阅读说明：本技术 一种HMFO@MOFs复合物材料及其制备方法和应用 (HMFO @ MOFs composite material and preparation method and application thereof ) 是由 尹恒 巩凤芹 于 2019-04-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及无机有机纳米催化剂及其应用领域,具体的说是2-甲基咪唑、锌离子和5-羟甲基糠醛氧化酶(5-hydroxymethylfurfural oxidase,HMFO)制备一种新型扇形多层纳米花状结构的复合材料,该复合材料结构不同于ZIF-8经典的菱形十二面体,而由多片层组合成扇形纳米花结构,更有利于小分子扩散及底物的传递,有利于提高催化效率。本发明采用的技术方案采用水溶液作为溶剂,不含有机溶剂,绿色环保。反应只需在室温下进行,能耗小,简单方便。本发明所述的HMFO@MOFs复合物保留了HMFO的催化活性,可催化HMF生成一系列高附加值产物,具有应用价值。(The invention relates to an inorganic organic nano catalyst and the application field thereof, in particular to a novel composite material with a fan-shaped multilayer nano flower-shaped structure prepared from 2-methylimidazole, zinc ions and 5-hydroxymethyl furfural oxidase (HMFO), the structure of the composite material is different from that of a ZIF-8 classic rhombic dodecahedron, and a fan-shaped nano flower structure is formed by combining a plurality of layers, so that the small molecule diffusion and the substrate transfer are facilitated, and the catalytic efficiency is improved. The technical scheme adopted by the invention adopts the aqueous solution as the solvent, does not contain an organic solvent, and is green and environment-friendly. The reaction is carried out only at room temperature, so that the energy consumption is low, and the method is simple and convenient. The HMFO @ MOFs compound disclosed by the invention reserves the catalytic activity of HMFO, can catalyze HMF to generate a series of high value-added products, and has application value.)

一种[email protected]复合物材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及无机有机纳米催化剂及其应用领域，具体涉及一种MOFs固载5-羟甲基糠醛氧化酶的复合材料及其制备方法与催化5-羟甲基糠醛生成一系列高附加值化合物的应用。

技术背景

游离酶具有独特的高选择性、高催化活性以及条件温和、绿色环保的特点，在化工、制药和食品等领域具有广泛应用。然而游离酶的稳定性不佳，回收困难，从而限制了其工业应用。为了解决游离酶存在的问题，固定化酶的技术应运而生并不断发展。目前关于新型材料固定化酶的研究主要集中在较多的模型酶，包括葡糖糖氧化酶、辣根过氧化物酶、脂肪酶等，酶的研究类型及范围相对较窄。由于固定化载体的选择需要综合考量目标酶的分子大小，氨基酸组成，结构特点及理化性质，所以至今没有针对某一类酶通用的固定化方法，仍缺乏更广泛的结构性质及机理的研究。因此，扩大新型材料固定化酶的研究范围，对酶-新型材料复合结构的基础和应用研究具有十分重要的意义。

目前HMF大多由化学催化剂催化果糖或葡萄糖生成，产物中含有许多副产物。2015年，Jin等(Chemical Engineering Science,2015,124:170-178.)通过制备一系列的金属有机骨架材料(Metal-organic Framework，MOFs)实现了在混合溶液中高效的吸附分离5-羟甲基糠醛，比较了ZIF-8，ZIF-90及ZIF-93对HMF的特异性吸附效果，结果表明ZIF-8的吸附量最高。5-羟甲基糠醛氧化酶(HMFO)作为一种葡萄糖-甲醇-胆碱氧化酶，可以有效的催化5-羟甲基糠醛(HMF)生成一系列高附加值化合物。鉴于ZIF-8特异性吸附HMF的特点，通过ZIF-8固定HMFO，理论上能够提高固定后的HMFO对HMF的催化效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型扇形多层纳米花状结构的复合物[email protected]复合结构及其制备方法和应用，具有催化5-羟甲基糠醛生成一系列高附加值化合物的功能。本发明采用ZIF-8的原材料2-甲基咪唑和锌离子首次对HMFO实现了固定化，制备得到一种新型结构的纳米生物催化剂[email protected]，该结构不同于ZIF-8经典的菱形十二面体，而是呈扇形多层纳米花状。具有较高的酶负载能力，固定化的酶具有较高的稳定性及可重复利用。该复合结构可高效连续氧化催化5-羟甲基糠醛，生成一系列高附加值化合物。本专利拓展了纳米生物催化剂的研究范围，实现了2,5-二甲酰呋喃及5-羟甲基-2-呋喃甲酸的绿色制备过程。

为了实现上述目标，本发明采用的技术方案为：

本发明一方面提供一种[email protected]复合材料，所述复合材料通过2-甲基咪唑和锌离子及5-羟甲基糠醛氧化酶混合制备得到；所述5-羟甲基糠醛氧化酶为发明专利申请文件CN108118064中公开的。

所述5-羟甲基糠醛氧化酶的基因序列表如SEQ ID NO.1所述的5-羟甲基糠醛氧化酶具体制备过程如下：

将5-羟甲基糠醛氧化酶基因(序列表SEQ ID NO.1)优化合成，用限制性内切酶XhoI和XbaI将HMF氧化酶基因接到pPICZa-A表达载体上，转化至大肠杆菌Top10，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性克隆子，重组质粒在大肠杆菌内扩增，用质粒纯化试剂盒回收质粒，进行测序分析，将测序正确的质粒采用钙转的方式转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中。从平板上挑选大肠杆菌阳性克隆转化子，接入5.0ml LA培养基中，37℃，220r/min培养过夜。次日，取1.0mL过夜菌接种至100.0mL新LA培养基中，37℃，220r/min培养菌液OD600为0.6-0.8左右，加入0.1mmol/L的IPTG，16℃，220r/min培养20h,离心收集菌体，加入30.0mLNaCl(0.5mol/L)溶液重悬菌体，再次离心。10.0mLNAT buffer重悬菌体，冰上进行超声破壁。离心收集上清即为粗酶液。将粗酶液经过Ni-NTA亲和层析柱纯化即得纯的5-羟甲基糠醛氧化酶液。

基于以上技术方案，优选的，所述混合温度为25-40℃，混合时间为10-60min。

基于以上技术方案，优选的，所述[email protected]复合材料形貌为片状结构组成的扇形纳米花，本发明的复合材料由2-甲基咪唑和锌离子混合5-羟甲基糠醛氧化酶形成，5-羟甲基糠醛氧化酶诱导2-甲基咪唑和锌离子结合形成的ZIF-8结构为扇形纳米花状的，而不是传统的菱形十二面体。

本发明另一方面提供一种上述的[email protected]复合材料的制备方法，其特征在于：步骤如下：将5-羟甲基糠醛氧化酶溶液，2-甲基咪唑溶液及锌前驱体溶液混合，在25-30℃下搅拌10-60min，然后静置12-24h后，洗涤，得到所述[email protected]复合材料。

基于以上技术方案，优选的，所述2-甲基咪唑溶液的浓度为120-200mM；所述锌前驱体溶液的浓度为30-50mM；所述5-羟甲基糠醛氧化酶溶液的浓度为0.5-2.0mg/mL；所述2-甲基咪唑溶液、锌前驱体溶液和5-羟甲基糠醛氧化酶溶液的体积比为(0.5～1):(0.5～1):0.25；所述5-羟甲基糠醛氧化酶的比活力为0.005-0.01U/mg。基于以上技术方案，优选的，所述2-甲基咪唑溶液和锌前驱体溶液的溶剂为水，所述5-羟甲基糠醛氧化酶溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液；所述磷酸缓冲溶液的pH值为7.2，浓度为0.1mol/L；所述锌前驱体为乙酸锌、硝酸锌。

基于以上技术方案，优选的，所述5-羟甲基糠醛氧化酶溶液的浓度1.0mg/mL；所述5-羟甲基糠醛氧化酶的比活力为0.01U/mg；所述搅拌时间为30min；所述搅拌温度为25℃；所述静置时间为18h。

本发明再一方面提供一种上述的[email protected]复合材料或上述制备方法制备的[email protected]复合材料的应用，所述反应需在有氧条件下进行，即在氧气和/或空气存在条件下进行，所述[email protected]复合材料催化氧化5-羟甲基糠醛(HMF)生成2,5-二甲酰呋喃(DFF)和5-羟甲基-2-呋喃甲酸(FFA)。

基于以上技术方案，优选的取5-羟甲基糠醛(HMF)溶液，加入所述[email protected]复合材料，于30℃反应24-85h；所述反；所述HMF的溶液为磷酸盐缓冲液，所诉磷酸盐缓冲液的pH值为7.9，浓度为50mmol/L；所述HMF溶液的浓度为0.5-1.0mg/mL；所述[email protected]加入量与HMF的质量比(mg/mg)为(10:1)～(100:1)。

基于以上技术方案，所述催化反应的温度为30℃；所述HMF溶液的浓度0.5mg/mL。

有益效果

1.本发明所述的技术方案采用水溶液作为溶剂，不含有机溶剂，绿色环保。

2.本发明所述的技术方案只需在室温下进行，能耗小，简单方便。

3.本发明所述的[email protected]复合物结构不同于ZIF-8经典的菱形十二面体，由多片层组合成扇形纳米花结构，具有较高的酶负载能力，更有利于小分子扩散及底物之间的传递，有利于增加催化效率。

4.本发明所述的[email protected]复合物保留了HMFO的催化活性，可催化HMF生成一系列高附加值产物，具有应用价值。

5.固定化后的[email protected]具有较好的稳定性及可重复利用性。

附图说明

图1.为实施例1中HMFO的SDS-PAGE图。

图2为实施例1制备的[email protected]的SDS-PAGE分析图。

图3为实施例1制备的[email protected]的扫描电镜图。

图4为实施例2制备的[email protected]的SDS-PAGE分析图。

图5为实施例2制备的[email protected]的扫描电镜图。

图6为实施例3制备的[email protected]的SDS-PAGE分析图。

图7为实施例3制备的[email protected]的扫描电镜图。

图8为实施例4制备的[email protected]的SDS-PAGE分析图。

图9为实施例4制备的[email protected]的扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明：

实施例1

5-羟甲基糠醛氧化酶制备过程

1.合成5-羟甲基糠醛氧化酶基因(序列表1)，用限制性内切酶XhoI和XbaI将5-羟甲基糠醛氧化酶基因接到pPICZa-A表达载体上。经T4连接酶过夜连接。取5μL连接液转化至大肠杆菌Top10，涂在含氨苄的抗性平板上37℃过夜培养12-15h。在氨苄平板上挑取10个大而分散的单菌落进行菌落PCR鉴定，将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，含有目的条带的菌落进行继续培养，提取质粒，进行测序分析。

2.质粒提取：将菌液5000rpm离心5min。去上清液，沉淀用质粒试剂盒提取质粒。

将提取的质粒进行双酶切验证，同时进行测序分析。

3.将测序正确的质粒转入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中。具体转化步骤如下：取5.0μL质粒于50.0μL大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，冰浴10min，42℃2min；冰浴20min后，加500.0μLLB培养液，于37℃摇床中培养45min，5000rpm离心5min，弃去300.0μL后涂布LB固体平板(含氨苄)

4.从平板上挑选大肠杆菌阳性克隆转化子，接入5.0mL LA液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜。

5.次日，取1.0mL过夜菌接种至100.0mL新LA培养基中，37℃，220r/min培养菌液OD₆₀₀为0.6-0.8左右，加入0.1mmol/L的IPTG，16℃，220r/min诱导20h,离心收集菌体，加入30.0mLNaCl(0.5mol/L)溶液重悬菌体，再次离心。用10.0mLNAT buffer重悬菌体，冰上进行超声破壁。离心收集上清即为5-羟甲基糠醛氧化酶粗酶液。

6.将粗酶液经Ni-NTA亲和层析柱纯化，得到纯化的5-羟甲基糠醛氧化酶。具体纯化过程如下：

(1)3个柱体积的无菌水冲洗Ni-NTA亲和层析柱；

(2)含20mM咪唑溶液的NAT buffer平衡3个柱体积；

(3)5-羟甲基糠醛氧化酶粗酶液流经柱子三遍；

(4)含20mM咪唑溶液的NAT buffer冲洗3个柱体积；

(5)含80mM咪唑溶液的NAT buffer冲洗3-5个柱体积；

(6)含500mM咪唑溶液的NAT buffer冲洗3个柱体积；

(7)无菌水冲洗镍柱；

(8)20％乙醇保存Ni-NTA亲和层析柱。

7.浓缩：将80mM咪唑溶液下洗脱的蛋白溶液用超滤管(3000KDa)浓缩。

8.置换：100mM磷酸钾缓冲溶液(pH7.2)置换三次，于4℃冰箱保存。

[email protected]的制备过程

取2.0mL 2-甲基咪唑(160.0mM)溶液，加入0.5mL HMFO(1.0mg/mL)溶液，混合均匀后加入2.0mL乙酸锌(40.0mM)溶液，于25℃搅拌10min，静置12h，所得固体用去离子水洗涤3次，得到[email protected]。

将实施例1制备的[email protected]加入适量冰醋酸溶解，按照体积比4:1比例加入体积比为1:1的乙醇和丙酮混合溶液，于-20℃放置2h后离心，弃上清，用无水乙醇将沉淀洗涤三次，加入2.0％SDS超声溶解，取40μL蛋白溶液和10.0μL样品缓冲液(5×)混匀，煮沸10min，取上清进行SDS-PAGE测定(图2，M是标准蛋白分子，条带1是HMFO，条带2是[email protected]粉末，条带3是制备过程中上清液)。另外分别取40.0μL负载上清液和HMFO同时进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE结果表明[email protected]粉末中有蛋白条带，而上清液中则没有条带，说明[email protected]成功合成。

将实施例1制备的[email protected]进行冷冻干燥，取少量样品置于扫描电子显微镜内进行形貌表征。结果(图3)表明[email protected]呈扇形多层纳米花状结构。

[email protected]催化氧化HMF过程

分别取1.0mg/mL的HMF溶液，加入2.0mg实施例1制备的[email protected]，将充满空气的气球连接到圆底烧瓶中，为确保氧气充足，每隔12h重新将气球充满空气，以确保在反应的整个过程气球都是鼓胀的，30℃下磁力搅拌反应85h。反应完成后，加入适量盐酸将[email protected]溶解，12000rpm离心10min，经0.22μm的水系滤膜过滤，采用HPLC检测HMF转化率79.9％，DFF收率61.5％，FFA收率11.0％，选择性达90.7％。

实施例2

[email protected]的制备过程

取2.0mL 2-甲基咪唑(160.0mM)溶液，加入0.5mL HMFO(1.0mg/mL)溶液，混合均匀后加入浓度为40.0mM的乙酸锌溶液2.0mL，25℃搅拌30min静置12h，所得固体用去离子水洗涤3次，得到[email protected]。

将实施例2制备的[email protected]加入适量冰醋酸溶解，按照体积比4:1比例加入体积比为1:1的乙醇和丙酮混合溶液，于-20℃放置2h后离心，弃上清，用无水乙醇将沉淀洗涤三次，加入2.0％SDS超声溶解，取40μL蛋白溶液和10.0μL样品缓冲液(5×)混匀，煮沸10min，取上清进行SDS-PAGE测定(图4，M是标准蛋白分子，条带1是制备过程中上清液，条带2是[email protected]粉末)。另外分别取40.0μL负载上清液和HMFO同时进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE结果表明[email protected]粉末中有蛋白条带，而上清液中则没有条带，说明[email protected]成功合成。

将实施例2制备的[email protected]进行冷冻干燥，取少量样品置于扫描电子显微镜内进行形貌表征。结果(图5)表明[email protected]呈扇形多层纳米花状结构。

[email protected]催化氧化HMF过程

分别取0.5mg/mL的HMF溶液，加入2.0mg实施例2制备的[email protected]，将充满空气的气球连接到圆底烧瓶中，为确保氧气充足，每隔12h重新将气球充满空气，以确保在反应的整个过程气球都是鼓胀的，30℃下磁力搅拌反应85h。反应完成后，加入适量盐酸将[email protected]溶解，12000rpm离心10min，经0.22μm的水系滤膜过滤，采用HPLC检测HMF转化率80.6％，DFF收率59.1％，FFA收率15.0％，选择性达91.9％。

实施例3

[email protected]的制备过程

取2.0mL 2-甲基咪唑(160.0mM)溶液，加入0.5mL HMFO(2.0mg/mL)溶液，混合均匀后加入浓度为40mM的乙酸锌溶液2.0mL，25℃搅拌10min，静置18h，所得固体用去离子水洗涤3次，得到[email protected]。

将实施例3制备的[email protected]加入适量冰醋酸溶解，按照体积比4:1比例加入体积比为1:1的乙醇和丙酮混合溶液，于-20℃放置2h后离心，弃上清，用无水乙醇将沉淀洗涤三次，加入2.0％SDS超声溶解，取40μL蛋白溶液和10.0μL样品缓冲液(5×)混匀，煮沸10min，取上清进行SDS-PAGE测定(图6，M是标准蛋白分子，条带1是制备过程中上清液，条带2是HMFO，条带3是[email protected]粉末)。另外分别取40.0μL负载上清液和HMFO同时进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE结果表明[email protected]粉末中有蛋白条带，而上清液中则没有条带，说明[email protected]成功合成。

将实施例3制备的[email protected]进行冷冻干燥，取少量样品置于扫描电子显微镜内进行形貌表征。结果(图7)表明[email protected]并非ZIF-8经典的菱形十二面体结构，而是一种呈扇形多层纳米花状结构。

[email protected]催化氧化HMF过程

分别取0.5mg/mL的HMF溶液，加入1.0mg实施例3制备的[email protected]，将充满空气的气球连接到圆底烧瓶中，为确保氧气充足，每隔12h重新将气球充满空气，以确保在反应的整个过程气球都是鼓胀的，25℃下磁力搅拌反应85h。反应完成后，加入适量盐酸将[email protected]溶解，12000rpm离心10min，经0.22μm的水系滤膜过滤，采用HPLC检测HMF转化率81％，DFF收率54.1％，FFA收率21.0％，选择性达到92.7％。

实施例4

[email protected]的制备过程

取2.0mL 2-甲基咪唑(160.0mM)溶液，加入0.5mL HMFO(2.0mg/mL)溶液，混合均匀后加入浓度为40.0mM的乙酸锌溶液2.0mL，25℃搅拌30min，静置18h，所得固体用去离子水洗涤3次，得到[email protected]。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)表征[email protected]

将实施例4制备的[email protected]加入适量冰醋酸溶解，按照体积比4:1比例加入体积比为1:1的乙醇和丙酮混合溶液，于-20℃放置2h后离心，弃上清，用无水乙醇将沉淀洗涤三次，加入2.0％SDS超声溶解，取40μL蛋白溶液和10.0μL样品缓冲液(5×)混匀，煮沸10min，取上清进行SDS-PAGE测定(图8，M是标准蛋白分子，条带1是HMFO，条带2是[email protected]粉末，条带3是制备过程中上清液)。另外分别取40.0μL负载上清液和HMFO同时进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE结果表明[email protected]粉末中有蛋白条带，而上清液中则没有条带，蛋白定量检测计算固载量达89％，说明[email protected]成功合成。

将实施例4制备的[email protected]进行冷冻干燥，取少量样品置于扫描电子显微镜内进行形貌表征。结果(图9)表明[email protected]并非ZIF-8经典的菱形十二面体结构，而是一种呈扇形多层纳米花状结构。

[email protected]催化氧化HMF过程

分别取0.5mg/mL的HMF溶液，加入1.0mg实施例4制备的[email protected]，将充满空气的气球连接到圆底烧瓶中，为确保氧气充足，每隔12h重新将气球充满空气，以确保在反应的整个过程气球都是鼓胀的，30℃下磁力搅拌反应85h。反应完成后，加入适量盐酸将[email protected]溶解，12000rpm离心10min，经0.22μm的水系滤膜过滤，采用HPLC检测HMF转化率84.3％，DFF收率64.1％，FFA收率17.7％，两者合并收率达81.8％，选择性达97％。

实施例5

[email protected]的稳定性测定

将游离的HMFO及实施例4制备的[email protected]置于4℃和25℃下放置一周，检测HMFO及[email protected]的剩余酶活。4℃下存放一周后游离的HMFO剩余59％左右的活性，[email protected]剩余67％左右的活性。25℃下存放一周后游离的HMFO剩余10％左右的活性，[email protected]剩余60％左右的活性。

实施例6

[email protected]的重复性测定

取2mg/mL实施例4制备的[email protected]加入1.0mg/mL香草醇的磷酸钾缓冲溶液中(50.0mΜ，pH 8.0)，于25℃的震荡孵育器中反应1h，反应完成后，12000rpm离心10min，取上清液于320nm下测定OD值，计算酶活力，沉淀继续进行活性反应。重复该反应过程，[email protected]可重复使用3次后保留80％的酶活力，重复使用5次后保留20％活力。

对比例1

将实施例1中制备的游离酶不经过固载，直接按照实施例4的条件催化氧化HMF，计算得到DFF和FFA的合并收率为71.7％。经过比较，实施例4的DFF和FFA的合并收率达81.8％，转化率为84.3％，选择性达97％，而对比例1中，转化率为100％，FFA的收率为71.7％，选择性为71.7％，因此，可以看出，固载后的酶催化性能比游离酶的性能更加优异，其收率和选择性均高于游离酶的71.7％(表1，A为[email protected]的催化结果，B为游离HMFO催化结果)。

表1

序列表

SEQ ID NO.1

ATGACCGACACCATCTTCGATTACGTGATCGTCGGCGGAGGCACCGCCGGCAGCGTGCTGGCTAATAGGCTGAGCGCCCGGCCTGAGAACAGGGTGCTGCTGATCGAGGCTGGCATCGATACCCCCGAGAACAACATCCCCCCCGAGATCCATGACGGCCTCAGGCCCTGGCTCCCTAGGCTGTCCGGAGACAAGTTCTTCTGGCCCAACCTCACCATTCACAGGGCCGCTGAGCATCCCGGCATCACCAGGGAGCCTCAGTTCTACGAACAGGGCAGGCTGCTGGGCGGCGGATCCTCCGTCAACATGGTGGTGTCCAACCGGGGCCTCCCCAGGGACTACGATGAGTGGCAGGCTCTGGGAGCCGACGGCTGGGATTGGCAGGGAGTGCTGCCCTACTTCATCAAGACCGAGAGGGATGCCGACTACGGAGATGATCCCCTGCATGGCAACGCCGGCCCTATCCCTATTGGCAGGGTGGACAGCAGGCACTGGTCCGACTTCACAGTGGCTGCTACCCAAGCTCTGGAGGCCGCTGGCCTGCCCAATATCCACGACCAGAACGCCAGGTTTGACGATGGCTATTTCCCCCCCGCTTTTACCCTGAAGGGCGAGGAGCGGTTTAGCGCCGCTAGGGGCTACCTGGATGCCTCCGTGAGGGTGCGGCCTAACCTGAGCCTCTGGACCGAGAGCCGGGTCCTGAAGCTCCTGACCACCGGAAACGCCATCACCGGCGTGAGCGTCCTGAGGGGCAGGGAAACCCTGCAGGTCCAGGCCAGGGAGGTGATCCTGACAGCCGGAGCCCTGCAGAGCCCTGCTATCCTGCTGCGGACCGGCATCGGCCCTGCTGCCGACCTGCATGCTCTCGGCATTCCTGTGCTCGCTGATAGGCCTGGCGTGGGACGGAACCTGTGGGAGCACAGCTCCATCGGCGTGGTGGCTCCCCTGACAGAGCAGGCTAGGGCTGACGCTAGCACCGGAAAGGCCGGAAGCAGGCACCAGCTCGGAATCCGGGCTTCCTCCGGAGTGGACCCTGCTACCCCCTCCGATCTGTTCCTGCACATCGGCGCCGATCCTGTGTCCGGCCTCGCTAGCGCTGTGTTCTGGGTGAACAAGCCTAGCAGCACCGGCTGGCTGAAGCTCAAGGACGCTGACCCCTTCAGCTACCCCGATGTGGACTTCAACCTGCTGTCCGATCCCCGGGATCTGGGAAGGCTGAAGGCTGGCCTGAGGCTGATCACACACTACTTCGCCGCCCCTAGCCTGGCTAAGTATGGCCTGGCTCTGGCCCTGAGCAGGTTTGCTGCTCCTCAGCCTGGCGGCCCCCTCCTGAATGACCTGCTCCAGGACGAGGCCGCCTTAGAAAGGTACCTGAGGACCAACGTGGGCGGAGTGTGGCATGCTTCCGGCACCGCTAGGATCGGCAGGGCCGACGATAGCCAGGCTGTGGTGGACAAGGCTGGCAGGGTCTACGGCGTGACAGGCCTGAGGGTGGCCGATGCCTCCATCATGCCTACCGTCCCTACCGCTAACACAAACCTGCCTACCCTGATGCTCGCCGAAAAGATCGCTGACGCTATCCTGACCCAGGCTTGA