有转录因子Cat8p的编码基因的表达盒的表达载体实现。
所述表达载体具体可为序列表的序列2所示的环状质粒。
所述表达载体具体可为序列表的序列3所示的环状质粒。
以上任一所述ADH1启动子的编码基因如序列表的序列2自5’端第251至646位所示。
以上任一所述TEF1启动子的编码基因如序列表的序列3自5’端第5117至5564位所示。
以上任一所述酿酒酵母具体可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58。
本发明还保护以上任一所述的重组菌在生产2-苯乙醇中的应用。
本发明还保护一种生产2-苯乙醇的方法，包括如下步骤：培养以上任一所述的重组菌，从培养产物中得到2-苯乙醇。所述培养产物具体可为所述重组菌的培养体系或培养体系离心得到的上清液。
本发明提供的产2-苯乙醇的酿酒酵母菌株与宿主菌相比，艾氏途径关键调控因子及关键酶基因表达水平增强，细胞的2-苯乙醇合成能力显著提高，且该酵母菌株发酵条件简单，发酵周期短，有利于该菌株工业化生产2-苯乙醇。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
质粒YEp352：参考文献：Hill JE,Meyers AM,Koerner TJ,et al.(1993).Ayeast/E.coli shuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast,9:163-167.；公众可从中国科学院微生物研究所获得。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58：参考文献：Teunissen AW R H,Holub E,van den Hucht J,van der Berg J A,Steensma H Y.(1993).Sequence of theopen reading frame of the FLO1gene from Saccharomyces cerevisiae.Yeast,9:423-427.；公众可从中国科学院微生物研究所获得。
发酵培养基：4g/100ml葡萄糖,0.5g/100ml MgSO4,0.5g/100ml KH2PO4,0.5g/100ml苯丙氨酸；溶剂为水。
含有0.5％苯丙氨酸的尿嘧啶缺陷SC选择培养基：含有5g/L苯丙氨酸，6.7g/L酵母氮源基础，10g/L葡萄糖，40mg/L的组氨酸，40mg/L色氨酸和40mg/L亮氨酸；溶剂为水。
含有0.5％苯丙氨酸的SC完全培养基：含5g/L苯丙氨酸，6.7g/L酵母氮源基础，10g/L葡萄糖，40mg/L的组氨酸，40mg/L色氨酸，40mg/L亮氨酸和20mg/L尿嘧啶；溶剂为水。
本发明中的CAT8基因如序列表的序列2自5’端第657至4958位所示，其编码的蛋白质(转录因子Cat8p)如序列表的序列5所示。
实施例1、重组菌株的构建
一、由ADH1启动子启动CAT8基因表达的酿酒酵母菌株的构建
1、重组质粒的构建
(1)重组质粒YEpA的构建：将质粒YEp352的HindIII和EcoRI酶切位点间的片段替换为序列表的序列1所示的DNA分子，得到重组质粒YEpA(已经测序验证)。
序列表的序列1自5’端第247至642位为ADH1p启动子序列，第680至867位为ADH1t终止子序列。
(2)重组质粒YEpA-CAT8的构建：将CAT8基因序列***步骤(1)制备的重组质粒YEpA的XmaI和XhoI酶切位点间，得到重组质粒YEpA-CAT8。重组质粒YEpA-CAT8为序列表的序列2所示的环状质粒(已经测序验证)。重组质粒YEpA-CAT8含有由ADH1p启动子启动CAT8基因表达的表达盒，如序列表的2自5′末端起第251位至第5169位所示，其中，自5’端第251至646位为ADH1启动子序列，第657至4958位为CAT8基因的编码区序列，第4982至5169位为ADH1终止子序列。
2、重组菌株的构建
1、将步骤一制备的重组质粒YEpA导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58，得到重组菌株YS58(YEpA)。
2、将步骤一制备的重组质粒YEpA-CAT8导入酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YS58，得到重组菌株YS58(YEpA-CAT8)(经过测序验证已***CAT8基因)。
二、由TEF1p启动子启动CAT8基因表达的酿酒酵母菌株的构建
1、重组质粒的构建
采用TEF1启动子序列替代步骤一制备的重组质粒YEpA-CAT8中的ADH1p启动子序列，得到重组质粒YEpT-CAT8。重组质粒YEpT-CAT8为序列表的序列3所示的环状质粒(已经测序验证)。重组质粒YEpT-CAT8含有由TEF1p启动子启动CAT8基因表达的表达盒，如序列表的3自5′末端起5117位至第10117位所示，其中，自5’端第5117至5564位为TEF1启动子序列，第5575至9873位为CAT8基因的编码区序列，第9930至10117位为ADH1终止子序列。
2、重组菌株的构建
将步骤二制备的重组质粒YEpT-CAT8导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58，得到重组菌株YS58(YEpT-CAT8)(经过测序验证已***CAT8基因)。
三、CAT8基因敲除菌株的构建
1、CAT8敲除盒的构建
人工合成序列表的序列4所示的CAT8敲除盒。
序列表的序列4中，自5’端第1至71位为CAT8基因5’同源臂，第175至518位为TEF1p启动子序列，第519至1328位为抗性基因KanR，第1334至1531位为TEF1t终止子序列，第1615至1685位为CAT8基因3’同源臂。
2、CAT8基因敲除菌株的构建
将步骤1得到的CAT8敲除盒导入导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58，在含有200μg/ml G418的YPD固体培养基上筛选获得转化子，因质粒中含有KanMX基因，所以基因组上整合CAT8敲除盒5’CAT8-KanMX-3’CAT8的转化菌株在含有200μg/ml G418的YPD固体培养基能生长，而宿主菌YS58不能生长。
提取转化子基因组进行测序，测序结果表明，转化子中的CAT8基因敲除成功，将CAT8基因敲除成功的转化子命名为菌株YS58-Δcat8。菌株YS58-Δcat8和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58的区别仅在于敲除了基因组中的CAT8基因。
实施例2、CAT8基因在酿酒酵母中表达对2-苯乙醇合成的影响
一、CAT8基因过表达对2-苯乙醇合成的影响
1、CAT8基因过表达对酿酒酵母中艾氏途径关键基因及转录因子的基因表达水平的影响
待测菌株：实施例1制备的重组菌株YS58(YEpA)和重组菌株YS58(YEpA-CAT8)。
(1)将待测菌株接种于5ml YPD液体培养基中，30℃、200rpm活化20小时；然后以10％(体积比)的接种量接种于50mL YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养24h。
(2)完成步骤(1)后，富集菌体，将菌体转接到含有0.5％苯丙氨酸的尿嘧啶缺陷SC选择培养基，30℃，200rpm，培养24h。
(3)完成步骤(2)后，提取待测菌株的总RNA，并反转录为cDNA。
(4)以步骤(3)得到的cDNA为模板，采用表1中所示的引物通过Quant两步法荧光定量qRT-PCR(SYBR Green I)对待测菌株中艾氏途径相关氨基酸通透酶(GAP1、BAP2、AGP1)、氨基转移酶(ARO8、ARO9、BAT1、BAT2)、脱羧酶(ARO10、PDC1)、脱氢酶(ADH6、ADH7)及转录因子(CAT8、GAT1、GLN3、ARO80)基因表达水平进行相对定量分析。
表1引物信息
实验数据由LightCycler96softwareSW 1.1(Roche)采集；以ΔCT计算方法分析各基因的表达水平差异。以酿酒酵母ACT1基因为对照。每个实验设三次重复。
以重组菌株YS58(YEpA)为对照菌株，重组菌株YS58(YEpA-CAT8)表达菌株中艾氏途径关键基因及转录因子的基因表达水平，如表2和表3所示。
表2 CAT8表达对艾氏途径关键通透酶、转氨酶基因表达影响
表3 CAT8表达对艾氏途径关键脱羧酶、还原酶及转录因子基因表达影响
上述结果表明，重组菌株YS58(YEpA-CAT8)与对照菌株YS58(YEpA)相比，艾氏途径的关键氨基酸通透酶基因BAP2提高3.68倍、AGP1提高3.32倍，氨基转移酶基因ARO9提高5.28倍，脱羧酶基因ARO10提高6.75倍，转录因子GAT1提高2.81倍、GLN3提高3.10倍，说明转录因子CAT8基因的表达有利于艾氏途径关键基因及转录因子的表达。
2、CAT8基因过表达对酿酒酵母产2-苯乙醇水平的影响
待测菌株：实施例1制备的对照菌株YS58和重组菌株YS58(YEpA-CAT8)。
(1)将待测菌株接种于发酵培养基中，30℃、200rpm发酵60h。
(2)完成步骤(1)后，10000转/分钟离心5分钟，取上清液，使用紫外分光光度法测定各个样品上清液中的2-苯乙醇含量。
测定方法：取500μl上清液，加入4ml正庚烷，涡旋震荡3min充分萃取，5000转离心5分钟，取上层有机相测定260nm的吸光度。以2-苯乙醇(阿拉丁试剂(上海)有限公司，产品目录号：P108197)为标准品，采用紫外分光光度法绘制标准曲线，定量分析2-苯乙醇。
结果如表4所示。
表4 CAT8在YS58中高效表达对2-苯乙醇含量的影响
结果表明，CAT8表达菌株YS58(YEpA-CAT8)的2-苯乙醇含量是出发菌株YS58的4.6倍，证明CAT8在酿酒酵母YS58中的高效表达明显提高了2-苯乙醇的产量。
二、CAT8基因敲除对2-苯乙醇合成的影响
1、CAT8基因过表达对酿酒酵母中艾氏途径关键基因及转录因子的基因表达水平的影响
待测菌株：实施例1制备的敲除菌株YS58-Δcat8及对照菌株YS58。
(1)将待测菌株接种于5ml YPD液体培养基中，30℃、200rpm活化20小时；然后以10％(体积比)的接种量接种于50mL YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养24h。
(2)完成步骤(1)后，富集菌体，将菌体转接到含有0.5％苯丙氨酸的SC完全培养基中，30℃，200rpm，培养24h。
(3)完成步骤(2)后，提取待测菌株的总RNA，并反转录为cDNA。
(4)以步骤(3)得到的cDNA为模板，采用表1中所示的引物通过Quant两步法荧光定量qRT-PCR(SYBR Green I)对待测菌株中艾氏途径相关氨基酸通透酶(GAP1、BAP2、AGP1)、氨基转移酶(ARO8、ARO9、BAT1、BAT2)、脱羧酶(ARO10、PDC1)、脱氢酶(ADH6、ADH7)及转录因子(CAT8、GAT1、GLN3、ARO80)基因表达水平进行相对定量分析。
实验数据由LightCycler96softwareSW 1.1(Roche)采集；以ΔCT计算方法分析各基因的表达水平差异。以酿酒酵母ACT1基因为对照。每个实验设三次重复。
以YS58为对照菌株，CAT8敲除菌株YS58-Δcat8中艾氏途径关键基因及转录因子的基因表达水平，如表5和表6所示。
表5 CAT8敲除对艾氏途径关键通透酶、转氨酶基因表达影响
表6 CAT8敲除对艾氏途径关键脱羧酶、还原酶及转录因子基因表达影响
上述结果表明，对照菌株YS58与CAT8敲除菌株YS58-Δcat8相比，艾氏途径的关键氨基酸通透酶基因GAP1提高92.41倍、BAP2提高23.10倍、AGP1提高4.35倍，氨基转移酶基因ARO8提高5.03倍、ARO9提高44.63倍，脱羧酶基因ARO10提高369.65倍、PDC1提高6.45倍，醇脱氢酶ADH1提高3.84倍，转录因子GLN3提高6.11倍，说明转录因子CAT8基因的缺失严重影响艾氏途径关键基因及转录因子的表达。
2、CAT8基因缺失对酿酒酵母产2-苯乙醇水平的影响
待测菌株：实施例1制备的敲除菌株YS58-Δcat8和对照菌株YS58。
(1)将待测菌株接种于发酵培养基中，30℃、200rpm发酵60h。
(2)完成步骤(1)后，10000转/分钟离心5分钟，取上清液，使用紫外分光光度法测定各个样品上清液中的2-苯乙醇含量。
测定方法：取500μl上清液，加入4ml正庚烷，涡旋震荡3min充分萃取，5000转离心5分钟，取上层有机相测定260nm的吸光度。以2-苯乙醇(阿拉丁试剂(上海)有限公司，产品目录号：P108197)为标准品，采用紫外分光光度法绘制标准曲线，定量分析2-苯乙醇。
结果如表7所示。
表7 CAT8在YS58中缺失对2-苯乙醇含量的影响
结果表明，CAT8缺失菌株YS58-Δcat8的2-苯乙醇含量比出发菌株YS58降低36％，证明CAT8在酿酒酵母YS58中的缺失明显降低了2-苯乙醇的产量。
实施例3、不同启动强度的Cat8p对2-苯乙醇合成的影响
待测菌株：实施例1制备的重组菌株YS58(YEpT-CAT8)和重组菌株YS58(YEpA-CAT8)和对照菌株YS58。
1、将待测菌株接种于发酵培养基中，30℃、220转/分钟培养60小时。
上述发酵培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为L-苯丙氨酸、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾；所述L-苯丙氨酸在发酵培养基中的浓度为5g/L，所述葡萄糖在发酵培养基中的浓度为40g/L，所述硫酸镁在发酵培养基中的浓度为5g/L，所述磷酸二氢钾在发酵培养基中的浓度为5g/L。
2、完成步骤1后，取发酵体系，离心取上清，使用紫外分光光度法测定各个样品上清液中的2-苯乙醇含量。测定方法：取500μl上清液，加入4ml正庚烷，涡旋震荡3min充分萃取，5000转离心5分钟，取上层有机相测定260nm的吸光度。以2-苯乙醇(阿拉丁试剂(上海)有限公司，产品目录号：P108197)为标准品，采用紫外分光光度法绘制标准曲线，定量分析2-苯乙醇。
结果如表8所示。
表8酵母菌发酵液中的2-苯乙醇含量
结果表明，YS58(YEpA-CAT8)的2-苯乙醇产量达到3.667g/L，YS58(YEpT-CAT8)的2-苯乙醇产量达到4.258g/L，分别比YS58提高87％，117％，表明转录因子Cat8p可以提高酵母菌株生产2-苯乙醇的能力。TEF1启动子调控下的CAT8表达菌株YS58(YEpT-CAT8)的2-苯乙醇产量比ADH1启动子调控下的CAT8表达菌株YS58(YEpA-CAT8)增加16％，说明增加启动子强度来表达转录因子Cat8p可以进一步提高2-苯乙醇产量。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种酿酒酵母中2-苯乙醇的制备方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcttttatt ctttcctctg gatcctctag ctccctaaca tgtaggtggc ggaggggaga 60
tatacaatag aacagatacc agacaagaca taatgggcta aacaagacta caccaattac 120
actgcctcat tgatggtggt acataacgaa ctaatactgt agccctagac ttgatagcca 180
tcatcatatc gaagtttcac tacccttttt ccatttgcca tctattgaag taataatagg 240
cgcatgcaac ttcttttctt tttttttctt ttctctctcc cccgttgttg tctcaccata 300
tccgcaatga caaaaaaatg atggaagaca ctaaaggaaa aaattaacga caaagacagc 360
accaacagat gtcgttgttc cagagctgat gaggggtatc tcgaagcaca cgaaactttt 420
tccttccttc attcacgcac actactctct aatgagcaac ggtatacggc cttccttcca 480
gttacttgaa tttgaaataa aaaaagtttg ctgtcttgct atcaagtata aatagacctg 540
caattattaa tcttttgttt cctcgtcatt gttctcgttc cctttcttcc ttgtttcttt 600
ttctgcacaa tatttcaagc tataccaagc atacaatcaa ctggtacccg ggtcgactcg 660
agctctagag gttaactaag cgaatttctt atgatttatg atttttatta ttaaataagt 720
tataaaaaaa ataagtgtat acaaatttta aagtgactct taggttttaa aacgaaaatt 780
cttattcttg agtaactctt tcctgtaggt caggttgctt tctcaggtat agcatgaggt 840
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<210> 2
<211> 10463
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tccagttact tgaatttgaa ataaaaaaag tttgctgtct tgctatcaag tataaataga 540
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tatcttttga acaggacgag gcacctggtc ttcctgcggt aaaggcatta aaatcaatga 1440
cgactcatca acgtagcact caattggcaa ctttagtttc tttatccatc ccaagatcta 1500
ctgaagaaat tctgtttatt cctcagcttt taactaggat aagacaaata tttggtttca 1560
actcaaagca atgtttgtat acggtttcat tattatcttc attgaaaaat agattgccag 1620
caccacggct tctagcacct tcaacatcaa ccaagttaaa ggagaaagat gaagataaaa 1680
aacttgatga tgattcggct tttgtgaaaa ggtttcaaag cacaaacctc tccgagtttg 1740
tcgatttgaa aaagttttta atttctttga aatttaacat taactcgttt tcaaagcaat 1800
cagaaaagcc ggctaatgat caggatgatg aactactttc cctcactgaa attaaagagc 1860
ttttacacct ttttttcaaa ttttggtcta atcaggtacc aattctaaac aatgaccact 1920
tcttaatata tttcaacaat tttgttgaag tcgtgaagca tttatctaca gaaaatttgg 1980
agacgaataa cactactaaa agtacagtca ccactaatca tgaaatattt gccctaaagc 2040
ttctgatgat gttacaaatg gggttactcg ttaagattaa aatggaaaaa ataaaataca 2100
ctgtaccgaa gaatccgaag gccaaatatg ctagattgat ggcatattat catcagcttt 2160
ccctaataat tcctaaaaat ccttattttt taaatatgtc cacaacttca ttaccatcct 2220
tacaattgtt atctttggca tccttttatt atttaaacgt gggtgatatt tcggcaatct 2280
atggggtaag aggccgtatt gtttctatgg cacaacaatt gagacttcac agatgtccta 2340
gtgccgtatt aagtgtacac tctaacccag ttctacaaaa atttgagcaa agcgagagga 2400
gattactgtt ttgggcaatt tattacgttg acgtttttgc ctcattgcaa cttggtgttc 2460
ctcgtttact taaggatttt gatattgaat gtgcattacc aatttctgat gttgagtata 2520
aggatcagtt atctatggaa aatgaaaaag cagataaaaa agctaaaaag attcaactgc 2580
aaggtcaagt ttcaagcttt tcattgcaga taatcagatt tgcgaaaata ttaggtaaca 2640
ttctagactc gatttttaag agaggaatga tggatgaacg tataacttct gaagttgcat 2700
tagtacatga aaacgcactg gataactgga gaaatcaact tcccgaaatg tactactttc 2760
aaataactgt aaacggaact gtgaatttag acgagattag agcaaccaat caaagaaata 2820
ctgagaccaa atttgataag aaagacataa tattatttga aaagaagatt ctattgctgt 2880
tttatttctt ggccaaatct atgatacatt taccggttat tgcaaccaaa cctttgccta 2940
agaatgttga taatgccaca aagaagaaac agtcaatgtt caacaacgac tctaaaggcg 3000
caaccaacca ggaccacatg atattagatg ttgatatgac ttctcctgct ataaggacat 3060
catcctcata tatcatttta caacaagcta ccaatgcaac gcttacgatt ttccaggcca 3120
ttaattccat gtatttacct ttgccattga atgtatcaag aacgttaatc agattttctt 3180
tgctctgtgc tagaggttct ttggaatata ccaaaggtgg tgcgttattc ttagataata 3240
aaaatcttct cctcgacacc atcaaagata tcgaaaacga taggcttttg gatttacctg 3300
gaattgcctc ttggcacacg ctgaaactgt ttgacatgag catcaacctg ttgttgaaag 3360
cacctaatgt taaggttgaa agactggata aattcttgga aaagaaattg aattactaca 3420
atagattgat ggggttacca ccggccacaa ccacatcctt aaaaccatta tttggctctc 3480
aatcgaagaa cagcctggaa aatagacaaa gaacacctaa tgtcaaaaga gaaaacccag 3540
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ctccaatgac aaatacaact aatggtaata agagattaaa gtatgaaaaa gatgcaaaac 3660
gaaatgcaaa agatggcggt atatccaagg gggagaacgc acataatttc cagaatgata 3720
ccaaaaaaaa catgtccacc agcaatctgt ttccattttc gtttagtaat acagacctta 3780
ctgcgctgtt cacccatcct gaaggaccga attgtacgaa tactaataat ggcaacgtgg 3840
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taaatatggc accattctta cagaccggta actccaatat aggtcaaaac acgattgaga 3960
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ataatatgga ctctaaaccg gaacaattag aacccgttat taagcaaaac cctgagaatt 4080
caaaaaacaa ccaatttcat cagaaaggaa aaagtacgaa tatggaaaag aataatctct 4140
ctttcaacaa caagagtaac tacagcctaa caaagctaat gagattgctg aacaacgata 4200
attctttctc gaatattagt attaacaact ttttatacca aaatgatcag aactccgcgt 4260
cagcggatcc gggaacaaat aaaaaagccg ttacaaatgc aggtgccaac ttcaaaccac 4320
cttcaactgg cagtaatacc agccaaggca gtatccttgg aagtacaaag catggaatgg 4380
acaactgtga tttcaacgat ttaggtaatt ttaacaattt catgacaaat gtcaattatt 4440
ctggggtcga ctatgattac attgtagatg catcacttgg gttggctcct ttattagtgg 4500
atacgcccga tatctcaaat accaacacga cgtctactac gtcaaatcga agtaaaaaca 4560
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ctcaagagaa ctcaaagagt gcaactggca accagttgga tacaccttct acactgtttc 4800
aaatgagaag gacctcttca gggccctcgg cgtcccaccg tggtccaaga cggcctcaga 4860
aaaatcgtta caatacagat cgatcaaaaa gttctggtgg cggaagttcc aacacagata 4920
atgtatctga tttattccaa tggcaaaacg ccaaataact cgagctctag aggttaacta 4980
agcgaatttc ttatgattta tgatttttat tattaaataa gttataaaaa aaataagtgt 5040
atacaaattt taaagtgact cttaggtttt aaaacgaaaa ttcttattct tgagtaactc 5100
tttcctgtag gtcaggttgc tttctcaggt atagcatgag gtcgctctta ttgaccacat 5160
ctctaccggc atgccgagca aatgcctgca aatcgctccc catttcaccc aattgtagat 5220
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acacctgttg taatcgttct tccacacgga tccacagcct agccttcagt cgtggcgaat 5340
tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 5400
aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gaggtaactc 5460
acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 5520
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aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 5820
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 5880
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 5940
ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 6000
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 6060
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 6120
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gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 6360
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 6420
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ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 7440
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cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 7560
aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc 7620
ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc 7680
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gtatatatat atacaggcaa cacgcagata taggtgcgac gtgaacagtg agctgtatgt 7860
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tccgaagttc ctattctcta gctagaaagt ataggaactt cagagcgctt ttgaaaacca 7980
aaagcgctct gaagacgcac tttcaaaaaa ccaaaaacgc accggactgt aacgagctac 8040
taaaatattg cgaataccgc ttccacaaac attgctcaaa agtatctctt tgctatatat 8100
ctctgtgcta tatccctata taacctaccc atccaccttt cgctccttga acttgcatct 8160
aaactcgacc tctacatttt ttatgtttat ctctagtatt actctttaga caaaaaaatt 8220
gtagtaagaa ctattcatag agtgaatcga aaacaatacg aaaatgtaaa catttcctat 8280
acgtagtata tagagacaaa atagaagaaa ccgttcataa ttttctgacc aatgaagaat 8340
catcaacgct atcactttct gttcacaaag tatgcgcaat ccacatcggt atagaatata 8400
atcggggatg cctttatctt gaaaaaatgc acccgcagct tcgctagtaa tcagtaaacg 8460
cgggaagtgg agtcaggctt tttttatgga agagaaaata gacaccaaag tagccttctt 8520
ctaaccttaa cggacctaca gtgcaaaaag ttatcaagag actgcattat agagcgcaca 8580
aaggagaaaa aaagtaatct aagatgcttt gttagaaaaa tagcgctctc gggatgcatt 8640
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tagactatat attattatac aggttcaaat atactatctg tttcagggaa aactcccagg 9120
ttcggatgtt caaaattcaa tgatgggtaa caagagcttt tcaattcatc attttttttt 9180
tattcttttt tttgatttcg gtttctttga aatttttttg attcggtaat ctccgaacag 9240
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ctccctatct actggagaat atactaaggg tactgttgac attgcgaaga gcgacaaaga 9900
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gttgattatg acacccggtg tgggtttaga tgacaaggga gacgcattgg gtcaacagta 10020
tagaaccgtg gatgatgtgg tctctacagg atctgacatt attattgttg gaagaggact 10080
atttgcaaag ggaagggatg ctaaggtaga gggtgaacgt tacagaaaag caggctggga 10140
agcatatttg agaagatgcg gccagcaaaa ctaaaaaact gtattataag taaatgcatg 10200
tatactaaac tcacaaatta gagcttcaat ttaattatat cagttattac cctatgcggt 10260
gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca 10320
ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 10380
cgaagggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 10440
gacgttgtaa aacgacggcc agt 10463
<210> 3
<211> 10304
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 60
gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgaggta actcacatta attgcgttgc 120
gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctggattaa tgaatcggcc 180
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 240
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 300
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 360
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 420
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 480
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 540
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac 600
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 660
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 720
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 780
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cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 900
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 960
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 1020
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 1080
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 1140
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 1200
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 1260
gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 1320
atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 1380
tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 1440
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ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 1740
tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 1800
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 1860
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 1920
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 1980
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 2040
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ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa 2160
ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg 2220
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atctaagatg ctttgttaga aaaatagcgc tctcgggatg catttttgta gaacaaaaaa 3300
gaagtataga ttctttgttg gtaaaatagc gctctcgcgt tgcatttctg ttctgtaaaa 3360
atgcagctca gattctttgt ttgaaaaatt agcgctctcg cgttgcattt ttgttttaca 3420
aaaatgaagc acagattctt cgttggtaaa atagcgcttt cgcgttgcat ttctgttctg 3480
taaaaatgca gctcagattc tttgtttgaa aaattagcgc tctcgcgttg catttttgtt 3540
ctacaaaatg aagcacagat gcttcgttaa caaagatatg ctattgaagt gcaagatgga 3600
aacgcagaaa atgaaccggg gatgcgacgt gcaagattac ctatgcaata gatgcaatag 3660
tttctccagg aaccgaaata catacattgt cttccgtaaa gcgctagact atatattatt 3720
atacaggttc aaatatacta tctgtttcag ggaaaactcc caggttcgga tgttcaaaat 3780
tcaatgatgg gtaacaagag cttttcaatt catcattttt tttttattct tttttttgat 3840
ttcggtttct ttgaaatttt tttgattcgg taatctccga acagaaggaa gaacgaagga 3900
aggagcacag acttagattg gtatatatac gcatatgtag tgttgaagaa acatgaaatt 3960
gcccagtatt cttaacccaa ctgcacagaa caaaaaccga aacgaagata aatcatgtcg 4020
aaagctacat ataaggaacg tgctgctact catcctagtc ctgttgctgc caagctattt 4080
aatatcatgc acgaaaagca aacaaacttg tgtgcttcat tggatgttcg taccaccaag 4140
gaattactgg agttagttga agcattaggt cccaaaattt gtttactaaa aacacatgtg 4200
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tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac 5100
ggccagtgcc aagcttgaat ccttacatca cacccaatcc cccacaagtg atcccccaca 5160
caccatagct tcaaaatgtt tctactcctt ttttactctt ccagattttc tcggactccg 5220
cgcatcgccg taccacttca aaacacccaa gcacagcata ctaaatttcc cctctttctt 5280
cctctagggt gtcgttaatt acccgtacta aaggtttgga aaagaaaaaa gagaccgcct 5340
cgtttctttt tcttcgtcga aaaaggcaat aaaaattttt atcacgtttc tttttcttga 5400
aaattttttt ttttgatttt tttctctttc gatgacctcc cattgatatt taagttaata 5460
aacggtcttc aatttctcaa gtttcagttt catttttctt gttctattac aacttttttt 5520
acttcttgct cattagaaag aaagcatagc aatctaatct aagtggtacc cgggatggca 5580
aataataatt ctgatcgaca aggtttggaa cccagagtca ttagaactct gggttcacaa 5640
gcgcttagcg gtcctagcat atctaataga acttcaagtt cggaggcaaa ccctcatttt 5700
tccaagaacg tgaaggaagc aatgatcaag acagcttctc cgactccttt atctacacct 5760
atttacagga tagctcaagc ttgtgacagg tgtcgatcta agaaaacaag gtgcgatgga 5820
aaaagaccac agtgttcgca gtgtgctgct gtcggatttg aatgcagaat aagcgataaa 5880
ttactgagga aagcgtatcc aaaagggtac acagaaagcc tggaagaaag agtacgcgaa 5940
ctggaggcag agaataagcg tttgctagct ttgtgtgata tcaaagaaca gcaaataagc 6000
cttgtttcac agtcgcgacc acagacatca acggataata ccataaatgg caatttcaaa 6060
catgatttga aagatgctcc attgaatctg tcttctacaa atatctattt attaaatcaa 6120
acggttaata agcagctaca aaatggcaaa atggatggtg ataatagcgg ttctgcaatg 6180
agtccattgg gggcaccacc tccaccgcca cacaaagacc atctttgtga cggcgtttcc 6240
tgtacaaatc atttacacgt caagcctact tctacgagtt taaacgatcc aaccgctata 6300
tcttttgaac aggacgaggc acctggtctt cctgcggtaa aggcattaaa atcaatgacg 6360
actcatcaac gtagcactca attggcaact ttagtttctt tatccatccc aagatctact 6420
gaagaaattc tgtttattcc tcagctttta actaggataa gacaaatatt tggtttcaac 6480
tcaaagcaat gtttgtatac ggtttcatta ttatcttcat tgaaaaatag attgccagca 6540
ccacggcttc tagcaccttc aacatcaacc aagttaaagg agaaagatga agataaaaaa 6600
cttgatgatg attcggcttt tgtgaaaagg tttcaaagca caaacctctc cgagtttgtc 6660
gatttgaaaa agtttttaat ttctttgaaa tttaacatta actcgttttc aaagcaatca 6720
gaaaagccgg ctaatgatca ggatgatgaa ctactttccc tcactgaaat taaagagctt 6780
ttacaccttt ttttcaaatt ttggtctaat caggtaccaa ttctaaacaa tgaccacttc 6840
ttaatatatt tcaacaattt tgttgaagtc gtgaagcatt tatctacaga aaatttggag 6900
acgaataaca ctactaaaag tacagtcacc actaatcatg aaatatttgc cctaaagctt 6960
ctgatgatgt tacaaatggg gttactcgtt aagattaaaa tggaaaaaat aaaatacact 7020
gtaccgaaga atccgaaggc caaatatgct agattgatgg catattatca tcagctttcc 7080
ctaataattc ctaaaaatcc ttatttttta aatatgtcca caacttcatt accatcctta 7140
caattgttat ctttggcatc cttttattat ttaaacgtgg gtgatatttc ggcaatctat 7200
ggggtaagag gccgtattgt ttctatggca caacaattga gacttcacag atgtcctagt 7260
gccgtattaa gtgtacactc taacccagtt ctacaaaaat ttgagcaaag cgagaggaga 7320
ttactgtttt gggcaattta ttacgttgac gtttttgcct cattgcaact tggtgttcct 7380
cgtttactta aggattttga tattgaatgt gcattaccaa tttctgatgt tgagtataag 7440
gatcagttat ctatggaaaa tgaaaaagca gataaaaaag ctaaaaagat tcaactgcaa 7500
ggtcaagttt caagcttttc attgcagata atcagatttg cgaaaatatt aggtaacatt 7560
ctagactcga tttttaagag aggaatgatg gatgaacgta taacttctga agttgcatta 7620
gtacatgaaa acgcactgga taactggaga aatcaacttc ccgaaatgta ctactttcaa 7680
ataactgtaa acggaactgt gaatttagac gagattagag caaccaatca aagaaatact 7740
gagaccaaat ttgataagaa agacataata ttatttgaaa agaagattct attgctgttt 7800
tatttcttgg ccaaatctat gatacattta ccggttattg caaccaaacc tttgcctaag 7860
aatgttgata atgccacaaa gaagaaacag tcaatgttca acaacgactc taaaggcgca 7920
accaaccagg accacatgat attagatgtt gatatgactt ctcctgctat aaggacatca 7980
tcctcatata tcattttaca acaagctacc aatgcaacgc ttacgatttt ccaggccatt 8040
aattccatgt atttaccttt gccattgaat gtatcaagaa cgttaatcag attttctttg 8100
ctctgtgcta gaggttcttt ggaatatacc aaaggtggtg cgttattctt agataataaa 8160
aatcttctcc tcgacaccat caaagatatc gaaaacgata ggcttttgga tttacctgga 8220
attgcctctt ggcacacgct gaaactgttt gacatgagca tcaacctgtt gttgaaagca 8280
cctaatgtta aggttgaaag actggataaa ttcttggaaa agaaattgaa ttactacaat 8340
agattgatgg ggttaccacc ggccacaacc acatccttaa aaccattatt tggctctcaa 8400
tcgaagaaca gcctggaaaa tagacaaaga acacctaatg tcaaaagaga aaacccagaa 8460
cacgagtatc tttatggaaa cgatagtaat aataacaata attctgaagc gggtcactct 8520
ccaatgacaa atacaactaa tggtaataag agattaaagt atgaaaaaga tgcaaaacga 8580
aatgcaaaag atggcggtat atccaagggg gagaacgcac ataatttcca gaatgatacc 8640
aaaaaaaaca tgtccaccag caatctgttt ccattttcgt ttagtaatac agaccttact 8700
gcgctgttca cccatcctga aggaccgaat tgtacgaata ctaataatgg caacgtggat 8760
gtgtgtaaca gagcttctac agatgccacg gatgccaata tagagaactt aagcttttta 8820
aatatggcac cattcttaca gaccggtaac tccaatatag gtcaaaacac gattgagaat 8880
aagcctatgc acatggatgc gatattcagt ctaccaagta atttagatct aatgaaggat 8940
aatatggact ctaaaccgga acaattagaa cccgttatta agcaaaaccc tgagaattca 9000
aaaaacaacc aatttcatca gaaaggaaaa agtacgaata tggaaaagaa taatctctct 9060
ttcaacaaca agagtaacta cagcctaaca aagctaatga gattgctgaa caacgataat 9120
tctttctcga atattagtat taacaacttt ttataccaaa atgatcagaa ctccgcgtca 9180
gcggatccgg gaacaaataa aaaagccgtt acaaatgcag gtgccaactt caaaccacct 9240
tcaactggca gtaataccag ccaaggcagt atccttggaa gtacaaagca tggaatggac 9300
aactgtgatt tcaacgattt aggtaatttt aacaatttca tgacaaatgt caattattct 9360
ggggtcgact atgattacat tgtagatgca tcacttgggt tggctccttt attagtggat 9420
acgcccgata tctcaaatac caacacgacg tctactacgt caaatcgaag taaaaacagc 9480
atcatcctag atacgacatt taacgatgac ttggatcggt cacgcatgaa tgccagagaa 9540
gtattgaatc ctaccgactc aattttaagt caagggatgg tatcctccgt aagtacgaga 9600
aataccagca atcaaagatc tctttcatcg ggcaatgatt caaaaggtga cagtagttct 9660
caagagaact caaagagtgc aactggcaac cagttggata caccttctac actgtttcaa 9720
atgagaagga cctcttcagg gccctcggcg tcccaccgtg gtccaagacg gcctcagaaa 9780
aatcgttaca atacagatcg atcaaaaagt tctggtggcg gaagttccaa cacagataat 9840
gtatctgatt tattccaatg gcaaaacgcc aaaggctacc catacgacgt accagattac 9900
gcttaactcg agctctagag gttaactaag cgaatttctt atgatttatg atttttatta 9960
ttaaataagt tataaaaaaa ataagtgtat acaaatttta aagtgactct taggttttaa 10020
aacgaaaatt cttattcttg agtaactctt tcctgtaggt caggttgctt tctcaggtat 10080
agcatgaggt cgctcttatt gaccacatct ctaccggcat gccgagcaaa tgcctgcaaa 10140
tcgctcccca tttcacccaa ttgtagatat gctaactcca gcaatgagtt gatgaatctc 10200
ggtgtgtatt ttatgtcctc agaggacaac acctgttgta atcgttcttc cacacggatc 10260
cacagcctag ccttcagtcg tggcgaattc gtaatcatgg tcat 10304
<210> 4
<211> 1685
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggtatttat ttcttcataa acagttacaa caccctaaag agaatttaca agttgagtaa 60
aagacaagac accagctgaa gcttcgtacg ctgcaggtcg acggatcccc gggttaatta 120
aggcgcgcca gatctgttta gcttgcctcg tccccgccgg gtcacccggc cagcgacatg 180
gaggcccaga ataccctcct tgacagtctt gacgtgcgca gctcaggggc atgatgtgac 240
tgtcgcccgt acatttagcc catacatccc catgtataat catttgcatc catacatttt 300
gatggccgca cggcgcgaag caaaaattac ggctcctcgc tgcagacctg cgagcaggga 360
aacgctcccc tcacagacgc gttgaattgt ccccacgccg cgcccctgta gagaaatata 420
aaaggttagg atttgccact gaggttcttc tttcatatac ttccttttaa aatcttgcta 480
ggatacagtt ctcacatcac atccgaacat aaacaaccat gggtaaggaa aagactcacg 540
tttcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc 600
gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc 660
cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg 720
tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta 780
ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg caaaacagca ttccaggtat 840
tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc 900
ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg 960
ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc 1020
gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taagcttttg ccattctcac 1080
cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga 1140
aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg 1200
ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa 1260
aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt 1320
ttttctaatc agtactgaca ataaaaagat tcttgttttc aagaacttgt catttgtata 1380
gtttttttat attgtagttg ttctatttta atcaaatgtt agcgtgattt atattttttt 1440
tcgcctcgac atcatctgcc cagatgcgaa gttaagtgcg cagaaagtaa tatcatgcgt 1500
caatcgtatg tgaatgctgg tcgctatact gctgtcgatt cgatactaac gccgccatcc 1560
agtttaaacg agctcgaatt catcgatgat atcagatcca ctagtggcct atgcaagtat 1620
tgaatcctac cgactcaatt ttaagtcaag ggatggtatc ctccgtaagt acgagaaata 1680
ccagc 1685
<210> 5
<211> 1433
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 5
Met Ala Asn Asn Asn Ser Asp Arg Gln Gly Leu Glu Pro Arg Val Ile
1 5 10 15
Arg Thr Leu Gly Ser Gln Ala Leu Ser Gly Pro Ser Ile Ser Asn Arg
20 25 30
Thr Ser Ser Ser Glu Ala Asn Pro His Phe Ser Lys Asn Val Lys Glu
35 40 45
Ala Met Ile Lys Thr Ala Ser Pro Thr Pro Leu Ser Thr Pro Ile Tyr
50 55 60
Arg Ile Ala Gln Ala Cys Asp Arg Cys Arg Ser Lys Lys Thr Arg Cys
65 70 75 80
Asp Gly Lys Arg Pro Gln Cys Ser Gln Cys Ala Ala Val Gly Phe Glu
85 90 95
Cys Arg Ile Ser Asp Lys Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Pro Lys Gly Tyr
100 105 110
Thr Glu Ser Leu Glu Glu Arg Val Arg Glu Leu Glu Ala Glu Asn Lys
115 120 125
Arg Leu Leu Ala Leu Cys Asp Ile Lys Glu Gln Gln Ile Ser Leu Val
130 135 140
Ser Gln Ser Arg Pro Gln Thr Ser Thr Asp Asn Thr Ile Asn Gly Asn
145 150 155 160
Phe Lys His Asp Leu Lys Asp Ala Pro Leu Asn Leu Ser Ser Thr Asn
165 170 175
Ile Tyr Leu Leu Asn Gln Thr Val Asn Lys Gln Leu Gln Asn Gly Lys
180 185 190
Met Asp Gly Asp Asn Ser Gly Ser Ala Met Ser Pro Leu Gly Ala Pro
195 200 205
Pro Pro Pro Pro His Lys Asp His Leu Cys Asp Gly Val Ser Cys Thr
210 215 220
Asn His Leu His Val Lys Pro Thr Ser Thr Ser Leu Asn Asp Pro Thr
225 230 235 240
Ala Ile Ser Phe Glu Gln Asp Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ala Val Lys
245 250 255
Ala Leu Lys Ser Met Thr Thr His Gln Arg Ser Thr Gln Leu Ala Thr
260 265 270
Leu Val Ser Leu Ser Ile Pro Arg Ser Thr Glu Glu Ile Leu Phe Ile
275 280 285
Pro Gln Leu Leu Thr Arg Ile Arg Gln Ile Phe Gly Phe Asn Ser Lys
290 295 300
Gln Cys Leu Tyr Thr Val Ser Leu Leu Ser Ser Leu Lys Asn Arg Leu
305 310 315 320
Pro Ala Pro Arg Leu Leu Ala Pro Ser Thr Ser Thr Lys Leu Lys Glu
325 330 335
Lys Asp Glu Asp Lys Lys Leu Asp Asp Asp Ser Ala Phe Val Lys Arg
340 345 350
Phe Gln Ser Thr Asn Leu Ser Glu Phe Val Asp Leu Lys Lys Phe Leu
355 360 365
Ile Ser Leu Lys Phe Asn Ile Asn Ser Phe Ser Lys Gln Ser Glu Lys
370 375 380
Pro Ala Asn Asp Gln Asp Asp Glu Leu Leu Ser Leu Thr Glu Ile Lys
385 390 395 400
Glu Leu Leu His Leu Phe Phe Lys Phe Trp Ser Asn Gln Val Pro Ile
405 410 415
Leu Asn Asn Asp His Phe Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Phe Val Glu Val
420 425 430
Val Lys His Leu Ser Thr Glu Asn Leu Glu Thr Asn Asn Thr Thr Lys
435 440 445
Ser Thr Val Thr Thr Asn His Glu Ile Phe Ala Leu Lys Leu Leu Met
450 455 460
Met Leu Gln Met Gly Leu Leu Val Lys Ile Lys Met Glu Lys Ile Lys
465 470 475 480
Tyr Thr Val Pro Lys Asn Pro Lys Ala Lys Tyr Ala Arg Leu Met Ala
485 490 495
Tyr Tyr His Gln Leu Ser Leu Ile Ile Pro Lys Asn Pro Tyr Phe Leu
500 505 510
Asn Met Ser Thr Thr Ser Leu Pro Ser Leu Gln Leu Leu Ser Leu Ala
515 520 525
Ser Phe Tyr Tyr Leu Asn Val Gly Asp Ile Ser Ala Ile Tyr Gly Val
530 535 540
Arg Gly Arg Ile Val Ser Met Ala Gln Gln Leu Arg Leu His Arg Cys
545 550 555 560
Pro Ser Ala Val Leu Ser Val His Ser Asn Pro Val Leu Gln Lys Phe
565 570 575
Glu Gln Ser Glu Arg Arg Leu Leu Phe Trp Ala Ile Tyr Tyr Val Asp
580 585 590
Val Phe Ala Ser Leu Gln Leu Gly Val Pro Arg Leu Leu Lys Asp Phe
595 600 605
Asp Ile Glu Cys Ala Leu Pro Ile Ser Asp Val Glu Tyr Lys Asp Gln
610 615 620
Leu Ser Met Glu Asn Glu Lys Ala Asp Lys Lys Ala Lys Lys Ile Gln
625 630 635 640
Leu Gln Gly Gln Val Ser Ser Phe Ser Leu Gln Ile Ile Arg Phe Ala
645 650 655
Lys Ile Leu Gly Asn Ile Leu Asp Ser Ile Phe Lys Arg Gly Met Met
660 665 670
Asp Glu Arg Ile Thr Ser Glu Val Ala Leu Val His Glu Asn Ala Leu
675 680 685
Asp Asn Trp Arg Asn Gln Leu Pro Glu Met Tyr Tyr Phe Gln Ile Thr
690 695 700
Val Asn Gly Thr Val Asn Leu Asp Glu Ile Arg Ala Thr Asn Gln Arg
705 710 715 720
Asn Thr Glu Thr Lys Phe Asp Lys Lys Asp Ile Ile Leu Phe Glu Lys
725 730 735
Lys Ile Leu Leu Leu Phe Tyr Phe Leu Ala Lys Ser Met Ile His Leu
740 745 750
Pro Val Ile Ala Thr Lys Pro Leu Pro Lys Asn Val Asp Asn Ala Thr
755 760 765
Lys Lys Lys Gln Ser Met Phe Asn Asn Asp Ser Lys Gly Ala Thr Asn
770 775 780
Gln Asp His Met Ile Leu Asp Val Asp Met Thr Ser Pro Ala Ile Arg
785 790 795 800
Thr Ser Ser Ser Tyr Ile Ile Leu Gln Gln Ala Thr Asn Ala Thr Leu
805 810 815
Thr Ile Phe Gln Ala Ile Asn Ser Met Tyr Leu Pro Leu Pro Leu Asn
820 825 830
Val Ser Arg Thr Leu Ile Arg Phe Ser Leu Leu Cys Ala Arg Gly Ser
835 840 845
Leu Glu Tyr Thr Lys Gly Gly Ala Leu Phe Leu Asp Asn Lys Asn Leu
850 855 860
Leu Leu Asp Thr Ile Lys Asp Ile Glu Asn Asp Arg Leu Leu Asp Leu
865 870 875 880
Pro Gly Ile Ala Ser Trp His Thr Leu Lys Leu Phe Asp Met Ser Ile
885 890 895
Asn Leu Leu Leu Lys Ala Pro Asn Val Lys Val Glu Arg Leu Asp Lys
900 905 910
Phe Leu Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Tyr Asn Arg Leu Met Gly Leu Pro
915 920 925
Pro Ala Thr Thr Thr Ser Leu Lys Pro Leu Phe Gly Ser Gln Ser Lys
930 935 940
Asn Ser Leu Glu Asn Arg Gln Arg Thr Pro Asn Val Lys Arg Glu Asn
945 950 955 960
Pro Glu His Glu Tyr Leu Tyr Gly Asn Asp Ser Asn Asn Asn Asn Asn
965 970 975
Ser Glu Ala Gly His Ser Pro Met Thr Asn Thr Thr Asn Gly Asn Lys
980 985 990
Arg Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Lys Arg Asn Ala Lys Asp Gly Gly
995 1000 1005
Ile Ser Lys Gly Glu Asn Ala His Asn Phe Gln Asn Asp Thr Lys Lys
1010 1015 1020
Asn Met Ser Thr Ser Asn Leu Phe Pro Phe Ser Phe Ser Asn Thr Asp
1025 1030 1035 1040
Leu Thr Ala Leu Phe Thr His Pro Glu Gly Pro Asn Cys Thr Asn Thr
1045 1050 1055
Asn Asn Gly Asn Val Asp Val Cys Asn Arg Ala Ser Thr Asp Ala Thr
1060 1065 1070
Asp Ala Asn Ile Glu Asn Leu Ser Phe Leu Asn Met Ala Pro Phe Leu
1075 1080 1085
Gln Thr Gly Asn Ser Asn Ile Gly Gln Asn Thr Ile Glu Asn Lys Pro
1090 1095 1100
Met His Met Asp Ala Ile Phe Ser Leu Pro Ser Asn Leu Asp Leu Met
1105 1110 1115 1120
Lys Asp Asn Met Asp Ser Lys Pro Glu Gln Leu Glu Pro Val Ile Lys
1125 1130 1135
Gln Asn Pro Glu Asn Ser Lys Asn Asn Gln Phe His Gln Lys Gly Lys
1140 1145 1150
Ser Thr Asn Met Glu Lys Asn Asn Leu Ser Phe Asn Asn Lys Ser Asn
1155 1160 1165
Tyr Ser Leu Thr Lys Leu Met Arg Leu Leu Asn Asn Asp Asn Ser Phe
1170 1175 1180
Ser Asn Ile Ser Ile Asn Asn Phe Leu Tyr Gln Asn Asp Gln Asn Ser
1185 1190 1195 1200
Ala Ser Ala Asp Pro Gly Thr Asn Lys Lys Ala Val Thr Asn Ala Gly
1205 1210 1215
Ala Asn Phe Lys Pro Pro Ser Thr Gly Ser Asn Thr Ser Gln Gly Ser
1220 1225 1230
Ile Leu Gly Ser Thr Lys His Gly Met Asp Asn Cys Asp Phe Asn Asp
1235 1240 1245
Leu Gly Asn Phe Asn Asn Phe Met Thr Asn Val Asn Tyr Ser Gly Val
1250 1255 1260
Asp Tyr Asp Tyr Ile Val Asp Ala Ser Leu Gly Leu Ala Pro Leu Leu
1265 1270 1275 1280
Val Asp Thr Pro Asp Ile Ser Asn Thr Asn Thr Thr Ser Thr Thr Ser
1285 1290 1295
Asn Arg Ser Lys Asn Ser Ile Ile Leu Asp Thr Thr Phe Asn Asp Asp
1300 1305 1310
Leu Asp Arg Ser Arg Met Asn Ala Arg Glu Val Leu Asn Pro Thr Asp
1315 1320 1325
Ser Ile Leu Ser Gln Gly Met Val Ser Ser Val Ser Thr Arg Asn Thr
1330 1335 1340
Ser Asn Gln Arg Ser Leu Ser Ser Gly Asn Asp Ser Lys Gly Asp Ser
1345 1350 1355 1360
Ser Ser Gln Glu Asn Ser Lys Ser Ala Thr Gly Asn Gln Leu Asp Thr
1365 1370 1375
Pro Ser Thr Leu Phe Gln Met Arg Arg Thr Ser Ser Gly Pro Ser Ala
1380 1385 1390
Ser His Arg Gly Pro Arg Arg Pro Gln Lys Asn Arg Tyr Asn Thr Asp
1395 1400 1405
Arg Ser Lys Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Asn Thr Asp Asn Val Ser
1410 1415 1420
Asp Leu Phe Gln Trp Gln Asn Ala Lys
1425 1430
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