利用固定化酶制备他汀中间体的方法
阅读说明：本技术 利用固定化酶制备他汀中间体的方法 (Method for preparing statin intermediate by using immobilized enzyme ) 是由 陶荣盛 郑云 朱傅赟 沈青 沈正权 孙梁栋 潘震华 原犇犇 胡海亮 刘萍 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种利用固定化酶制备他汀中间体的方法,包括如下步骤：使用固定化载体Seplite LX-1000NH和LX-G20将羰基还原酶固定化,得到固定化酶；使用固定化酶催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯进行还原反应得到他汀中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯,催化(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯进行还原反应得到他汀中间体6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯。本发明的方法稳定性好,能够生成高光学纯度的产物,有效降低生产成本,适合于工业化应用。(The invention provides a method for preparing a statin intermediate by using immobilized enzyme, which comprises the following steps: immobilizing carbonyl reductase by using immobilized carriers Seplite LX-1000NH and LX-G20 to obtain immobilized enzyme; immobilized enzyme is used for catalyzing the tert-butyl 6-cyano- (5R) -hydroxy-3-carbonyl hexanoate to carry out reduction reaction to obtain a statin intermediate tert-butyl 6-cyano- (3R,5R) -dihydroxyhexanoate, and the immobilized enzyme is used for catalyzing the tert-butyl (S) -6-chloro-5-hydroxy-3-carbonyl hexanoate to carry out reduction reaction to obtain the statin intermediate tert-butyl 6-chloro- (3R,5S) -dihydroxyhexanoate. The method has good stability, can generate products with high optical purity, effectively reduces the production cost, and is suitable for industrial application.)
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种利用固定化酶制备他汀中间体的方法。
背景技术
他汀类药物是临床上最常用的血脂调节药，是国内外心脑血管疾病防治的重大基础药物。下述式A7所示的阿伐他汀中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(CAS号：125971-93-9)、式A8所示的(4R,6R)-6-氰甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-乙酸叔丁酯(CAS号为125971-94-0，阿伐他汀钙侧链ATS-8)、式D3所示的瑞舒伐他汀中间体6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯(CAS号：154026-93-4)都是他汀类药物的重要手性化合物中间体。
发明人在专利文献CN110387359A中报道了三种羰基还原酶SEQ ID NO:2-4能够催化式A6进行不对称还原反应得到化合物A7；并且催化式D2进行不对称还原反应得到化合物D3。该方法能够解决化学法生产所造成的严重污染问题。
但是，该酶催化法生产中使用的是游离的羰基还原酶，一次反应完毕后，昂贵的酶就被废弃，无法重复使用，导致原料成本居高不下。另外，作为一种蛋白质，在搅拌反应中，游离酶的机械稳定性和耐热稳定性都比较脆弱，也会影响其在工业化生产他汀类药物中间体中的应用。
与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产工艺简化、生产效率提高等优点。同时，由于固定化酶可多次使用、稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了产物提纯工艺，使得产品质量稳定。
发明内容
为了克服游离羰基还原酶的上述问题，发明人对于酶的固定化技术进行了研究和大量实验探索。意外地发现，专利文献CN110387359A中报道的羰基还原酶在采用吸附法用个别载体固定化后，能够保持较高的酶活力和显著提高的稳定性，而且产物的手性纯度不降反升，这对于追求光学活性产品手性纯度的制药领域而言极为有利。具体而言，本发明包括如下技术方案。
一种利用固定化酶制备他汀中间体的方法，包括如下步骤：
A.使用固定化载体Seplite LX-1000NH和LX-G20将羰基还原酶固定化，得到固定化酶；B.使用步骤A中得到的固定化酶催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯进行还原反应得到他汀中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，或者催化(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯进行还原反应得到他汀中间体6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯。
优选地，上述固定化载体是Seplite LX-1000NH。
上述羰基还原酶的氨基酸序列优选为SEQ ID NO:1：
MSTPLNALVTGASRGIGAATAIKLAENGYSVTLAARNVAKLNEVKEKLPVVKDGQKHHIWELDLASVEAASSFKGAPLPASDYDLFVSNAGIAQITPTADQTDKDFLNILTVNLSSPIALTKALLKGVRERSNEKPFHIIFLSSVAALHGVPQAAVYSASKAGLDGFVRSLAREVGPKGIHVNVIHPGWTKTDMTDGIDDPNDTPIKGWIQPEAIADAVVFLAKSKNITGTNIVVDNGLLA(SEQ ID NO:1)。其为专利文献CN110387359A中报道的羰基还原酶突变体SEQ ID NO:4。
在一种优选的实施方式中，上述羰基还原酶SEQ ID NO:1可以由大肠杆菌表达得到，从而能够大量生产并在发酵后无需提纯就可以直接用于制备固定化酶。
例如，上述步骤A为：将大肠杆菌发酵液离心得到菌泥，破壁，离心，取上清得粗酶液，在磷酸盐缓冲液中与固定化载体混合、吸附，得到固定化酶。
优选地，上述步骤B的反应体系pH为7.5-8.5，优选pH7.8-8.2，更优选pH8.0左右。例如反应体系可以为pH7.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
上述步骤B的反应温度为30-45℃。优选35-42℃，更优选37-40℃。
优选地，上述反应体系中可以添加有异丙醇和辅酶NADP+。NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶II)的作用是，作为氧化剂掠夺电子，羰基还原酶利用异丙醇将NADP+还原为NADPH，产生充足的NADPH作为生物合成的还原剂，从而促进还原反应。
本发明提供的固定化羰基还原酶能够高活性地催化化合物A6发生不对称还原反应，产生高光学纯度的他汀中间体A7；并催化化合物D2发生不对称还原反应，产生高光学纯度的他汀中间体D3，具有稳定性好，有效降低生产成本的优点，有利于实现工业化生产他汀中间体。
具体实施方式
酶的固定化是用物理或化学手段，将游离酶封锁在固体材料上、或限制在一定区域内，酶仍然可以发挥催化作用，并可循环使用。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
生物催化领域公知，与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产过程简化、生产效率提高等优点。同时，由于酶可多次使用，且酶的稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。但是，酶的固定化也有不少缺点，固定化时酶活力通常会有损失，而且催化反应产物的手性纯度有时也会发生变化，往往难于保证高的手性纯度。
发明人在研究羰基还原酶突变体SEQ ID NO:1(即专利文献CN110387359A中报道的羰基还原酶突变体SEQ ID NO:4)的固定化时，尝试了多种类型的固定化方法，包括吸附法、交联法、包埋法、载体偶联法(又称共价结合法)等。在吸附法/载体偶联法的载体选择中，重点考察了离子交换树脂，包括商品化的氨基固定化载体比如系列的EC-HA、EC-EA；西安蓝晓科技有限公司的Seplite LX-1000HA、Seplite LX-1000NH；RelizymeTM系列的HA403、EA403；商品化的环氧基固定化载体比如
表1、部分离子交换树脂分类
通过实验发现，羰基还原酶SEQ ID NO:1能够与两种固定化载体Seplite LX-1000NH和LX-G20、尤其是LX-1000NH形成理想的组合。通过吸附法进行固定化后，能够高效且稳定地催化底物A6和D2进行手性还原，分别得到高光学活性的化合物A7和D3，解决了目前游离酶催化工艺中存在的瓶颈问题，从而降低生产成本，为实现酶法生产他汀类药物手性中间体的工业化奠定基础。
令人惊奇的是，载体LX-1000NH固定化羰基还原酶SEQ ID NO:1催化反应的产物的光学纯度(ee值)竟然超过了游离酶催化的反应产物的光学纯度，提示LX-1000NH固定化羰基还原酶SEQ ID NO:1的立体选择性提高，其原因有待于进一步研究。有可能是因为羰基还原酶SEQ ID NO:1被载体LX-1000NH固定化后，发生了立体构象变化、或者酶活性位点的空间改变，促进了酶蛋白正确折叠，增强了酶活，改善底物的选择性。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例1酶的固定化
1.1制备粗酶液
表达羰基还原酶SEQ ID NO:1的菌种和培养方法由CN110387359A的申请人湖州颐辉生物科技有限公司提供。
培养基的配制和摇瓶发酵的方法如下：
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5，121℃高温高压灭菌20min；
斜面培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、20g/L琼脂粉，混匀后按30-40mL装液量分装到茄子瓶，竖立放置于121℃高温高压灭菌20min，降温后加入100μg/mL硫酸卡那霉素，摆放成斜面，待冷凝成固体即可。
种子活化：从种子甘油保藏管中取100μL种子保藏液，用接种环均匀涂抹于茄子瓶斜面，然后置于37℃培养箱培养18h；
种子培养：取100mL无菌水导入茄子瓶做成菌悬液，取菌悬液50μl接入装有50mLTB培养基的250mL摇瓶，30℃，220rpm培养16h；
发酵：将一级种子培养液接入装有1L TB培养基的5L摇瓶，37℃，220rpm培养4-6h后，加入0.3mM IPTG并降温至28℃，220rpm诱导培养12h。
菌体收集：收集发酵液，置于离心机4000rpm离心30min，弃上清后收集菌泥，放置于-20℃冷冻收藏。
称取菌体或者冻存菌泥，用0.02M磷酸钾缓冲液(pH 7.5±0.2)混悬，配制成菌含量100g/L的液体。再用均质机压榨破胞，离心后即得粗酶液，备用。
1.2分别采用表1中所示离子交换树脂作为固定化载体进行酶的固定化
氨基类固定化载体在使用前需要进行活化，方法为：将10g载体浸没于40ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH4.2-4.5)中，于150rpm，20-25℃下振摇15min；维持pH在8.0±0.2的范围内，必要时应调节；静置，除去上清；将载体重新浸没于40ml 0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)，150rpm，20-25℃下振摇5min；除去上清，用40ml含2％戊二醛的0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)浸没载体，150rpm，20-25℃下振摇60min；静置，除去上清；用0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)清洗载体两次抽干即可。
环氧类和吸附类固定化载体无需活化，可直接用于酶的固定。
氨基类固定化载体与羰基还原酶的固定，以LX-1000NH为例，固定化酶的制备方法如下：按蛋白载体比1：10的比例，在20-25℃条件下，150rpm振摇。1min后停止振摇，检测并调整pH为8.0±0.1，继续振摇18h，除去上清，用40ml 0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)在25℃条件下振摇1-2min；除去上清，以0.02M含0.5M NaCl的磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)于20-25℃，150rpm振摇45min；除去上清，再次用0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)清洗，用真空泵抽干，即得固定化酶，用于转化测试。
其他氨基类固定化载体与羰基还原酶的固定同LX-1000NH的制备。
环氧类和吸附类固定化载体与羰基还原酶的固定，以吸附类载体LX-G20为例，固定化酶的制备方法如下：按蛋白载体比1：10的比例，置于0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)，在20-25℃条件下，150rpm振摇；1min后停止振摇，检测并调整pH为8.0±0.1，继续振摇18h；停止振摇，在相同温度下静置20-24h；除去上清，用40ml 0.02M磷酸钾缓冲液(pH8.0±0.2)在20-25℃条件下振摇1-2min；除去上清，再次以相同缓冲液振摇洗涤45min；除去上清，再次用40ml 0.02M磷酸钾缓冲液(pH 8.0±0.2)清洗，用真空泵抽干，即得固定化酶，用于转化测试。
其他环氧类和吸附类固定化载体与羰基还原酶的固定同LX-G20的制备。
实施例2固定化酶对化合物A6的酶催化试验
2.1酶催化方法(以150ml体系为例)：
准确称取底物A6即6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯30g(200g/L)，异丙醇22.5ml，水127.5ml至250ml三角瓶中，混匀，用2N氢氧化钠溶液调pH至8.0左右，升温至37℃。
然后加入实施例1中得到的固定化酶9g，再加入终浓度0.04g/L的NADP+，密封，180rpm，37℃反应。
反应2h和6h后取样用HPLC检测还原反应产物A7含量，并通过检测A7进一步反应的产物A8的光学纯度来检测A7的光学纯度。
2.2产物A7含量检测方法如下：
流动相A：称取2.72g磷酸二氢钾，至1L水中用磷酸调ph＝4.0
流动相B：乙腈
进样量5μl 流速：1.0ml/min 色谱柱：SB-C18(250*4.6*5)
检测波长：215nm 柱温：40度 运行时间：40min
梯度洗脱程序
2.3化合物A7的手性通过测定A8的手性来确定，具体方法如下：
2.3.1化合物A8的合成方法：在酶催化反应完的料液中加入乙酸乙酯250mL和硅藻土25g，升温至50～60℃，过滤后分层，水层用150mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，浓缩得到化合物A7粗品，为油状物。在烧瓶中加入获得的油状物、2,2-二甲氧基丙烷25g、甲苯50mL和甲磺酸0.2g，升温至25℃，保温反应3小时。反应结束后，加入100mL甲苯，加饱和碳酸氢钠水溶液中和至pH7.5，分去水层，浓缩干有机层。加入75mL已烷，升温溶解，然后冷却至0℃，结晶，过滤，得化合物A8粗品。再用正已烷(50mL)和乙醇(2.5mL)混合溶剂重结晶，过滤，烘干得化合物A8。
2.3.2化合物A8的手性分析方法：检测仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪，液相流动相：正已烷：异丙醇98：2，波长λ＝215nm，流速0.6mL/min，溶剂：流动相；色谱柱：Chiralcel OD-H 250×4.6mm 5μm；进样量：20μl，柱温：30℃，运行时间：28min。化合物A8的保留时间为19.8min左右；4R,6S-异构体保留时间14.1min左右；4S,6S-异构体保留时间15.5min左右；4S,6R-异构体保留时间16.9min左右。样品分析：称取催化并处理得到的A8样品200mg，置于10ml的容量瓶中，用溶剂溶解、定容、摇匀，作为样品溶液。取样品溶液20μL，注入液相色谱仪，进行检测。
2.4固定化酶催化A6反应2h时转化率(产物峰面积/(产物峰面积+底物峰面积))和ee值对比结果见如下表2。
表2、部分固定化酶催化A6反应2h时的产物转化率和ee值比较
由表2可见，载体LX-1000NH和LX-G20固定化羰基还原酶的酶活性比较突出，转化率分别达到58.53％和50.07％。尤其是载体LX-1000NH，其在转化率为58.53％时的产物ee值为99.99％，所得他汀中间体A7几乎是纯手性化合物。
通过与粗酶液催化反应进行比较，尽管粗酶液催化活性明显较高，反应速度明显较快，但在产物A7含量为55％左右时的光学纯度为99.75％，低于LX-1000NH固定化酶催化产物的立体专一性。
以下实验重点研究该LX-1000NH固定化酶。
实施例3载体LX-1000NH固定化酶催化底物A6反应的稳定性考察
按照实施例2中的方法，考察不同批次LX-1000NH固定化酶催化A6进行还原反应的稳定性，分别在反应2h和6h时测定产物A7转化率和ee值。
3.1化合物A7的提取
反复使用同一次投料的LX-1000NH固定化酶催化不同批次底物A6，每批反应至6h时，液相检测都已经反应完全(转化率达到99％以上)。
在反应完的料液中加入乙酸乙酯250mL，升温至50～60℃，过滤后分层，水层用150mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，浓缩得到化合物A7，称重，计算收率。
3.2产物A7手性测定
产物A7手性检测方法见步骤2.3，结果见表3。
表3、同一批次LX-1000NH固定化酶催化不同批次底物A6反应2h和6h时的产物A7收率和ee值
由表3可见，载体LX-1000NH固定化羰基还原酶经过10个批次的催化反应，产物A7的收率相当稳定，产物A7的ee值始终在99.98％以上(对映异构体4S,6S-异构体的含量均不超过0.02％，其他异构体未检测到。)，表明固定化酶反复使用10次，其酶活力和立体选择性保持得相当稳定，具有很高的稳定性。
实施例4载体LX-1000NH固定化酶对化合物D2的催化试验
4.1酶催化方法(以150ml体系为例)：
准确称取D2底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯30g(200g/L)，异丙醇22.5ml，水127.5ml至250ml三角瓶中，混匀，用2N氢氧化钠调pH至8.0左右，升温至37℃。
然后加入固定化酶9g，再加入终浓度0.04g/L的NADP+，密封，180rpm，37℃反应。反应2h和6h后取样用HPLC检测。
4.2底物D2和产物D3含量测定方法：
检测仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪。检测方法：HPLC色谱柱：ZORBAXSB-C8，4.6×150mm，5-Micron，流动相：30％乙腈，流速：1.0mL/min，柱温：40℃，检测波长：210nm。产物D3保留时间：7.1min左右；底物D2保留时间：12.0min左右。外标法计算含量。
4.3产物D3提取
待上述LX-1000NH固定化酶反应继续反应至6h，液相检测都已经反应完全，反应完的料液中加入乙酸乙酯250mL，升温至40～50℃，过滤后分层，水层用150mL乙酸乙酯萃取两次，盐水洗一次，合并有机层，浓缩得到化合物D3，称重，计算收率。
4.4产物D3手性测定
检测方法：采用手性色谱柱OD-H柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：正己烷：异丙醇＝85：15，流速1mL/min，检测波长215nm。化合物D3和(3S,5S)-异构体的保留时间分别为5.1min和4.9min。结果表明，在该液相手性分析条件下，样品中对映异构体含量低于0.03％，其他异构体未检测到。表明本发明构建的羰基还原酶固定在LX-1000NH载体上对于底物D2均具有高度的立体特异性，结果数据见如下表4。
表4、不同批次LX-1000NH固定化酶催化D2反应2h和6h时的产物D3收率和ee值
由表4可以看出，载体LX-1000NH固定化羰基还原酶经过10个批次的催化反应，产物D3的收率相当稳定，产物D3的ee值始终在99.93％以上，表明固定化酶反复使用10次，其酶活力和立体选择性保持得相当稳定，具有很高的稳定性。
以上实验表明，羰基还原酶SEQ ID NO:1能够与两种固定化载体Seplite LX-1000NH和LX-G20进行理想的匹配，尤其是LX-1000NH与羰基还原酶SEQ ID NO:1的组合能够保持羰基还原酶的高催化活性和稳定性，还能提高羰基还原酶的立体专一性，对于工业化生产他汀中间体A7、A8和D3的应用具有重要意义。
序列表
<110> 湖州颐盛生物科技有限公司
<120> 利用固定化酶制备他汀中间体的方法
<130> SHPI2010276
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Ser Thr Pro Leu Asn Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Gly Ala Ala Thr Ala Ile Lys Leu Ala Glu Asn Gly Tyr Ser Val Thr
20 25 30
Leu Ala Ala Arg Asn Val Ala Lys Leu Asn Glu Val Lys Glu Lys Leu
35 40 45
Pro Val Val Lys Asp Gly Gln Lys His His Ile Trp Glu Leu Asp Leu
50 55 60
Ala Ser Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala
65 70 75 80
Ser Asp Tyr Asp Leu Phe Val Ser Asn Ala Gly Ile Ala Gln Ile Thr
85 90 95
Pro Thr Ala Asp Gln Thr Asp Lys Asp Phe Leu Asn Ile Leu Thr Val
100 105 110
Asn Leu Ser Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Lys Gly Val
115 120 125
Arg Glu Arg Ser Asn Glu Lys Pro Phe His Ile Ile Phe Leu Ser Ser
130 135 140
Val Ala Ala Leu His Gly Val Pro Gln Ala Ala Val Tyr Ser Ala Ser
145 150 155 160
Lys Ala Gly Leu Asp Gly Phe Val Arg Ser Leu Ala Arg Glu Val Gly
165 170 175
Pro Lys Gly Ile His Val Asn Val Ile His Pro Gly Trp Thr Lys Thr
180 185 190
Asp Met Thr Asp Gly Ile Asp Asp Pro Asn Asp Thr Pro Ile Lys Gly
195 200 205
Trp Ile Gln Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Val Val Phe Leu Ala Lys
210 215 220
Ser Lys Asn Ile Thr Gly Thr Asn Ile Val Val Asp Asn Gly Leu Leu
225 230 235 240
Ala
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