利用混菌发酵生产2-苯乙醇的方法
阅读说明：本技术 利用混菌发酵生产2-苯乙醇的方法 (Method for producing 2-phenethyl alcohol by mixed fermentation ) 是由 信丰学 姜岷 严伟 章文明 蒋羽佳 周杰 董维亮 于 2020-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了利用混菌发酵生产2-苯乙醇的方法,将活化大肠杆菌接种至含葡萄糖发酵培养基中发酵后,将活化的季也蒙毕赤酵母接种至大肠杆菌发酵体系,发酵生产2-苯乙醇；所述大肠杆菌为引入苯丙氨酸合成中关键抗反馈抑制基因的重组菌。该方法是目前首次使用多细胞共培养的方式合成2-苯乙醇,降低了工业生产2-苯乙醇的底物成本,具有重要的应用价值。(The invention discloses a method for producing 2-phenethyl alcohol by mixed fermentation, which comprises the steps of inoculating activated escherichia coli into a fermentation culture medium containing glucose for fermentation, inoculating activated pichia guilliermondii into an escherichia coli fermentation system, and fermenting to produce 2-phenethyl alcohol; the Escherichia coli is a recombinant bacterium introduced with a key anti-feedback inhibition gene in phenylalanine synthesis. The method synthesizes the 2-phenethyl alcohol by using a multi-cell co-culture mode for the first time at present, reduces the substrate cost of industrial production of the 2-phenethyl alcohol and has important application value.)
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用大肠杆菌和季也蒙毕赤酵母混菌发酵生产2-苯乙醇的方法。
背景技术
2-苯乙醇是一种具有玫瑰气味的芳香醇，天然存在于玫瑰和百合等多种植物的精油中。现如今在国内外，2-苯乙醇已被广泛应用于医药、食品、化妆品、烟草和日化用品等产业中。以其为原料可以合成许多应用价值很高的衍生物，例如，苯乙醇的酯类衍生物—乙酸苯乙酯，是一种重要的芳香物质，香气似玫瑰而带有蜜甜，可以用作日化香精和食用香精。全球2-苯乙醇的年产量近万吨，除了很少一部分是从天然的玫瑰花中提取之外，大部分采用廉价的化工原料苯或苯乙烯通过化学途径合成的，即苯-环氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氢法。但化学合成所使用的原料很多属于致癌物质，对人体健康和环境都有巨大危害。此外，化学合成的苯乙醇中常含有一些难以除去的副产物，例如，联二苯、β-氯代乙苯、氯乙醇等具有不良气味，严重影响了2-苯乙醇的产品质量，难以达到食用和日用香料的质量标准。
从上世纪末开始，随着人们对生活品质要求的提高和对健康的关注，消费者越来越注重食品、日用品等的安全性，更崇尚“绿色”和“天然”，食品、化妆品等生产也越来越倾向于使用天然的添加剂。所谓“天然”，即此物质必须来源于自然，在美国和欧洲，能被标记为“天然”的调味剂和芳香剂必须是采用物理方法从天然材料中提取和酶催化或微生物发酵法生产，其售价也更昂贵。
天然2-苯乙醇虽然存在于很多花和植物的精炼油中如茉莉、水仙、百合等，但多数情况下浓度太低，无法提取。唯一例外的是玫瑰精油，然而，玫瑰花每年只开一次，从玫瑰中提取天然2-苯乙醇的生产周期长、生产成本昂贵，无法进行大规模工业化生产，难以满足市场的需要。微生物具有体积小、繁殖快、吸收多、转化快、适应强等特点，采用微生物转化法生产天然的2-苯乙醇保留了产品的单纯、天然的特点，又具有成本低、周期短、效率高等优点，且产品的质量符合国际标准。研究表明，酵母细胞具有从头合成2-苯乙醇的代谢途径，也可通过氨基酸分解代谢途径将L-苯丙氨酸直接转化为2-苯乙醇。 1907年艾利希在酵母培养物中添加L-苯丙氨酸使2-苯乙醇的产量得到大幅提高，给利用酵母菌生物转化生产天然2-苯乙醇的产业化带来了希望。在欧美发达国家，健康天然的生活理念已经深入人心，人们很早就开始重视天然物质的生物合成，对于2-苯乙醇生物合成的研究较早，目前已达到较高水平。我国虽然已有很多关于L-苯丙氨酸生物合成的研究报告，但对于2-苯乙醇生物合成的研究尚处于起步阶段，有关的文献报道也甚少，这与国外差距甚远。
混菌发酵是指采用两种或多种微生物的协同作用共同完成某发酵过程的一种新型发酵技术。是纯种发酵技术的新发展，也是一种不需要进行复杂的DNA体外重组却可取得类似效果的新型发酵技术。优点是可提高发酵效率甚至可形成新产品。根据生物间的结合方式，可分如下四型。（1）联合发酵：用两种或多种微生物同时接种和培养，例如我国发明的维生素C生产中山梨糖转化为二酮基古龙酸过程中的混菌发酵。（2）顺序发酵:先用甲菌进行常规发酵，再由乙菌等按顺序进行发酵，以共同完成数个生化反应，例如少根根霉(Rhizopus arhizus)先把葡萄糖转化为反丁烯二酸，然后再由产气肠杆菌(Enterococcus aerogenes)或普通变形杆菌(Proteus vulgaris)将它还原为发酵产物琥珀酸。（3）共固定化细胞混菌发酵：把两种或多种微生物细胞同时包埋或吸附于同一载体上而进行的混菌发酵，例如黑曲霉(Aspergillus niger)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)共同把淀粉转化为酒精等；（4）混合固定化细胞混菌发酵：将两种或多种微生物细胞分别固定化后，再把它们混在一起进行混菌发酵。目前还没有利用葡萄糖混菌生产2-苯乙醇的报道。
发明内容
为了解决传统2-苯乙醇发酵方法以葡萄糖为底物代谢路径长、单菌负荷重，产量低的问题，本发明提供了一种利用大肠杆菌和季也蒙毕赤酵母混菌发酵生产2-苯乙醇的方法。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用混菌发酵生产2-苯乙醇的方法，将活化大肠杆菌接种至含葡萄糖发酵培养基中发酵后，将活化的季也蒙毕赤酵母接种至大肠杆菌发酵体系，发酵生产2-苯乙醇；
所述大肠杆菌为引入苯丙氨酸合成中关键抗反馈抑制基因的酪氨酸缺陷型重组菌。
进一步的，将苯丙氨酸合成中关键抗反馈抑制基因导入敲除酪氨酸合成途径关键酶基因的大肠杆菌，获取所述重组菌；所述酪氨酸合成途径关键酶基因为tyrA(Genbank:947115)基因，所述苯丙氨酸合成中关键抗反馈抑制基因为aroF(Genbank:947084)和pheA(Genbank:947081)基因。
进一步的，所述重组菌的构建方法为：
（1）利用Crispr基因编辑技术敲除大肠杆菌K12中的tyrA基因，获取酪氨酸缺陷型大肠杆菌K12；
（2）将基因aroF和pheA导入pTrc99a质粒，将重组质粒导入酪氨酸缺陷型大肠杆菌K12中表达，获取重组菌。
进一步的，所述季也蒙毕赤酵母为季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）YLG18，保藏号为CCTCC NO：M 2020638。
进一步的，将活化的大肠杆菌接种到含有葡萄糖的发酵培养基中发酵24~48小时后接种活化的季也蒙毕赤酵母；优选发酵24小时。此时发酵液中有一定量L-苯丙氨酸，且大肠杆菌生物量高，能够继续利用葡萄糖合成L-苯丙氨酸，而季也蒙毕赤酵母可以利用大肠杆菌合成的L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇。接种时间过早（大肠杆菌发酵少于24 h），大肠杆菌生物量不高，不利于L-苯丙氨酸的合成；接种时间过晚（大肠杆菌发酵48 h-72 h），则会导致菌株YLC20培养时间过长，L-苯丙氨酸产量增长有限，发酵液中的营养成分太低，从而影响季也蒙毕赤酵母的生长，最终导致2-苯乙醇产量降低。因此，季也蒙毕赤酵母的接种时间是混菌发酵生产2-苯乙醇极为关键的步骤。
进一步的，所述活化大肠杆菌的接种量为发酵培养基体积的1-10%；活化季也蒙毕赤酵母按10%的接种量接种到大肠杆菌发酵体系中。
进一步的，大肠杆菌发酵条件为：发酵温度35-37℃，发酵pH为6.0-7.0，转速200-400 rpm。优选的发酵条件为发酵温度37℃，发酵pH为6.8，转速300 rpm。
进一步的，所述发酵培养基配方为：3g/L MgSO4，3 g/L KH2PO3，1 g/L NaCl，5 g/L(NH4)2SO4，0.015 g/L CaCl2·2H2O，0.1125 g/L FeSO4·7H2O，1 g/L柠檬酸三钠，10 g/L酵母粉，0.3 g/L酪氨酸，0.15 g/L VB1，0.5 g/L YNB，20 g/L 葡萄糖，溶剂为水，调节pH至6.0-7.0，115℃灭菌20 min。
进一步的，接种季也蒙毕赤酵母后，发酵条件为：发酵温度28-30℃，发酵时间48-72 h，发酵pH5.0-6.0，转速500-600 rpm。优选的发酵条件为：发酵温度30℃，发酵时间为72h，发酵pH为5.0，转速为500 rpm。
进一步的，在大肠杆菌发酵12h后，按照2~4g/L/h的补糖速率向发酵体系补加葡萄糖；优选4g/L/h。
进一步的，所述大肠杆菌的活化培养基配方为3g/L MgSO4, 3 g/L KH2PO3, 1 g/LNaCl, 5 g/L (NH4)2SO4, 0.015 g/L CaCl2·2H2O, 0.1125 g/L FeSO4·7H2O, 1 g/L柠檬酸三钠，10 g/L酵母粉，0.3 g/L酪氨酸，0.15 g/L VB1，0.5 g/L YNB，20 g/L 葡萄糖，溶剂为水，调节pH至6.0-7.0。活化条件为：将大肠杆菌以接种量5 % v/v接种到活化培养基中，35-37℃、200-400 rpm活化24-48 h。
进一步的，所述季也蒙毕赤酵母的活化培养基配方为20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母粉，20 g/L 葡萄糖，溶剂为水；活化条件如下：将季也蒙毕赤酵母以接种量5 % v/v接种到活化培养基中，30℃、200 rpm活化12-24 h得到活化的季也蒙毕赤酵母培养液。
有益效果：与现有技术相比，本发明的技术优势如下：
（1）本发明通过先培养可以利用葡萄糖为唯一碳源生长的大肠杆菌YLC20，在最适条件下将葡萄糖转化为L-苯丙氨酸，季也蒙毕赤酵母直接利用葡萄糖合成2-苯乙醇产量极低，但是利用L-苯丙氨酸为底物合成2-苯乙醇产量较高；目前微生物以葡萄糖为底物直接合成2-苯乙醇的产量都非常低。而本发明采用混菌发酵中的顺序发酵方法，通过大肠杆菌YLC20发酵将葡萄糖逐步转化为L-苯丙氨酸，在L-苯丙氨酸达到一定量时接入季也蒙毕赤酵母，其利用已经转化而成的L-苯丙氨酸和葡萄糖进行发酵，生产2-苯乙醇。
（2）当大肠杆菌YLC20培养了24 h时加入季也蒙毕赤酵母培养液，2-苯乙醇产量最高，达到2.3 g/L，这也是目前利用葡萄糖为唯一底物时混菌发酵得到的最高2-苯乙醇产量。YLC20培养24 h时，此时发酵液中大肠杆菌生物量较高，葡萄糖被有效的利用，并得到约9 g/L的L-苯丙氨酸；此后，在混菌体系中，大肠杆菌的生物量仍在继续提高，能够源源不断将葡萄糖转化为L-苯丙氨酸，而季也蒙毕赤酵母可以利用转化得到的L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇。
（3）该方法是一种不需要进行复杂的DNA体外重组却可取得类似效果的新型发酵技术。该方法降低了工业生产2-苯乙醇的成本，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为优化混菌发酵条件下季也蒙毕赤酵母的接种时间。
图2为优化混菌发酵条件下季也蒙毕赤酵母的接种量。
本发明所述的生物材料，其分类命名为季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）YLG18，已保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏日期为2020年10月26日，保藏号为CCTCC NO：M 2020638，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
实施例中使用的季也蒙毕赤酵母为季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）YLG18，保藏号为CCTCC NO：M 2020638。
大肠杆菌为自行构建的基因工程菌，将基因aroF和pheA导入pTrc99a质粒，将重组质粒导入宿主菌酪氨酸缺陷型大肠杆菌K12中表达获取，实施例中命名为大肠杆菌YLC20。
YLC20的构建方式为：
（1）利用Crispr基因编辑技术敲除大肠杆菌K12中的tyrA基因，获取酪氨酸缺陷型大肠杆菌K12；Crispr基因编辑技术为现有方法，可参考Duan CL, Yang, S, Chen, B, etal.,Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9System. Applied and Environmental Microbiology. 2015, 81(7): 2506-2514.或Chung ME, Sung LY, Wu YM, et al., Enhanced Integration of Large DNA Into E. Coli Chromosome by CRISPR/Cas9. Biotechnology and bioengineering. 2017, 114(1), 172-183；
（2）将基因aroF和pheA导入pTrc99a质粒，将重组质粒导入酪氨酸缺陷型大肠杆菌K12中表达，获取重组菌。重组质粒构建和表达和现有方法大致相同，仅基因区别，可参考Wang J, Wang HY, Yang L, et al., A novel riboregulator switch system of geneexpression for enhanced microbial production of succinic acid. Journal ofIndustrial Microbiology & Biotechnology. 2018, 45(4), 253-269.和Wang W, LiZM, Xie JL, et al., Production of succinate by a pflBldhA double mutant ofEscherichia coli overexpressing malate dehydrogenase. Bioprocess andbiosystems engineering. 2009, 32(6), 737-745.
实施例1不同补糖速率对最终2-苯乙醇产量的影响
（1）将大肠杆菌以接种量5 % v/v接种到活化培养基中，37℃、300 rpm活化24 h；
活化培养基配方为：10 g/LNaCl，5 g/L酵母粉，10 g/L蛋白胨，溶剂为水，调节pH至6.8；
（2）将活化的大肠杆菌YLC20以接种量5 % v/v接种到发酵培养基中，37 ℃，发酵24 h；
发酵培养基配方为：3g/L MgSO4，3 g/L KH2PO3，1 g/L NaCl，5 g/L (NH4)2SO4，0.015 g/L CaCl2·2H2O，0.1125 g/L FeSO4·7H2O，1 g/L柠檬酸三钠，10 g/L酵母粉，0.3g/L酪氨酸，0.15 g/L VB1，0.5 g/L YNB，20 g/L 葡萄糖，溶剂为水，调节pH至6.0-7.0，115℃灭菌20 min；设置三组发酵实验，其中补糖速率分别为2 g/L/h，4g/L/h，6 g/L/h；
（3）将季也蒙毕赤酵母以接种量5 % v/v接种到季也蒙毕赤酵母的活化培养基中，30℃、200 rpm活化12-24 h；
活化培养基配方为：20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖，溶剂为水；
（4）以混合时间为72 h为例，将活化好的季也蒙毕赤酵母以5% v/v接种到步骤（2）的发酵体系中，30℃，500 rpm发酵72 h。
培养过程中，每隔12 h取样测定其2-苯乙醇产量。当补糖速率为4 g/L/h时，混菌发酵得到的2-苯乙醇达到了1.5 g/L，当补糖速率为2 g/L/h时，混菌发酵得到的2-苯乙醇浓度仅有1.1 g/L；当补糖速率为6 g/L/h时的2-苯乙醇浓度为1.53 g/L，但从经济性来考虑，最终选择4 g/L/h的补糖速率。
实施例2季也蒙毕赤酵母不同的接种时间对最终2-苯乙醇产量的影响
方法同实施例1，其中补糖速率为4 g/L/h；不同的是步骤（2）中设置4组实验，发酵时间分别为12 h，24 h，36 h，48 h。
培养过程中，每隔12 h取样并测定其2-苯乙醇产量。当大肠杆菌YLC20培养了24 h时加入季也蒙毕赤酵母，2-苯乙醇产量最高，达到1.75 g/L。在此体系中，菌株YLC20有效的利用葡萄糖生长并得到约9 g/L的L-苯丙氨酸，此后，在混菌体系中，大肠杆菌仍可以利用葡萄糖不断生长，能够源源不断将葡萄糖转化为L-苯丙氨酸，而季也蒙毕赤酵母可以利用转化得到的L-苯丙氨酸生产2-苯乙醇。接种时间过早（12 h），大肠杆菌生物量不高，利用葡萄糖能力受限，而接种过晚（36-48 h），则会导致菌株YLC20培养时间过长，发酵液中营养物质较低，季也蒙毕赤酵母难以达到所需生物量，最终导致2-苯乙醇产量降低。
实施例3季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondiiYLG18不同接种量对2-苯乙醇产量的影响
方法同实施例1，其中补糖速率为4 g/L/h，接种时间为24 h，不同的是步骤（3）中设置4组实验，每组季也蒙毕赤酵母接种量分别为5% v/v、10%v/v、15% v/v、20% v/v。
培养过程中，每隔12 h取样并测定其2-苯乙醇产量。当接种量为10% v/v时，2-苯乙醇产量最高，有2.0 g/L；当接种量为5% v/v时，菌株生长缓慢，影响2-苯乙醇的产量；而接种量为15%-20% v/v时，由于接种量过多，会影响大肠杆菌合成L-苯丙氨酸，故采用10%v/v接种量为最优接种量。
实施例4混菌体系培养基中不同的pH对最终2-苯乙醇产量的影响
方法同实施例3，其中补糖速率为4 g/L/h，接种时间为24 h，接种量为200 mL，不同的是步骤（3）中设置6组实验，每组pH分别为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0。
培养过程中，每隔12 h取样并测定其2-苯乙醇产量。当pH为5.0时，2-苯乙醇产量最高，达到2.3 g/L。当pH提高时，发酵条件将更有利于大肠杆菌生物转化产生L-苯丙氨酸，不利于季也蒙毕赤酵母利用L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇。大肠杆菌最适pH为6.8，季也蒙毕赤酵母最适pH为5.0，通过优化pH可以在一定程度上提高2-苯乙醇的产量。大肠杆菌由于可以一直使用葡萄糖而转化为L-苯丙氨酸，所以可通过降低pH（大肠杆菌在低pH下几乎不能生长）和降低发酵温度（接入季也蒙毕赤酵母后发酵温度为30℃），使其在混菌后不能生长，而其分泌出来的L-苯丙氨酸依然可以在发酵液中稳定存在并且足够季也蒙毕赤酵母利用来合成2-苯乙醇。
实验证明季也蒙毕赤酵母单菌直接利用葡萄糖进行发酵，2-苯乙醇产量很低，只有不到0.1 g/L；而使用混菌体系时，可生产2.3 g/L2-苯乙醇。混菌体系是一种不需要进行复杂的DNA体外重组却可取得类似效果的新型发酵技术，其不仅降低了工业生产2-苯乙醇的底物成本，而且可有效提高2-苯乙醇产量。
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