阅读说明：本技术 一种塞内卡病毒的纯化方法及病毒液的浓缩纯化方法 (Purification method of seneca virus and concentration and purification method of virus liquid ) 是由 张燕红 高艳华 王玉雯 陈九连 齐志涛 史琳凯 路荣 田志辉 刘国英 范秀丽 于 2019-03-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种塞内卡病毒的纯化方法及病毒液的浓缩纯化方法,向塞内卡病毒待处理液中加入PEG后,经搅拌、静置、离心,得到的沉淀即为纯化的塞内卡病毒,完成塞内卡病毒的纯化。本发明提供的塞内卡病毒的纯化方法中使用PEG法对塞内卡病毒进行纯化,可有效去除病毒中的杂质,提高有效抗原含量,提高疫苗有效性,对塞内卡灭活疫苗的规模化生产具有重要意义。(The invention discloses a purification method of seneca virus and a concentration purification method of virus liquid. The purification method of the seneca virus provided by the invention uses the PEG method to purify the seneca virus, can effectively remove impurities in the virus, improve the effective antigen content, improve the effectiveness of the vaccine, and has important significance for the large-scale production of the inactivated seneca vaccine.)

一种塞内卡病毒的纯化方法及病毒液的浓缩纯化方法

技术领域

本发明涉及病毒的纯化和浓缩技术领域，特别是涉及一种塞内卡病毒的纯化方法，由该方法得到的纯化的塞内卡病毒，由纯化的塞内卡病毒得到的塞内卡病毒液浓缩纯化方法，和由该浓缩纯化方法得到的塞内卡病毒重悬液。

背景技术

塞内卡病毒(Seneca Valley virus，SVV)，又叫做Senecavirus A(SVA)，是近年来新发现的一种能引起猪水泡样症状的病毒，被认为是引起猪原发性水疱病(PIVD)的主要原因。该病毒感染动物(尤其是猪)后,可使动物的鼻吻、蹄冠部出现水疱性病变和新生仔猪死亡，在临床上其发病症状与***、猪水疱病和猪水泡性口炎很难区分。

SVV是无囊膜单股正链RNA病毒，属于细小RNA病毒科，是Senecavirus病毒属唯一成员，与心病毒最为接近。目前，我国对SVV的报道并不多，大多养殖户对该病没有引起足够的重视，但该病已经形成全球蔓延的趋势，一旦大规模爆发，势必会造不可估量的经济损失。因此，研制该病毒的疫苗是预防该病毒大规模蔓延的最主要途径之一。

病毒灭活疫苗能够发挥作用取决于疫苗的有效性高低，提高疫苗有效性的关键因素之一是提高灭活病毒的含量。而获得高病毒含量的疫苗的有效方式之一是将病毒进行浓缩纯化，去除病毒中的杂质，浓缩病毒液使其病毒的含量升高。因此浓缩纯化是疫苗生产过程的重要环节。

目前，病毒浓缩纯化最常用的方法包括膜包法和中空纤维柱法，其只能用于浓缩不能用于纯化，是一种单纯的物理浓缩方法，配套设备昂贵，处理量大且耗时，更适用于工业化生产，不适用于实验室研究。因此，需要寻找一种有效的方法对塞内卡病毒既能进行浓缩又能进行纯化，既适用于工业化生产，又适用于实验室研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种提高有效病毒含量的塞内卡病毒的纯化方法，向塞内卡病毒待处理液中加入PEG溶液后，经搅拌、静置、离心，得到的沉淀即为纯化的塞内卡病毒，完成塞内卡病毒的纯化；PEG溶液的加入质量为塞内卡病毒待处理液体积的5-10％，优选8％；可选的，PEG溶液是由固体PEG溶于水中得到，PEG溶液中PEG的质量百分比浓度优选50％。

所述离心的转速为7000-8000r/min，优选转速为8000r/min。

所述离心的时间为10-20分钟；优选离心10min。

PEG选自PEG-2000、PEG-6000和PEG-8000中的一种或几种，优选PEG-6000。

所述塞内卡病毒待处理液是将接种有塞内卡病毒的细胞的培养液经反复冻融和离心预处理后，取上清得到；优选的，所述离心预处理前还要进行反复冻融，所述冻融具体为：将接种有塞内卡病毒的细胞的培养液冷冻成固体再融化成液体，冻融一般进行3次，即进行3次反复冻融。

所述离心预处理是以3000-5000r/min的转速离心10-20min；优选以5000r/min的转速离心10分钟。

第二方面，本发明提供一种纯化的塞内卡病毒，是由上述纯化方法得到的。

第三方面，本发明提供一种塞内卡病毒的浓缩纯化方法，在所述塞内卡病毒的纯化后，还包括按所需要的浓缩倍数，将沉淀重悬得到塞内卡病毒重悬液，即为塞内卡病毒浓缩纯化液。

将所述沉淀重悬于磷酸盐缓冲液(pH7.4±0.2)中得到重悬液。

第四方面，本发明提供一种塞内卡病毒重悬液，是由上述浓缩纯化方法得到的，所述塞内卡病毒浓缩纯化液的荧光定量PCR不低于3.3×10⁸拷贝数/μl，TCID₅₀不低于7.5/μl。

本发明提供的塞内卡病毒的纯化方法中使用PEG法对塞内卡病毒进行纯化，可有效去除病毒中的杂质，提高有效抗原含量，提高疫苗有效性，对塞内卡灭活疫苗的规模化生产具有重要意义。

具体实施方式

本发明提供了一种用PEG(聚乙二醇)来纯化塞内卡病毒的方法，虽然有文献报道(如公开号为CN101698680A的中国专利申请)用PEG对病毒液进行纯化，但并没有将其用于塞内卡病毒的纯化，并且PEG并不是单独使用，而是利用PEG进行粗提，然后结合其它纯化手段进一步提纯，如PEG结合柱层析、PEG结合透析、PEG先后结合氯仿和柱层析等进行纯化。

在此基础上，本发明经过大量的尝试探索，提供了一种专用于塞内卡病毒的纯化方法，既可以有效去除病毒中的杂质，提高有效抗原含量，又可以简化操作过程，该方法包括以下步骤：

(1)将接种有塞内卡病毒的细胞的培养液反复冻融后，置于高速冷冻离心机中3000-5000r/min离心10-20分钟；优选5000r/min离心10分钟。

(2)弃去沉淀，向上清(即塞内卡病毒待处理液)中加入PEG溶液，即每100ml塞内卡病毒待处理液中加入体积质量百分比浓度(g/100ml)为50％的PEG溶液(50％的PEG溶液由50g固体PEG溶于100ml水中得到)，PEG的加入质量百分比为上清体积的5-10％(即100ml塞内卡病毒待处理液中加入10-20ml的50％的PEG溶液)，优选加入比例为8％；然后在4℃下磁力搅拌器搅拌混匀，静置过夜得到混合液。PEG可选自PEG-2000、PEG-6000和PEG-8000中的一种或几种，优选PEG-6000。PEG溶液的浓度为50％，过低不利于后续的浓缩，浓度过高会饱和析出，使用固体PEG会导致其与液体混合不匀的情况出现。

(3)将步骤(2)得到的混合液于7000-8000r/min离心10-15分钟(优选8000r/min离心10分钟)，弃去上清，留沉淀，即纯化后的塞内卡病毒。

塞内卡病毒在使用过程中，一般需要配制成一定浓度的病毒液再使用，所以还需要进行浓缩，即本发明在上述纯化方法的基础上，又提出了一种病毒液的浓缩纯化方法，包括以下步骤：

(4)根据需要的病毒含量，在步骤(3)得到的沉淀(塞内卡病毒)中加入PBS液进行重悬，重悬得到的重悬液即浓缩纯化后的塞内卡病毒浓缩纯化液。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

本发明中的百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、塞内卡病毒的培养

(1)细胞培养

病毒培养所用细胞为PK-15细胞(来源于金宇保灵生物药品有限公司实验室细胞室)，用于培养细胞的营养液购自宜兴市赛尔生物科技有限公司，含10％新生牛血清、2％的浓度为7.5％的碳酸氢钠溶液、1％的100×HEPES缓冲液的MEM基础培养基。将PK-15细胞置于营养液中37℃培养24-48h，直至细胞长满单层。

(2)病毒培养

1)将(1)中长满单层PK-15细胞的营养液弃去；

2)用含有2wt％碳酸氢钠溶液(浓度为7.5wt％)、1wt％100×HEPES缓冲液的MEM基础培养基润洗PK-15细胞1-2次，洗后弃去培养基，得到用于培养病毒的PK-15细胞；

3)将塞内卡病毒按照5wt％的接种比例接入步骤2)润洗后的用于培养病毒的PK-15细胞中，在37℃下吸附1小时；其中塞内卡病毒由金宇保灵生物药品有限公司提供；

4)将步骤3)中接种了病毒的PK-15细胞根据不同细胞瓶型补液后，置于37℃的恒温环境下培养，当PK-15细胞出现85％及以上的病变时收获细胞瓶中的液体，即为病毒液，也就是接种有塞内卡病毒的细胞的培养液，直接用于后续的预处理；PK-15细胞病变表现为：与正常细胞相比，PK-15细胞膨大、拉网、产生空洞，变成不规则形状，大部分细胞膜破裂，释放出细胞中复制的病毒。

实施例2、病毒液的预处理

(1)将实施例1第(2)部分得到的接种有塞内卡病毒的细胞的培养液冻融3次，即-20℃冻成固体，室温融化成液体，如此反复3次，使细胞破裂，将细胞内的塞内卡病毒释放出来，标记为病毒液Ⅰ；

(2)将步骤(1)得到的病毒液Ⅰ置于高速冷冻离心机中，在3000-5000r/min的条件下离心10-20分钟，弃去沉淀，以去除细胞碎片，取上清液作为塞内卡病毒待处理液，标记为病毒液Ⅱ。

实施例3、病毒的浓缩纯化

本实施例改变PEG的加入质量进行平行实验组

(1)向实施例2得到的病毒液Ⅱ中，分别按病毒液Ⅱ体积数的5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％加入质量数的PEG-6000，即分别在100ml病毒液Ⅱ中加入10、12、14、16、18、20、22、24ml质量体积百分比浓度(g/100ml)为50％的PEG溶液(50g固体PEG-6000溶于100ml水中得到)，在磁力搅拌器上4℃搅拌混合，然后静置过夜得到混合液；

(2)将步骤(1)中的混合液置于高速冷冻离心机中，在8000r/min的条件下离心10分钟，弃去上清液(标记为上清液Ⅲ)，取沉淀，即纯化后的塞内卡病毒。

(3)按浓缩10倍计算，向步骤(2)得到的沉淀中加入0.04mol/L的PBS液(PBS液的加入体积为病毒液Ⅱ体积的1/10，即是浓缩10倍)，将沉淀重悬，得到重悬液，标记为病毒液Ⅳ，即为浓缩10倍的塞内卡病毒浓缩纯化液，浓缩纯化完成，该病毒液即是塞内卡病毒浓缩纯化液。

实施例4、病毒的浓缩纯化

本实施例改变PEG的种类进行平行试验

(1)向实施例2得到的病毒液Ⅱ每100ml中分别加入8g的PEG-2000、PEG-6000、PEG-8000(加入的是PEG-2000、PEG-6000、PEG-8000溶液，质量体积百分比浓度(g/100ml)为50％，因此，加入8g的PEG-2000，即是加入16ml的PEG-2000溶液)，在磁力搅拌器上4℃搅拌混合，然后静置过夜，得到混合液；

(2)将步骤(1)中的混合液置于高速冷冻离心机中，在8000r/min的条件下离心10分钟，弃去上清液(标记为上清液Ⅲ)，取沉淀，即纯化后的塞内卡病毒；

(3)按浓缩10倍计算，向步骤(2)得到的沉淀中加入0.04mol/L的PBS液，将沉淀重悬，得到重悬液，标记为病毒液Ⅳ，即为浓缩10倍的塞内卡病毒浓缩纯化液，浓缩纯化完成，该病毒液即是塞内卡病毒浓缩纯化液。

比较例1、病毒的浓缩纯化

(1)向实施例2得到的病毒液Ⅱ中每100ml加入15g的PEG-6000，在磁力搅拌器上4℃搅拌混合，然后静置过夜得到混合液；

(2)同实施例3；

(3)同实施例3。

对塞内卡病毒浓缩纯化液进行TCID₅₀测定和荧光定量PCR检测，结果与实施例3中PEG加入质量百分比为12％的无异，但PEG的加入量过高导致生产成本提高，且纯化效果并无明显提高。

比较例2、病毒的浓缩纯化

(1)向实施例2得到的病毒液Ⅱ中每100ml加入2g的PEG-6000，在磁力搅拌器上4℃搅拌混合，然后静置过夜得到混合液；

(2)同实施例3；

(3)同实施例3。

PEG的加入量过低导致抗原吸附不彻底，损失抗原，使得抗原回收率低下。

比较例3、病毒的浓缩纯化

(1)向实施例2得到的病毒液Ⅱ中每100ml加入8g的PEG-6000，在磁力搅拌器上4℃搅拌混合，然后静置过夜得到混合液；

(2)将步骤(1)中的混合液置于高速冷冻离心机中，在8000r/min的条件下离心20分钟，弃去上清液(标记为上清液Ⅲ)，取沉淀；

(3)同实施例3。

比较例4、病毒的浓缩纯化

(1)向实施例2得到的病毒液Ⅱ中每100ml加入8g的PEG-6000，在磁力搅拌器上4℃搅拌混合，然后静置过夜得到混合液；；

(2)将步骤(1)中的混合液置于高速冷冻离心机中，在8000r/min的条件下离心5分钟，弃去上清液(标记为上清液Ⅲ)，取沉淀；

(3)同实施例3。

比较例5、病毒的浓缩纯化

(1)向实施例2得到的病毒液Ⅱ中每100ml加入8g的PEG-6000，在磁力搅拌器上4℃搅拌混合，然后静置过夜得到混合液；；

(2)将步骤(1)中的混合液置于高速冷冻离心机中，在5000r/min的条件下离心10分钟，弃去上清液(标记为上清液Ⅲ)，取沉淀；

(3)同实施例3。

离心速率过低导致混合液沉降不完全，损失大部分抗原，使得抗原回收率低下。

实验例1、本发明方法浓缩纯化效果的检测

(1)TCID₅₀测定

将实施例1-3中各处理阶段的样品液(包括病毒液Ⅰ、病毒液Ⅱ、上清液Ⅲ、病毒液Ⅳ)进行毒价测定，即TCID₅₀测定。取高压灭菌后的1.5mL离心管，每管加入0.9mL病毒稀释液(含有2％的浓度为7.5％的碳酸氢钠溶液、1％的100×HEPES缓冲液的MEM基础培养液)，然后加入0.1mL的样品液，用旋涡混合仪混匀后得到10倍稀释液。取0.1mL的10倍稀释液加入至0.9ml病毒稀释液中，得到100倍稀释液，如此依次稀释，分别得到稀释度为10¹-10¹¹倍稀释液；将各稀释度的稀释液接种至长满单层PK-15细胞的96孔细胞板中，每个稀释度的稀释液接种4孔，每孔接种0.1mL，每孔再补加MEM基础培养液0.1mL，置37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养，逐日观察。根据细胞病变孔数按Reed-Muench法计算TCID₅₀/mL，以实施例1-3的结果为例，结果见表1。

(2)荧光定量PCR检测

将实施例1-3中各处理阶段样品(包括病毒液Ⅰ、病毒液Ⅱ、上清液Ⅲ及病毒液Ⅳ)进行荧光定量PCR测定(PEG在上清中的质量体积百分比浓度为8％)，结果见表1；实施例3中所有PEG质量体积百分比浓度的数据见表2。

表1实施例1-3中各处理阶段样品的指标检测结果

检测项目	病毒液Ⅰ	病毒液Ⅱ	上清液Ⅲ	病毒液Ⅳ
					TCID<sub>50</sub>(0.1ml)	7.5	7.5	4.5	8.75
荧光定量PCR(拷贝数/μl)	3.69×10<sup>8</sup>	3.94×10<sup>8</sup>	1.04×10<sup>6</sup>	4.24×10<sup>9</sup>

由表1的结果可见，病毒液Ⅰ和离心后的病毒液Ⅱ的毒价、拷贝数基本没有差别，加入PEG处理后，上清液Ⅲ中毒价显著降低，PEG处理后沉淀重悬得到的病毒液Ⅳ(10倍浓缩液)中毒价较未处理前提高了1个滴度(从8.75-7.5≈1.25)，PCR拷贝数也有明显的上升，说明用PEG可以浓缩纯化塞内卡病毒。

表2实施例3中各样品的指标检测结果

由表2的结果可见，病毒液Ⅰ和离心后的病毒液Ⅱ的毒价、拷贝数基本没有差别，加入不同比例PEG处理后，上清液Ⅲ中毒价都显著降低，其中PEG的加入质量体积百分比为8％的降低最多；PEG处理后沉淀重悬得到的病毒液Ⅳ(10倍浓缩液)中毒价较未处理前有显著性提高，其中PEG的加入质量体积百分比为8％的提高最多，提高了1个滴度(从8.75-7.5≈1.25)，PCR拷贝数也有明显的上升，说明本发明用PEG可以有效地浓缩纯化塞内卡病毒，考虑到生产成本等因素，PEG加入质量体积百分比为8％时效果最好。

实验例2、本发明方法浓缩纯化效果的检测

按照实验例1中的方法对实施例4和比较例3-4各处理阶段的样品液进行毒价测定和荧光定量PCR测定，结果见表3和表4。

表3实施例4中各处理阶段样品的指标检测结果

由表3可以看出，PEG-2000、PEG-6000和PEG-8000都能降低浓缩后上清液Ⅲ的毒价和PCR拷贝数，并且得到的病毒液Ⅳ中毒价和PCR拷贝数显著升高，说明这三种PEG均能有效地浓缩纯化塞内卡病毒。相比PEG-2000和PEG-8000，使用PEG-6000浓缩后上清液Ⅲ的毒价和PCR拷贝数更低，病毒液Ⅳ的毒价和PCR拷贝数更高，使用PEG-6000效果最好。

表4比较例3-4中各处理阶段样品的指标检测结果

由表4可以看出，使用PEG-6000浓缩条件下，离心时间为10min、20min浓缩后上清液Ⅲ的毒价和PCR拷贝数更低，病毒液Ⅳ的毒价和PCR拷贝数更高，比起离心5min有显著性差异，但考虑到生产成本及离心机损坏等方面原因，离心时间定为10min效果最好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。