阅读说明：本技术 酰基间苯三酚杂萜类化合物及其在制药中的用途 (Acyl phloroglucinol heteroterpenoid compound and application thereof in pharmacy ) 是由 侯爱君 李静雅 贾心语 吴咏梅 雷春 虞燕燕 于 2019-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明属医药技术领域,具体涉及从金丝梅中分离得到的天然酰基间苯三酚杂萜类化合物及其在制备防治炎症相关代谢性疾病药物中的用途。本发明从金丝梅中分离得到的式(I)和式(II)结构的酰基间苯三酚杂萜类化合物,经试验表明,所述化合物具有显著的NF-κB转录抑制活性,能有效抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应,可用于制备新的预防或治疗与炎症相关代谢性疾病药物或先导化合物,所述疾病包括肥胖症、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高脂血症、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化或慢性肾病。<Image he="287" wi="700" file="DDA0002046439460000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention belongs to the technical field of medicines, and particularly relates to a natural acyl phloroglucinol heteroterpenoid compound separated from golden plum and a preparation method thereofThe application of the compound in preparing medicaments for preventing and treating inflammatory-related metabolic diseases. Experiments show that the acyl phloroglucinol heteroterpenoid compounds with the structures shown in the formula (I) and the formula (II) separated from the hypericum japonicum have remarkable NF-kB transcription inhibiting activity, can effectively inhibit macrophage inflammatory reaction induced by LPS, and can be used for preparing novel medicines or lead compounds for preventing or treating metabolic diseases related to inflammation, wherein the diseases comprise obesity, insulin resistance, type 2 diabetes, hyperlipidemia, non-alcoholic fatty liver, atherosclerosis or chronic nephropathy.)

酰基间苯三酚杂萜类化合物及其在制药中的用途

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及酰基间苯三酚杂萜类化合物及其在制药中的用途，具体涉及从金丝梅中分离得到的天然酰基间苯三酚杂萜类化合物及其在制备防治炎症相关代谢性疾病药物中的用途。

背景技术

据报道，随着生活水平的提高，高能量摄食的不断增加，肥胖以及肥胖相关的胰岛素抵抗、2型糖尿病、脂代谢紊乱、动脉粥样硬化、慢性肾病等代谢性疾病已严重威胁人类健康。大量的研究表明，炎症是肥胖以及肥胖相关代谢性疾病发生的重要机制；肥胖相关代谢性疾病动物模型以及肥胖患者的循环血液中均呈现出炎性标志物含量的异常变化，如促炎因子TNF-α、IL-1β、IL 6、MCP 1、瘦素、抵抗素等水平明显上升，而抗炎因子脂联素、IL 10等水平显著下降，因此，抗炎已经成为防治上述慢性代谢性疾病的关键切入点。

研究公开了巨噬细胞是介导炎症反应的最主要的免疫细胞，在不同的环境刺激下，可以通过改变自身数量和表型或与代谢细胞相互作用，调控炎症基因的表达和分泌，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高脂血症、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、慢性肾病等多种代谢性疾病的发生发展密切相关，研究认为，巨噬细胞已经成为防治炎症相关代谢性疾病的重要靶细胞。研究还表明，转录因子NF-κB是炎症信号通路的重要组成之一，NF-κB的持续性激活与若干炎症性疾病如肥胖、2型糖尿病、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等密切相关，因此，抑制NF-κB的激活可有效缓解以上慢性炎症相关代谢性疾病。

研究证实了炎症与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化、慢性肾病等代谢性疾病密切相关，抗炎可有效防治上述慢性代谢性疾病，但迄今为止，并未见有以抗代谢性疾病为主要适应症的小分子抗炎药物上市，而现有的抗炎药物用于治疗慢性代谢性疾病将会产生极大副作用，因此开发安全有效、选择性抑制炎症反应的药物是抗炎策略治疗代谢性疾病研究领域面临的重大挑战。

金丝梅(Hypericum patulum Thunb.)是藤黄科金丝桃属植物。中药大辞典记载其全株用药，具有清热利尿、疏肝活络的功效，主治热淋、肝炎、感冒、扁桃体炎、筋骨疼痛及跌打损伤等。日本学者从金丝梅叶中发现了酰基间苯三酚杂萜类化合物，并报道其具有一定的抗菌活性(Organic Letters,2016,18(20):5360)；中国学者从该植物中发现了酰基间苯三酚杂萜类化合物，并具有抑制NO生成的活性(Organic Letters,2018,20(24):7953)。

基于现有技术的现状和基础，本申请的发明人拟提供酰基间苯三酚杂萜类化合物及其在制药中的用途。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状和基础，提供酰基间苯三酚杂萜类化合物及其在制药中的用途；具体涉及从金丝梅中分离得到的天然酰基间苯三酚杂萜类化合物及其在制备防治炎症相关代谢性疾病药物中的用途。

本发明提供了新的化合物，本发明从金丝梅枝叶中分离得到结构如式(I)和式(II)所示的酰基间苯三酚杂萜类天然化合物；

本发明所述的化合物通过下述方法制得：

将金丝梅的干燥枝叶粉碎后，用有机溶剂或/和水提取制备得到总提取物，所用的有机溶剂可采用醇类，如乙醇，甲醇等，其中优选95％(体积比)乙醇；将总提取物分散于水后，用烷烃类溶剂(如石油醚或正己烷)萃取，回收溶剂后得烷烃类萃取物；

将烷烃类萃取物进行硅胶柱层析，以石油醚-丙酮体系进行梯度洗脱，然后经ODS反相硅胶柱色谱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，再经高效液相制备得到化合物(I)和(II)；用波谱方法鉴定化合物(I)的结构为(2S,4aR,6aR,7R,8S,9aS,10R,11S)-11-苯甲酰基-2,6a-二羟基-3,3,7-三甲基-8,10-二(3-甲基-2-丁烯基)六氢-1H,6H-7,4a-桥亚乙基环戊基并[3,4]呋喃并[2,3-b]吡喃-6-酮，化合物(II)的结构为(2R,3aR,5aR,6R,7S,8aS,9R,10S)-2-(2-氨基丙基)-10-苯甲酰基-5a-羟基-6-甲基-7,9-二(3-甲基-2-丁烯基)六氢-5H-6,3a-桥亚乙基环戊基并[c]呋喃并[2,3-b]呋喃-5-酮。

本发明的进一步目的是提供所述化合物的药用用途；对所述式(I)和式(II)所示化合物进行了NF-κB转录抑制活性测试，并考察了对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的影响，结果表明，所述式(I)和式(II)化合物具有显著强的NF-κB转录抑制活性，并能有效抑制脂多糖LPS诱导的RAW 246.7巨噬细胞系和小鼠原代骨髓巨噬细胞BMDM炎症基因的表达，可作为制备新的防治炎症相关代谢性疾病的药物或先导化合物。

本发明提供了具有显著的NF-κB转录抑制活性，并能有效抑制脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症反应的酰基间苯三酚杂萜类化合物，尤其是式(I)和式(II)所示的酰基间苯三酚杂萜类化合物，所述的化合物可用于制备新的抗炎症相关代谢性疾病的药物或先导化合物；所述的与炎症相关代谢性疾病包括肥胖症、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高脂血症、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化，慢性肾病；实验表明，抗炎干预能有效防治上述慢性代谢性疾病。

附图说明

图1为实施例3中本发明化合物(I)和(II)对LPS诱导的RAW 246.7巨噬细胞炎症基因表达的影响，

图2为实施例4中本发明化合物(I)和(II)对LPS诱导的原代BMDM巨噬细胞炎症基因表达的影响，

图1和图2中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

实施例1从金丝梅中提取酰基间苯三酚杂萜类化合物

提取：将干燥的金丝梅枝叶(9.4千克)粉碎后于室温下用95％的乙醇渗漉提取，减压浓缩得到浸膏1.0千克；将浸膏分散于水中，石油醚萃取，减压浓缩得石油醚提取物340克；

分离：将石油醚提取物经硅胶柱层析(200～300目)，以石油醚-丙酮体系(200:1→100:1→50:1→10:1→2:1)梯度洗脱，每个梯度用量5升，收集流份，其中石油醚-丙酮(50:1)流份(53.0克)经ODS反相硅胶柱色谱，以甲醇-水体系(40:60→50:50→60:40→70:30→80:20→90:10→95:5)梯度洗脱，每个梯度用量4升，收集流份；其中甲醇-水70:30流份(5.0克)经过Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化除去杂质(以甲醇-二氯甲烷1:1体系洗脱，用量1升)，再经半制备HPLC纯化得到化合物(I)7.6毫克，即(2S,4aR,6aR,7R,8S,9aS,10R,11S)-11-苯甲酰基-2,6a-二羟基-3,3,7-三甲基-8,10-二(3-甲基-2-丁烯基)六氢-1H,6H-7,4a-桥亚乙基环戊基并[3,4]呋喃并[2,3-b]吡喃-6-酮；化合物(II)10.7毫克，即(2R,3aR,5aR,6R,7S,8aS,9R,10S)-2-(2-氨基丙基)-10-苯甲酰基-5a-羟基-6-甲基-7,9-二(3-甲基-2-丁烯基)六氢-5H-6,3a-桥亚乙基环戊基并[c]呋喃并[2,3-b]呋喃-5-酮。色谱仪为岛津Essentia LC-16，色谱柱为Kromasil C₁₈column(150×10mm，5μm)，洗脱剂为乙腈-水(58:42)，保留时间分别为33.0min及30.0min。HPLC制备时的检测波长为210nm及254nm，流速为4.0mL·min^-1；

式(I)化合物的理化性质及光谱数据如下：性状为无色晶体；分子式为C₃₂H₄₂O₆；分子量为522；熔点：167-169℃；比旋光度值：[α]²⁵ _D+54.0(c 0.10,甲醇)；紫外光谱最大吸收波长值(甲醇)：203(4.09),245(3.79)nm；红外光谱最大吸收频率值(溴化钾)：3442,2973,2917,1780,1737,1654,1465,1379,1145,1049,1010cm^-1；高分辨电喷雾电离质谱(质荷比)：正离子模式523.3057[M+H]⁺(示分子式C₃₂H₄₂O₆)；核磁共振氢谱和碳谱数据如表1所示；

式(II)化合物的理化性质及光谱数据如下：性状为无色晶体；分子式为C₃₂H₄₃NO₅；分子量为521；熔点：175-177℃；比旋光度值：[α]²⁵ _D+61.0(c 0.10,甲醇)；紫外光谱最大吸收波长值(甲醇)：203(4.05),247(3.79)nm；红外光谱最大吸收频率值(溴化钾)：3446,2976,2915,1779,1738,1647,1461,1379,1141,1076,1008cm^-1；高分辨电喷雾电离质谱(质荷比)：正离子模式522.3218[M+H]⁺(示分子式C₃₂H₄₃NO₅)；核磁共振氢谱和碳谱数据如表1所示。

表1是式(I)和式(II)化合物的核磁共振氢谱数据(600MHz，化学位移：ppm，偶合常数：Hz，溶剂：氘代氯仿)和碳谱数据(150MHz，化学位移：ppm，溶剂：氘代氯仿)。

表1

^a信号重叠。

实施例2化合物(I)和(II)对NF-κB转录抑制活性测试实验

利用体外HEK 293细胞上建立的NF-κB荧光素酶报告基因稳转株筛选模型，考察化合物对NF-κB转录活性抑制的影响，将HEK 293/NF-κB细胞10000/孔/50μL接种于96孔细胞板中培养24h，每孔加入含肿瘤坏死因子TNF-α(20ng/mL)的HG-DMEM培养基50μL刺激，同时用二甲亚砜(DMSO)配制2mM化合物母液，1：3梯度稀释化合物后，取1μL加入含细胞的培养板中，孵育6h后加入荧光素酶底物，孵育30min后酶标仪检测荧光信号并计算IC₅₀，式(I)化合物的IC₅₀为0.75±0.17μM，式(II)化合物的IC₅₀为1.19±0.48μM。

实施例3化合物(I)和(II)对RAW 246.7巨噬细胞炎症反应的影响试验

将RAW 246.7细胞以120000/孔接种于48孔板中，用含10％胎牛血清的HG-DMEM培养基过夜培养，LPS(100ng/mL)单独处理或LPS(100ng/mL)与化合物共处理24h，NF-κB抑制剂BAY 11-7082作为阳性对照，并设DMSO溶剂对照组，加入适量TRIzol提取RNA，RT-QPCR检测炎症相关基因表达；

结果如图1(A、B)所示，LPS能刺激RAW 246.7细胞炎症反应，在式(I)和式(II)化合物或阳性对照BAY 11-7082存在的条件下，促炎因子(IL-1β，IL 6，TGF-β，iNOS，COX 2，MCP1)相关基因表达均被显著抑制。

实施例4化合物(I)和(II)对原代BMDM巨噬细胞炎症反应的影响试验

分离C57BL/6J小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)，以500000/孔接种于24孔板中，用含10％胎牛血清的HG-DMEM培养基培养，并用巨噬细胞集落刺激因子M-CSF(10ng/mL)诱导分化，于细胞接种第三天和第五天更换新鲜培养基，诱导分化七天，待细胞分化成熟后LPS(100ng/mL)单独处理或LPS(100ng/mL)与化合物共处理24h，加入适量TRIzol提取RNA，RT-QPCR检测炎症相关基因表达；

结果如图2(A、B)所示，在BMDM巨噬细胞中，式(I)和式(II)化合物能显著抑制促炎因子(IL-1β，IL 6，TNF-α，iNOS)相关基因的表达。

实验结果表明，本发明的酰基间苯三酚杂萜类化合物(I)和(II)具有显著的抗炎作用，可用于制备新的预防或治疗炎症相关代谢性疾病的药物或先导化合物。