一种果蔬中不可萃取多酚的制备方法
阅读说明：本技术 一种果蔬中不可萃取多酚的制备方法 (Preparation method of non-extractable polyphenol in fruits and vegetables ) 是由 程安玮 罗凯云 崔文玉 丰程凤 夏智慧 郭时印 吴卫国 于 2021-03-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于食品精加工领域,具体提供一种果蔬中不可萃取多酚的制备方法,本发明通过果胶酶和单宁酶复合酶解的作用,将NEPP从果胶中释放出来,并通过单宁酶转换成方便提取的多酚,本发明多酚提取率高,方法简单,不需要辅以酸碱。危害小,污染物少,适合操作以及大规模工业化生产。(The invention belongs to the field of food finishing, and particularly provides a preparation method of non-extractable polyphenol in fruits and vegetables. The harm is small, the pollutant is less, and the method is suitable for operation and large-scale industrial production.)
技术领域
本发明属于食品精加工领域，具体的，涉及一种果蔬中不可萃取多酚的制备方法。
背景技术
植物多酚是一类存在于植物中的多羟基类化合物的总称，主要存在于植物的皮、根、叶、壳、果实及种子中，被认为是人类的第7大类营养素。多酚中活性酚羟基使其具有独特的化学和生理活性，主要表现抗氧化、清除自由基等功能。
果蔬原料中多酚含量丰富，根据多酚结合方式和萃取方法的不同，将其分为可萃取多酚和不可萃取多酚。所谓可萃取多酚主要是指通过简单的有机溶剂萃取或水就可以获得的处于游离状态的多酚，不可萃取多酚主要是指结合于细胞壁上的一些水合单宁酸和原花青素等，需通过化学或者酶处理等方法，打破多酚物质与细胞壁结合的化学键，才将其分离出来。
目前对果蔬原料中多酚的研究主要集中在可萃取多酚，而很少关注不可萃取多酚。如果考虑不可萃取多酚，果蔬原料中含有的有益多酚如原青花素、鞣花酸、儿茶酚含量远远超出人们的估计。目前这些不可萃取多酚一直不被列为食物的营养组成，实际上这些不可萃取多酚是食物中具有生物活性的成分，可被结肠中细菌发酵，产生的代谢产物对人体十分有益。
现有技术中，不可萃取多酚的提取方法主要有酸法和碱法，酸法主要是用硫酸和甲醇按一定比例混合作为萃取溶剂，通过加热水解的方法将不可萃取多酚游离出来。碱法是用1-5mol/L的NaOH作为萃取溶剂进行水解将不可萃取多酚游离出来，这两种方法都需要用强酸或者强碱，产生的废液易造成环境污染，需非常注意其安全性。
发明内容
针对现有技术中，对于不可萃取多酚制备的技术缺点，本发明提供一种果蔬中不可萃取多酚的制备方法。
一种果蔬中不可萃取多酚的制备方法，包括下述步骤：
（1）果蔬原料打浆或者干燥，用乙醇提取可萃取多酚后，收集剩余的残渣，并在50℃以下干燥，得到残渣干粉；
（2）向残渣干粉中加入单宁酸酶和果胶酶的缓冲液，进行酶解处理，得到酶解溶液；
（3）酶解液离心分离收集上清液，剩余残余物洗涤1次，离心合并两次上清液，得不可萃取多酚粗提液，然后105℃加热5min进行灭酶处理；
（4）将不可萃取多酚粗提液进一步浓缩，至原体积的1/2-1/3，得到不可萃取多酚粗提浓缩液；
（5）不可萃取多酚粗提浓缩液用乙酸乙酯与乙醇的混合液进行萃取，静止分层后，上层为油相，下层为水相，收集水相，合并得不可萃取多酚萃取液；
（6）将不可萃取多酚萃取液进一步浓缩，至原体积的1/3-1/5，过滤收集滤液，冷冻干燥，得不可萃取多酚冻干粉。
优选的，步骤（1）中的果蔬原料的干燥为果蔬干物质打粉处理，粉碎粒度为40-80目。
优选的，步骤（1）采用下述方式完成：将果蔬原料处理后与50%-80%乙醇按照1:20-40（g：mL）比例混匀，然后以200-500W超声频率超声1-2h，再以3000-5000r/min离心10-20min，收集果蔬残渣。
其中，步骤（2）中单宁酸酶和果胶酶的缓冲液为：用0.05-0.2mol/L的乙酸钠缓冲液溶解，缓冲液的pH为5.0-6.0，单宁酸酶的浓度为50-100U/mL，果胶酶的浓度为10-20U/mL。
优选的，步骤（2）中，酶解温度范围为35-42℃，酶解时间为15-25h，震荡速度为10-20rpm。
其中，步骤（3）中，酶解液冷却后将其在4000-6000r/min转速下离心10-15min，收集上清液，残余物再用2-4倍体积的纯水震荡洗涤10-15min，并在4000-6000r/min转速下离心10-15min，合并两次上清液，然后105℃加热5min进行灭酶处理后冷却。
其中，步骤（5）中，所述的混合液体中乙酸乙酯与乙醇的体积比为1:1-3，优选的，体积比为1:1。
其中，步骤（5）中，所述的萃取次数为4-6次。
不可萃取多酚中重要的一大类为单宁，很大一部分附着于果胶上，本发明通过果胶酶酶解果胶，释放单宁。单宁是多酚化合物，单宁酸不是单一的化合物，化学组成比较复杂，大致分为两种：一是缩合单宁酸，是黄烷醇衍生物；二是可水解单宁酸，分子中具有酯键。单宁酸酶严格从酶学含义即是单宁酰水解酶，这就意味着该水解酶存在有一个丝氨酸活性位点，它拥有酯酶活性和缩酚酸的双重活性，即是说它能水解单宁中的酯键和缩酚键。
本发明在酶解中添加单宁酶，可以将缩合单宁酸和水解单宁酸都进行水解，释放出游离的儿茶酚、没食子酸等成分，因此就提高了不可萃取多酚的提取率量。
本发明有益效果
本发明提供了公开了使用单宁酸酶和果胶酶缓冲液水解提取不可萃取多酚的方法。与现有技术的酸法（硫酸/甲醇）加热水解提取工艺相比：
本发明不需要高温加热，不要硫酸等危险化学试剂或强碱性条件，具有实验条件温和、安全性高，不会产生大量的危险性废弃物，操作步骤简单、提取物纯度高等特点。
具体实施方式
以下实施例，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。
实施例1
选择苹果榨汁后剩余的果渣，按照1：25（g/mL）的比例加入50%乙醇水溶液；500W超声萃取1h，5000r/min离心10min。
过滤后将获得的果渣放烘箱中50℃烘干，然后粉碎至60目。单宁酸酶和果胶酶用0.1mol/L的乙酸钠缓冲液溶解（pH5.5），至单宁酸酶的浓度为50U/mL，果胶酶浓度为20U/mL。
果渣按照1:25（g/mL）的比例与混合酶缓冲液混匀，酶解温度为38℃，酶解时间为20h，震荡速度为20r/min。酶解完成后6000r/min转速下离心10min，收集上清液，残余物再用2倍体积的纯水震荡洗涤10min，并在6000r/min转速下离心10min，合并两次上清液，然后105℃加热5min进行灭酶处理后冷却。
将合并的上清液浓缩至原体积的1/3，得到不可萃取多酚粗提浓缩液。配制萃取溶剂乙酸乙酯与乙醇的比例为1:1，然后不可萃取多酚粗提浓缩液与萃取溶剂（乙酸乙酯与乙醇）按照1:1比例混合震荡混匀，静置到分层，收集下层水相，重复萃取6次，合并水相，然后浓缩至原体积的1/5，然后冷冻干燥，得不可萃取多酚冻干粉。
使用Folin-Ciocalteu法在765nm条件下测定不可萃取多酚的含量，测得其含量为9.2mg/g。
实施例2
选择新鲜、成熟的蓝莓为原料，剔除霉烂果、病虫果及杂质并在清水中除去泥沙及漂浮物。将沥干水后的蓝莓粉碎打浆，然后按照1：30（g/mL）的比例加入50%乙醇溶液，200W超声萃取2h，3000r/min离心20min。
单宁酸酶的和果胶酶用0.1mol/L的乙酸钠缓冲液溶解（pH=5.0），至单宁酸酶的浓度为100U/mL，果胶酶浓度为10U/mL，过滤后将获得的果渣按照1:25（g/mL）的比例与混合酶缓冲液混匀，酶解温度为38℃，酶解时间为20h，震荡速度为20r/min。反应完全后105℃加热5min进行灭酶处理，酶解液冷却后在6000r/min转速下离心10min，收集上清液，残余物再用2倍体积的纯水震荡洗涤10min，并在6000r/min转速下离心10min，合并两次上清液，然后105℃加热5min进行灭酶处理后冷却。
将合并的上清液浓缩至原体积的1/3，得到不可萃取多酚粗提浓缩液。配置萃取溶剂乙酸乙酯与乙醇的比例为1:1，然后不可萃取多酚粗提浓缩液与萃取溶剂按照1:1比例震荡混匀，静置到分层，收集下层水相，重复萃取6次，合并水相，然后浓缩至原体积的1/5，然后冷冻干燥，得不可萃取多酚冻干粉。
使用Folin-Ciocalteu法在765nm条件下测定不可萃取多酚的含量，测得其含量为11.5mg/g。
实施例3
选择葡萄酒酿造后剩余的残渣，剔除葡萄梗和籽，留下葡萄皮渣，粉碎到60目，然后按照1：40（g/mL）的比例加入50%乙醇水溶液，400W超声萃取2h，4000r/min离心20min。重复提取两次。
选用单宁酸酶和果胶酶用0.05mol/L的乙酸钠缓冲液溶解（pH6.0），至单宁酸酶的浓度为75U/mL，果胶酶浓度为15U/mL。过滤后将获得的果渣按照1:30（g/mL）的比例与混合酶缓冲液混匀，酶解温度为35℃，酶解时间为24h，震荡速度为20r/min。反应完全后105℃加热5min进行灭酶处理，酶解液冷却后在4000r/min转速下离心15min，收集上清液，残余物再用2倍体积的纯水震荡洗涤10min，并在4000r/min转速下离心15min，合并两次上清液，然后105℃加热5min进行灭酶处理后冷却。
将合并的上清液浓缩至原体积的1/3，得到不可萃取多酚粗提浓缩液。配置萃取溶剂乙酸乙酯与乙醇的比例为1:1，然后不可萃取多酚粗提浓缩液与萃取溶剂按照1:1比例震荡混匀，静置到分层，收集下层水相，重复萃取6次，合并水相，然后浓缩至原体积的1/5，然后冷冻干燥，得不可萃取多酚的冻干粉。
使用Folin-Ciocalteu法在765nm条件下测定不可萃取多酚的含量，测得其含量为10.9mg/g。
对比例1
仅采用果胶酶酶解果渣，果胶酶浓度50U/ml，其他步骤和参数同实施例2，使用Folin-Ciocalteu法在765nm条件下测定不可萃取多酚的含量，测得其含量为6.3mg/g。
对比例2
采用果胶酶和纤维素酶酶解果渣，果胶酶浓度50U/ml，纤维素酶浓度5U/ml，其他步骤和参数同实施例2，使用Folin-Ciocalteu法在765nm条件下测定不可萃取多酚的含量，测得其含量为7.2mg/g。
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