阅读说明：本技术 一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法 (Preparation method for synthesizing polyphenol compound by enzyme immobilization technology ) 是由 杨缜 韦春媚 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法,所述制备方法包括：将金属离子或金属簇与有机配体和酪氨酸酶混合,对酪氨酸酶进行固定化,得到酪氨酸酶-金属有机骨架复合物；用所述酪氨酸酶-金属有机骨架复合物做为催化剂,以单苯酚类化合物作为反应物,合成所述多酚类化合物。本发明通过金属离子或金属簇与有机配体在酪氨酸酶的诱导下配位形成金属有机骨架,同时金属有机骨架形成酪氨酸酶的保护壳,实现对酪氨酸酶的固定化,得到的固定化酪氨酸酶具有较高的催化性能。固定化酪氨酸酶催化单苯酚类化合物合成邻位羟基化多酚类化合物,并添加还原剂以抑制多酚类化合物被进一步氧化,从而提高多酚类化合物产率。(The invention provides a preparation method for synthesizing polyphenol compounds by using an enzyme immobilization technology, which comprises the following steps: mixing metal ions or metal clusters with an organic ligand and tyrosinase, and immobilizing the tyrosinase to obtain a tyrosinase-metal organic framework compound; and synthesizing the polyphenol compound by using the tyrosinase-metal organic framework compound as a catalyst and using a monophenol compound as a reactant. According to the invention, the metal ions or metal clusters and the organic ligands are coordinated under the induction of tyrosinase to form a metal organic framework, and meanwhile, the metal organic framework forms a protective shell of the tyrosinase, so that the tyrosinase is immobilized, and the obtained immobilized tyrosinase has high catalytic performance. The immobilized tyrosinase catalyzes the monophenol compound to synthesize the ortho-hydroxylated polyphenol compound, and a reducing agent is added to inhibit the polyphenol compound from being further oxidized, so that the yield of the polyphenol compound is improved.)

一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法

技术领域

本发明涉及酶的固定化及酶催化技术领域，尤其涉及一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法。

背景技术

多酚类化合物是指苯环上有两个或两个以上羟基的物质，其独特的多羟基结构使其性质更优于单酚类化合物，其抗氧化、抗菌、抗癌抗肿瘤、降血糖降血脂、增强免疫功能等作用均对人体健康有着重要意义，在生物医学和保健领域都具有较大的应用和研究价值。

目前多酚类化合物多采用化学法和生物法合成，与化学法相比，生物法利用酶催化合成多酚类化合物，具有高特异性、高效、环保、容易回收等优势，因此生物法在多酚类化合物的合成技术中得到广泛关注。

酪氨酸酶又称多酚氧化酶，是一种含铜氧化还原酶，能够催化一元酚氧化成邻位的二元酚，并进一步将二元酚氧化成邻苯醌。游离酪氨酸酶由于存在稳定性差，极端条件不耐受以及不易回收等缺陷，因此利用固定化技术对酪氨酸酶进行固定化，可使固定化酪氨酸酶催化合成多酚类化合物具有易于反应器操作、便于产物分离和提高酶的重复利用性等优势。但目前的固定化技术存在使用的试剂和载体成本高、固定化效率低、稳定性差、连续操作使用的设备比较复杂等缺陷，导致采用传统固定化技术合成多酚类化合物产率不高。因此，进一步开发更简便、更适用的固定化方法以及性能更加优异的载体材料，仍然是酶固定化领域追求的目标。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，所述固定化技术制备工艺简单，用其固定酪氨酸酶，旨在解决现有的采用酪氨酸酶合成多酚类化合物产率不高的问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其中，包括步骤：

将金属离子或金属簇、有机配体及酪氨酸酶溶液混合，使酪氨酸酶固定在金属离子或金属簇与有机配体结合生成的金属有机骨架上，得到酪氨酸酶-金属有机骨架复合物；

将所述酪氨酸酶-金属有机骨架复合物加入到单苯酚类化合物溶液中，并加入还原剂，在预定反应条件下反应，合成所述多酚类化合物。

所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其特征在于，所述金属离子包括Cu²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Ni²⁺、Ag⁺和Ca²⁺中的一种或多种。

所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其中，所述有机配体为偶氮杂环有机配体和/或含羧基的有机化合物。

所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其中，所述偶氮杂环有机配体为2-甲基咪唑、苯并咪唑、N-乙酰基咪唑、2，4-二甲基咪唑、2-十一烷基咪唑、1-三苯甲基咪唑、2-巯基-1-甲基咪唑、2,2’-联吡啶、4,4’-联吡啶、4,4'-二甲氧基-2,2'-联吡啶、2,4-二氨基吡啶、1，2，4-***、5-氨基四唑中的一种或多种。

所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其中，所述酪氨酸酶来源于动物、植物和微生物。

所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其中，所述单苯酚类化合物为含有一个酚羟基的有机化合物。

所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其中，所述还原剂为L-抗坏血酸、柠檬酸、硫脲、NaBH₄和LiBH₄中的一种或多种。

所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其中，所述金属离子或金属簇、有机配体及酪氨酸酶溶液中，所述酪氨酸酶的体积分数为50-80％。

所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其中，所述金属离子或金属簇、有机配体及酪氨酸酶溶液中，所述金属离子或金属簇的浓度为0.1～80mM。

所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其中，所述金属离子或金属簇、有机配体及酪氨酸酶溶液中，所述有机配体在混合溶液中的浓度为0.1～640mM。

所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其中，所述预定反应条件为反应温度10℃-60℃，反应pH值5.0-8.0。

本发明优选Zn²⁺和2-甲基咪唑，在酶分子诱导下Zn²⁺和咪唑基配位作用形成沸石咪唑酯骨架-8(ZIF-8)晶体，并生长成为酶的保护壳，对酪氨酸酶进行固定，形成酪氨酸酶@沸石咪唑酯骨架-8([email protected])。

有益效果：本发明提供一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法。通过“一锅法”合成酪氨酸酶-金属有机骨架复合物，使金属离子或金属簇与有机配体在酪氨酸酶的诱导下络合形成金属有机骨架，同时在反应过程中金属有机骨架能进一步生长形成酪氨酸酶的保护壳，从而实现对酪氨酸酶的固定化，固定化后的酪氨酸酶具有较高的催化性能。固定了酪氨酸酶的金属有机骨架复合物对单苯酚类化合物进行催化，在反应体系中添加还原剂以抑制醌类物质生成，可以提高多酚类化合物产率。

附图说明

图1是本发明实施例提供的一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法流程图。

图2为本发明实施例1提供的不同条件对酪氨酸酶@沸石咪唑酯骨架-8([email protected])的活性的影响示意图。其中图2A为2-甲基咪唑浓度对所生成的[email protected]的活性的影响；图2B为醋酸锌浓度对所生成的[email protected]的活性的影响；图2C为反应时间对所生成的[email protected]的活性的影响。

图3为本发明实施例2提供的白皮杉醇的HPLC检测图谱示意图。

图4为本发明实施例3提供的各种因素对[email protected]催化合成白皮杉醇的影响示意图。其中图4A为L-抗坏血酸浓度对白皮杉醇产率的影响；图4B为酶促反应温度对白皮杉醇产率的影响；图4C为酶促反应pH对白皮杉醇产率的影响；图4D为[email protected]作为催化剂的用量对白皮杉醇产率的影响。

图5为本发明实施例4提供的用响应曲面法对白皮杉醇产率优化示意图。其中图5A为响应曲面法优化三维图；图5B为响应曲面法优化后白皮杉醇产率与反应时间的关系。

图6为本发明实施例5提供的L-多巴的HPLC检测图谱示意图。

图7为本发明实施例6提供的制备L-多巴产率与反应时间关系示意图。

图8为本发明实施例7提供的3’-羟基紫檀茋的HPLC检测图谱示意图。

图9为本发明实施例8提供的制备3’-羟基紫檀茋产率与反应时间关系示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

请参阅图1，图1为本发明提供的一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法较佳实施例的流程图，如图所示，其包括以下步骤：

S10、将金属离子或金属簇、有机配体及酪氨酸酶溶液混合，使酪氨酸酶固定在金属离子或金属簇与有机配体结合生成的金属有机骨架上，得到酪氨酸酶-金属有机骨架复合物；

S20、将所述酪氨酸酶-金属有机骨架复合物加入到单苯酚类化合物溶液中，并加入还原剂，在预定反应条件下反应，合成所述多酚类化合物。

通过本实施例提供的合成方法，可以使酪氨酸酶得到更好的固定效果和催化性能，而且该合成方法操作简单，可有效提高多酚类化合物的产率，实现上述效果的原理具体如下：

本发明通过金属离子或金属簇与有机配体、酪氨酸酶混合，采用“一锅法”固定酪氨酸酶，其中酪氨酸酶诱导金属离子或金属簇与有机配体通过配位作用形成杂化多孔金属有机骨架，成为酪氨酸酶的保护壳，酪氨酸酶被固定在具有多孔结构的金属有机骨架中，得到酪氨酸酶-金属有机骨架复合物。所述酪氨酸酶-金属有机骨架复合物具有良好的催化性能，在一定条件下可以使单苯酚类化合物氧化成邻位羟基化的多酚类化合物(如邻二酚)，并将多酚类化合物氧化成醌类化合物(如邻醌)，为此本实施例中还加入还原剂，可以有效抑制醌类化合物的生成，从而进一步提高了多酚类化合物的产率。

所述用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，其特征在于，所述金属离子包括Cu²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Ni²⁺、Ag⁺和Ca²⁺中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述金属盐中的阴离子为Cl^-、NO₃ ^-、SO₄ ^2-、CH₃COO^-、PO₄ ³⁺中的一种或多种，但不限于此。

本实施例中，金属离子与有机配体之间产生络合效应，使得所形成的金属有机骨架具有很好的热稳定性，从而进一步提高酪氨酸酶-金属有机骨架复合物的环境耐受性。

在一些实施方式中，所述有机配体为偶氮杂环有机配体和/或含羧基的有机化合物。

在一些实施方式中，所述偶氮杂环有机配体为2-甲基咪唑、苯并咪唑、N-乙酰基咪唑、2，4-二甲基咪唑、2-十一烷基咪唑、1-三苯甲基咪唑、2-巯基-1-甲基咪唑、2,2’-联吡啶、4,4’-联吡啶、4,4'-二甲氧基-2,2'-联吡啶、2,4-二氨基吡啶、1，2，4-***、5-氨基四唑中的一种或多种。

本实施例中，采用金属离子Zn²⁺与有机配体2-甲基咪唑反应，构建沸石咪唑酯骨架-8(ZIF-8)。ZIF-8是MOF家族的一种，这种材料在孔体积、孔道结构、稳定性以及生物相容性等方面都具有很好的优势。在上述Zn²⁺和2-甲基咪唑反应体系中同时添加酪氨酸酶，进行“一锅法”合成，制备得到酪氨酸酶@沸石咪唑酯骨架-8([email protected])。

具体的，所述Zn²⁺在混合溶液中的浓度为0.1～80mM。所述2-甲基咪唑在混合溶液中的浓度为0.1～640mM。所述酪氨酸酶在混合溶液中的体积分数为50-80％。将混合溶液在4℃条件下搅拌1-12小时，离心收集沉淀，磷酸缓冲液或去离子水洗涤沉淀数次，室温真空干燥过夜，制备得到[email protected]。

具体的，所述酪氨酸酶为酪氨酸酶粗酶液，所述酪氨酸酶粗酶液的制备方法如下：将白色双孢菇与磷酸缓冲液(如50mM，pH6.0)按1:2的质量(g)体积(mL)比在匀浆机中进行捣碎，并过滤、离心处理，取上清液即为酪氨酸酶粗酶液。

本实施例中，采用上述制备方法得到的酪氨酸酶粗酶液，在酶固定化反应中，酪氨酸酶粗酶液体积分数为总反应体系体积的50-80％，在此用量范围内使得在酶固定化反应过程中，有较好的酶固定化效率，并且固定化酶的酶活性高。

一些实施方式中，所述单苯酚类化合物为含有一个酚羟基的有机化合物。所述含有一个酚羟基的有机化合物为L-酪氨酸、4-羟基苯乙酸、4-羟基布洛芬苯酚酯、对苯氧基苯酚、3-氯苯酚、对甲基苯酚、2，4-二氯苯酚、白藜芦醇和紫檀茋中的一种或多种，但不限于此。

一些实施方式中，所述还原剂为L-抗坏血酸、柠檬酸、硫脲、NaBH₄和LiBH₄等具有强还原性的有机或无机化合物，但不限于此。

本实施例中，单苯酚类化合物优选L-酪氨酸、白藜芦醇、紫檀茋，还原剂优选L-抗坏血酸。用[email protected]作为催化剂，将单苯酚类化合物氧化成邻位羟基化的多酚类化合物，其中，L-酪氨酸、白藜芦醇和紫檀茋依次被催化形成L-多巴、白皮杉醇和3’-羟基紫檀茋。

在一些实施方式中，在步骤S20的酶催化反应中，反应温度为10℃-60℃，反应pH值为5.0-8.0。

在一些实施方式中，步骤S20的反应体系中，所述单苯酚类化合物占溶质总质量15％-40％(wt.％)，所述还原剂占溶质总质量25％-60％(wt.％)，所述酪氨酸酶-金属有机骨架复合物([email protected])的用量为2.5-10mg/mL。

本实施例中，采用[email protected]作为催化剂，将单苯酚类化合物氧化成邻位羟基化的多酚类化合物，酪氨酸酶是含铜氧化还原酶，在O₂分子参与下，将单苯酚类化合物氧化成多酚类化合物后，还会进一步催化多酚类化合物得到醌类化合物，对多酚类化合物的产率造成不良影响。本发明在催化反应体系中添加还原剂，可以有效抑制醌类化合物的生成，进一步提高多酚类化合物的产率。

本发明提供一种多酚类化合物，所述多酚类化合物采用上述方法制备得到。

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

不同条件对[email protected]的活性的影响。

探究2-甲基咪唑浓度对所生成的[email protected]的活性的影响：制备总体系为200mL，100mL酪氨酸酶液、80mL不同浓度2-甲基咪唑溶液和20mL醋酸锌溶液(0.4M)混合，在4℃下搅拌1h，将混合液离心(4℃,8000rpm,10min)并磷酸缓冲液(50mM，pH6.0)清洗沉淀数次，真空干燥沉淀，研磨样品至粉末状。其中2-甲基咪唑终浓度分别为80mM、160mM、320mM、640mM，醋酸锌终浓度为40mM。通过测定[email protected]的酶活力获得最佳2-甲基咪唑浓度，其中酶活力测定方法是以L-多巴为底物，利用紫外-可见分光光度计测定在A475nm处的吸光值大小，再根据朗伯-比尔定律A＝Kbc(K为摩尔吸光系数；c为吸光物质的浓度，单位为mol/L；b为比色皿厚度，单位为cm)计算酶活力。结果如图2A所示。

探究Zn²⁺浓度对所生成的[email protected]的活性的影响：制备总体系为200mL，100mL酪氨酸酶液、40mL 2-甲基咪唑溶液(1.6M)和60mL不同浓度醋酸锌溶液混合，在4℃下搅拌1h，将混合液离心(4℃,8000rpm,10min)并磷酸缓冲液(50mM，pH6.0)清洗沉淀数次，真空干燥沉淀，研磨样品至粉末状。其中醋酸锌终浓度分别为20mM、40mM、80mM，2-甲基咪唑终浓度为320mM。通过测定[email protected]的酶活力获得最佳醋酸锌浓度。结果如图2B所示。

探究反应时间对所生成的[email protected]的活性的影响：制备总体系为200mL，100mL酪氨酸酶液、2-甲基咪唑溶液(0.8M，80mL)和醋酸锌溶液(20mL，0.4M)混合，在4℃下分别搅拌1h、5h、12h，将混合液离心(4℃,8000rpm,10min)并磷酸缓冲液(50mM，pH6.0)清洗沉淀数次，真空干燥沉淀，研磨样品至粉末状。其中2-甲基咪唑终浓度为320mM，醋酸锌终浓度为40mM。在通过测定[email protected]的酶活力获得最佳搅拌时间。结果如图2C所示。

从图2A、2B、2C中可以看出，[email protected]最佳制备条件为：2-甲基咪唑终浓度为320mM，Zn²⁺终浓度为40mM，[2-甲基咪唑]/[Zn²⁺]＝8，4℃下搅拌1h。

实施例2

白皮杉醇的HPLC检测图谱。

岛津高效液相色谱仪，采用反向C18柱(日本GLSciences，Inc公司，InertsilODS-SP，4.6×150mm，5μm)，该液相条件为：流动相A为0.5％乙酸/乙腈＝95/5(v/v)，流动相B为乙腈/0.5％乙酸＝95/5(v/v)，A/B＝75/25(v/v)，进样量10μL，总流速为1.0mL/min，检测波长为320nm，柱温为29℃。

用50％乙腈(v/v)精确配制系列浓度的白皮杉醇标准液，经HPLC检测白皮杉醇出峰图谱。[email protected]催化所产生的白皮杉醇经适当稀释后以HPLC检测定性定量分析。白皮杉醇的HPLC检测图谱如图3。

如图3所示，[email protected]催化白藜芦醇所产生的产物与白皮杉醇标准品出峰时间一致，表明[email protected]催化生成的物质确定为白皮杉醇。

实施例3

各种因素对[email protected]合成白皮杉醇(多酚类化合物)的影响。

L-抗坏血酸浓度对白皮杉醇产率的影响：反应体系体积2mL,用磷酸缓冲液(100mM或者200mM)配制含不同L-抗坏血酸浓度的白藜芦醇底物溶液，其中L-抗坏血酸浓度分别为20、30、40、50、60、70、80mM，白藜芦醇浓度为20mM，反应体系pH保持在6.0-6.28之间，[email protected]质量为10mg，在30℃，220rpm的摇床中反应3h。得到不同L-抗坏血酸浓度对白皮杉醇产率的影响，结果如图4A所示。当L-抗坏血酸等于60mM时，反应3h，产率达到最大为73.8％。

反应体系温度对白皮杉醇产率的影响：反应体系体积2mL,100mM磷酸缓冲液配制含L-抗坏血酸的白藜芦醇底物溶液，其中L-抗坏血酸浓度为60mM,白藜芦醇浓度为20mM,反应体系pH为6.02，[email protected]质量为10mg，在不同温度10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃，220rpm的摇床中反应3h，得到不同温度对白皮杉醇产率的影响。结果如图4B所示。15-30℃范围内，温度对白皮杉醇产率影响不大，其中20℃时，反应3h产率达到最大为74.6％。

反应体系pH对白皮杉醇产率的影响:反应体系体积2mL，磷酸缓冲液(100mM或者200mM)配制含L-抗坏血酸的白藜芦醇底物溶液，其中L-抗坏血酸浓度为60mM,白藜芦醇浓度为20mM,在不同反应pH5.0、5.64、6.04、6.65、7.09、7.5条件下，加入10mg [email protected]，在30℃，220rpm的摇床中反应3h，得到不同pH对白皮杉醇产率的影响。结果如图4C所示。pH6.0-7.0范围内，pH对[email protected]催化白藜芦醇的影响不大，其中pH6.65时，反应3h产率达到最大为77.1％。

反应体系[email protected]作为催化剂的用量对白皮杉醇产率的影响:反应体系体积2mL，100mM磷酸缓冲液配制含L-抗坏血酸的白藜芦醇底物溶液，其中L-抗坏血酸浓度为60mM，白藜芦醇浓度为20mM，反应体系pH为6.02，加入不同[email protected]质量5mg、7.5mg、10mg、15mg、20mg、30mg，在30℃，220rpm的摇床中反应3h，得到不同[email protected]质量对白皮杉醇产率的影响。结果如图4D所示。[email protected]为15mg时，反应3h产率达到最大为79.8％。

所述实施例3，其中添加终体积分数为25％DMSO(v/v)到磷酸缓冲液中对底物助溶，反应过程每隔0.5h，取出反应液进行离心(1min，10000rpm)，而后从反应体系中取出50μL上清液，并用50％的乙腈溶液稀释20倍(稀释至1000μL)，经过0.22μm滤膜过滤，以HPLC测定底物和产物含量。

实施例4

响应曲面法对白皮杉醇产率优化

利用响应曲面法(Response surface methodolog，RSM)，选择Central CompositeDesign(CCD)作为优化反应的模型,以L-抗坏血酸浓度(50-70mM)、温度(15-25℃)、[email protected](10-20mg)为三个自变量进行试验设计，根据软件给出的20个实验组进行试验，底物白藜芦醇浓度为20mM，利用HPLC检测每个实验组的产物与底物含量，其3D模型结果如图5A所示。

根据软件给出最优条件设计实验组，其中实验组条件为L-抗坏血酸浓度68mM、温度15℃、[email protected]质量18.6mg，以白藜芦醇浓度20mM为底物溶液，得到白皮杉醇产率与反应时间的关系。结果如图5B所示。经过RSM优化后，反应3h得到白皮杉醇产率最大为86.0％。

实施例5

L-多巴的HPLC检测图谱。

岛津高效液相色谱仪，采用反向C18柱(日本GLSciences，Inc公司，InertsilODS-SP，4.6×150mm，5μm)，该液相条件为流动相A:去离子水：甲醇：磷酸＝979.5：19.5:1(v/v/v),PH＝2.0；进样量10μL；总流速为1.0mL/min，检测波长为282nm；柱温为27℃。

用磷酸缓冲液(pH7.0，100mM)精确配制系列浓度的L-多巴标准液，经HPLC检测L-多巴出峰时间。[email protected]催化所产生的L-多巴以HPLC检测定性定量分析。L-多巴的HPLC检测图谱如图6所示。

如图6所示，[email protected]催化酪氨酸所产生的产物与L-多巴标准品出峰时间一致，表明[email protected]催化生成的物质确定为L-多巴。

实施例6

[email protected]催化酪氨酸制备L-多巴。

反应体系体积10mL,磷酸缓冲液(pH6.7，50mM)配制含L-抗坏血酸的酪氨酸底物溶液，其中L-抗坏血酸浓度为12mM,酪氨酸浓度为2mM，反应体系pH为6.15，加入40mg的[email protected]作为催化剂，在30℃，250rpm的摇床中反应1.5h，其中反应过程每隔0.5h，取出反应液进行离心(1min，10000rpm)，而后从反应体系中取出1mL上清液用HPLC测定底物和产物含量。得到L-多巴产率与反应时间的关系。结果如图7所示。反应进行到1.5h时,L-多巴的最大产率为52.5％。

实施例7

3’-羟基紫檀茋的HPLC检测图谱。

岛津高效液相色谱仪，采用反向C18柱(日本GLSciences，Inc公司，InertsilODS-SP，4.6×150mm，5μm)，该液相条件为：流动相A为0.5％乙酸/乙腈＝95/5(v/v)，流动相B为乙腈/0.5％乙酸＝95/5(v/v)，A/B＝50/50(v/v)；进样量10μL；总流速为1.0mL/min，检测波长为306nm；柱温为29℃。

用50％(v/v)乙腈精确配制系列浓度的3’-羟基紫檀茋标准液，经HPLC检测3’-羟基紫檀茋出峰图谱。[email protected]催化所产生的3’-羟基紫檀茋以HPLC检测定性定量分析。3’-羟基紫檀茋的HPLC检测图谱如图8所示。

如图8所示，TY[email protected]催化紫檀茋所产生的产物与3’-羟基紫檀茋出峰时间一致，表明[email protected]催化生成的物质确定为3’-羟基紫檀茋。

实施例8

[email protected]催化紫檀茋制备3’-羟基紫檀茋。

反应体系体积2mL，磷酸缓冲液(pH8.0，50mM)配制含L-抗坏血酸的紫檀茋底物溶液，其中L-抗坏血酸浓度为30mM，紫檀茋浓度为20mM，反应体系pH为5.95，加入30mg的[email protected]作为催化剂，在25℃，250rpm的摇床中反应3h，其中反应过程每隔0.5h，取出反应液进行离心(1min，10000rpm)，每0.5h将5mL离心管取出，离心(10000rpm，1min)，取40μL上清液用50％(v/v)乙腈稀释20倍(稀释至800μL)，涡旋震荡混合均匀后，0.22μm滤头过滤后用HPLC测定底物和产物含量。得到3’-羟基紫檀茋产率与反应时间的关系。结果如图9所示。反应进行到3h时,3’-羟基紫檀茋的最大产率为64.8％。

综上所述，本发明提供一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法，通过“一锅法”合成酪氨酸酶-金属有机骨架复合物，使金属离子或金属簇与有机配体在酪氨酸酶的诱导下络合形成金属有机骨架，同时在反应过程中金属有机骨架能进一步生长形成酪氨酸酶的保护壳，从而实现对酪氨酸酶的固定化，固定化后的酪氨酸酶具有较高的催化性能。酪氨酸酶-金属有机骨架复合物作为催化剂，以单苯酚类化合物作为反应物，在一定反应条件下合成所述多酚类化合物，在反应体系中添加还原剂以抑制醌类物质生成，可以进一步提高多酚类化合物产率。本发明提供的一种用酶固定化技术合成多酚类化合物的制备方法合成工艺简单，容易操作，对反应条件要求低，对于工业生产多酚类化合物有潜在应用。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。