阅读说明：本技术 一种人用狂犬病疫苗中宿主dna去除方法 (Method for removing host DNA in human rabies vaccine ) 是由 杨骏宇 唐阳 余军 李凡 望朔 赵永强 朱实惠 杨文彬 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人用狂犬病疫苗中宿主DNA去除方法,包括将病毒收获液超滤浓缩,得浓缩液；将浓缩液进行病毒灭活,得灭活浓缩液；将灭活浓缩液纯化,得原液；将原液配制、除菌后,分装、冻干,即得疫苗成品；以及,对病毒收获液进行高压均质处理,或对灭活浓缩液进行高压均质处理,或对纯化后原液进行高压均质处理。本发明采用的处理工艺可有效去除疫苗中宿主DNA,起到良好的纯化效果,且处理方式简单,成本较低,具有广阔的商业化前景。(The invention discloses a method for removing host DNA in human rabies vaccine, which comprises the steps of carrying out ultrafiltration concentration on a virus harvest solution to obtain a concentrated solution; inactivating the virus of the concentrated solution to obtain an inactivated concentrated solution; purifying the inactivated concentrated solution to obtain a stock solution; preparing the stock solution, sterilizing, packaging, and lyophilizing to obtain vaccine product; and carrying out high-pressure homogenization treatment on the virus harvest liquid, or carrying out high-pressure homogenization treatment on the inactivated concentrated liquid, or carrying out high-pressure homogenization treatment on the purified stock solution. The treatment process adopted by the invention can effectively remove the host DNA in the vaccine, has good purification effect, simple treatment mode and lower cost, and has wide commercialization prospect.)

一种人用狂犬病疫苗中宿主DNA去除方法

技术领域

本发明涉及人用疫苗纯化技术领域，具体是一种人用狂犬病疫苗中宿主DNA去除方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种人兽共患传染病，是世界上病死率最高的疾病。一般被携带病毒的动物咬伤后感染，一旦发病，死亡率为100％。据估计每年造成59000人死亡，主要发生在卫生服务水平低下的农村和城市，区域以亚洲、非洲和拉丁美洲为主，不同种族的人群对狂犬病均有普遍易感性，大多数病例发生在非洲和亚洲，约有40％是15岁以下儿童。我国仅次于印度，为世界第二发病率高的国家。

近年来我国狂犬病发病人数不断走低，表明狂犬病防治和狂犬疫苗接种对控制狂犬病流行具有决定性意义。在条件许可的情况下对人群的普遍性预防性接种，可望避免由狂犬病引其的人员死亡。

在狂犬疫苗生产中，经病毒感染的细胞培养上清液中含有目标物狂犬病毒，而且还有宿主细胞碎片和蛋白以及宿主DNA，以及细胞培养基组份。这些杂质都是需要去除的。其中，以传代细胞制备人用狂犬疫苗安全性的关键是细胞残余DNA的含量。中国药典规定人用狂犬疫苗(Vero)细胞)的宿主DNA残留量不得高于3ng/剂(PCR法)。

传统的狂犬病毒纯化路线主要采用超滤浓缩和凝胶过滤色谱法。其中，凝胶过滤色谱法是目前最有效的纯化方法，但是该方法的纯化效果并不能满足人用狂犬疫苗制品新的国家标准3ng/剂(PCR法)的要求，主要原因是凝胶过滤色谱法是根据生物分子量大小进行分离的，而病毒与宿主DNA的分子量不相上下，不能在凝胶介质中被有效分离。

此外，采用在病毒收获液中添加硫酸鱼精蛋白的方法去除 DNA，原理是硫酸鱼精蛋白可以与DNA结合，结合物容易沉淀，使用离心的方法能有效去除DNA。但是同时鱼精蛋白也与病毒结合，病毒损失严重，通常回收率只有25～30％。

此外，在超滤浓缩后加入核酸酶处理步骤，经过酶切以后的DNA变成了小片段，然后再经过凝胶过滤色谱步骤，使大部分DNA和病毒分离开。但是由于核酸酶的作用受环境条件限制，不能完全发挥效果，仍有极小一部分DNA不能和病毒分开，最终DNA残留量还停留在纳克(ng)级水平。结果只是接近国家标准，仍然很难达到合格水平。

近几年，在狂犬病毒的纯化过程中引入了离子交换色谱步骤，首先是阴离子交换色谱，让DNA和病毒一起被吸附在介质上，然后控制条件仅对病毒洗脱，能够使成品中DNA的残留量降低至1ng/剂，但是病毒量的回收率只有大约20％。

CN102282253A公开了一种狂犬病病毒纯化方法，使用一步阳离子交换色谱法能够使DNA的去除率达到95％以上，而病毒回收率在70％以上。所述的阳离子交换介质是MERK公司的产品 Fractogel EMD S03_，结合后续的核酸酶处理步骤和超速离心纯化步骤，最终得到的病毒液配制成的狂犬疫苗，在含有2.5IU 有效剂量里DNA残留量小于1ng。整个纯化过程病毒回收率在 50％左右。然而，CN102282253A公开的狂犬病病毒纯化工艺过于复杂，生产成本高。

CN102282253A公开了采用离子交换色谱纯化狂犬病病毒的工艺，先将被病毒感染的细胞的培养物的上清液与阳离子交换色谱胶体接触，以便让狂犬病毒结合在胶体上，随后从胶体上洗脱该病毒。这样的工艺流程主要是为了去除病毒液中的宿主DNA残留，但是由于病毒先吸附再洗脱的做法使得病毒量损失较大。而且病毒和宿主DNA都吸附在胶体上，先后洗脱病毒和DNA的做法也导致了DNA去除不彻底的后果。

因此开发一种既能有效去除狂犬疫苗中宿主DNA残留从而达到国家药典标准，又能提高病毒回收率的纯化工艺非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人用狂犬病疫苗中宿主DNA去除方法，以解决现有技术中的病毒回收率不高，且工艺复杂的技术难题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种人用狂犬病疫苗中宿主DNA去除方法，具体去除步骤中，包括高压均质处理。

与现有技术相比，上述技术方案带来的有益效果是：

(1)上述技术方案采用物理性方法来进行宿主DNA去除，该方法对狂犬疫苗的病毒活性剂抗原性均不造成影响，均质后，单步抗原回收率可达90％以上；

(2)对病毒培养过程中因细胞凋亡产生的宿主DNA，通过高压均质的剪切力使其宿主DNA链断裂、变小，结合原生产工艺逐步依次处理，有效降低宿主DNA残余量。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种人用狂犬病疫苗中宿主DNA去除方法，具体去除步骤中，包括高压均质处理。

对病毒培养过程中因细胞凋亡产生的宿主DNA，通过高压均质的剪切力使其宿主DNA链断裂、变小，结合原生产工艺逐步依次处理，有效降低宿主DNA残余量。

进一步的，所述具体制备步骤中，包括高压均质处理；所述高压均质处理为对病毒收获液进行高压均质处理。

通过对病毒收获液进行高压均质处理，可使得宿主细胞线性分子DNA断裂，断裂后，有利于分子量较小的DNA分子链段去除，提升后续处理过程的效率。

进一步的，所述具体制备步骤中，包括高压均质处理；所述高压均质处理为对病毒收获液的超滤浓缩液进行高压均质处理。

上述技术手段对超滤浓缩液进行高压均质处理，经过超滤浓缩后，体系的粘度提升，在高压均质过程中，内部分子链之间的相互作用力更强，从而可以使高压均质效果得到有效提升，使宿主细胞线性分子DNA链更容易断裂。

进一步的，所述具体制备步骤中，包括高压均质处理；所述高压均质处理为：将病毒收获液经超滤浓缩和纯化后，再进行高压均质处理。

在纯化后再对原液进行高压均质处理，可有效避免杂质成分同步被高压均质化处理，从而可有效提升产品的纯度。

进一步的，所述高压均质处理为：于压力为500～1100bar 条件下进行均质处理。

若压力低于500bar，则高压均质压力过小，难以将DNA链段切断；若压力高于1100bar，不仅对设备使用成本要求较高，同时还会导致DNA链段过分细化，后续难以纯化。

进一步的，所述高压均质处理为：于压力为800bar条件下进行均质处理。

进一步的所述高压均质处理为：于流速为6～10L/h条件下进行均质处理。

若流速过慢，则处理过程时间较长，处理效率偏低，若流速过快，则容易导致高压均质效果下降，无法有效将DNA链段切断。

进一步的，所述高压均质处理为：于流速为8L/h条件下进行均质处理。

进一步的，所述具体制备步骤包括：

(1)将病毒收获液超滤浓缩，得浓缩液；

(2)将浓缩液进行病毒灭活，得灭活浓缩液；

(3)将灭活浓缩液纯化，得原液；

(4)将原液配制、除菌后，分装、冻干，即得疫苗成品；

以及，对病毒收获液进行高压均质处理，或对灭活浓缩液进行高压均质处理，或对纯化后的原液进行高压均质处理。

实施例1

在细胞扩增后，进行换液种毒，再进行病毒培养，待培养结束，得病毒收获液，将病毒收获液于压力为500～1100bar，流速为8L/h条件下，高压均质处理，得均质收获液；再将均质收获液进行超滤浓缩，得浓缩液；将浓缩液进行病毒灭活，得灭活浓缩液；将灭活浓缩液纯化，得原液；将原液配制、除菌后，分装、冻干，即得疫苗成品。

实施例2

在细胞扩增后，进行换液种毒，再进行病毒培养，待培养结束，得病毒收获液；将病毒收获液进行超滤浓缩，得浓缩液；将浓缩液进行病毒灭活，得灭活浓缩液；将灭活浓缩液于压力为500～1100bar，流速为8L/h条件下，高压均质处理，得均质灭活浓缩液，将均质灭活浓缩液纯化，得原液；将原液配制、除菌后，分装、冻干，即得疫苗成品。

实施例3

在细胞扩增后，进行换液种毒，再进行病毒培养，待培养结束，得病毒收获液；将病毒收获液进行超滤浓缩，得浓缩液；将浓缩液进行病毒灭活，得灭活浓缩液；将灭活浓缩液纯化，得原液；将原液于压力为500～1100bar，流速为10L/h条件下，高压均质处理，得均质原液，将原液配制、除菌后，分装、冻干，即得疫苗成品。

对实施例1至3分别进行性能测试，具体测试结果依次见表1～3：

表1：(对应实施例1)

表2：(对应实施例2)

表3：(对应实施例3)

有上述测试结果可知：采用本发明所述处理方式，可有效去除宿主DNA，达到纯化疫苗的效果。

具体测试方式如下所述：

抗原含量检测

本法用狂犬病毒抗原诊断试剂盒检测。

检验原理：采用双抗体夹心ELISA法，用多株抗狂犬病毒单克隆抗体包被微孔板，与抗狂犬病毒酶标抗体等试剂组成，通过对样品系列稀释，与参考品做对照，用于定量检测狂犬病疫苗狂犬病毒抗原。

检验方法：

每次试验设空白、阴性对照(样品稀释液)各1孔，做好标记。

对参考品及待检样品进行2倍系列稀释，取连续5个稀释度 (1:16、1:32、1:64、1:128、1:256)，每个稀释度取样100μl，按照试剂盒的操作方法进行，置于酶标仪450nm波长处，读取各孔OD值。

结果计算

先将各OD值×100后，转换成对数值(Y)，依照直线回归方程计算平均斜率b值一步。

计算公式

平均斜率(平行化)

其中为固定值，N为样品数。

P^S和P_T为参考疫苗和被检苗的效价。

PT＝10^-M×P^S(IU/ml)

宿主DNA检测

选择通用型宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒、Vero DNA检测试剂盒进行DNA溶液和反应体系的制备，进行PCR反应，运行结束，使用Roche Cobas Z 480软件生成ST1～ST6标准曲线，进行DNA 残量的计算。

供试品Vero细胞残留DNA的制备

试剂准备：检查洗涤液A中是否加入无水乙醇，若未标明加入，则在洗涤液A中加入40ml的无水乙醇；单个样品所需的蛋白酶K消化液的配制：10μl蛋白酶K+100μl蛋白酶K缓冲液；(现配现用) 单个样品的工作结合液的配制：200μl结合液+0.2μl酵母tRNA+9 μl糖原；(现配现用)使用前将磁珠在37℃温浴10min，每次使用前应高速涡旋，振荡均匀。首次使用可将磁珠根据实验量提前进行分装，避免环境温度反复导致结合能力降低。

样品准备：将待测样品用1×PBS稀释适当倍数，每个待检测样品取100μl到1.5ml干净的离心管中；每次进行提取实验时，应有 1个阴性提取对照(NCS)：100μl 1×PBS；每个样品应有1个加标回收(ERC)：100μl稀释后待测样品+标品(加标量可根据未加标样 DNA量调整)。

样品消化：每个样品中加入10μl的5M NaCl；加入110μl蛋白酶K消化液振荡混匀后，55℃水浴60min。

结合：从水浴中取出样本，10000g快速离心30s，加入210μl 工作结合液，振荡混匀；

10000g快速离心10s，在样本混合物中分别加入200μl异丙醇， 10μl磁珠，每次加入磁珠时应再次充分震荡混匀磁珠，以保证每次加入的磁珠量的一致性；将装有全部混合物的离心管置于涡旋仪上连续振荡5min，10000g快速离心10s，后于磁力架上静置5min；待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头小心移去上清，去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。

洗涤：加入700μl洗涤液A，振荡10s，使磁珠和洗涤液A混匀；10000g快速离心10s后，将离心管重置于磁力架上静置1min，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第1次磁珠洗涤；加入700μl洗涤液B，振荡40s，使磁珠和洗涤液B混匀； 10000g快速离心10s后，将离心管重置于磁力架上静置1min，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第2次磁珠洗涤；为保证液体充分移除，可将离心管再次10000g快速离心10s，置于磁力架上静置1min，待磁珠完全分离后，用10μl枪头小心的将残余液体吸除干净；打开管盖在室温下干燥3min，除去残留的乙醇。

洗脱：沿离心管壁加入50μl 70℃预热的洗脱液，高速涡旋离心管至磁珠完全分散，70℃水浴7min，水浴过程中每隔2min振荡混匀1次；孵育完成后，将离心管15000g高速离心1min，然后于磁力架上静置2min，待磁珠分离后，用枪头小心转移溶液到干净的离心管中；将上一步获得的离心管15000g高速离心10s，然后于磁力架上静置1min，待磁珠分离后，用枪头再次转移溶液到干净离心管，所得即为样本纯化液；收集洗脱液时，应将离心管内溶液转移完全，离心管内不得残留液体，否则将影响样本检测的准确性，同时不能取到磁珠，以免对后续实验有干扰。Vero DNA标准溶液的制备见表 75。

Vero DNA定量参考品的稀释

Q-PCR反应液的制备：根据表76配制qPCR MIX，轻轻吹打混合，然后盖上管盖。

qPCR MIX配制表

根据表77配制PCR反应体系(30μl/反应)混匀，每个样本纯化液做2个平行。

表77反应体系配制

加样：进行样品排板，使阳性对照品与阴性对照及待测样品分开，以防污染影响检测结果。

封管(板)：若是8连管，直接使用配套的管盖封闭严实即可。在板上放置一个光学粘胶膜，然后沿着板的长边来回摩擦涂抹板的平面。沿着板的短边来回摩擦涂抹板的平面。在所有孔之间水平和垂直地涂抹板的边缘。使用小力气按压涂敷器在板的四边来回滑动以全封闭外部的孔。瞬离5s，使试剂在反应孔的底部，待设置反应程序上机反应。

QPCR反应程序设置：设置QPCR反应程序，上机运行反应。选择 Detection Format为Mono Color Hydrolysis Probe/UPL Probe；标准曲线浓度赋值分别为3000、300、30、3、0.3、0.03(含义为每反应加入DNA的模板量，单位为pg)。Q-PCR反应程序见表78。

表78Q-PCR反应程序

检测结果分析与计算：待Q-PCR运行结束，使用Roche Cobas Z 480软件生成ST1～ST6标准曲线，同时软件中Concentration一栏即为样品检测值。若实验结果同时满足以下条件，方成立。NTC、NCS 的检测结果应为Undetermined或Cp值≥35。待测样本和样本ERC 的检测结果计算加样回收率，回收率＝(样本ERC的检测结果-样本检测结果)/样本ERC的加标量×100％，加样回收率要求在50％～150％之间。供试品Vero细胞DNA残留量(ng/ml)＝样品检测值×5/100 ×稀释倍数。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。