阅读说明：本技术 一种丁香酚的微生物合成方法 (Microbial synthesis method of eugenol ) 是由 赵广荣 曹嘉誉 于 2020-06-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种丁香酚的微生物合成方法。本发明提供的松柏醇酰基转移酶CFAT,其氨基酸序列和其核苷酸序列分别用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示,丁香酚合成酶EGS2、APS1和AIS1,其核苷酸序列分别用SEQ ID No.6、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11所示。松柏醇酰基转移酶和丁香酚合成酶EGS2组合,或松柏醇酰基转移酶和丁香酚合成酶APS1组合,或松柏醇酰基转移酶和丁香酚合成酶AIS1组合,能高效催化松柏醇合成丁香酚,减少中间体积累,为微生物发酵丁香酚的工业化生产奠定了基础。(The invention discloses a microbial synthesis method of eugenol. The amino acid sequence and the nucleotide sequence of coniferyl alcohol acyltransferase CFAT provided by the invention are respectively shown by SEQ ID No.1 and SEQ ID No.2, and the nucleotide sequences of eugenol synthetase EGS2, APS1 and AIS1 are respectively shown by SEQ ID No.6, SEQ ID No.9 and SEQ ID No. 11. The combination of coniferyl alcohol acyltransferase and eugenol synthetase EGS2, or the combination of coniferyl alcohol acyltransferase and eugenol synthetase APS1, or the combination of coniferyl alcohol acyltransferase and eugenol synthetase AIS1 can efficiently catalyze coniferyl alcohol to synthesize eugenol, reduce the accumulation of intermediates, and lay the foundation for the industrial production of eugenol by microbial fermentation.)

一种丁香酚的微生物合成方法

技术领域

本发明所属生物农药技术领域，涉及一种松柏醇酰基转移酶和三种丁香酚合成酶在微生物中转化松柏醇合成丁香酚中的应用。

背景技术

丁香酚是一种高效的植物源生物农药，主要用于防治番茄灰霉病、葡萄霜霉病和马铃薯晚疫病等重要的农业病害。目前国内采用从丁香等植物中提取制备丁香酚，存在含量低、生长缓慢等原料来源问题。

据文献报道，松柏醇酰基转移酶(CFAT)可催化松柏醇发生酰基化反应生成乙酸松柏酯，丁香酚合成酶(EGS)催化乙酸松柏酯发生还原反应生成丁香酚，其途径如图1所示。

松柏醇酰基转移酶(CFAT)属于BAHD酰基转移酶家族，已经从矮牵牛、樱桃李、苹果等植物中鉴定了基因并进行酶学表征^[1-4]。丁香酚合成酶是NADPH依赖性还原酶，将乙酸松柏酯侧链上的酯键还原成烯丙基。目前已经有罗勒、啤酒花、牵牛、月季、草莓、手参等多种植物来源的丁香酚合成酶被鉴定[5-9]。在大肠杆菌异源合成丁香酚产量低，在20mg/L以下。如LtCAAT1/LtAPS1的组合，合成了约27mg/L丁香酚[10]，是目前文献报道最高产量。

[1]Dexter R,Qualley A,Kish C M,et al.Characterization of a petuniaacetyltransferase involved in the biosynthesis of the floral volatileisoeugenol[J].Plant J.,2007,49(2):265-275.

[2]Koeduka T,Orlova I,Baiga T J,et al.The lack of floral synthesisand emission of isoeugenol in petunia axillaris subsp.Parodii is due to amutation in the isoeugenol synthase gene[J].Plant J., 2009,58(6):961-969.

[3]Zhang T,Huo T,Ding A,et al.Genome-wide identification,characterization,expression and enzyme activity analysis of coniferyl alcoholacetyltransferase genes involved in eugenol biosynthesis in Prunus mume[J].PLoS One,2019,14(10):e0223974.

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[6]晏慧君,张颢,蹇洪英,等.月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的克隆及表达分析[J].中国农业科学,2012,45(3):590-597.

[7]王海萍,晏慧君,张颢,等.月季(Rosa chinensis)丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及其表达分析[J].园艺学报,2012,39(7):1387.

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[10]Kim S J,Vassao D G,Moinuddin S G,et al.Allyl/propenyl phenolsynthases from the Creosote bush and engineering production of specialty/commodity chemicals,eugenol/isoeugenol,in Escherichia coli[J].Arch.Biochem.Biophys.,2014,541:37-46.

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种丁香酚的微生物合成方法，解决现有技术中制备丁香酚含量低的问题。

本发明的技术方案概述如下：

一种丁香酚的微生物合成方法，组合表达松柏醇酰基转移酶CFAT和丁香酚合成酶EGS2，以松柏醇为底物直接合成丁香酚。所述松柏醇酰基转移酶CFAT的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，丁香酚合成酶EGS2的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

一种丁香酚的微生物合成方法，组合表达松柏醇酰基转移酶CFAT和丁香酚合成酶APS1，以松柏醇为底物直接合成丁香酚。所述松柏醇酰基转移酶CFAT的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，丁香酚合成酶APS1的基因序列如SEQ IDNo.9所示。

一种丁香酚的微生物合成方法，组合表达松柏醇酰基转移酶CFAT和丁香酚合成酶AIS1，以松柏醇为底物直接合成丁香酚。所述松柏醇酰基转移酶CFAT的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，丁香酚合成酶AIS1的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。

松柏醇酰基转移酶CFAT和丁香酚合成酶EGS2或APS1或AIS1组合，以松柏醇为底物，在丁香酚合成中的应用。

本发明的优点：

本发明通过微生物法转化松柏醇生成丁香酚，并筛选到一种松柏醇酰基转移酶和三种丁香酚合成酶的组合表达，建立生物合成方法，以松柏醇为底物直接合成了丁香酚。本发明通过大肠杆菌表达，筛选出最优酶及其组合，丁香酚产量达到200mg/L以上，有利于工业化生产丁香酚。

附图说明

图1为微生物法转化松柏醇生成丁香酚途径；

图2为菌株BEG1发酵样品气相色谱图；

图3为菌株BEG1发酵样品质谱图；

图4为丁香酚标准品质谱图。

具体实施方式

本发明所用大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)和E.coli DH5α购买自北京全式金生物技术有限公司。

LB培养基组成为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。

M9Y培养基组成为：6.8g/L Na₂HPO₄、3.0g/LKH₂PO₄、1.0g/L NaCl、0.5g/L NH₄Cl、1.0 g/L酵母粉，余量为水，培养基在0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。灭菌完后加入终浓度为2mM MgSO₄、0.1mM CaCl₂和10g/L葡萄糖。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1(类)松柏醇酰基转移酶的获得

松柏醇酰基转移酶可催化松柏醇发生酰基化反应生成乙酸松柏酯，通过生物信息分析和序列比对等方式挖掘，筛选出三种松柏醇酰基转移酶，它们分别是CFAT(GenBank:ABG75942.1)、 CAAT1(GenBank:KF543260.1)和AT(NCBI:NP_178020.1)。下面以松柏醇酰基转移酶PhCFAT 为例，说明如何获取(类)松柏醇酰基转移酶。

结合松柏醇酰基转移酶CFAT的氨基酸序列及大肠杆菌对密码子的偏好性，去除常用酶切位点，设计全长CFAT基因，所述核酸序列如SEQ ID No.2示。设计将CFAT基因连接在质粒 pCDFDuet-1第一个T7启动子下游，全人工合成两端分别加上Nco I和BamH I酶切位点的 P_T7-CFAT基因片段，得到的基因片段命名为synCFAT。

将通过化学全合成得到的synCFAT片段，通过PCR方法扩增。用高保真DNA聚合酶，建立PCR体系。以synCFAT-F(SEQ ID No.3)和synCFAT-R(SEQ ID No.4)为引物，synCFAT 片段为模板大量扩增制备。

PCR过程是，95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，循环数为30个。扩增synCFAT片段，纯化扩增产物后，备用。

采取类似方法，获得了AT和CAAT1的基因序列。

实施例2丁香酚合成酶的获得

丁香酚合成酶催化乙酸松柏酯发生还原反应生成丁香酚。通过生物信息分析和序列比对等方式挖掘，筛选出四种丁香酚合成酶。它们分别是EGS1(GenBank:ABR24113.1)、EGS2 (GenBank:AKB11750.1)、APS1(GenBank:KF543262.1)和AIS1(GenBank:ACL13526.1)。下面以丁香酚合成酶EGS2为例，说明如何获取丁香酚合成酶。

结合丁香酚合成酶EGS2的氨基酸序列及大肠杆菌对密码子的偏好性，去除常用酶切位点，设计全长EGS2基因，所述核酸序列如SEQ ID No.6示。设计将EGS2基因连接在质粒pCDFDuet-1第二个T7启动子下游，全人工合成两端分别加上Nde I和Kpn I酶切位点的P_T7-EGS2基因片段，得到的基因片段命名为synEGS2。

将通过化学全合成得到的synEGS2片段，通过PCR方法扩增。用高保真DNA聚合酶，建立PCR体系。以synEGS2-F(SEQ ID No.7)和synEGS2-R(SEQ ID No.8)为引物，synEGS2 片段为模板大量扩增制备。

PCR过程是，95℃预变性5min；95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸30s，循环数为30个。扩增synEGS2片段，纯化扩增产物后，备用。

采取类似方法，获得了EGS1、APS1和AIS1的基因序列。

实施例3重组表达载体的构建

将优化后的两类基因进行组合，连接至质粒pCDFDuet-1上，其中松柏醇酰基转移酶***至酶切位点Nco I和BamH I之间，丁香酚合成酶***至酶切位点Nde I和Kpn I之间。下面以重组表达载体pCPG1为例，说明如何构建重组表达载体。

将synPhCFAT片段使用FastDigest内切酶Nco I和BamH I进行酶切，反应体系为：5μL 10*FD buffer、2μL Nco I内切酶、2μL BamH I内切酶、41μL synCFAT片段。反应条件为：37℃， 2h。并用试剂盒纯化回收得到用Nco I和BamH I双酶切的synCFAT片段。将纯化回收后得到的synCFAT片段与用相同酶酶切得到的线性化载体骨架pCDFDuet-1(包括复制子和抗性片段部分)进行连接反应得到pCP质粒。其连接反应体系为：1μL 10*T4 DNA LigaseBuffer、1μL T4 DNA Ligase、6μL用纯化回收后得到的synCFAT片段和2μL相同酶酶切得到的线性化载体骨架。连接反应条件为：30℃，0.5h。同理，使用FastDigest内切酶Nde I和KpnI酶切synEGS2 片段和pCP质粒，各自回收纯化后再通过连接反应得到重组表达载体pCEG1。

各重组表达载体的组合如下：

pCEG1：pCDFDuet-1，P_T7-CFAT-P_T7-EGS2；

pCEG2：pCDFDuet-1，P_T7-CFAT-P_T7-APS1；

pCEG3：pCDFDuet-1，P_T7-CFAT-P_T7-EGS1；

pCEG4：pCDFDuet-1，P_T7-CFAT-P_T7-AIS1；

pCEG5：pCDFDuet-1，P_T7-AT-P_T7-EGS1；

pCEG6：pCDFDuet-1，P_T7-AT-P_T7-EGS2；

pCEG7：pCDFDuet-1，P_T7-AT-P_T7-APS1；

pCEG8：pCDFDuet-1，P_T7-AT-P_T7-AIS1；

pCEG9：pCDFDuet-1，P_T7-CAAT1-P_T7-EGS1；

pCEG10：pCDFDuet-1，P_T7-CAAT1-P_T7-EGS2；

pCEG11：pCDFDuet-1，P_T7-CAAT1-P_T7-APS1；

pCEG12：pCDFDuet-1，P_T7-CAAT1-P_T7-AIS1。

实施例4重组大肠杆菌的构建及生物转化合成丁香酚

1.重组大肠杆菌的构建

将所构建的重组表达载体电击转化进入宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，得到重组菌株 BEG1-BEG12。

2.重组菌BEG1-BEG12生物转化合成丁香酚

将重组菌BEG1-BEG12接种在LB培养基中，37℃，220rpm，震荡培养12h，然后按1％的接种量添加到新鲜LB培养基中，培养至OD₆₀₀约等于1时加入0.1mM IPTG，继续培养5-6h后等比例转接到M9Y发酵培养基中，添加400mg/L松柏醇，30℃，220rpm发酵12h，转化合成丁香酚。

发酵结束后，取有机相50μL，稀释至10倍体积的乙酸乙酯溶剂中，震荡混匀2min，除水，用0.22μm的微孔滤膜过滤后进行气相色谱(GC)系统检测。气相色谱仪仪器型号为Agilent 7820A，气相色谱柱为HP-5(30m*0.25mm，0.25μm film thick ness)，检测器为FID火焰检测器。升温程序为初始温度60℃，保持1min，20℃/min升到240℃，保持5min，之后10℃/min 升到280℃，然后320℃后运行8min。进样口温度为280℃，检测器温度为320℃。氮气的流速为3mL/min，分流比为10。

如图2所示，气相检测出现了新峰，与丁香酚标准品具有相同的保留时间。进一步质谱分析，如图3所数据显示，新合成的产物与丁香酚标准品(图4)具有相同的离子图谱，为此新合成的产物为丁香酚。进行计算，各菌株合成丁香酚的产量如表1所示，其在12个菌株中，菌株BEG1合成最多的丁香酚，为207.32mg/L；其次是BEG2和BEG4，丁香酚产量分别为196.30mg/L和188.71mg/L；其余菌株都较低，在30mg/L以下。实验数据表明，CFAT和丁香酚合成酶EGS2组合表达较其它组合而言更具有优势，其次是松柏醇酰基转移酶CFAT分别和丁香酚合成酶APS1以及丁香酚合成酶AIS1的组合表达，但都远高于AT和CAAT1与丁香酚合成酶组合表达的效果，说明松柏醇酰基转移酶CFAT较AT和CAAT1而言，更适合用于丁香酚生物合成过程。

表1.菌株发酵结果

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

<110> 天津大学

<120> 一种丁香酚的微生物合成方法

<160> 11

<210> 1

<211> 454

<212> PRT

<213> Petunia x hybrida

<400> 1

Met Gly Asn Thr Asp Phe His Val Thr Val Lys Lys Lys Glu Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Val Leu Pro Met His His Glu His Trp Leu Pro Met Ser Asn

20 25 30

Leu Asp Leu Leu Leu Pro Pro Leu Asp Phe Gly Val Phe Phe Cys Tyr

35 40 45

Lys Arg Ser Lys Ile Asn Asn Asp Thr Lys Asp Asp Asp Glu Thr Ile

50 55 60

Lys Lys Ala Leu Ala Glu Thr Leu Val Ser Phe Tyr Ala Leu Ala Gly

65 70 75 80

Glu Val Val Phe Asn Ser Leu Gly Glu Pro Glu Leu Leu Cys Asn Asn

85 90 95

Arg Gly Val Asp Phe Phe His Ala Tyr Ala Asp Ile Glu Leu Asn Asn

100 105 110

Leu Asp Leu Tyr His Pro Asp Val Ser Val His Glu Lys Leu Ile Pro

115 120 125

Ile Lys Lys His Gly Val Leu Ser Val Gln Val Thr Gly Leu Lys Cys

130 135 140

Gly Gly Ile Val Val Gly Cys Thr Phe Asp His Arg Val Ala Asp Ala

145 150 155 160

Tyr Ser Ala Asn Met Phe Leu Val Ala Trp Ala Ala Ile Ala Arg Lys

165 170 175

Asp Asn Asn Ile Asn Thr Val Ile Pro Ser Phe Arg Arg Ser Leu Leu

180 185 190

Asn Pro Arg Arg Pro Pro Gln Phe Asp Asp Ser Phe Ile Asp Ser Thr

195 200 205

Tyr Val Phe Leu Ser Ser Pro Pro Lys Gln Pro Asn Asp Val Leu Thr

210 215 220

Ser Arg Val Tyr Tyr Ile Asn Ser Gln Glu Ile Asn Leu Leu Gln Ser

225 230 235 240

Gln Ala Thr Arg Asn Gly Ser Lys Arg Ser Lys Leu Glu Cys Phe Ser

245 250 255

Ala Phe Leu Trp Lys Thr Ile Ala Glu Gly Gly Ile Asp Asp Ser Lys

260 265 270

Arg Cys Lys Leu Gly Ile Val Val Asp Gly Arg Gln Arg Leu Arg His

275 280 285

Asp Ser Ser Thr Thr Met Lys Asn Tyr Phe Gly Asn Val Leu Ser Val

290 295 300

Pro Tyr Thr Glu Ala Ser Val Gly Gln Leu Lys Gln Thr Pro Leu Gly

305 310 315 320

Lys Val Ala Asp Leu Val His Thr Cys Leu Asp Asn Val Ala Asn Glu

325 330 335

His His Phe Pro Ser Leu Ile Asp Trp Val Glu Leu His Arg Pro Arg

340 345 350

Gln Ala Ile Val Lys Val Tyr Cys Lys Asp Glu Cys Asn Asp Glu Ala

355 360 365

Ala Ile Val Val Ser Ser Gly Leu Arg Phe Pro Leu Ser Gln Val Asn

370 375 380

Phe Gly Trp Gly Cys Pro Asp Phe Gly Ser Tyr Ile Phe Pro Trp Gly

385 390 395 400

Gly Gln Thr Gly Tyr Val Met Pro Met Pro Ser Pro Asn Lys Asn Gly

405 410 415

Asp Trp Ile Val Tyr Met His Leu Gln Lys Lys His Leu Asp Leu Val

420 425 430

Glu Thr Arg Ala Pro His Ile Phe His Pro Leu Thr Ala Cys Tyr Leu

435 440 445

Asp Leu Thr Ala Thr Tyr

450

<210> 2

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggtaaca ccgatttcca cgtgaccgtg aagaagaaag aggtggttgc ggcggtgctg 60

ccgatgcacc acgaacactg gctgccgatg agcaacctgg atctgctgct gccgccgctg 120

gactttggcg ttttcttttg ctacaaacgt agcaagatca acaacgacac caaagacgat 180

gacgagacca ttaaaaaggc gctggcggaa accctggtga gcttctatgc gctggcgggt 240

gaggtggttt ttaacagcct gggcgagccg gaactgctgt gcaacaaccg tggtgttgat 300

ttctttcacg cgtacgcgga catcgagctg aacaacctgg atctgtatca cccggacgtg 360

agcgttcacg aaaaactgat cccgattaaa aagcacggtg tgctgagcgt gcaggttacc 420

ggcctgaagt gcggtggcat cgtggttggc tgcaccttcg atcaccgtgt ggcggacgcg 480

tacagcgcga acatgtttct ggttgcgtgg gcggcgattg cgcgtaaaga taacaacatc 540

aacaccgtga ttccgagctt ccgtcgtagc ctgctgaacc cgcgtcgtcc gccgcaattc 600

gatgacagct ttatcgatag cacctatgtt tttctgagca gcccgccgaa gcagccgaac 660

gatgtgctga ccagccgtgt ttactatatc aacagccaag agattaacct gctgcaaagc 720

caagcgaccc gtaacggtag caaacgtagc aagctggagt gcttcagcgc gtttctgtgg 780

aaaaccatcg cggaaggtgg cattgatgac agcaaacgtt gcaagctggg tattgtggtt 840

gatggccgtc agcgtctgcg tcacgacagc agcaccacca tgaagaacta cttcggtaac 900

gtgctgagcg ttccgtatac cgaagcgagc gttggtcagc tgaaacaaac cccgctgggc 960

aaggtggcgg atctggttca cacctgcctg gacaacgtgg cgaacgagca ccactttccg 1020

agcctgatcg attgggttga actgcaccgt ccgcgtcaag cgattgtgaa agtttactgc 1080

aaggatgagt gcaacgacga agcggcgatc gtggttagca gcggtctgcg tttcccgctg 1140

agccaggtga actttggttg gggctgcccg gacttcggta gctacatttt tccgtggggt 1200

ggccaaaccg gctatgttat gccgatgccg agcccgaaca agaacggcga ttggatcgtg 1260

tacatgcacc tgcaaaagaa gcacctggac ctggttgaaa cccgtgcgcc gcacattttc 1320

cacccgctga ccgcgtgcta cctggacctg accgcgacct attaa 1365

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catgccatgg gtaacaccga tttc 24

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcggatcct taataggtcg cgg 23

<210> 5

<211> 328

<212> PRT

<213> Gymnadenia x densiflora

<400> 5

Met Ser Ser Gln Ile Met Thr Lys Ser Ala Ser Lys Val Leu Val Ile

1 5 10 15

Gly Ala Thr Gly Tyr Ile Gly Lys Tyr Leu Val Glu Ala Ser Val Lys

20 25 30

Leu Gly His Pro Thr Phe Ala Leu Val Arg Ser Pro Val Ile Ala Ala

35 40 45

Ser His Pro Asp Thr His Arg Ala Asp Glu Glu Gly Arg Asn Asn Leu

50 55 60

Ile Gln Ser Phe His Asn Ala Gly Val His Val Leu Phe Gly Asp Val

65 70 75 80

Asn Asp Arg Glu Val Leu Val Gly Ala Met Lys Lys Val Asp Val Val

85 90 95

Tyr Ser Ala Leu Ala His His Pro Cys Lys Leu Leu Glu Gln Gln Thr

100 105 110

His Ile Ile Ala Ala Ile Lys Gln Ala Gly Asn Ile Lys Arg Phe Phe

115 120 125

Pro Ser Glu Phe Gly Phe Asp Ile Glu Arg Gly Gln Phe Leu Glu Pro

130 135 140

Leu Lys Ser Val Leu Ala Glu Lys Ile Lys Ile Arg Glu Ala Val Arg

145 150 155 160

Lys Glu Gly Ile Pro Phe Thr Phe Val Ser Ser Asn Phe Gly Ala Thr

165 170 175

Tyr Phe Leu Ser Arg Leu Ala Gln Val Glu Ala Asp Gly Ile Pro Asp

180 185 190

Ser Thr Val Ser Ile Ile Gly Asp Gly Asn Pro Lys Ala Ile His Val

195 200 205

Asp Glu Arg Asp Ile Ala Thr Tyr Ser Ile Lys Ala Ala Asp Asp Glu

210 215 220

Arg Thr Leu Asn Lys Ile Leu Tyr Ile Arg Pro Pro Ala Asn Ile Tyr

225 230 235 240

Ser Val Asn Glu Leu Val Ser Leu Trp Glu Thr Lys Thr Asn Lys Thr

245 250 255

Leu Glu Arg Ile Tyr Val Ser Glu Glu Glu Val Leu Lys Lys Ile Asn

260 265 270

Glu Ser Pro Gly Gln Leu Pro Phe Phe Tyr Ala Val Ala Tyr Ala Gly

275 280 285

Phe Ile Lys Gly Leu Thr Thr Asn Phe Asp Ile Asp Pro Ser Ile Gly

290 295 300

Val Glu Ala Ser Ile Leu Tyr Pro Asp Val Glu Tyr Thr Thr Val Glu

305 310 315 320

Lys Phe Met Asp Arg Phe Leu

325

<210> 6

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgagttctc agattatgac taaaagtgcg agcaaggtgt tggttattgg agccaccgga 60

tacatcggaa agtacctcgt ggaggctagc gttaagctgg gccaccctac cttcgccctg 120

gtgaggtcgc cggtcatcgc cgccagtcat cccgacactc accgcgccga cgaggagggc 180

aggaacaacc tcatacaatc atttcacaac gctggtgttc atgtcctatt cggtgatgtg 240

aatgatcgtg aagtgctggt tggtgcgatg aagaaggtgg atgttgtgta ctcggctttg 300

gctcatcatc cctgcaaact gcttgagcag cagactcaca tcatagctgc aattaaacag 360

gctggaaata tcaagagatt cttcccatcc gagttcggat ttgatatcga aaggggccag 420

tttctggaac ctttgaaaag cgtgttggcg gagaagataa agataagaga ggctgtgagg 480

aaggaaggca ttcccttcac tttcgtctcc tccaacttcg gagccaccta ctttctttcc 540

aggcttgcgc aggtggaagc cgacgggatt ccggactcca ccgtctccat tattggagat 600

ggaaacccta aagccataca tgtggacgag cgtgacattg ccacatattc catcaaggcg 660

gcagacgatg aaaggactct gaacaaaata ttatacataa ggccgcccgc caacatctac 720

tccgtcaatg aactcgtgtc gctttgggag acgaagacga acaaaacact cgaaagaata 780

tatgtttccg aagaagaagt cttgaaaaag ataaatgaat ctcctgggca actgcctttc 840

ttttacgcag tcgcgtatgc cggattcatc aagggactaa cgacaaattt cgacatagat 900

ccatcaatcg gagtcgaggc ctccatcctc tacccagatg tcgaatacac taccgtcgag 960

aagtttatgg accgctttct ataa 984

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggaattccat atgagcagcc agatcat 27

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggggtacctt acagaaaacg atccatgaat 30

<210> 9

<211> 927

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggcacaga agagcaagat tttgatcatt ggaggcactg gctatattgg caaattcgtt 60

gttgaagcaa gcgctaaggc tggccgtcct acctttgcat tagttagaga aagcactgtt 120

tctgaccctg ttaaaggaaa gcttattgca aacttcaaga atttgggtgt caatattctc 180

catggagatc tcaatgatca cgagagctta gtgaaggcaa ttaagaaggt ggatgtggtc 240

atttctacag taggcaactt tcagatagct gatcaagtca agattattgc tgctatcaaa 300

gcggctggaa atgtcaagag atttttccct tcagaatttg gaaacgacgt tgaccgaacc 360

catgctgtgg aaccagcaaa atctacattt gaaatgaagg ctcaactccg cagaactatt 420

gaggcagaag ggatccctta cacttatgtg tcgtccaatt tctttgccgg ttatttcttg 480

cctgtattgg gacaggtagg agtcactgct ccccctagag acaaagtcac cattttaggg 540

gatgggaatc aaaaggctgt tttcaacaag gaagatgata ttggaacata cacaatccga 600

gctgctgatg atccaagaac attgaataag atcctttaca ttaggcctcc tcggaatacc 660

tactcaatga atgagcttgt tgccctgtgg gagaagaaaa ttggcaaaac tcttgaaaag 720

acttacgttc cagaggagca gcttctaaag aacattcaag aggccgaaat accatggaat 780

gttgtgttag caatcaacca ttccgtcttt gtaaagggtg atcataccaa cttcgcgatc 840

aaaccatctt tcggcgtcga ggcctccgag ctttatcccg atgtcaagta taccactgtt 900

gaggagtacc ttagtcagtt tgtttaa 927

<210> 10

<211> 324

<212> PRT

<213> Pimpinella anisum

<400> 10

Met Gly Ser Ile Glu Gln Lys Ser Arg Ile Leu Val Phe Gly Gly Thr

1 5 10 15

Gly Tyr Ile Gly Asn Phe Ile Val Lys Ala Cys Val Ala Ala Gly His

20 25 30

Pro Thr Tyr Val Tyr Val Arg Pro Met Lys Pro Asp His Asn Pro Ser

35 40 45

Lys Leu Asp Val Leu Asn Glu Tyr Lys Ser Leu Gly Val Thr Ile Phe

50 55 60

Glu Gly Glu Leu Asp Glu His Glu Lys Leu Val Asp Val Leu Arg Gln

65 70 75 80

Val Asp Ile Val Ile Val Thr Leu Ala Ile Pro Gln Cys His Glu Gln

85 90 95

His Lys Ile Ile Glu Ala Met Lys Glu Ala Gly Asn Ile Lys Arg Phe

100 105 110

Ile Pro Ser Glu Phe Gly Asn Asp Val Asp Arg Ile Ser Pro Leu Pro

115 120 125

Pro Phe Gln Glu Gly Val Cys Lys Ile Lys Lys Gly Val Arg Arg Ala

130 135 140

Ala Glu Lys Ser Gly Ile Pro Tyr Thr Phe Val Ser Ser Asn Ser Cys

145 150 155 160

Gly Ala Tyr Phe Val Asn Phe Leu Leu Arg Pro Ser Asp Glu Lys Leu

165 170 175

Arg Lys Val Thr Val Tyr Gly Thr Gly Glu Ala Lys Phe Pro Leu Asn

180 185 190

Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Glu Tyr Thr Leu Arg Leu Ala Thr Asp Pro

195 200 205

Arg Ala Ala Asn Ser Leu Val Phe Tyr Arg Pro Pro Lys Asn Ile Val

210 215 220

Ser Gln Leu Asp Leu Ile Ser Ser Trp Glu Lys Lys Thr Gly Arg Thr

225 230 235 240

Leu Glu Lys Thr Tyr Val Ser Glu Glu Glu Ile Ile Lys Leu Ser Gln

245 250 255

Thr Ala Ser Thr Val Gln Asp Ala Val Gly Thr Ser Ile Leu His Ser

260 265 270

Ile Phe Val Lys Gly Glu Gln Met Asn Phe Glu Leu Lys Glu Asp Glu

275 280 285

Leu Glu Val Ser Lys Leu Tyr Pro Asp Tyr Lys Tyr Thr Ser Val Asp

290 295 300

Glu Leu Leu Asp Ile Phe Leu Val Asp Pro Pro Lys Pro Ala Ser Ala

305 310 315 320

Ala Phe Gly

<210> 11

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgggttcta ttgagcagaa aagcaggata cttgtatttg gaggaaccgg ttatattggt 60

aatttcatag taaaagcatg cgttgcagct ggtcatccaa cttatgttta tgttcgtccg 120

atgaaacctg atcataatcc ctccaagtta gacgttctca acgaatataa atcccttgga 180

gttaccattt tcgagggaga actcgatgaa catgagaagc tcgtggatgt gctccgtcag 240

gtagacatcg ttattgtgac attagcaata cctcaatgcc atgaacaaca caaaataata 300

gaagccatga aagaagctgg caacataaag agatttattc cttcagaatt tggaaatgac 360

gtggatagga ttagtccatt gccaccgttt caagaagggg tctgtaaaat caagaaagga 420

gtcagaaggg ccgctgaaaa atctggaata ccttacactt ttgtttcctc aaactcatgt 480

ggagcatatt ttgttaattt cttgcttcgt ccctctgatg aaaagctccg caaagttact 540

gtctatggga ctggtgaagc taaatttccg ttgaactacg aaaaagacat agctgaatat 600

acactgaggc tcgcaacaga tccacgagca gcaaatagct tggttttcta caggcctcca 660

aagaatatag tctcacagtt agatttgatt tcaagctggg agaaaaaaac tggacgtact 720

ctggaaaaga catacgtctc tgaggaagaa atcatcaagc tctctcagac ggcctctact 780

gtgcaggatg ctgtggggac atccatactt catagcattt tcgtaaaagg tgagcagatg 840

aattttgagc tgaaagagga tgagttagaa gtatctaagc tttatccaga ctacaagtat 900

acatcagttg atgaacttct tgatattttt ctggttgatc caccaaaacc agcatcagct 960

gctttcgggt ag 972