阅读说明：本技术 利用秸秆制备香草醛和4-乙烯基愈创木酚的方法 (Method for preparing vanillin and 4-vinyl guaiacol by using straws ) 是由 高旻天 侯蓉蓉 崔收庆 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用秸秆制备香草醛和4-乙烯基愈创木酚的方法。该方法的步骤包括：(1)粉碎秸秆粒径小于1mm；(2)利用纤维素酶糖化(1)的秸秆；(3)利用阿魏酸酯酶处理步骤(2)中得到的液体；(4)用枯草芽孢杆菌、青霉、酵母和纤维素酶对(3)中的液体进行转化,制备香草醛和4-乙烯基愈创木酚。秸秆的生物炼制,如秸秆的生物乙醇转化,其主要问题是纤维素酶成本高,如果能够在其转化过程中制备出香草醛和4-乙烯基愈创木酚这种高附加值产品,乙醇的生产成本就可以大幅度降低。(The invention relates to a method for preparing vanillin and 4-vinyl guaiacol by using straws. The method comprises the following steps: (1) the particle size of the crushed straw is less than 1 mm; (2) saccharifying the straw of (1) with cellulase; (3) treating the liquid obtained in the step (2) by using feruloyl esterase; (4) transforming the liquid in (3) with bacillus subtilis, penicillium, yeast and cellulase to prepare vanillin and 4-vinyl guaiacol. The main problem of the bio-refining of the straws, such as the bio-ethanol conversion of the straws, is that the cost of the cellulase is high, and if the high value-added products, such as vanillin and 4-vinyl guaiacol, can be prepared in the conversion process, the production cost of the ethanol can be greatly reduced.)

利用秸秆制备香草醛和4-乙烯基愈创木酚的方法

技术领域

本发明涉及农作物废弃物秸秆的综合利用。特别是一种利用秸秆制备香草醛和4-乙烯基愈创木酚的方法。

背景技术

香草醛被认为是世界上最重要的香料之一，从一种叫香草的兰花的荚中获得，被广泛应用于食品、饮料、香水以及制药行业。根据***粮农组织统计数据库记录，香草豆的产量印度尼西亚最高（2600吨），其次是马达加斯加（1946吨）、中国（1300吨）、墨西哥（395吨）、汤加（202吨）和科摩罗（66吨）。由于天然香草醛产量少且成本高，使用替代品生产香草醛的重要性逐渐提高。化学合成的香草醛主要是从化石碳氢化合物产生的，合成香草醛的产量因为其价格低廉逐年增加，但是，因为有些生产工艺可能造成环境和健康相关的问题，而被禁止。4-乙烯基愈创木酚是一种挥发性酚类化合物，被广泛应用于食品、饮料、医药和香料等行业，对人们的日常生活起到重要作用。4-乙烯基愈创木酚具有丁香般的辛辣香气，是德国劳赫啤酒和比利时小麦中一种可感知的风味成分。同时，4-乙烯基愈创木酚因为其抗癌和抗氧化的功能而具有药用价值。4-乙烯基愈创木酚可以通过化学合成、天然植物提取和生物转化合成。然而，从天然植物中获得的4-乙烯基愈创木酚数量有限，不能满足日益增加的市场需求。目前，市场上的4-乙烯基愈创木酚是用化学合成生产的，但是消费者更偏好更环保和更自然的产品。欧洲和美国的食品立法也指出风味物质可以通过微生物或酶法制备。因此，生物转化制备4-乙烯基愈创木酚和香草醛成为当务之急。

传统处理秸秆的方式采用田间焚烧，其排放物会产生温室气体和空气污染物，这些物质会加剧环境污染，威胁人类健康。秸秆是种来源广泛的可再生能源，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，能够通过生物转化为可用材料和生物燃料，包括乳酸和乙醇。在用纤维素酶对秸秆进行预处理糖化的过程中，纤维素酶具有较强的水解纤维素释放葡萄糖糖的能力，阿魏酸酯酶还能够释放糖化液中的酚酸。酚酸可以转化成为4-乙烯基愈创木酚后和香草醛。目前，市场上的香草醛和4-乙烯基愈创木酚多为化学合成，可能具有一定的安全问题。因此，通过生物法获得这些天然产物引起了人们的兴趣和关注。

发明内容

本发明的目的在于提高以秸秆生物炼制过程中生产高附加值，而提供了一种秸秆制备香草醛和4-乙烯基愈创木酚的方法，降低秸秆生物炼制成本。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种利用秸秆制备香草醛和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 粉碎秸秆粒径小于1mm；

b. 利用纤维素酶糖化步骤a所得秸秆，得含糖化后秸秆的糖化液；

c. 将步骤b所得糖化液进行灭活后，用阿魏酸酯酶进行处理，得到阿魏酸酯酶处理后的糖化液；

d. 用微生物转化步骤c所得的糖化液，得到香草醛和4-乙烯基愈创木酚。

上述的步骤b的具体步骤为： 将步骤a所得粉碎秸秆浸没在浓度范围为5～20FPU/g纤维素酶溶液中，调节pH值调为3～12，在25～65℃条件下、200 rpm条件下进行糖化36～48 h，得到纤维素酶糖化后的粉碎秸秆。

上述的步骤c的具体步骤为：将纤维素酶糖化后的糖化液中加入阿魏酸酯酶；所述的粉碎秸秆与阿魏酸酯酶的质量比为：1g：10～100mg；得到经过阿魏酸酯酶处理的糖化液，在该糖化液中接入糖化液体积的3～5%的微生物，在25～50℃条件下进行生物转化24～48小时，得到香草醛和4-乙烯基愈创木酚；所述的微生物指青霉、酵母或枯草芽胞杆菌。

一种利用秸秆制备香草醛和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a. 粉碎秸秆粒径小于1mm；

b. 用青霉将步骤a所得的秸秆发酵糖化转化，得到香草醛和4-乙烯基愈创木酚。

上述的步骤b的具体步骤为：将步骤a所得粉碎秸秆浸没在超纯水中，接入前培养过的青霉，所接体积是超纯水体系的1～5%，25～65℃，pH 3-7进行秸秆发酵糖化转化24～48小时，得到产物香草醛和4-乙烯基愈创木酚。

上述的秸秆为水稻，大麦、小麦或玉米农作物秸秆。

本发明的有益效果在于：秸秆的生物炼制，如秸秆的生物乙醇转化，其主要问题是纤维素酶成本高，如果能够在其转化过程中制备出香草醛和4-乙烯基愈创木酚这种高附加值产品，乙醇的生产成本就可以大幅度降低。

附图说明

图1为青霉产酶和糖化图；说明青霉可以直接利用秸秆进行发酵产酶，糖化和转化；其中A为青霉产生的阿魏酸酯酶的量（mU/mL）； B为青霉产生的滤纸酶活的量 (FPU/mL)； C为青霉产酶过程中产生的葡萄糖的量（g/L）； D为青霉产酶过程中产生的木糖的量（g/L）； E为青霉产酶过程中产生的香草酸的量（mg/g）； F为青霉产酶过程中产生的香草醛含量（mg/g）。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1： 以秸秆为原料用纤维素酶进行糖化后进行转化和经过纤维素酶糖化后经过阿魏酸酸酯酶作用后进行转化。

实验方法：

（1）粉碎秸秆粒径小于1mm

（2）秸秆糖化：1 g球磨（10 g，15次）水稻秸秆中加入5 FPU的来源于T.reesei、T.viride和A.niger的纤维素酶10 mL水，用0.5 M H₂SO₄将pH值调为5，45 °C、200 rpm条件下进行糖化48 h。糖类物质测定采用高效液相色谱仪检测，，此系统配有一个视差检测器。采用糖柱（Aminex HPX-87H column 7.8 mm *30 cm;Bio-Rad, USA）进行分离，流速为1.0mL/min，温度为80 °C，流动相为去离子水，进样体积为10 μL。

（3）糖化液灭活：糖化上清液的灭活：将糖化液在8000 rpm下离心5 min，取上清液，沸水浴10 min；冷却后，在8000 rpm下离心5 min，去除沉淀的蛋白，即得灭活的糖化液。

（4）阿魏酸酯酶处理糖化液：

（5）微生物法转化：挑取一点枯草芽孢杆菌（ATCC 9372）或酵母（CICC 41125）或青霉（CICC 40361）于前培养基中，37 ℃ 200rpm 培养1 d，吸取一定体积的菌液10000 rpm离心后加入灭活的糖化液、阿魏酸酯酶处理过的灭活糖化液中(含有转化培养基) ，总转化体系为10 mL，转化条件为枯草芽胞杆菌37℃、酵母30℃ 、青霉30℃，200rpm 24 h，分别在0、3、6、9、12、24 h取样，取样后10000 rpm 离心10 min后取上清，适当稀释后进行HPLC分析。枯草芽孢杆菌：前培养基(g/L)：葡萄糖 5，yeast extracr 3，蛋白胨 10，NaCl 5 pH 8.0转化培养基(g/L)：蛋白胨 10 ，yeast extract 3，NaCl 5 pH 9.0；酵母前培养基和转化培养基：种子培养基：YPD培养基（不含琼脂）。转化培养基（g/L）：YE 2.0，(NH4)2SO42.0，MgSO4•7H2O 1.0，KH2PO41.5；碳源分别是葡萄糖和前述去除自由酚的糖化液，pH自然。

实验结果：直接用来源于T.reesei、T.viride和A.niger的纤维素酶得到的糖化液不能转化出香草醛和4-乙烯基愈创木酚。经过阿魏酸酯酶处理后的糖化液能够转化出香草醛和4-乙烯基愈创木酚。

实施例2 几种纤维素酶转化效果进行比较

实验方法：

（1）糖化：用来源于A. cellulolyticus、T. reesei、T. viride和A. niger这四种纤维素酶对秸秆进行糖化。1 g球磨（10 g，15次）水稻秸秆中加入5 FPU的纤维素酶和定量的阿魏酸酯酶（加入量视实验所需决定）、10 mL水，用0.5 M H₂SO₄将pH值调为5，45 °C、200 rpm条件下进行糖化。

（2）转化：将5 mL经上述处理的糖化液（不灭活）调节pH值后，加入一定量的纤维素酶，45 °C、200 rpm，进行转化

实验结果：来源于A. cellulolyticus、来源于这四种纤维素酶中只有来源于A. cellulolyticus的纤维素酶具有阿魏酸酯酶活力，可以转化出香草醛(VA)。来源于T. reesei、T. viride和A. niger的这三种纤维素酶的糖化液（不灭活，保留酶的活性）可以同来源于A. cellulolyticus的纤维素酶进行协同转化。在使用三种不同来源的纤维素酶与来源于A. cellulolyticus协同转化时，当来源于A. cellulolyticus和T. viride的纤维素酶协同作用时24 h内能完全将糖化液中的阿魏酸(FA)完全转化，其FA到VA的摩尔转化率为4.98%。当使用来源于T. reesei、A. niger的纤维素酶与来源于A. cellulolyticus的纤维素酶协同转化和来源于A. cellulolyticus的纤维素酶自身转化时，在转化24 h后并不能完全将FA全部转化，但VA的增量明显高于使用灭活的糖化液中的FA进行转化时VA的增量；在转化至24 h时，使用来源于T. reesei、A. niger的纤维素酶与来源于A. cellulolyticus的纤维素酶协同转化和来源于A. cellulolyticus的纤维素酶自身转化时，FA到VA的摩尔转化率分别为2.65%、3.04%和2.52%。该实验与前一节使用灭活糖化液进行FA的转化相比，无论是使用哪种纤维素酶进行转化，FA到VA的摩尔转化率都有所提高，可以确定证来源于T. reesei、T. viride和A. niger的纤维素酶与来源于A. cellulolyticus的纤维素酶在FA的转化过程中确实存在一定的协同作用。

实施例3 青霉发酵糖化转化

实验方法：

（1）青霉发酵产酶：取少量青霉菌（CICC 40361）放入前培养基（碳源为2% 球磨秸秆）中，放入摇床中30℃ 200rpm培养3 d。吸取前培养中1 ml菌液，加入20 ml发酵培养中,在培养的2、4、6 d 取1 ml样。样品经8000 rpm离心后取上清，上清稀释后测定各酶活和蛋白质含量。

（2）青霉糖化转化：取第6天的发酵液，测定FPase后，8000 rpm离心5 min，取上清液进行糖化。糖化条件为10%体系，5 FPU/g 球磨水稻秸秆，45℃，200 rpm，分别于12 h，24h，36 h时取样，通过HPLC系统测定葡萄糖产量及转化的香草醛和4-乙烯基愈创木酚量。

实验结果：测定青霉发酵液的纤维素酶酶活和阿魏酸酯酶酶活后，结果表明青霉能生产纤维素酶和阿魏酸酯酶。当使用青霉发酵液对秸秆进行糖化作用时，也会进行转化作用产生香草醛。见下表1：

表1微生物法和酶法对糖化液的转化

表1表明：没有被阿魏酸酯酶处理的糖化液不能发生转化

表2几种纤维素酶在pH11下对糖化液的转化

表2表明几种纤维素没酶和有阿魏酸酯酶活性的酶协同转化能产生VA和4-VG，其中来源于A.niger的纤维素酶协同转化效果最好。