阅读说明：本技术 一种病毒纯化的方法、制备的疫苗组合物及其应用 (Virus purification method, vaccine composition prepared by virus purification method and application of vaccine composition ) 是由 田克恭 侯瑞卿 郜玮 张许科 于 2019-04-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种病毒抗原的纯化方法,该纯化方法包括：中速离心去除增殖的病毒液中的大分子杂质,用核酸酶处理去除大分子杂质后的病毒液,加入EDTA抑制核酸酶,用凝胶层析进行纯化分离,以获得纯化的病毒抗原。本发明的方法制备的抗原在相同TCID<Sub>50</Sub>含量时产生的中和抗体效价较经纯化的灭活抗原更高,具有良好的免疫原性。(The invention provides a purification method of a virus antigen, which comprises the following steps: removing proliferated virus liquid by medium-speed centrifugationTreating the virus liquid with nuclease to remove macromolecular impurities, adding EDTA to inhibit nuclease, and performing purification and separation by gel chromatography to obtain purified virus antigen. The antigens produced by the process of the invention are in the same TCID 50 The titer of the generated neutralizing antibody is higher than that of the purified inactivated antigen during content, and the neutralizing antibody has good immunogenicity.)

一种病毒纯化的方法、制备的疫苗组合物及其应用

技术领域

本发明涉及病毒的纯化领域以及制备的含病毒的医药配制品领域，特别是涉及病毒纯化的方法、及其制备的疫苗组合物。

背景技术

病毒抗原的纯化是研究及生产中的一个关键步骤。为了去除培养过程中的杂质，一个好的病毒抗原纯化工艺应该能有效去除各种培养过程中带来的杂蛋白、核酸及其他杂质，并且具有很好的抗原回收率。

传统的病毒类疫苗纯化采用密度梯度超速离心工艺，该工艺需要价格昂贵的超速离心机，制备疫苗的成本高昂；过大的离心力和梯度溶液的高渗透性极易损伤病毒的活性及完整性，而且一次处理的样品量受到限制，为疫苗的产业化带来困难。

凝胶过滤柱层析纯化技术虽然能得到较为纯净的病毒抗原，但病毒抗原在培养过程中带来的杂质直接影响着病毒抗原的收率，同时，宿主细胞的破碎、病变、坏死或凋亡产生的部分核酸分子量与病毒粒子非常相近，直接影响病毒抗原的纯度。

因此，开发一种纯化技术路线简洁、分离效率高、分离选择性好、对病毒结构破坏性小的病毒纯化方法具有非常重要的意义。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供一种病毒的纯化方法，该方法可以进行大规模病毒纯化，获得高纯度、高滴度的病毒，降低成本投入。

本发明提供了一种病毒抗原的纯化方法，其中，所述纯化方法包括以下步骤：步骤(1)中速离心去除增殖的病毒液中的大分子杂质；步骤(2)用核酸酶处理所述步骤(1)获得的所述去除了大分子杂质后的病毒液，以降解宿主细胞的核酸；步骤(3)将所述步骤(2)核酸酶处理后的病毒液加入EDTA抑制核酸酶；以及步骤(4)用凝胶层析对所述步骤(3)的所述抑制了的核酸酶的病毒液进行纯化分离，以获得纯化的病毒抗原。

本发明的纯化方法，其纯化的病毒抗原在更大程度上保留了抗原的免疫原性，其制备的灭活疫苗其免疫原性与未经纯化处理的病毒抗原相当。

本发明病毒纯化方法去除大分子杂质的处理工艺采用中速离心方式，要求低，处理条件温和，不会对病毒颗粒造成二次破坏，同时具有处理量大，处理成本低的特点；本发明病毒纯化方法采用核酸酶处理病毒液，不仅提升病毒的纯度，而且显著增加后期纯化病毒的收率；本发明病毒纯化方法采用EDTA中和核酸酶，避免对目的病毒结构造成持续破坏，最大程度保证了病毒抗原的免疫原性；本发明病毒纯化方法可以处理多种病毒抗原，具有广泛的适用性。

作为本发明的一种实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述步骤(1)中所述增殖的病毒液经浓缩前置处理。

作为本发明的一种实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述步骤(1)中所述中速离心的离心速率为7000rpm～9000rpm，所述离心时间为10min～20min。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述中速离心的离心速率为8000rpm，所述离心时间为12min。

作为本发明的一种实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述步骤(2)中所述核酸酶为Benzonase核酸酶，所述核酸酶添加量为1.5～2U/mL，所述核酸酶处理时间为30min。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述核酸酶添加量为1.8U/mL。

作为本发明的一种实施方式，本发明的病毒抗原的纯化方法中，所述步骤(3)中EDTA浓度2mmol/L。

本发明还提供了所述的纯化方法得到的病毒抗原。

本发明的病毒抗原具有良好的免疫原性，与未经纯化处理的病毒抗原相当，制备的疫苗能进行完全保护，副反应小。经本发明病毒纯化方法纯化后制备的疫苗，病毒抗原最大程度保持了原来的免疫原性，其产生的抗体滴度较相同含量的未处理抗原制备的疫苗产生的滴度更高，保证了良好的免疫效果，适用于产业上大量生产制备疫苗。

作为本发明的一种实施方式，本发明的纯化的病毒抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、***病毒、或猪流行性腹泻病毒。

本发明还提供了一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的灭活的所述病毒抗原和药学上可接受的载体。

本发明的疫苗组合物具有良好的免疫原性，不仅能进行完全保护，且副反应小。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗中，所述药学上可接受的载体为佐剂，所述佐剂包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；所述佐剂含量为5％-70％V/V。

所述佐剂的含量可以任意选自5％V/V、6％V/V、7％V/V、8％V/V、9％V/V、10％V/V、15％V/V、20％V/V、25％V/V、30％V/V、35％V/V、40％V/V、45％V/V、50％V/V、55％V/V、60％V/V、65％V/V、66％V/V、67％V/V、70％V/V。

本发明的疫苗组合物可使用可用技术来调配，优选为药学上可接受的载体一起调配。例如，油可有助于稳定调配物，且另外充当疫苗佐剂。油佐剂既可以是自然来源，也可以是经过人工合成获得的。术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成，或(4)Montanide^TMGel。

尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。

特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。

适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

本发明的疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物中。例如，本发明的组合物还可以包含以下试剂，如：药物，免疫刺激剂(如：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

可以根据本发明的疫苗组合物制备成口服剂型或非口服剂型。

优选的是可通过皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或硬脑膜外途径给予的非口服剂型。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述的病毒抗原为灭活前10^6.0～10^8.0TCID₅₀/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株灭活抗原，所述药学上可接受的载体为水包油乳剂佐剂。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述的病毒抗原为灭活前10^7.0～10^8.0TCID₅₀/ml的猪流行性腹泻病毒HN1303株灭活抗原，所述药学上可接受的载体为铝胶佐剂。作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述的病毒抗原为灭活前10^7.0TCID₅₀/ml的猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株灭活抗原，所述药学上可接受的载体为水包油乳剂佐剂。

作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述的病毒抗原为灭活前10^8.0TCID₅₀/ml的猪流行性腹泻病毒HN1303株灭活抗原，所述药学上可接受的载体为铝胶佐剂。

本发明的疫苗组合物由于抗原成分中去除了大分子蛋白和其他杂质对免疫反应的影响，其产生的抗体滴度较相同含量的未纯化抗原制备的疫苗抗体滴度更高，显示了良好的免疫原性。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1猪繁殖与呼吸综合征病毒的纯化

1.大分子杂质的去除

将Marc-145细胞培养的NVDC-JXA1株(公开于中国专利申请200710086549.7)经浓缩病毒液分为三份，第一份加入离心管，放入中速离心机中，以8000rpm离心12min，除去细胞碎片及部分杂质，获得初级纯化病毒液，命名为A1；第二份加入离心管，放入高速离心机中，以12000rpm离心5min，除去细胞碎片及部分杂质，获得初级纯化病毒液，命名为A2；第三份不处理，命名为A3。

2.核酸酶处理

将上述步骤获得的病毒液A1、A2、A3分别分出一份，添加Benzonase核酸酶处理病毒30min，添加量为1.8U/mL，处理后的病毒液分别命名为B1、B2、B3。

3.EDTA抑制核酸酶

将上述步骤获得的病毒液B1、B2、B3分别分出一份，添加EDTA，终浓度2mmol/L，对核酸酶进行抑制，抑制后的病毒液分别命名为C1、C2、C3。

4.凝胶层析法纯化分离

将上述步骤获得的病毒液A1、A2、A3分别采用凝胶层析法进行精细纯化分离，A1经凝胶层析法纯化后收率为40％，经凝胶层析法纯化后的病毒液命名为A11；A2经凝胶层析法纯化后收率为41％，经凝胶层析法纯化后的病毒液命名为A21；A3经凝胶层析法纯化后收率为38％，经凝胶层析法纯化后的病毒液命名为A31。

将上述步骤获得的病毒液B1、B2、B3分别采用凝胶层析法进行精细纯化分离，B1经凝胶层析法纯化后收率为90％，经凝胶层析法纯化后的病毒液命名为B11；B2经凝胶层析法纯化后收率为91％，经凝胶层析法纯化后的病毒液命名为B21；B3经凝胶层析法纯化后收率为40％(经凝胶层析法纯化后的病毒液命名为B31。

将上述步骤获得的病毒液C1、C2、C3分别采用凝胶层析法进行精细纯化分离，C1经凝胶层析法纯化后收率为90％，经凝胶层析法纯化后的病毒液命名为C11；C2经凝胶层析法纯化后收率为91％，经凝胶层析法纯化后的病毒液命名为C21；C3经凝胶层析法纯化后收率为40％，经凝胶层析法纯化后的病毒液命名为C31。

上述结果表明，经离心、核酸酶处理，或离心、核酸酶和EDTA处理，后经凝胶层析法纯化后收率较高。

将上述纯化后的病毒加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次搅拌10min，灭活完全后备用。

实施例2猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物的制备

将实施例1制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原A3、B11、B21、C11、C21灭活后分别与水包油乳剂佐剂按照体积比50:50混合，在30℃条件下120转/分钟搅拌15分钟。具体配比见表1。

表1猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物配比

实施例3猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫原性试验

将43日龄PRRSV抗原抗体阴性仔猪30头随机分成6组，5头/组，按照表2注射疫苗，对照组接种PBS 2ml/头。

表2猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫原性试验分组

组别	注射疫苗	免疫剂量
			1	疫苗1	2ml/头
2	疫苗2	2ml/头
			3	疫苗3	2ml/头
4	疫苗4	2ml/头
			5	疫苗5	2ml/头
6	PBS	2ml/头

免疫后28天攻毒，用猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株攻毒，攻毒剂量均为10^5.5TCID₅₀/头，观察临床症状见表3。

表3猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫原性试验结果

结果显示，本发明方法制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物(疫苗4)免疫仔猪，用NVDC-JXA1株攻毒，能阻断病毒感染(出现临床症状)，为仔猪提供100％(5/5)保护；用常规细胞培养方法制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物(疫苗1)免疫仔猪，用NVDC-JXA1株攻毒，能阻断病毒感染(出现临床症状)，能提供100％(5/5)的有限保护；仅经中速离心后添加核酸酶处理，直接采用凝胶层析法进行精细纯化分离制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物(疫苗2)或高速离心后添加核酸酶处理，直接采用凝胶层析法进行精细纯化分离制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物(疫苗3)免疫仔猪，用NVDC-JXA1株攻毒，均不能完全阻断病毒感染(出现临床症状)，能提供80％(4/5)的有限保护；经高速离心、核酸酶处理及EDTA中和后采用凝胶层析法进行精细纯化分离制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物(疫苗5)免疫仔猪，用NVDC-JXA1株攻毒，也不能完全阻断病毒感染(出现临床症状)，能提供80％(4/5)的有限保护；攻毒对照仔猪攻毒后全部出现临床症状，部分猪只死亡。

上述表明本发明方法及常规提供的抗原，制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物均具有良好的免疫效果，能提供100％的保护；其他无论是通过高速离心、添加核酸酶、添加EDTA或其组合方式处理，后通过凝胶层析法进行精细纯化分离，均不能达到本发明所述方法带来的效果。

实施例4猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物安全性试验

将3～4周龄PRRSV抗原抗体阴性仔猪30窝随机分成5组，6窝/组，按照表4注射疫苗。

表4猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物安全性试验分组

组别	注射疫苗	免疫剂量
			7	疫苗1	4ml/头
8	疫苗2	4ml/头
			9	疫苗3	4ml/头
10	疫苗4	4ml/头
			11	疫苗5	4ml/头

免疫后继续饲养观察21天，观察免疫后动物的反应，并对部分仔猪进行解剖，观察注射部位疫苗的吸收情况。结果见表5。

表5猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物安全性试验结果

结果显示，本发明方法制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物(疫苗4)和经高速离心、核酸酶处理及EDTA中和后采用凝胶层析法进行精细纯化分离制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物(疫苗5)超剂量免疫仔猪，均无不良反应，安全性好；用常规细胞培养方法制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物(疫苗1)超剂量免疫仔猪，出现5％左右的不良反应；仅经中速离心后添加核酸酶处理，直接采用凝胶层析法进行精细纯化分离制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物(疫苗2)或高速离心后添加核酸酶处理，直接采用凝胶层析法进行精细纯化分离制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物(疫苗3)超剂量免疫仔猪，出现31％左右的不良反应。

上述表明无论中速离心还是高速离心，并经核酸酶处理及EDTA中和后采用凝胶层析法进行精细纯化分离提供的抗原，制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物均有较好的安全性，但本发明方法免疫原性较好；其他纯化方法制备的疫苗在免疫原性和安全性两方面不能同时达到本发明所述方法带来的效果。

实施例5猪流行性腹泻病毒的纯化

参照实施例1的方法将Vero细胞培养的猪流行性腹泻病毒HN1303株(公开于中国专利申请CN106148287A)经浓缩病毒液放入中速离心机中，以8000rpm离心12min，除去细胞碎片及部分杂质，获得初级纯化病毒液；将上述步骤获得的病毒液添加Benzonase核酸酶处理病毒30min，添加量为1.8U/mL；再添加EDTA，终浓度2mmol/L，对核酸酶进行中和；中和后采用凝胶层析法进行精细纯化分离，纯化后收率为90％。

将纯化后的病毒及未经纯化处理的病毒分别加入β-丙内酯进行灭活处理，灭活完全后与铝胶佐剂按照体积比9:1乳化培苗。具体配比见表6。

表6猪流行性腹泻病毒疫苗组合物配比

成分	疫苗6(纯化)	疫苗7(未纯化)
			抗原(TCID<sub>50</sub>/ml)	10<sup>8.0</sup>	10<sup>8.0</sup>
佐剂含量(V/V％)	10	10

实施例6猪流行性腹泻病毒疫苗组合物免疫原性试验

将8～10日龄PEDV抗原抗体阴性仔猪13头随机分为3组，按照表7注射疫苗，两次免疫，间隔2周，对照组接种PBS 2ml/头。

表7猪流行性腹泻病毒疫苗组合物免疫原性试验分组

组别	数量(头)	注射疫苗	免疫剂量
				12	5	疫苗6	2ml/头
13	5	疫苗7	2ml/头
				14	3	PBS	2ml/头

二免2周开始每周采血，检测血清中PEDV中和抗体效价。结果见表8。

表8猪流行性腹泻病毒疫苗组合物免疫原性试验抗体情况

结果显示，两种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗免疫仔猪后，均能产生较高的中和抗体，免疫后第3周各组仔猪的中和抗体均大于1:32，且免疫力能维持较长时间；纯化后的病毒抗原制备的疫苗组合物中和抗体效价产生更快、效价更高。

将11头PEDV抗原抗体阴性的后备母猪用于本试验，随机分为3组，按照表9注射疫苗，产前7周首免，产前4周二免，对照组接种PBS 2ml/头。

表9猪流行性腹泻病毒疫苗组合物后备母猪免疫分组

组别	数量(头)	注射疫苗	免疫剂量
				15	4	疫苗6	2ml/头
16	4	疫苗7	2ml/头
				17	3	PBS	2ml/头

二免2周开始每周采血，检测血清中PEDV中和抗体效价。结果见表10。

表10猪流行性腹泻病毒疫苗组合物后备母猪免疫抗体情况

结果显示，两种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗免疫后备母猪后，均能产生较高的中和抗体，免疫后第3周各组仔猪的中和抗体均大于1:32，且免疫力能维持较长时间；纯化后的病毒抗原制备的疫苗组合物中和抗体效价产生更快、效价更高。

综上，本发明经纯化后抗原在相同TCID₅₀含量产生的中和抗体效价较经纯化的灭活抗原未更高，这是因为未去除的大分子杂质及其他杂质会影响免疫应答，而本发明的抗原通过去除了这些大分子杂质及其他杂质，产生了更好的免疫效果。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。