Pei固定化酶、其制备方法及其应用
阅读说明：本技术 Pei固定化酶、其制备方法及其应用 (PEI immobilized enzyme, preparation method and application thereof ) 是由 洪浩 詹姆斯·盖吉 肖毅 张娜 罗杰斯卡·维亚撒·威廉姆斯 崔瑜霞 赵佳东 高妍妍 于 2020-04-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种固定化酶、其制备方法及其应用。该固定化酶包括活化的PEI以及共价结合在活化的PEI上的酶,酶选自如下任意一种：转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶。通过将酶与PEI固定,将酶固定于PEI形成的多聚网状结构之间,提高了机械稳定性,实现了酶的固定化,而且避免了在固定化过程中酶直接与戊二醛等交联剂的直接共价结合而降低活性。(The invention provides an immobilized enzyme, a preparation method and application thereof. The immobilized enzyme comprises activated PEI and an enzyme covalently bonded on the activated PEI, wherein the enzyme is selected from any one of the following enzymes: transaminase, ketoreductase, monooxygenase, ammonia lyase, alkene reductase, imine reductase, amino acid dehydrogenase, and nitrilase. By fixing the enzyme and the PEI, the enzyme is fixed between the poly-reticular structures formed by the PEI, the mechanical stability is improved, the immobilization of the enzyme is realized, and the reduction of the activity caused by the direct covalent bonding of the enzyme and crosslinking agents such as glutaraldehyde and the like in the immobilization process is avoided.)
本申请是基于申请日为2020年4月29日、申请号为202010353558.3、发明创造名称为“固定化酶、其制备方法及其应用”专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及固定化酶领域，具体而言，涉及一种固定化酶、其制备方法及其应用。
背景技术
微生物细胞或分离的酶或工程酶的应用使得生物催化取得了重大进展，且使得制造方式发生了转变。许多种类的酶如酰基转移酶、酰胺酶、转氨酶、酮还原酶、氧化酶、单加氧酶及水解酶等被用于生产涉及抗生素、除草剂、医药中间体和新时代治疗剂的反应中。
当游离酶用作生物催化剂时，会有很大的酶浪费，因为回收水溶性酶非常困难。而水不溶性固定化酶，在每个循环后，通过非常简单的过滤就可以容易地回收。
大家熟知的是，采用载体或支撑物来对自由酶进行固定化。然而固相载体存在成本高及量转移受限的缺陷，而且，制备载体或支撑物，尤其是聚合物树脂，会引起严重的污染环境。大多的固相载体固定化酶方法存在固有的缺陷：酶负载少及酶特异性低。克服该缺陷的一种方法是通过纯化酶来避免污染蛋白或酶的负载，但酶的纯化成本也很高，进一步增加了固定化生物催化剂的成本。
现有已经报道了对脂肪酶(Lipase)、青霉素酰化酶(penicillin acylase)、蛋白酶(protease)、氨基酰化酶(aminoacylase)等酶的无载体固定化方法。然而无载体支持，不含载体的固定化酶由于较低的机械稳定性不能对抗剪切力和搅拌条件，而且还会引起过滤问题，因而不能充分满足于大批量生产。
而且，不含载体的固定化酶方法也不适用于某些敏感性的酶，比如转氨酶(TA),酮还原酶(KRED)、单加氧酶(CHMO)、氨裂解酶(PAL)、烯还原酶(ERED)、亚胺还原酶(IRED)、氨基酸脱氢酶(AADH)及腈水解酶(Nitrilase)。
因此，有必要开发不含载体的固定化酶方法，以提高敏感性酶活性及其循环利用率。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种固定化酶、其制备方法及其应用，以解决现有技术中难以实现对敏感性酶的活性及其循环利用的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种固定化酶，该固定化酶包括活化的阳离子聚合物以及共价结合在活化的所述阳离子聚合物上的酶，活化的阳离子聚合物为经辅因子活化的PEI；酶选自如下任意一种：转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶。
进一步地，转氨酶来源于B.thuringiensis、Arthrobacter citreus或Chromobacterium violaceum DSM30191；优选地，酮还原酶来源于Acetobacter sp.CCTCCM209061或Candida macedoniensis.AKU4588；优选地，单加氧酶为来源于Brachymonaspetroleovorans或Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶；优选地，氨裂解酶来源于photorhabdus luminescens或Solenostemon scutellarioides的苯丙氨酸氨裂解酶；优选地，烯还原酶来源于Saccharomyces cerevisiae或Chryseobacterium sp.CA49；优选地，亚胺还原酶来源于Streptomyces sp.或Bacillus cereus；优选地，氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶或来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；优选地，腈水解酶来源于Aspergillus niger CBS 513.88或Neurospora crassa OR74A。
进一步地，PEI的分子量为3KDa～600KDa；优选地，固定化酶中酶与PEI的质量比为0.1～1.5：1，更优选地，质量比为0.2～1：1。
进一步地，辅因子为PLP、NAD或NADP
进一步地，固定化酶中还包括酶的辅因子，辅因子共价结合与PEI上，优选辅因子为PLP、NAD或NADP。
进一步地，酶为一种或多种，辅因子为一种或多种，一种或多种辅因子与一种或多种酶相对应，优选地，固定化酶中辅因子与PEI的质量比为1～80:120，更优选为1～60:100。
根据本申请的第二个方面，提供了一种固定化酶的制备方法，该制备方法包括：利用活化剂对阳离子聚合物进行活化，得到活化的阳离子聚合物；将酶与活化的阳离子聚合物固定，得到固定化酶；其中，活化剂为辅因子；酶选自如下任意一种：转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶。
进一步地，在利用活化剂对PEI进行活化之前，制备方法还包括对PEI进行预处理的步骤，优选地，预处理包括：用纯水将PEI稀释至终浓度为1g/100mL～8g/100mL，更优选为1g/100mL～5g/100mL，得到稀释PEI；调节稀释PEI的pH为5～11，更优选为7.0～10.0，得到预处理后的PEI。
进一步地，酶是游离酶，活化剂为辅因子，辅因子为PLP、NAD或NADP；优选地，预处理的步骤中，采用纯化水调节稀释PEI的浓度为1g/100mL～8g/100mL，优选为1g/100mL～3g/100mL，pH为6～11，更优选地，pH为8.0～11.0，得到预处理后的PEI；更优选地，利用活化剂对PEI进行活化，得到活化PEI的步骤包括：向预处理后的PEI中加入辅因子，并控制辅因子的终浓度为0.3～20mg/mL，进一步优选辅因子终浓度为1～10mg/mL，然后搅拌10～600min，更优选搅拌30～180min，得到活化PEI。
进一步地，游离酶为一种酶的酶液或多种酶的混合液，辅因子为多种酶对应的辅因子。
进一步地，将酶与活化PEI固定，得到固定化酶的步骤包括：在4～25℃下，向游离酶酶液中滴加活化PEI，得到PEI吸附酶；向PEI吸附酶中滴加交联剂进行固定化，得到PEI固定化酶；优选地，游离酶的浓度0.05～0.3g/mL；优选地，PEI与游离酶的质量比为0.2～1：1。
进一步地，向PEI吸附酶中滴加交联剂进行固定化，得到PEI固定化酶包括：向PEI吸附酶中滴加交联剂，并控制交联剂的终浓度为0.2g/100mL～1g/100mL，得到待固定化物；对待固定化物依次进行静置、离心以及干燥，得到干燥酶；对干燥酶进行清洗，得到固定化酶；优选地，静置的时间是10～300min，进一步优选为30～120min，干燥为自然晾干，清洗是依次采用磷酸盐缓冲液清洗3～5次、水清洗3～5次及磷酸盐缓冲液清洗3～5次，磷酸盐缓冲液包含NaCl，其中NaCl的浓度为0.5～1M。
进一步地，转氨酶来源于B.thuringiensis、Arthrobacter citreus或Chromobacterium violaceum DSM30191；优选地，酮还原酶来源于Acetobacter sp.CCTCCM209061或Candida macedoniensis.AKU4588；优选地，单加氧酶为来源于Brachymonaspetroleovorans或Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶；优选地，氨裂解酶来源于photorhabdus luminescens或Solenostemon scutellarioides的苯丙氨酸氨裂解酶；优选地，烯还原酶来源于Saccharomyces cerevisiae或Chryseobacterium sp.CA49；优选地，亚胺还原酶来源于Streptomyces sp.或Bacillus cereus；优选地，氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶或来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；优选地，腈水解酶来源于Aspergillus niger CBS 513.88或Neurospora crassa OR74A。
根据本申请的第三个方面，提供了上述任一种固定化酶或者上述任一种制备方法制备得到的固定化酶在生物催化反应中的应用。
进一步地，生物催化反应为批次反应或连续化反应。
应用本发明的技术方案，通过将酶与PEI固定，将酶固定于PEI形成的多聚网状结构之间，提高了机械稳定性，实现了酶的固定化，而且避免了在固定化过程中，酶直接与戊二醛等交联剂的直接共价结合而降低活性。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有技术虽然已经有报道一些无载体支持的固定化酶，但不适合敏感性的酶，因此，仍需要开发新的固定化方式，以提高敏感性酶的活性及其循环利用效率。在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种固定化酶，该固定化酶包括活化的阳离子聚合物以及共价结合在活化的阳离子聚合物上的酶，活化的阳离子聚合物为经辅因子或交联剂活化的PEI，交联剂为多元醇处理或未处理的交联剂，酶选自如下任意一种：转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶。
本申请的固定化酶中，酶与酶之间，以及酶与PEI之间形成网状结合，提高了机械稳定性，不仅实现了酶的固定化，而且能够提高敏感性酶的活性、稳定性及循环利用次数。
上述固定化酶中，PEI即Polyethylene imine，简称PEI，聚乙烯亚胺，又称聚氮杂环丙烷，是一种水溶性高分子聚合物，溶于水和乙醇，不溶于苯。市售品通常为20％～50％浓度的水溶液。PEI最初报道被用来作为一种多聚阳离子型非病毒载体，因其价格低廉、体内外转染效果好，且具有使用方便、可大规模生产以及无免疫原性等优点，因而在作为药物的非病毒载体方面受到极大关注。PEI聚合物含有多个氨基，可与戊二醛交联反应产生各种多聚网状的纳米结构。这种网状结构中分散有醛基、氨基等各官能团，能够与酶蛋白间通过共价作用、氢键作用、离子作用、以及疏水作用等多种方式结合，而不是像与单一的戊二醛那样仅仅是共价结合，共价键作用极易破坏酶的活性。
因此本申请的上述固定化酶，通过将酶与PEI固定，将酶固定于PEI形成的多聚网状结构之间，实现了酶的固定化，而且避免了在固定化过程中，酶直接与戊二醛等交联剂的直接共价结合而降低活性。上述PEI的具体分子量并无特殊限定，只要能够实现对酶的固定化即可。在本申请一种优选的实施例中，PEI的分子量为3KDa～600Kda。PEI的具体分子量大小，可以根据所固定酶种类的不同进行合理优化选择，在上述分子量范围内，对现有酶类的固定化效果相对更好。
上述固定化酶中，酶与PEI可以根据具体酶种类的不同合理调整质量比。在一种优选的实施例中，固定化酶中酶与PEI的质量比为0.1～1.5：1，优选地，质量比为0.2～1：1。在0.1～1.5：1的质量比范围内，使得固定化酶的循环利用次数较高，而质量比在0.2～1：1范围内，固定化酶的循环利用次数更高。
上述辅因子为PLP、NAD或NADP，交联剂为戊二醛；优选地，多元醇为PEG，更优选，PEG为PEG400～6000。
上述固定化酶，可以是单一酶的固定化，也可以是多种酶的固定化。当多种酶固定化时，可以是主酶和辅酶的共固定化。在本申请一种优选的实施例中，固定化酶中还包括酶的辅因子，辅因子共价结合与PEI上，优选辅因子为PLP、NAD或NADP。主酶和辅酶的共固定化酶，具有催化活性稳定，循环利用次数高的效果。
如上述，本申请的固定化酶中的酶可以为一种或多种，相应地，辅因子也为一种或多种，一种或多种辅因子与一种或多种酶相对应。优选地，固定化酶中辅因子与PEI的质量比为1～80:120，更优选为1～60:100。
当两种或两种以上的酶具有不同的辅因子时，固定化酶中包含各自酶的不同的辅因子；当两种或两种以上的酶具有相同的辅因子时，固定化酶中所包含的辅因子的用量根据与各种不同主酶的用量进行合理配比。根据具体辅因子用量的不同，相应的PEI的用量也有所不同。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种固定化酶的制备方法，该制备方法包括：利用活化剂对阳离子聚合物进行活化，得到活化的阳离子聚合物；将酶与活化的阳离子聚合物固定，得到固定化酶；其中，活化剂为多元醇未修饰的交联剂、多元醇修饰的交联剂或辅因子，酶选自如下任意一种：转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶。
上述固定化酶的制备方法，通过先采用戊二醛或辅因子对PEI进行活化之后，再与酶结合即可得到固定化酶。该方法简单且在固定过程中不容易影响酶的活性，从而使得固定化酶的活性高，稳定性好，循环利用次数多。
为了更有效地对PEI进行活化，在本申请一种优选的实施例中，在利用活化剂对PEI进行活化之前，该制备方法还包括对PEI进行预处理的步骤，更优选地，该预处理包括：用纯水将PEI稀释至终浓度为1g/100mL～8g/100mL，进一步优选为1g/100mL～5g/100mL，得到稀释PEI；调节稀释PEI的pH为5～11，更优选为7.0～10.0，得到预处理后的PEI。稀释的原因是：降低PEI的粘度和浓度，利于活化过程的进行，防止因浓度过高形成沉淀。调pH的目的是：过高或过低的pH会引起酶的变性失活，也会影响PEI上各级别氨基官能团与戊二醛的结合程度，过高的pH还容易导致在活化过程中形成沉淀。
上述制备方法中，根据酶具体是沉淀酶还是游离酶，其活化剂也不同，具体的制备步骤也略有差异。在一种优选实施例中，酶是沉淀酶，交联剂为戊二醛，活化剂为戊二醛或PEG化的戊二醛。更优选地，预处理的步骤中，调节稀释PEI的pH为5.0～11.0，优选为7.0～10.0，得到预处理后的PEI。在一种更优选的实施例中，上述利用活化剂对PEI进行活化，得到活化PEI的步骤包括：向预处理后的PEI中滴加戊二醛或PEG化的戊二醛，并控制体系中戊二醛或PEG化的戊二醛的终浓度为0.1g/100mL～4g/100mL，优选为0.3g/100mL～2g/100mL，得到活化PEI。
当酶是沉淀酶时，利用戊二醛或PEG化的戊二醛活化PEI，通过控制戊二醛或PEG化的戊二醛的浓度在上述优选的范围内，能够获得活化性能较佳的PEI，从而更有利于与酶有效结合。
戊二醛或PEG化的戊二醛活化PEI的步骤无特殊要求，只要控制戊二醛或PEG化的戊二醛对PEI的活性效率最佳即可。为了更充分、更均匀地对PEI进行活化，在一种优选的实施例中，在向预处理后的PEI中滴加戊二醛或PEG化的戊二醛的过程中，控制戊二醛或PEG化的戊二醛的滴加速度为10～50mL/min，更优选地，在滴加的过程中，还包括搅拌的步骤，优选搅拌的温度为4～25℃，搅拌的速度为50～400rpm，进一步优选为100～300rpm，搅拌的时间为1～12h，进一步优选为2～10h。
上述沉淀酶可采用现有方法形成，本申请中优选通过采用沉淀剂对酶进行沉淀得到，沉淀剂的选择包括但不仅限于有机溶剂(比如乙腈)、硫酸铵、PEG400～6000或者分子量为3KDa～70KDa的PEI。更优选采用PEG400～6000或者分子量为3KDa～70KDa的PEI获得沉淀酶。需要说明的是，当沉淀剂为3KDa～70KDa的PEI时，由于沉淀酶中含有PEI，且在沉淀过程中实现了PEI与酶的物理吸附，因而此时可直接在戊二醛的交联作用下实现与酶的共价结合形成固定化酶。当然，如果此时与戊二醛活化的PEI进行反应，同样是沉淀酶聚集体经过交联剂的手臂作用与PEI共价结合，形成酶与酶之间，酶与PEI之间的网状结合。
而当沉淀酶为有机溶剂、硫酸铵、PEG400～6000等形成时，则需要与戊二醛活化的PEI结合。在一种优选实施例中，上述将酶与活化PEI结合，得到固定化酶的步骤包括：向沉淀酶中滴加活化PEI，并在滴加过程中控制pH值为5～11，优选地，7.0～9.0，得到混合物；对混合物依次进行静置、离心、过筛和干燥处理，得到固定化酶；更优选地，酶与活化PEI的质量比0.2～1：1。
当pH值在5～11的范围内时具有在保证酶活的基础上提高PEI与活化剂更牢固结合的有益效果，而控制滴加过程中控制pH值在7.0～9.0的范围内时具有对酶的活性最有益以及PEI与活化剂结合程度最佳且操作更容易的更优异的效果。酶与活化PEI的质量比在0.2～1：1范围内，能够获得不浪费酶的基础上得到活性最高的固定化酶的技术效果。
上述优选实施例中，静置的作用是使酶分子与活化的PEI之间的内部作用进一步加强形成机械强度更高的固定化酶。过筛使形成颗粒大小均一的固定化酶。在一种优选的实施例中，上述静置的时间为1～5小时；更优选地，过筛为过20～50目筛；更优选地，干燥为自然晾干，更优选为过夜晾干；更优选地，在对混合物进行干燥之后，以及得到PEI固定化酶之前，上述制备方法还包括：依次用磷酸盐缓冲液、水及磷酸盐缓冲液对干燥后的混合物进行清洗的步骤，每种清洗重复3～5次，磷酸盐缓冲液的pH为7.0～8.0，磷酸盐缓冲液中包括NaCl，其中，NaCl的浓度为0.5～1M。
上述优选实施例中，对混合物清洗采用磷酸盐缓冲液清洗能够防止清洗液对酶的活性造成不良影响。上述浓度和pH范围内的缓冲液不会影响酶的活性。
当酶是一种游离酶时，在一种优选的实施例中，酶是游离酶，活化剂为辅因子，辅因子为PLP、NAD或NADP。在上述辅因子的作用下，PEI被活化，活化PEI可有效吸附游离酶，之后可以在交联剂的作用下实现PEI与酶的交联固定。
在一种优选的实施例中，上述预处理的步骤，采用纯化水调节稀释PEI的浓度为1g/100mL～8g/100mL，优选为1g/100mL～3g/100mL，pH为6～11，优选pH为8.0～11.0，得到预处理后的PEI。针对游离酶将稀释PEI的浓度和pH在上述范围内，使得活化后的PEI有效官能团分布更有利于与酶分子的结合，固定化酶沉淀状态好，更利于从溶液中分离出来。
对于游离酶的固定化，在一种优选的实施例中，利用活化剂对PEI进行活化，得到活化PEI的步骤包括：向预处理后的PEI中加入辅因子，并控制辅因子的终浓度为0.3～20mg/mL，进一步优选辅因子终浓度为1～10mg/mL，然后搅拌10～600min，更优选搅拌30～180min，得到活化PEI。
控制辅因子的终浓度为在上述范围内，具有在不浪费辅因子的基础对PEI的活化程度最佳更利于后期和酶分子结合的效果。将加入的辅因子进行搅拌，利于充分实现辅因子对PEI的活化。
上述游离酶为一种酶的酶液或多种酶的混合液，相应地，辅因子为一种酶或多种酶对应的辅因子。
在一种优选的实施例中，将酶与活化PEI固定，得到固定化酶的步骤包括：在4～25℃下，向游离酶酶液中滴加活化PEI，得到PEI吸附酶；向PEI吸附酶中滴加交联剂进行固定化，得到PEI固定化酶；更优选地，游离酶的浓度0.05～0.3g/mL；更优选地，活化PEI与游离酶的质量比为0.2～1：1。
将游离酶的浓度控制在0.05～0.3g/mL范围内，有利于颗粒大小合适、分布均匀的固定化酶且固定化酶利于从溶液中分离出来的作用。活化PEI与游离酶的质量比控制在0.2～1：1范围内，有在不浪费游离酶的基础上形成获利回收最高的固定化酶的作用。
在一种优选的实施例中，向PEI吸附酶中滴加交联剂进行固定化，得到PEI固定化酶包括：向PEI吸附酶中滴加交联剂，并控制交联剂的终浓度为0.2g/100mL～1g/100mL，得到待固定化物；对待固定化物依次进行静置、离心以及干燥，得到干燥酶；对干燥酶进行清洗，得到固定化酶；优选地，静置的时间是10～300min，进一步优选为30～120min，干燥为自然晾干，清洗是依次采用磷酸盐缓冲液清洗3～5次、水清洗3～5次及磷酸盐缓冲液清洗3～5次，磷酸盐缓冲液包含NaCl，其中NaCl的浓度为0.5～1M。
控制交联剂的终浓度在0.2g/100mL～1g/100mL范围内，具有既能保证形成结合牢固的固定化酶且酶活回收最高的效果。此处静置、清洗等作用同前述。
在本申请第三种典型的实施例中，还提供了上述任一种固定化酶，或者上述任一种制备方法制备而成的固定化酶在生物催化反应中的应用。该固定化酶具有稳定性高，循环利用效率高的优势，因而在生物催化反应中可多次重复使用。
在一种更优选的实施例中，上述固定化酶所应用的生物催化反应为批次反应或连续化反应，更有选为连续化反应。固定化酶循环利用效率高，因而适合应用于连续化的生物催化反应，提高反应效率。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
表1：
表2：部分酶的母本及其突变体的序列
表3：
表4：
表5：
表6：
上述酶所参与反应的化学过程简述如下：
上述反应式中的R，R1和R2可以各自独立的选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基，或R1与其所连接的杂环形成稠环体系。
下列实施例中的PB代表磷酸缓冲液的意思。
实施例1：戊二醛活化的PEI共价固定化酶聚集体的制备(GA：Glutaraldehyde，PEI:Polyethylene imine，GP：GA activated PEI，戊二醛活化的PEI)
PEG修饰的戊二醛：将戊二醛用水稀释至终浓度为20g/100mL，并添加2-10g/100mLPEG 2000或PEG 6000，室温下混合1-3h备用。
活化PEI溶液的制备1：100mL水溶液中加入2g戊二醛和4g PEI(3-70KDa)，pH8.0，搅拌3h。
活化PEI溶液的制备2：100mL水溶液中加入4g PEI(3KDa)，pH8.0，以及PEG修饰的戊二醛(戊二醛在溶液中的终浓度为2g/100mL)搅拌3h。
固定化：10mL酶(酶蛋白含量为100-200mg/mL，相应地包含3-10mg/mL辅因子)置于圆底摇瓶中，冷却至5～10℃后，混合10min。缓慢加入沉淀剂如硫酸铵(45％～65％)、乙醇(80％～90％)或PEI(20％～60％)，混合30-60min，得到沉淀酶。向沉淀酶中滴加15mL活化PEI溶液，混合10-30min，静置1-2h后离心。收集不溶性沉淀物，并过30目筛。自然环境下晾干后，用0.1M PB(pH7.5，含0.5M NaCl)浸泡3小时，然后再用0.1M PB(pH7.5)冲洗。
实施例2：辅因子活化的PEI共价固定化酶聚集体的制备
辅因子活化的PEI溶液制备：PEI(Mw＝3-70KDa)用水稀释至PEI的终浓度为1g/100mL～2g/100mL，pH值为7.0～11.0。根据酶的需要，向PEI溶液中添加3-10mg/mL每种酶辅因子，室温下混合30-60min。
固定化：在4-10℃下，将7.5mL辅因子活化的PEI溶液滴加到5mL of酶液中(酶蛋白含量30-80mg/mL，相应地也包含辅因子)，混合30-60min后，加入交联剂戊二醛或者PEG修饰的戊二醛，并使得戊二醛终浓度为0.2-1g/100mL。混合30-60min后，离心并收集不溶性沉淀物，然后过30目筛。自然晾干后，沉淀物于0.1M PB(pH 7.0-8.0，含0.5-0.9M NaCl)中浸泡3小时，然后再用0.1M PB(pH 7.0-8.0)冲洗。
实施例3：转氨酶-戊二醛活化的PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
在10mL的反应瓶中，加入0.3mL DMSO，溶解0.1g主原料1或2，并加入4eq异丙胺盐酸盐和1.0mg PLP(5’-磷酸吡哆醛)，补加0.1M PB 7.0至反应液终体积为1mL，0.1g固定化转氨酶(湿的，含水量在70％～80％)，在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表。
表7：
实施例4：转氨酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶方法中酶液浓度，PEI浓度与GA浓度的考察
以PEG6000作为沉淀剂，其余制备过程同实施例1，设置不同的PEI浓度，交联剂浓度，酶与PEI的比例，制备相应的固定化酶。
在10mL的反应瓶中，加入0.3mL DMSO，溶解0.1g主原料1或2，并加入4eq异丙胺盐酸盐和1.0mg PLP(5’-磷酸吡哆醛)，补加0.1M PB 7.0至反应液终体积为1mL，再加入0.1g固定化转氨酶(湿的，含水量为70％～80％)，在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，结果见下表。
表8：
上表结果显示，PEI浓度1～7g/100mL较适宜；酶与PEI的比例为0.2～1：1最佳；交联剂浓度在0.5～1.5g/100mL时稳定性最理想。
实施例5：转氨酶-辅因子活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
采用与实施例3相同的水相反应进行活性验证，结果如下表。结果显示，PEI浓度在1％～5％较合适；辅因子浓度>5mg/mL后基本无区别，节约起见，可选5～10mg/mL；交联剂浓度0.5～1％最适宜。PEG修饰的交联剂制备的固定化酶活性略有提高。
表9：转氨酶辅因子活化PEI共价固定化酶水相反应概况
实施例6：酮还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
按照实施例1的方法制备酮还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶。
在10mL的反应瓶中，加入0.5mL异丙醇(IPA)，溶解0.1g主原料3或4，并加入0.5mL0.1M PB 7.0和1-10mg NAD+，再加入由0.1g固定化酶(湿的，含水量为70～80％)，在30℃搅拌16-20h。体系经GC检测转化率，反应数据如下表。
表10：酮还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶水相反应概况
实施例7：酮还原酶辅因子-PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
同实施例2的方法制备酮还原酶辅因子-PEI共价固定化酶。
同实施例6进行固定化酶酶活和稳定性检测。检测结果见下表。
表11：酮还原酶辅因子-PEI共价固定化酶水相反应概况
实施例8环己酮单加氧酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
按照实施例1的方法制备环己酮单加氧酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶。
固定化酶的活性通过利用以下底物5进行反应来检测。
0.3mL的异丙醇装入10ml的反应瓶中，随后加入500mg的底物5，3mL含有5mg NADP+的0.1M PB(pH 8.0)，然后加入50mg醇脱氢酶ADH-Tb游离酶及0.1g CHMO固定化酶(湿的，含水量70～80％)。在30℃下反应16-20小时，测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。结果见下表。
表12：环己酮单加氧酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶活性和重复使用次数
实施例9.环己酮单加氧酶-辅因子活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
同实施例2，制备环己酮单加氧酶-辅因子活化PEI共价固定化酶聚。
同实施例8，检测固定化酶活性和重复使用次数，结果见下表。
表13：环己酮单加氧酶-辅因子活化PEI共价固定化酶活性和重复使用次数
实施例10烯还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
按照实施例1的方法制备烯还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶。
固定化酶的活性和重复使用次数通过利用以下底物6进行反应来检测
3mL的0.1M PB(pH7.0-8.0)装入10ml的反应瓶中，随后通过加入100mg的底物6，接着加入10mg NAD(P)+，80mg甲酸铵，20mg FDH及100mg的ERED固定化酶(湿的，含水量为70～80％)。在30℃下反应16-20小时，测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果见下表。
表14：烯还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶活性和重复使用次数
实施例11烯还原酶辅因子-PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
同实施例2的方法制备烯还原酶辅因子-PEI共价固定化酶；
同实施例10进行固定化酶酶活和稳定性检测，结果见下表。
表15：烯还原酶辅因子-PEI共价固定化酶活性和重复使用次数
实施例12.腈水解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
按照实施例1的方法制备腈水解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶
固定化酶的活性和重复使用次数通过利用以下底物7进行反应来检测
将2mL 0.1M PB缓冲液(pH 7.0-8.0)加入10mL反应瓶中，并加入100mg上述底物9，然后加入含有200mg NIT固定化酶(湿的，含水量为70～80％)。在30℃下反应16小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果见下表。
表16：腈水解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶性和重复使用次数
实施例13.腈水解酶辅因子-PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
同实施例2的方法制备腈水解酶辅因子-PEI共价固定化酶；
同实施例12进行固定化酶酶活和稳定性检测，结果见下表。
表17：腈水解酶辅因子-PEI共价固定化酶活性和重复使用次数
实施例14.亚胺还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
按照实施例1的方法制备亚胺还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶。
固定化酶的活性通过利用以下底物8进行反应来检测。
将2mL 0.1M PB缓冲液(pH 7.0-8.0)加入10mL反应球中，然后加入100mg上述底物8、10mg NAD+、60mg甲酸铵、10mg FDH和100mg IRED固定化酶(湿的，含水量为70～80％)。在30℃下反应20小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果见下表。
表18：亚胺还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶活性和重复使用次数
实施例15亚胺还原酶辅因子-PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
同实施例2的方法制备亚胺还原酶辅因子-PEI共价固定化酶
同实施例14进行固定化酶酶活和稳定性检测，结果见下表。
表19：亚胺还原酶辅因子-PEI共价固定化酶活性和重复使用次数
实施例16.氨裂解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
按照实施例1的方法制备氨裂解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶
固定化酶的活性和重复使用次数通过利用以下底物9进行反应来检测
将8mL 4M氨基甲酸铵水溶液(pH 9.0～9.5)加入10mL反应瓶中，并加入100mg上述底物9，然后加入含有200mg氨裂解酶固定化酶(湿的，含水量为70～80％)。在30℃下反应16-20小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果见下表。
表20：氨裂解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶活性和重复使用次数
实施例17氨裂解酶辅因子-PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
同实施例2的方法制备氨裂解酶辅因子-PEI共价固定化酶；
同实施例16进行固定化酶酶活和稳定性检测，结果见下表。
表21：氨裂解酶辅因子-PEI共价固定化酶活性和重复使用次数
实施例18：氨基酸脱氢酶戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
按照实施例1的方法制备氨基酸脱氢酶戊二醛活化PEI共价固定化酶。
固定化酶的活性和重复使用次数通过利用以下底物10、11或12进行反应来检测。
在10mL的反应瓶中，加入5mL 0.1M Tris-Cl缓冲液(pH 8.0-9.0)，溶解100mg主原料10、11或12，并加入108mg氯化铵，调节pH为7.5-8.0，然后加入10-50mg NAD+、50mg GDH及100mg固定化的AADH湿酶，在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下。
表22：氨基酸脱氢酶戊二醛活化PEI共价固定化酶水相反应概况
实施例19：氨基酸脱氢酶辅因子活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活
同实施例2的方法制备氨裂解酶辅因子-PEI共价固定化酶；
同实施例18进行固定化酶酶活和稳定性检测，结果见下表。
表23：氨基酸脱氢酶辅因子活化PEI共价固定化酶水相反应概况
实施例20：共固定化TA,LDH和FDH三种酶与戊二醛活化的PEI共价固定化
固定化：10mL酶(TA:LDH:FDH)按比例混合，置于圆底摇瓶中，冷却至5～10℃后，混合10min。缓慢加入沉淀剂如硫酸铵(45％～65％)、或PEG(20％～60％)，混合30-60min，得到沉淀酶。向沉淀酶中滴加15mL活化PEI溶液，混合10-30min，静置1-2h后离心。收集不溶性沉淀物，并过30目筛。自然环境下晾干后，用0.1M PB(pH7.5，含0.5M NaCl)浸泡3小时，然后再用0.1M PB(pH7.5)冲洗。
所得共固定化酶按如下方法测试酶活性：
在10mL的反应瓶中，加入5mL 0.1M PB(pH 8.0)，溶解100m g主原料12，80mg甲氨酸和5mg PLP(5’-磷酸吡哆醛)，调节pH值为7.5-8.0，然后加5mg NAD+，100mg共固定化酶(湿的，含水量70～80％)。在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表。
表24：
实施例21转氨酶戊二醛修饰PEI共价固定化酶在填充床连续反应中的应用
实施例3中转氨酶TA-Cv-戊二醛修饰PEI共价固定化酶填充至120mL柱体积的柱状反应器中，固定化酶(湿的，含水量70～80％)用量90g。
500g底物1，用1.5L的甲醇溶解，并加入4eq的异丙胺盐酸盐(1.8L的6M异丙胺盐酸盐水溶液)和5g PLP，不加PB缓冲液(0.1M,pH8.0)定容至5L。
设置流速0.6mL/min，即保留时间200min，进行连续化反应，出口端流出液检测转化率，转化率＞92％，持续运行500h，转化率无降低。
实施例22转氨酶-辅因子修饰PEI固定化酶在连续搅拌罐反应中的应用
使用同实施例2的方法制备的转氨酶-辅因子修饰PEI固定化酶60g，加入到200mL反应器中，加入150mL磷酸缓冲液。
500g底物1，加入3.2L PB(0.1M,pH 7.0)，1.8L异丙胺盐酸盐水溶液(6M)和5gPLP，打浆制成混悬液。
以0.4mL/min的速度向反应瓶中连续添加底物混悬液(即保留时间500min)，同时以同样的流速在出口抽出反应体系(管道末端加过滤头，防止将固定化酶抽出)。在该条件下，转化率可达90％以上，且连续运行600h，转化率基本无降低。
实施例23TA、LDH和FDH三种酶与戊二醛活化的PEI共价固定化酶在连续搅拌罐反应中的应用
使用同实施例20的共固定化酶，200mL反应器中加入70g转氨酶TA-Bt与辅酶LDH,FDH的共固定化酶，加入150mL磷酸缓冲液。
500g底物12，108mg氯化铵，用4.5L的PB缓冲液(0.1M,pH8.0)溶解，氢氧化钠溶液调节pH至pH 7.5-8.0，然后加入10-50mg NAD+，80mg甲酸铵，最后用PB缓冲液定容至5L。
以0.8mL/min的速度向连续搅拌罐中连续添加底物(即保留时间250min)，同时以同样的流速在出口抽出反应体系(管道末端加过滤头，防止将固定化酶抽出)。在该条件下，转化率可达92％以上，且连续运行600h，转化率基本无降低。
实施例24
同实施例2的方法，将制备的酮还原酶KRED-Ac固定化酶(湿的，含水量70～80％)，8g填充至10mL柱状反应器。
100g底物3，用0.3L的异丙醇溶解，加入0.7LPB缓冲液(0.1M,pH7.0)溶解，然后加入0.1g NAD+。
设置流速0.05mL/min，即保留时间200min，进行连续化反应，出口端流出液检测转化率，转化率＞90％，持续运行500h，转化率无降低。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过将酶与PEI固定，将酶固定于PEI形成的多聚网状结构之间，提高了机械稳定性，实现了酶的固定化，而且避免了在固定化过程中，酶直接与戊二醛等交联剂的直接共价结合而降低活性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 凯莱英生命科学技术（天津）有限公司
<120> 固定化酶、其制备方法及其应用
<130> PN136730KLY
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 459
<212> PRT
<213> 转氨酶(Chromobacterium violaceum)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(459)
<223> TA-Cv-母本
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<213> 转氨酶(Chromobacterium violaceum)
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50 55 60
Gly Gln Lys Asn Gln Lys Val Asn Ala Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asp
65 70 75 80
Arg Tyr Gly Phe Val Trp Asp Thr Tyr Ala Thr Asp Tyr Lys Ala Lys
85 90 95
Ala Ala Lys Ile Ile Ile Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Asp Trp Pro
100 105 110
Gly Lys Val Arg Phe Val Ser Thr Gly Ser Glu Ala Val Glu Thr Ala
115 120 125
Leu Asn Ile Ala Arg Leu Tyr Thr Asn Arg Pro Leu Val Val Thr Arg
130 135 140
Glu His Asp Tyr His Gly Trp Thr Gly Gly Ala Ala Thr Val Thr Arg
145 150 155 160
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Gly Leu Val Gly Asp Asn Ser Glu Ser Phe
165 170 175
Ser Leu Gln Val Pro Gly Ser Ser Cys Gly Ala Ala Val Leu Met Ala
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Pro Ser Ser Asn Thr Phe Gln Asp Ser Asn Gly Asn Tyr Leu Lys Asp
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Glu Asn Gly Glu Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu
210 215 220
Asn Tyr Gly Pro Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln
225 230 235 240
Gly Val Gly Ser Thr Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Ile Pro Gln Ile Arg
245 250 255
Lys Met Thr Lys Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Ser Asp Glu Val Leu
260 265 270
Thr Gly Phe Gly Arg Thr Gly Lys Trp Phe Gly Tyr Gln His Tyr Gly
275 280 285
Val Gln Pro Asp Ile Ile Thr Met Gly Lys Gly Leu Ser Ser Ser Ser
290 295 300
Leu Pro Ala Gly Ala Val Val Val Ser Lys Glu Ile Ala Ala Phe Met
305 310 315 320
Asp Lys His Arg Trp Glu Ser Val Ser Thr Tyr Ala Gly His Pro Val
325 330 335
Ala Met Ala Ala Val Cys Ala Asn Leu Glu Val Met Met Glu Glu Asn
340 345 350
Leu Val Glu Gln Ala Lys Asn Ser Gly Glu Tyr Ile Arg Ser Lys Leu
355 360 365
Glu Ala Leu Gln Glu Lys His Lys Ser Ile Gly Asn Phe Asp Gly Phe
370 375 380
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Ile Gly Gly Ala Met Pro Asn Thr Met Arg Ile Gly Ala Ser Leu Asn
435 440 445
Val Ser Arg Gly Asp Ile Asp Lys Ala Met Asp Ala Leu Asp Tyr Ala
450 455 460
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<211> 476
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65 70 75 80
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Ala Ala Lys Ile Ile Ile Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Asp Trp Pro
100 105 110
Gly Lys Val Arg Phe Val Ser Thr Gly Ser Glu Ala Val Glu Thr Ala
115 120 125
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130 135 140
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Leu Arg Ser Leu Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asn Ser Glu Ser Phe
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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305 310 315 320
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325 330 335
Ala Met Ala Ala Val Cys Ala Asn Leu Glu Val Met Met Glu Glu Asn
340 345 350
Leu Val Glu Gln Ala Lys Asn Ser Gly Glu Tyr Ile Arg Ser Lys Leu
355 360 365
Glu Ala Leu Gln Glu Lys His Lys Ser Ile Gly Asn Phe Asp Gly Phe
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Tyr Val Lys Leu Asp Arg Asn Phe Arg His Asp Met Asn Pro Asn Gln
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420 425 430
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Val Ser Arg Gly Asp Ile Asp Lys Ala Met Asp Ala Leu Asp Tyr Ala
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Leu Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Glu Trp Gln Gln Ser
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Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Ala
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Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val
50 55 60
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Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Asn Tyr Ser
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Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser
100 105 110
Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala
115 120 125
Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Ser
130 135 140
Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Val Ala Ser Lys Gly
145 150 155 160
Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser
165 170 175
Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr
180 185 190
Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys
195 200 205
Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile
210 215 220
Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
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<211> 253
<212> PRT
<213> 酮还原酶(Acetobacter sp. )
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(253)
<223> KRED-Ac-V2
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(253)
<223> E144S+A94T+N156T
<400> 9
Met Ala Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn
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65 70 75 80
Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr Tyr Ser
85 90 95
Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser
100 105 110
Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala
115 120 125
Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Ser
130 135 140
Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Thr Ala Ser Lys Gly
145 150 155 160
Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser
165 170 175
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Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp
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Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser
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Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu
100 105 110
Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser
115 120 125
Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val
130 135 140
Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr
145 150 155 160
Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn
165 170 175
Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln
180 185 190
Gln Val Ile Thr Ala Leu Ala Pro Glu Val Glu His Leu Thr Val Phe
195 200 205
Val Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Val Gly Asn Arg Pro Val Thr
210 215 220
Lys Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ala Asp Tyr Asp Gly Ile Trp Asp
225 230 235 240
Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu
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Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Glu Glu Arg Asn Arg Ile Phe Gln Glu
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Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly
325 330 335
Tyr Tyr Glu Val Tyr Asn Arg Pro Asn Val Glu Ala Val Ala Ile Lys
340 345 350
Glu Asn Pro Ile Arg Glu Val Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Glu Asp
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370 375 380
Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly
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<213> 环己酮单加氧酶(Rhodococcus sp. Phi1)
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<221> VARIANT
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Gly Leu Thr Val Val Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Pro Gly Gly Thr
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Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr Glu Ser His
50 55 60
Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp
65 70 75 80
Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser
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Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu
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Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser
115 120 125
Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val
130 135 140
Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr
145 150 155 160
Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn
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Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln
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Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu
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275 280 285
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Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly
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Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly
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Leu His Ile Asn Asp His Trp Asp Gly Gln Pro Thr Ser Tyr Leu Gly
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Ile Ala Asn Ala Thr Leu Phe Thr Arg Gly Asp Ser Trp Ile Phe Gly
485 490 495
Ala Asn Val Pro Gly Lys Lys Pro Ser Val Leu Tyr Tyr Leu Gly Gly
500 505 510
Leu Gly Asn Tyr Arg Asn Val Leu Ala Gly Val Val Ala Asp Ser Tyr
515 520 525
Arg Gly Phe Glu Leu Lys Ser Ala Val Pro Val Thr Ala
530 535 540
<210> 12
<211> 541
<212> PRT
<213> 环己酮单加氧酶(Rhodococcus sp. Phi1)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(541)
<223> CHMO-Rs-V2
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(541)
<223> F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V
<400> 12
Met Thr Ala Gln Ile Ser Pro Thr Val Val Asp Ala Val Val Ile Gly
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Ala Gly Phe Gly Gly Ile Tyr Ala Val His Lys Leu His Asn Glu Gln
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Gly Leu Thr Val Val Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Pro Gly Gly Thr
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Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp
65 70 75 80
Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser
85 90 95
Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu
100 105 110
Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser
115 120 125
Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val
130 135 140
Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr
145 150 155 160
Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn
165 170 175
Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln
180 185 190
Gln Val Ile Thr Ala Leu Ala Pro Glu Val Glu His Leu Thr Val Phe
195 200 205
Val Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Val Gly Asn Arg Pro Val Thr
210 215 220
Lys Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ala Asp Tyr Asp Gly Ile Trp Asp
225 230 235 240
Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu
245 250 255
Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Glu Glu Arg Asn Arg Ile Phe Gln Glu
260 265 270
Ala Trp Asp His Gly Gly Gly Val Arg Phe Met Phe Gly Thr Phe Gly
275 280 285
Asp Ile Ala Thr Asp Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Ala Ser Phe Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ile Ile Glu Asp Pro Glu Thr Ala Arg Lys
305 310 315 320
Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly
325 330 335
Tyr Tyr Glu Val Tyr Asn Arg Pro Asn Val Glu Ala Val Ala Ile Lys
340 345 350
Glu Asn Pro Ile Arg Glu Val Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Glu Asp
355 360 365
Gly Val Leu His Glu Leu Asp Val Leu Val Phe Ala Thr Gly Phe Asp
370 375 380
Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly
385 390 395 400
Leu His Ile Asn Asp His Trp Asp Gly Gln Pro Thr Ser Tyr Leu Gly
405 410 415
Val Thr Thr Ala Asn Phe Pro Asn Trp Phe Met Val Leu Gly Pro Asn
420 425 430
Gly Pro Asn Ser Asn Ala Pro Pro Val Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp
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Ile Ser Asp Thr Val Ala Tyr Ala Glu Arg Asn Glu Ile Arg Ala Ile
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Glu Pro Thr Pro Glu Ala Glu Glu Glu Trp Thr Gln Thr Cys Thr Asp
465 470 475 480
Ile Ala Asn Ala Thr Leu Phe Thr Arg Gly Asp Ser Trp Ile Phe Gly
485 490 495
Ala Asn Val Pro Gly Lys Lys Pro Ser Val Leu Tyr Tyr Val Gly Gly
500 505 510
Leu Gly Asn Tyr Arg Asn Val Leu Ala Gly Val Val Ala Asp Ser Tyr
515 520 525
Arg Gly Phe Glu Leu Lys Ser Ala Val Pro Val Thr Ala
530 535 540
<210> 13
<211> 603
<212> PRT
<213> 环己酮单加氧酶(Rhodococcus ruber-SD1)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(603)
<223> CHMO-Rr-母本
<400> 13
Met Thr Thr Ser Ile Asp Arg Glu Ala Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Glu
1 5 10 15
Glu Arg Asp Lys Arg Ile Arg Pro Asp Gly Asn Asp Gln Tyr Ile Arg
20 25 30
Leu Asp His Val Asp Gly Trp Ser His Asp Pro Tyr Met Pro Ile Thr
35 40 45
Pro Arg Glu Pro Lys Leu Asp His Val Thr Phe Ala Phe Ile Gly Gly
50 55 60
Gly Phe Ser Gly Leu Val Thr Ala Ala Arg Leu Arg Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
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Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Met Cys Asp Thr Ala Ala Met Val
100 105 110
Tyr Met Pro Leu Leu Glu Glu Thr Gly Tyr Met Pro Thr Glu Lys Tyr
115 120 125
Ala His Gly Pro Glu Ile Leu Glu His Cys Gln Arg Ile Gly Lys His
130 135 140
Tyr Asp Leu Tyr Asp Asp Ala Leu Phe His Thr Glu Val Thr Asp Leu
145 150 155 160
Val Trp Gln Glu His Asp Gln Arg Trp Arg Ile Ser Thr Asn Arg Gly
165 170 175
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