具体实施方式

首先，在主要养殖牡蛎的海域(例如广岛/宫城海域)中，在预定时间收集海水，将收集的海水过滤，并将残留在用于过滤的过滤器上的浮游生物1取出，对其进行加热或加压后，研究并分析是否检测到DHMBA(ディーバ；注：此为英文DHMBA的日语发音，以下不再标注)。

首先，将描述通过加热获得的DHMBA的检测。

收集在牡蛎养殖的现场海域(例如广岛/宫城海域)的海水。

(含浮游生物的海水的收集)

用泵抽出牡蛎养殖海域(例如，广岛、宫城海域)中预定时间的海水，即广岛县海域中9月和3月的含浮游生物的海水和宫城县海域中5月的含浮游生物的海水。

在该实施例中，收集了广岛和宫城海域的海水，但不仅限于广岛和宫城的海水。

此外，时间不限于9月或3月的海水。

(含浮游生物的海水的过滤)

在收集了含浮游生物1的海水之后，用由无纺布等构成的例如GF/C过滤器4对该海水进行过滤(参见图1)。

在此，对要过滤的海水的量没有任何限制，这次，在广岛或宫城的海域中收集约3100升海水，并对其进行过滤。

在通过上述方法过滤的过滤器上附着有大量的浮游生物1，并且附着有浮游生物1的过滤器可以冷冻保存直到进行提取工作。

(超声波处理)

接下来，例如，将附着有浮游生物1的过滤器冷冻保存，将冷冻保存的过滤器放置在离心管等容器5中，并且例如，将超纯水添加到容器5中，进一步对浮游生物1通过例如超声或球磨机用超声波破坏细胞壁约1小时，使得更易于提取DHMBA等。

(提取)

在前述的例如用超声等方法破坏浮游生物1的细胞后，对细胞进行加热，取出该细胞中的内容物。即，通过在约100℃下的沸水提取前述的浮游生物等(参见图2)。

在此，由于通过沸水提取进行加热，因此不会直接加热前述容器5内的浮游生物1。即，将加热的热水储存在烧杯等中，并将容器5放入热水中以进行所谓的间接加热。这具有可以进行稳定的加热提取的优点，例如能够在恒定温度下加热。

(取样)

然后，对于沸水提取，每小时取样1次，持续5小时。

(有用物质分析)

通过LC-MS/MS测量取样出的浮游生物1的DHMBA浓度。

(广岛海域取样的提取实验结果)

然后，关于前述的2016年9月和2017年3月的广岛海域取样，在9月和3月的样本中，加热前的浮游生物中未检测到DHMBA。

但是，关于9月的广岛海域样本，可以确认，在加热后，即沸水提取后的1小时后，检测到的DHMBA提取量为0.303(ng/L)。另外，可以确认，在沸水提取后的2小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.297(ng/L)，在沸水提取后的3小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.279(ng/L)。此外，可以确认，在沸水提取后的4小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.274(ng/L)，在沸水提取后的5小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.217(ng/L)。

关于3月的广岛海域样本，可以确认，加热后，即沸水提取后的1小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.906(ng/L)。此外，可以确认，在沸水提取后的2小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.66(ng/L)，在沸水提取后的3小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.686(ng/L)。此外，可以确认，在沸水提取后的4小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.517(ng/L)，在沸水提取后的5小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.794(ng/L)(参见图4和5)。

(宫城海域取样的提取实验结果)

图6示出了2016年5月在宫城海域取样中DHMBA的检测结果。

图6示出了DHMBA的提取量随时间的变化。与广岛海域样本一样，加热前样本中未在浮游生物中检测到DHMBA。但是，可以确认，加热后，即沸水提取后的1小时后，检测出的DHMBA的提取量为0.108(ng/L)。此外，可以确认，在沸水提取后的2小时后，检测到的DHMBA提取量为0.113(ng/L)，在沸水提取后的3小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.156(ng/L)。此外，可以确认，在沸水提取后的4小时后，检测到的DHMBA提取量为0.125(ng/L)，在沸水提取后的5小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.134(ng/L)(参见图6)。

另外，加热时间不限于经过1小时后的时间。DHMBA有可能在不到1小时的加热时间内被检测到。

在任何情况下，当不加热浮游生物时，都不会从浮游生物中检测到DHMBA，但是可清楚地表明，当加热浮游生物时，可以从快速加热的浮游生物中检测到DHMBA。

接下来，将描述通过加压获得的DHMBA的检测。

首先，收集牡蛎养殖的现场海域(例如宫城海域)的海水。

(含浮游生物的海水的收集)

用泵抽出在牡蛎养殖海域(例如，宫城海域)中预定时间的海水，即在宫城县海域中2016年5月的含浮游生物的海水。

另外，在该实施例中，收集了宫城海域中的海水，但不限于宫城海中的海水。另外，时间不限于5月的海水。

(含浮游生物的海水的过滤)

在收集含浮游生物1的海水之后，用由无纺布等构成的例如GF/C过滤器4对该海水进行过滤(参见图1)。

在这里，对要过滤的海水的量没有任何限制，这次，在宫城海域收集了约3100升海水，并对其进行过滤。

在通过上述方法过滤的过滤器上附着有大量的浮游生物1，并且附着有浮游生物1的过滤器可以冷冻保存直到进行提取工作。

(超声波处理)

接下来，例如，将附着有浮游生物1的过滤器冷冻保存，将冷冻保存的过滤器放置在离心管等容器5中，并且例如，将超纯水添加到容器5中，进一步对浮游生物1通过例如超声或球磨机用超声波破坏细胞壁约1小时，使得更易于提取DHMBA等。

(提取)

然后，在前述的用例如超声等方法破坏浮游生物1的细胞后，对细胞进行加压，取出该细胞的内容物。即，对前述的浮游生物等加压至约2个大气压以进行提取(参见图3)。

在此，对加压方法没有任何限制。可以使用作为通常方法的加压釜来进行加压。此外，可以通过其他方法进行加压。

(采样)

然后，关于前述加压提取，每小时取样1次，持续5小时。

(有用物质分析)

通过LC-MS/MS测量前述的取样的浮游生物1的DHMBA浓度。

(宫城海域取样的提取实验结果)

图7示出了宫城海域取样中DHMBA的检测结果。

图7示出了DHMBA的提取量随时间的变化。加压前的浮游生物中未检测到DHMBA。可以确认，在2个大气压下加压后，即在2个大气压下加压1小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.05(ng/L)。此外，可以确认，在2个大气压下加压2小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.29(ng/L)，在2个大气压下加压3小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.49(ng/L)。此外，可以确认，在2个大气压下加压4小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.58(ng/L)，在2个大气压下加压5小时后，检测到的DHMBA的提取量为0.67(ng/L)(参见图7)。

在任何情况下，当不对浮游生物加压时，都不会从浮游生物中检测到DHMBA，但是可以清楚地表明，当对浮游生物进行加压时，从快速加压的浮游生物中检测到DHMBA。

(能够检测出DHMBA的浮游生物1的鉴定)

海水中有多种类型的浮游生物1，尚不清楚检测到DHMBA的是哪种类型的浮游生物1。因此，本发明的发明人进行了对检测到DHMBA的浮游生物1的鉴定。

本发明的发明人如上所述收集海水并在其中获得浮游生物1。

从获得的大量浮游生物1中选择约200种，并分别培养这些约200种浮游生物1。

然后，分别对培养的约200种浮游生物进行前述的DHMBA提取处理。即，进行前述超声波处理和前述通过加热或加压的提取处理等。

结果，检测到DHMBA的浮游生物1为4种微藻菌株。然后，详细观察这4种微藻菌株的形态，鉴定出它们为硅藻。

另外，在浮游植物中硅藻最多，存在很多种类。

然而，当本发明的发明人用显微镜详细观察检测到DHMBA的4种微藻菌株的形态时，4种菌株都是硅藻。这里所用的显微镜的放大倍数为1000倍(目镜：10倍，物镜：100倍)。

前述4种微藻菌株，即硅藻，是一组广泛分布在海湾海水中的海洋硅藻，已知为产生大量不饱和脂肪酸的硅藻。它也被称为超浮游硅藻。

接下来，本发明的发明人对四种微藻菌株，即硅藻进行了DNA分析，并试图进一步具体地鉴定硅藻。

DNA分析是对硅藻所属的类别进行分析，所述类别被分类为“门”、“亚门”、“纲”、“亚纲”、“目”、“科”、“属”、“种”。并且随着从“门”到“种”，更具体地进行鉴定。

该DNA分析的过程将在下面进行说明。

检测到DHMBA的硅藻(H-7-09株)的鉴定

其被认为是硅藻亚纲的硅藻。但是，无法达到“目”以下水平的鉴定。

(方法)

进行在Genbank(NCBI，NHI)中的megablast检索

检索条件(1)对除环境衍生的序列之外的全体进行检索(图8和图9)

→根据此结果进行考察。

检索条件(2)对仅限于类型衍生的序列进行检索(图10和图11)

→由于要比对的序列数据的信息量不足，因此不会根据此结果进行考察。

(megaBlast检索结果)

·18S

示出与一种喜湿藻(Humidophila Schmassmannii)分离株HYU-D030菌株的序列具有约96.2％的同一性。

→同一性低至约96％。

但是，考虑到第二个以后命中的序列，推定其是硅藻纲硅藻亚纲的硅藻。

·28S D2R2的序列

示出与多纹拟菱形藻菌株(Pseudo-nitzschia multistriata strain)HAB-132菌株的序列具有约96.1％的同一性。

→同一性低至约96％。另外，序列短，分值和覆盖率也低，并且与18S的结果相比，鉴定结果的可靠性低。

但是，它与根据18S的结果推定的是硅藻纲的硅藻的可能性并不矛盾。

(鉴定结果)

被认为是硅藻门、硅藻亚门、硅藻纲、硅藻亚纲的硅藻。

但是，无法鉴定出“目”以下的水平。

检测到DHMBA的硅藻(H-9-05菌株)的鉴定

被认为是硅藻门、硅藻亚门、硅藻纲、硅藻亚纲、双菱藻(Surirellales)目、内茧藻(Entomoneidaceae)科、内茧藻(Entomoneis)属的硅藻。

但是，无法鉴定出“种”级别。

(方法)

进行在Genbank(NCBI，NHI)中的megablast检索

检索条件(1)对除环境衍生的序列之外的全体进行检索(图12、图13、图14)

→根据此结果进行考察。

检索条件(2)对仅限于类型衍生的序列进行检索(图15、图16、图17)

→由于要比对的序列数据的信息量不足，因此不会根据此结果进行考察。

(megaBlast检索结果)

·18S

示出与沼地内茧藻(Entomoneis paludosa)L431菌株的序列具有98％的同一性。

→同一性低至98％，但考虑到第二个以后命中Entomoneis属，推定为硅藻门、硅藻亚门、硅藻纲、硅藻亚纲、双菱藻(Surirellales)目、内茧藻(Entomoneidaceae)科、内茧藻(Entomoneis)属的硅藻。

·28S D2C2的序列

示出与华丽内茧藻(Entomoneis ornata)27D菌株的序列具有92％的同一性。

→同一性非常低，仅为92％，无法作为参考。另外，序列短，分值和覆盖率低，并且与18S的结果相比，鉴定结果的可靠性相当低。

但是，它与根据18S的结果推定的是内茧藻(Entomoneis)属硅藻的可能性并不矛盾。

·28S D2R2的序列

示出与多纹拟菱形藻菌株(Pseudo-nitzschia multistriata strain)HAB-132菌株的序列具有96％的同一性。

→同一性低至96％，无法作为参考。另外，序列短，分值和覆盖率低于D2C2，并且鉴定结果的可靠性相当低。

但是，它与根据18S的结果推定的是硅藻亚纲的硅藻的可能性并不矛盾。

(鉴定结果)

被认为是硅藻门、硅藻亚门、硅藻纲、硅藻亚纲、双菱藻(Surirellales)目、内茧藻(Entomoneidaceae)科、内茧藻(Entomoneis)属的硅藻。

但是，无法鉴定出“种”的水平。

检测到DHMBA的硅藻(H-9-06菌株)的鉴定

被认为是硅藻门、硅藻亚门、硅藻纲、硅藻亚纲、双菱藻(Surirellales)目、内茧藻(Entomoneidaceae)科、内茧藻(Entomoneis)属的硅藻。

但是，无法鉴定出“种”的水平。

(方法)进行在Genbank(NCBI，NHI)中的megablast检索

检索条件(1)对除环境衍生的序列之外的全体进行检索(图18、图19、图20)

→根据此结果进行考察。

检索条件(2)对仅限于类型衍生的序列进行检索(图21、图22、图23)

→由于要比对的序列数据的信息量不足，因此不会根据此结果进行考察。

(megaBlast检索结果)

·18S

示出与沼地内茧藻(Entomoneis paludosa)L431菌株的序列具有99％的同一性。

→同一性低至99％，但考虑到第二个以后命中Entomoneis属，推定为硅藻门、硅藻亚门、硅藻纲、硅藻亚纲、双菱藻(Surirellales)目、内茧藻(Entomoneidaceae)科、内茧藻(Entomoneis)属的硅藻。

·28S D2C2的序列

示出与华丽内茧藻(Entomoneis ornata)27D菌株的序列具有91％的同一性。

→同一性非常低，仅为91％，无法作为参考。另外，序列短，分值和覆盖率低，并且与18S的结果相比，鉴定结果的可靠性相当低。

但是，它与根据18S的结果推定的是内茧藻(Entomoneis)属硅藻的可能性并不矛盾。

·28S D2R2的序列

示出与单性蒲变虫(Vannella septentrionalis)(阿米巴)具有88％的同一性。

→同一性不到90％。另外，序列短，分值和覆盖率低于D2C2，并且鉴定结果的可靠性相当低。

因此，从这次的鉴定考察中排除。

(鉴定结果)

被认为是硅藻门、硅藻亚门、硅藻纲、硅藻亚纲、双菱藻(Surirellales)目、内茧藻(Entomoneidaceae)科、内茧藻(Entomoneis)属的硅藻。

H-9-09菌株鉴定

未知

(方法)进行在Genbank(NCBI，NHI)中的megablast检索

检索条件(1)对除环境衍生的序列之外的全体进行检索(图24、图25、图26)

→根据此结果进行考察。

检索条件(2)对仅限于类型衍生的序列进行检索(图27、图28、图29)

→由于要比对的序列数据的信息量不足，因此不会根据此结果进行考察。

(megaBlast检索结果)

·18S

示出与一种鞭毛虫(Caecitellus paraparvulus)HFCC320菌株(Bicosoeca，杯鞭虫属)的序列具有97％同一性。

示出第二个以后均与同属的硅藻具有97％的同一性。

→同一性低至97％，但不能否认杯鞭虫属的序列已被扩增的可能性。

然而，通过先前的显微镜检查已经确认样品显示出硅藻形状。

·28S D2C2的序列

示出与一种鞭毛虫(Caecitellus paraparvulus)HFCC71菌株(Bicosoeca，杯鞭虫属)的序列具有88％同一性。

→同一性小于90％。另外，序列短，分值和覆盖率低，并且与18S的结果相比，鉴定结果的可靠性相当低。

因此，从这次的鉴定考察中排除。

但是，这与18S的结果(是杯鞭虫属)并不矛盾。

·28S D2R2的序列

与多纹拟菱形藻(Pseudo-nitzschia multistriata)HAB-132菌株(硅藻亚纲)的序列具有92％的同一性。

→同一性低至92％。另外，序列短，分值和覆盖率低，并且与18S的结果相比，鉴定结果的可靠性低。

但是，这与先前的形态学观察结果(是硅藻)并不矛盾。

(鉴定结果)

未知

附图标记说明

1 浮游生物

4 GF/C过滤器

5 容器。