阅读说明：本技术 一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法 (Multi-point immobilization method based on unnatural amino acid modified enzyme ) 是由 王安明 谢恬 李慧敏 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法,使用非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸对醛酮还原酶进行修饰,同时使用环辛炔改性的氨基活化环氧树脂聚合物对酶进行固定化,而且将其作为固体化载体实现与非天然氨基酸修饰的醛酮还原酶进行多点共价连接,通过炔烃-叠氮化物环加成反应,完成了酶的一步纯化和固定化。通过本发明方法制得的非天然氨基酸修饰的固定化醛酮还原酶在酶活上比游离酶有了很大的提高,并通过无铜点击反应,使醛酮还原酶省去传统繁琐的纯化方法,其中五点固定化可以实现60％的纯化效率。该方法安全可靠且环境污染少,很大程度节约了纯化所耗的时间和成本,适合于工业化生产。(The invention relates to a multipoint immobilization method based on an unnatural amino acid modified enzyme, wherein an unnatural amino acid is used for modifying aldehyde ketone reductase, cyclooctyne modified amino activated epoxy resin polymer is used for immobilizing the enzyme, and the enzyme is used as a solidified carrier to realize multipoint covalent connection with the unnatural amino acid modified aldehyde ketone reductase, and one-step purification and immobilization of the enzyme are completed through alkyne-azide cycloaddition reaction. The enzyme activity of the non-natural amino acid modified immobilized aldehyde-ketone reductase prepared by the method is greatly improved compared with that of free enzyme, and the traditional complicated purification method of the aldehyde-ketone reductase is omitted by copper-free click reaction, wherein the five-point immobilization can realize the purification efficiency of 60%. The method is safe and reliable, has less environmental pollution, greatly saves the time and cost consumed by purification, and is suitable for industrial production.)

一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法

技术领域

本发明涉及一种酶的固定化方法，尤其是涉及一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法。

背景技术

催化剂酶是从容易获得的可再生资源中产生的，并且是可生物降解的，基本上无害且无毒。在过去的几十年中，酶的应用急剧增加，主要在研究方法学，药物研究，食品改性，化妆品工业的洗衣和造纸工业领域。但是，此类实际应用受到酶的脆弱性(例如，热稳定性低，最适pH范围狭窄，对大多数有机溶剂和许多金属离子的耐受性低等)的阻碍。此外，酶会导致不可避免的纯化和分离步骤。固定化酶为这些挑战提供了简单而优雅的解决方案。固定酶的方法可分为三类：与固相支持物(载体)结合，截留和交联。与预制支撑物的结合可以是物理的(例如疏水性的)，离子的或共价的。这些在所形成的相互作用的类型，特征，所用载体材料的形式和类型方面不同。传统上，所有这些技术都无法控制酶附着或吸附到表面的方向，从而最大程度地减少了不希望的酶与表面的相互作用，最大化了酶的稳定性，并最大化了活性部位的可及性。在各种固定化策略中，酶通过物理吸附或共价键在固体表面的附着建立了最佳实用技术之一。酶-载体共价键的形成牢固且不可逆，具有较高的操作稳定性。

因此，找到有效的共价位点特异性酶固定化方法非常重要。定点突变允许在蛋白质序列的任何位置交换特定氨基酸，从而增加了对连接方向的控制，因为它不仅限于N端或C端修饰。此外，可以在单个酶变体中引入多个定点突变，不仅允许将其定向更改为支持物，而且还可以调节酶与支持物的相互作用及其催化行为。以前的研究证明了共价位点特异性固定技术在潜在的固定位置，如N端或C端区域存在很大的局限性，并且主要依赖于20个规范氨基酸侧链中官能团的修饰。传统规范氨基酸的位点特异性修饰不能满足我们对新共价固定化的需求，因此我们选择非天然氨基酸作为固定化的重要工具。

修饰应发生在酶的特定位点，以最大程度地控制酶的方向并保持其最高活性。研究表明非天然氨基酸的位点特异性结合可以使蛋白质以受控方式固定。遗传密码扩展使用正交的氨酰基-tRNA合成酶对(aaRS)-tRNA指导非天然氨基酸掺入蛋白质，以响应在基因的所需位点引入的未分配密码子(通常为琥珀色终止密码子，UAG)。正交合成酶不能识别内源性tRNA，特别是通过提供给细胞(或由细胞合成)的非天然氨基酸来氨酰化正交同源的tRNA(这不是内源性合成酶的有效底物)。

同样对于蛋白质固定，Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)及其菌株促进的变体(SPAAC)也变得越来越流行。已知铜(I)盐具有细胞毒性，因此研究发现了一种有效的替代方法是由反应的菌株促进形式。为了改善叠氮化物-炔烃环加成的生物相容性，我们试图通过除金属催化以外的其他方法(即通过环应变)活化炔烃。对张力烯烃和炔烃的研究一直持续到1960年代，在此期间，科学家曾经声称最小的稳定的环炔烃环辛炔与苯叠氮化物结合时会“像***一样”发生反应。基于上述理论，我们选择了环辛炔(BCN，Bicyclo[6.1.0]nonyne)作为叠氮化物交联剂，并在合成聚合物载体上对其进行了改性，以完成蛋白质的生物交联。替代无机材料，包括聚苯乙烯(PS)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚碳酸酯(PC)和聚(L-丙交酯)在内的合成聚合物是生物分析中另一种流行的固定化酶载体。合成聚合物的最大优点是支持材料是构建聚合物链的单体可以根据酶的要求和使用固定化产物的过程进行选择。然而，固定化中最麻烦的问题之一是酶的纯化。通常，纯化的蛋白质被广泛用于固定在固相支持物上，但蛋白质的纯化通常费力且昂贵。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种基于非天然氨基酸修饰酶的一步纯化和多点固定化方法。该方法将非天然氨基酸引入的特征在于使用非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸对醛酮还原酶进行修饰，同时使用环辛炔改性的氨基活化环氧树脂聚合物对酶进行固定化，而且将其作为固体化载体实现与非天然氨基酸修饰的醛酮还原酶进行多点共价连接，通过炔烃-叠氮化物环加成反应，完成了酶的一步纯化和固定化。通过本发明方法制得的非天然氨基酸修饰的固定化醛酮还原酶在酶活上比游离酶有了很大的提高，并通过无铜点击反应，使醛酮还原酶省去传统繁琐的纯化方法，其中五点固定化可以实现60％的纯化效率。该方法安全可靠且环境污染少，很大程度节约了纯化所耗的时间和成本，适合于工业化生产。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，包括下述步骤：

(1)非天然氨基酸修饰醛酮还原酶的合成和表达：使用非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸对醛酮还原酶进行修饰，得到不同数量突变位点的醛酮还原酶；

(2)载体活化(环辛炔修饰的氨基环氧树脂的制备)：将环氧树脂通过一次氨基修饰和二次环辛炔基修饰使其成为带有环辛炔官能基团的环氧树脂载体；

(3)酶的一步纯化和多点固定化：使用环辛炔官能基团的环氧树脂对不同数量突变位点的醛酮还原酶进行固定化，通过炔烃-叠氮化物环加成反应，完成了酶的一步纯化和固定化。

作为优选，所述醛酮还原酶包括单点突变醛酮还原酶、三点突变醛酮还原酶以及五点突变醛酮还原酶。

本发明以单点突变醛酮还原酶和三点以及五点突变醛酮还原酶作为研究材料，并将环氧树脂通过一次氨基修饰和二次环辛炔基修饰使其成为带有环辛炔官能基团的环氧树脂，同时将三类突变酶和修饰后环氧树脂进行酶的固定化，得到一步纯化和固定化后具有较高酶活力的酶，同时证明了随着位点的增加，固定化效率得到了很大的提升。

作为优选，步骤(1)具体为：通过SWISS-MODEL对模拟目的醛酮还原酶的三级结构，通过对活性位点的筛选，对醛酮还原酶目的基因进行定点突变为TAG密码子，将醛酮还原酶目的基因和正交氨酰基-tRNA合成酶(aaRS)/tRNA对pEVOL-pAzF共转化到C321.ΔA strain(MG1655)，加入抗生素和诱导剂，诱导以获得所需醛酮还原酶(目的蛋白)。在这一技术中,首先需要在体内引入外源的氨酰tRNA合成酶(aaRS)-tRNA对，这些外源aaRS-tRNA对不会对内源aaRS-tRNA对产生干扰，而且外源的aaRS可以特异地识别某种非天然氨基酸并将之通过氨酰化“结合”到对应的同源tRNA上。之后这些携带有非天然氨基酸的氨酰tRNA进入核糖体，并通过识别mRNA上特定的无义密码子，将非天然氨基酸引入到增长的肽链当中。

步骤(1)醛酮还原酶的突变位点的选择要使突变位点远离蛋白活性中心并突变为TAG密码子，并于单点的基础上进行多点的目的基因突变。

作为优选，步骤(2)中氨基修饰(环氧树脂氨基化)过程为：将环氧树脂聚合物添加到反应水溶液中进行氨基活化，调节溶液pH值至碱性，反应后通过离心，洗涤，干燥得到氨基活化的环氧树脂载体中间体。

氨基修饰的环氧树脂要在碱性条件下，并使用碱性条件下相近等电点的氨基酸进行修饰固定。

作为优选，步骤(2)中环辛炔基修饰(氨基环氧树脂的羧基的酯化反应)过程为：将环辛炔(BCN)、氨基活化的环氧树脂载体中间体、二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)添加到二氯甲烷(DCM)中，反应后得到环辛炔官能化的环氧树脂。

作为优选，步骤(3)具体为：环辛炔官能化树脂载体和收获的不同数量突变位点的醛酮还原酶(培养菌株细胞裂解物的粗酶上清液)添加到磷酸盐缓冲液中，并在摇动孵育运转进行固定化，将固定化酶用氯化钠溶液和磷酸盐缓冲液洗涤，已完成目的蛋白的精准多点固定化。

作为优选，环辛炔基修饰具体过程为：向反应水溶液中加入环氧树脂聚合物，加入2eq赖氨酸，通过添加NaOH调节溶液的pH值为9～11；在室温下反应过夜，将反应物取出并离心，用注射器将上清液排干，并将反应物用水洗涤2～5次，并在40～60℃的真空烘箱中干燥。

作为优选，环辛炔基修饰过程具体为：将环辛炔，氨基活化的环氧树脂载体中间体，二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶按摩尔比1：1：1.2：0.5添加到二氯甲烷中，在室温下于黑暗中反应过夜；反应后，溶液用水洗涤3～6次，将环辛炔官能化的树脂在40～60℃的真空干燥箱中干燥。

作为优选，所述的基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，具体包括下述步骤：

(1)非天然氨基酸修饰醛酮还原酶的合成和表达：将醛酮还原酶突变体细胞接种到含有50μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素和100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，并在振荡培养箱中于34℃培养；当OD 600达到0.5时，添加诱导剂L-(+)-***糖至终浓度为0.2％(w/v)；在OD600为0.6时，通过添加诱导剂30ng/mL脱水四环素和对叠氮基-L-苯丙氨酸至终浓度1mmol/L诱导蛋白质表达；

(2)载体活化：向3mL反应水溶液中加入环氧树脂聚合物1g，加入赖氨酸15mg，通过添加1mol/L NaOH调节溶液的pH值达到10，将反应在室温下进行过夜，将反应物取出并离心，用注射器将上清液排干，并将反应物用水洗涤3次，并在50℃的真空烘箱中干燥；将100μmoL环辛炔，100μmoL氨基活化的环氧树脂载体中间体，120μmoL二环己基碳二亚胺和50μmoL4-二甲氨基吡啶添加到2mL二氯甲烷中，在室温下于黑暗中反应过夜；反应后，溶液用水洗涤4次以除去过量的DCC和DMAP，将环辛炔官能化的树脂在50℃真空干燥箱中干燥；

(3)酶的一步纯化和多点固定化：将0.5g环辛炔官能化树脂载体和3mL收获的培养菌株细胞裂解物的单点，三点，五点突***酶上清液添加到1mL磷酸盐缓冲液中，并在20℃摇动孵育以160rpm的转速运转18小时，然后，将固定的酶用1mol/L NaCl溶液和0.02mol/L磷酸盐缓冲液洗涤两次。

通过本发明方法制得的非天然氨基酸修饰的固定化醛酮还原酶在酶活上比游离酶有了很大的提高，并通过无铜点击反应，使醛酮还原酶省去传统繁琐的纯化方法，其中在24h的条件下，五点固定化可以实现60％的纯化效率。该方法安全可靠且环境污染少，很大程度节约了纯化所耗的时间和成本，适合于工业化生产。

附图说明

图1是本发明的固定化的过程示意图；

图2是固定时间对固定化酶量的影响；

图3是单点突变酶固定化的相对强度；

图4是三点突变酶固定的相对强度；

图5是五点突变酶固定的相对强度。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步的说明，这些实施例并非是对本发明的限定，依照本领域现有的技术，本发明的实施方式并不限于此，凡依照本发明公开内容所做出的本领域的等同替换，均属本发明的保护内容。

本发明使用非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸对醛酮还原酶进行修饰，同时我们使用环辛炔改性的氨基活化环氧树脂聚合物对酶进行固定化，而且将其作为固体化载体实现与非天然氨基酸修饰的醛酮还原酶进行多点共价连接，通过炔烃-叠氮化物环加成反应，完成了酶的一步纯化和固定化；其过程如图1所示。

非天然氨基酸修饰醛酮还原酶的合成和表达

通过SWISS-MODEL对模拟目的醛酮还原酶的三级结构，通过对活性位点的筛选，对目的基因进行定点突变为TAG密码子，将目的基因和正交氨酰基-tRNA合成酶(aaRS)/tRNA对pEVOL-pAzF共转化到C321.ΔA strain(MG1655)，加入抗生素和诱导剂，诱导以获得所需醛酮还原酶(目的蛋白)。具体为：将醛酮还原酶突变体细胞接种到含有50μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素和100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，并在振荡培养箱中于34℃培养；当OD 600达到0.5时，添加诱导剂L-(+)-***糖至终浓度为0.2％(w/v)；在OD600为0.6时，通过添加诱导剂30ng/mL脱水四环素和对叠氮基-L-苯丙氨酸至终浓度1mmol/L诱导蛋白质表达。

本发明以单点突变醛酮还原酶和三点以及五点突变醛酮还原酶作为研究材料。

环氧树脂载体的修饰

为了对环氧树脂氨基化进行更好的选择，本发明实施了对环氧树脂氨基化的前体氨基酸进行了筛选，分别使用赖氨酸，谷氨酸和甘氨酸进行环氧树脂的氨基化。

利用BCN修饰赖氨酸氨基化的环氧树脂

向反应水溶液(3mL)中加入环氧树脂聚合物(120μmoL环氧值，1g)，加入2eq赖氨酸(240μmoL，15mg)，调节溶液的pH值通过添加1mol/L NaOH达到10。将反应在室温下进行过夜，将反应取出并离心，用注射器将上清液排干，并将反应用水洗涤3次，并在50℃的真空烘箱中干燥。将双环[6.1.0]nonyne(BCN)(100μmoL)，氨基活化的环氧树脂支持中间体(100μmoL)，DCC(120μmoL)和DMAP(50μmoL)添加到2mL DCM中，在室温下反应过夜黑暗中的温度。反应后，溶液用水溶液洗涤4次以除去过量的DCC和DMAP。将BCN官能化的树脂在真空干燥箱中在50℃下干燥。

利用BCN修饰谷氨酸氨基化的环氧树脂

向反应水溶液(3mL)中加入环氧树脂聚合物(120μmoL环氧值，1g)，加入2eq谷氨酸(240μmoL，35mg)，调节溶液的pH值通过添加1mol/L NaOH达到10。将反应在室温下进行过夜，将反应取出并离心，用注射器将上清液排干，并将反应用水洗涤3次，并在50℃的真空烘箱中干燥。将双环[6.1.0]nonyne(BCN)(100μmoL)，氨基活化的环氧树脂支持中间体(100μmoL)，DCC(120μmoL)和DMAP(50μmoL)添加到2mL DCM中，在室温下反应过夜黑暗中的温度。反应后，溶液用水溶液洗涤4次以除去过量的DCC和DMAP。将BCN官能化的树脂在真空干燥箱中在50℃下干燥。

利用BCN修饰甘氨酸氨基化的环氧树脂

向反应水溶液(3mL)中加入环氧树脂聚合物(120μmoL环氧值，1g)，加入2eq甘氨酸(240μmoL，18mg)，调节溶液的pH值通过添加1mol/L NaOH达到10。将反应在室温下进行过夜，将反应取出并离心，用注射器将上清液排干，并将反应用水洗涤3次，并在50℃的真空烘箱中干燥。将BCN(100μmoL)，氨基活化的环氧树脂支持中间体(100μmoL)，DCC(120μmoL)和DMAP(50μmoL)添加到2mL DCM中，在室温下反应过夜黑暗中的温度。反应后，溶液用水溶液洗涤4次以除去过量的DCC和DMAP。将BCN官能化的树脂在真空干燥箱中在50℃下干燥。

通过环辛炔修饰不同的氨基化树脂，我们发现了赖氨酸的固定化作用优于谷氨酸和甘氨酸。赖氨酸，甘氨酸和谷氨酸这三种氨基酸的等电点分别为9.74、5.97和3.22。在碱性条件下，赖氨酸比甘氨酸和谷氨酸更难以质子化，这意味着氨基酸基团容易暴露于载体并易于与环氧基反应，环氧基，氨基可以在碱性条件下打开环氧基，完成基团的修饰。

酶的固定化时间进行筛选

为了对固定化时间进行更好的选择，本发明实施了对环辛炔修饰的氨基环氧树脂进行单点突变醛酮还原酶的固定化时间的筛选。

利用BCN修饰氨基酸氨基化的环氧树脂对单点突变酶进行固定化

将BCN官能化树脂载体(0.5g)和3mL收获的培养菌株细胞裂解物的粗酶上清液添加到1mL磷酸盐缓冲液(0.02M，pH 7.0)中，并在20℃摇动孵育以160rpm的转速运转24小时。进行单点突变醛酮还原酶的酶浓度测试，之后每隔4个小时对固定化酶中上清的酶浓度进行检测以计算不同时间的固定化酶量的计算。然后，将固定的酶用1mol/L NaCl溶液和0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤两次。

赖氨酸改性的环氧树脂、谷氨酸改性的环氧树脂、甘氨酸改性环氧树脂的固定时间对固定化酶量的影响结果如图2所示，从图2可以看出，随着时间的增加，三种固定化载体固定的酶量都逐渐增多，其中达到24h后固定化酶量达到最大，而三种载体中，利用环辛炔修饰赖氨酸氨基化的环氧树脂的固定化效果是最好的。通过实验，我们测得赖氨酸相比于谷氨酸和甘氨酸修饰的环氧树脂具有更好的固定效率，同时随着时间的增加，固定化酶量逐渐增加，到24h后达到最大。

固定化位点数量对固定化率的影响

为了对固定化酶的位点数量进行更好的选择，本发明实施了对不同数量突变位点的醛酮还原酶的固定化。

单个突变位点醛酮还原酶进行一步纯化和固定化

将BCN官能化树脂三种氨基酸修饰的环氧树脂分别和载体(0.5g)和3mL收获的单点突变的菌株细胞裂解物的粗酶上清液添加到1mL磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，pH 7.0)中，并在20℃摇动孵育以160rpm的转速运转24小时。进行单点突变醛酮还原酶的酶浓度测试，之后每隔4个小时对固定化酶中上清的酶浓度进行检测以计算不同时间的固定化酶量的计算。然后，将固定的酶用1mol/L NaCl溶液和0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤两次。

将固定前的蛋白上清，固定后的蛋白上清，一级冲洗掉的非目的蛋白进行SDS-PAGE，通过SDS-PAGE分析固定的整个过程(包括固定前的粗酶上清液，固定的上清液和两个1mol/L NaCl洗涤载体的上清液)，使用ImageJ软件计算固定过程中上清液的相对强度，以获得实际的目标酶固定率。用赖氨酸改性的环氧树脂固定在粗酶上，固定时间对固定化酶量的影响如图3所示，赖氨酸修饰的环氧树脂的纯化固定化率经计算可达到30％。

三个突变位点醛酮还原酶进行一步纯化和固定化

将BCN官能化的赖氨酸修饰的环氧树脂分别和载体(0.5g)和3mL收获的三点突变的菌株细胞裂解物的粗酶上清液添加到1mL磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，pH 7.0)中，并在20℃摇动孵育以160rpm的转速运转24小时。进行单点突变醛酮还原酶的酶浓度测试，之后每隔4个小时对固定化酶中上清的酶浓度进行检测以计算不同时间的固定化酶量的计算。然后，将固定的酶用1mol/LNaCl溶液和0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤两次。

将固定前的蛋白上清，固定后的蛋白上清，一级冲洗掉的非目的蛋白进行SDS-PAGE，通过SDS-PAGE分析固定的整个过程(包括固定前的粗酶上清液，固定的上清液和两个1mol/L NaCl洗涤载体的上清液)，使用ImageJ软件计算固定过程中上清液的相对强度，以获得实际的目标酶固定率。用赖氨酸改性的环氧树脂固定在粗酶上，固定时间对固定化酶量的影响如图4所示，赖氨酸修饰的环氧树脂的纯化固定化率经计算可达到50％。

五个突变位点醛酮还原酶进行一步纯化和固定化

将BCN官能化的赖氨酸修饰的环氧树脂分别和载体(0.5g)和3mL收获的五点突变的菌株细胞裂解物的粗酶上清液添加到1mL磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，pH 7.0)中，并在20℃摇动孵育以160rpm的转速运转24小时。进行单点突变醛酮还原酶的酶浓度测试，之后每隔4个小时对固定化酶中上清的酶浓度进行检测以计算不同时间的固定化酶量的计算。然后，将固定的酶用1mol/LNaCl溶液和0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤两次。

将固定前的蛋白上清，固定后的蛋白上清，一级冲洗掉的非目的蛋白进行SDS-PAGE，通过SDS-PAGE分析固定的整个过程(包括固定前的粗酶上清液，固定的上清液和两个1mol/L NaCl洗涤载体的上清液)，使用ImageJ软件计算固定过程中上清液的相对强度，以获得实际的目标酶固定率。用赖氨酸改性的环氧树脂固定在粗酶上，固定时间对固定化酶量的影响如图5所示，赖氨酸修饰的环氧树脂的纯化固定化率经计算可达到60％。

我们选用了赖氨酸修饰的环氧树脂进行单点，三点和五点突变的醛酮还原酶进行固定化，经过24h的固定化，我们使用1mol/L的NaCl将树脂固定化酶进行洗涤两次，以冲洗吸附在环氧树脂上的酶，达到使整个载体负载于目的突变酶，我们通过将固定前的蛋白上清，固定后的蛋白上清，一级冲洗掉的非目的蛋白进行SDS-PAGE，并通过软件Image进行条带强度的分析，得到预计的固定化收率。经验证，单点固定化率可以达到30％，而三点的效果可以达到50％，五点的纯酶固定化率可以达到60％。

上述实施例仅例示性说明本发明的较佳方案，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不超出记载的技术方案的范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。